UA62925C2 - METHOD FOR PRODUCTION OF rDSPA a1 - Google Patents

Description

Настоящее изобретение относится к способу вьіделения и очистки активатора сі плазминогена слюнь!

Оезтопаиз» гоїшпаицзв (ГО5РА с1)) к очищенному зтим способом гО5РА «1, к фармацевтическим композициям", содержащим очищенньй таким образом гО5НРА с, и к способам лечения, использующим очищенньй таким образом гО5РА с1.

Предпосьілки изобретения

Тромбозьі возникают в результате образования кровяного сгустка в кровеносньїх сосудах. Кровяной сгусток различаєтся при различньїх тромбозах, включая змболийи легких и артериальнье тромбозь, к которь!м относится острьій инфаркт миокарда. Змболия легких и инфаркт миокарда являются опасньми для жизни собьтиями, требующими немедленного медицинского вмешательства.

Распространенная форма терапии таких артериальньх и венозньїх тромбозов заключаєется в применений активаторов плазминогена для осуществления знзиматического тромболиза (СоїІеп с соавт., Апп. Неу. Мед., (1988), 39:405-423). Зти вещества, назьваемье тромболитиками, превращают плазминоген, неактивньй профермент фибринолитической системь! крови, в активньій протеолитический фермент, плазмин. Плазмин, в свою очередь, растворяет волокнистьій материал фибрин, которьйй является основньмм компонентом кровяного сгустка; зто приводит к возобновлению работь зтих закупоренньїх сосудов и восстановлению тока крови. Однако, поскольку плазмин является относительно неспецифической протеазой, он может также разрушать, посредством протеолиза, компоненть! крови, необходимье для интактного гемостаза (например, фибриноген) и, таким образом, повьішать риск кровотечения.

Первье знзиматические тромболитики, стрептокиназа и урокиназа, представляют собой соединения, которне однократно введеннье в кровообращение, системно превращают плазминоген в плазмин и индуцируют протеолиз во всем организме. Таким образом, тромболитические терапии, которне используют зти соединения, сопровождаются осложнениями, связанньми с кровотечением. Бьіли созданьі, ранее не существовавшие," тромболитические терапии, основаннье на соответствующем использований активаторов плазминогена определенного тканевого типа, обьічно именуемьсе как Ї-РА, но они также обладают рядом недостатков, в том числе, серьеезньмми осложнениями при кров"отечениях, сравнительно часто случающимися при повторной окклюзии, неспособнье бьть одинаково зффективньми, и подозреваемье в инактивации активаторов плазминогена ингибиторами, такими как ингибитор активатора плазминогена Типа 1 (РАЇ!-1) (Го5Ккшоїї, Зетіпагв іп Тпготровів апа Нетозіавів, Мої. 14, Мо 1 (1988)).

Совсем недавно из слюньі и слюнньїх желез большого вампира (Оезтопаив гошпаив) очистили белки активатора плазминогена (Опубликованная Европейская Патентная Заявка 0383417 (Ваідив с соавт.), опубликованная Европейская Патентная Заявка 0352119 (Оцопд с соавт.)). Зти активаторьї плазминогена (именуемье ОБРА) представляют собой сериновье протеазь, которье катализируют соответствующее превращение плазминогена в плазмин, но они проявляют большую селективность в отношений фибринсвязанного плазминогена и, позтому, могут бьіть ассоциированьії с менее серьезньмм и частьм кровотечением при использований тромболитическоий терапии. Кроме того, ОБРА нелегко инактивируется плазменньми ингибиторами, такими как РАЇІ-1, и по зтой причине могут бьіть ассоциированьї с меньшей частотой повторной окклюзии.

В слюне вампира можно обнаружить две вьиісокомолекулярнье формь! О5РА (обозначаємніе как с и ог), которне обе содержат несколько доменов, в том числе, протеазньй домен, и которне обе обладают способностью знергично связьвваться с плазмино-геном в присутствий фибрина. С помощью рекомбинантной биотехнологиий в культуре клеток млекопитающих получень! соответствующие различнье формь О5РА (Кгаїг5сптег с соавт., беле (1991), 105:229-237; опубликованная Европейская Патентная Заявка 0 352 119 (Онопад с соавт.)), и описаньії ограниченно очищеннье рекомбинантно полученнье Ю5РА (ТО5РА) (М/їй с соавт. ; Віоса (1992), 79:1213-1217). Однако, не бьли описаньі соответствующие вьіделение и очистка гО5РА в промьішленном масштабе и степень чистотьії, полагающаяся для фармацевтических препаратов.

Настоящая заявка касаєтся вьіделения и очистки рекомбинантного О5РА с (ТО5РА с) в промьиішленном масштабе. В настоящем изобретениий описано получение достаточно чистого и стабильного ГО5РА с для продажи и годного для клинического применения.

В настоящем изобретении разработали способ соответствующего вьіделения и очистки ГО5РА с в промьішленном масштабе и получения продукта, которьій пригоден для клинического использования.

В соответствий с зтим, один аспект изобретения направлен на способ очистки ГО5РА из биологической средь, причем указанньй способ включаєт в себя нижеследующие стадии: (а) нанесение средьі на катионообменную смолу в условиях загрузки, которье приводят к селективному связьіванию гО5мРА «1 с катионообменной смолой; (р) необязательно, промьівание данной катионообменной смоль! для удаления белков, не относящихся к "О5РА с11, и небелковьїх примесей; (с) селективная злюция с данной катионообменной смоль! связавшегося гО5РА сі; (4) нанесение злюента со стадии (с), содержащего гО5РА с1, на гидрофобно-взаимодействуюшую смолу в условиях загрузки, которне приводят к селективному связьвшванию гО5РА с1 с данной гидрофобно- взаймодействующей смолой; (е) необязательно, промьівание данной гидрофобно взаймодействующей смоль! для удаления белка, не принадлежащего г05РА с, и небелковьїх примесей; () селективная злюция с гидрофобно-взаймодействующей смоль! связавшегося ГО5РА сі; (9) нанесение злюента со стадии (Ї), содержащего соответствующий гО5РА ої1, на смолу для хроматографии по сродству в условиях загрузки, которне приводят к селективному связьіванию гО5РА с со смолой для хроматографии по сродству; (п) необязательно, промьшаниеє смольй для хроматографии по сродству для удаления белка, не принадлежащего к "05РА с, и небелковьїх примесей; () селективная злюция связавшегося гО5РА с из смоль! для хроматографии по сродству для получения,

в основном, по существу чистого ГОРА с11 в водном растворе.

Другим аспектом настоящего изобретения является белок пО5РА о, которьйй вьіделили и очистили способом настоящего изобретения.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей

БРА 01, которьйй вьделили и очистили способом настоящего изобретений, и фармацевтически приемлемьїй наполнитель.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ, использования г05пА «1, вьіделенного и очищенного способом настоящего изобретения, для лечения артериальньх и венозньїх тромбозов человека.

Подробное описание настоящего изобретения Используемье в данном описаний и формуле изобретения, если не оговорено иначе, нижеследующие терминьі обладают следующми указанньїми значениями: "Биологическая среда" относится к точному составу солей и питательньїх веществ, используемьх для размножения клеток в культуре. "Кондиционная среда" относится к биологической среде, в которой вьиіращивают клетки. По зтой причине данная среда обладает определенньіми условиями для роста соответствующих клеток и содержит продукть, секретируемье в данную среду в течение клеточного роста. Они могут представлять собой продукть! отхода, продуцируемніее в течение роста, или белки, которне бьіли синтезировань и секретировань! в данную среду в течение роста данньїми клетками. "Катионообменная смола" относится к естественному или синтетическому веществу, обьічно твердому, которое обладаєт способностью обменивать связанньсе ионь! на ионьії из данной окружающей жидкой средь!.

Катионообменная смола обладаєт постоянно функционирующими отрицательньми ионами и обменивает положительнье противоионь!.

Соответствующие якорнье группьі (компонентьії активного обмена) в коммерчески доступньх катионообменниках обьічно представляют собой -СеН5О, -5053, -Сб00, -РО или -АБОх. Слабье катионообменнье смольі представляют собой смоль, в которьїх связьвающая сила соответствующего катиона невьісока, например катионьії с карбоксильной или карбоксиалкильной функциями. Кроме того, слабье катионообменнье смоль обьчно, при кислом рН, диссоциируют не полностью. Конкретная катионообменная смола, используемая в настоящем изобретении, включаєт в себя матрицу из силикагелевьх частиц, ковалентно связанньїх с полизтилениминсиланом, в котором аминогруппь! полизтиленимина дериватизированьї карбоксильньми группами. Такая смола коммерчески доступна от

У.Т.Вакег под торговьмм названием У/ідероге СВХФО Спготаїйоодгарну гезіп.

Тидрофобно взаймодействующая смола" относится к естественному или синтетическому веществу, обьчно твердому, которое содержит незаряженньюе группьі, такие как метильная, зтильная или другие алкильньсе группьї. Зти группьї образуют гидрофобнье связи с группами в белковьїх составляющих, которье пропускают через смолу, и разделяют белки по соответствующей силе взаймодействия между данньм белком и группами смольм. Конкретная гидрофобно взаймодействующая смола состоит из полужестких сферических гранул, синтезированньїх путем сополимеризации зтиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированньїх бутильньми группами. Такая смола коммерчески доступна от То5зо-Наа5 под торговьім названием Тоуо-Реагією 650М С4. "Смола для хроматографии по сродству" относится к естественному или синтетическому веществу, обьічно твердому, которое используется для очистки белков. Данная смола разделяет белки на оснований сродства, которое имеет место между группами данного белка и группами данной смоль. В настоящем изобретений смола, используемая в качестве смоль! для аффинной хроматографии, обьічно является смолой для разделения белков на основе их размера. Конкретная смола для аффинной хроматографии представляет собой сшитьїй сополимер из аллилдекстрана и М,М'-метиленбисакриламида в соответствующей форме гранул, которне обладают способностью фракционировать глобулярнье белки между 20000 ий 8000000кДа. Такая смола коммерчески доступна от Ріпаптасіа под торговьім названием Зернасгу!Ф 5-400. "Алкил" относится к неразветвленному или разветвленному моновалентному радикалу цепи, состоящему исключительно из углерода и водорода" без насьшщщения и имеющего от одного до восемнадцати углеродньх атомов, предпочтительно, от одного до шести углеродньїх атомов, например, метила, зтила, н-пропила, изопропила (1-метилотил), н-бутила, трет-бутила (1,1-диметилотил), втор-бутила (1-метилпропил), н-пентила, н-гексила и т.п. "Практически чистьій", применительно ок чистоте продукта гО5РА 01, после схемь! очистки, детализированной в зтой заявке, означает, что болеє, чем 8095, общего белка в конечном очищенном продукте представляет собой "О5РА с1, предпочтительно более, чем 9095, вьіделенного общего белка представляет собой гО5РА с11, и найболее предпочтительно 9895 вьіделенного общего белка представляєт собой гО5РА с1. Содержание белка и его чистота основаньї на обращенно-фазовой НРІ С и анализе 505-

ПААГ. "Белок, не принадлежащий гО5РА о1, и небелковье загрязняющие примеси" относятся ко всем материалам, иньім чем гО5РА с, обнаруженньіїм в данной биологической среде, из которой очищали гО5РА о. "Фармацевтически приемлемьй наполнитель" относится ок приемлемому носителю, и любое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, суспендированное или включенное в данную фармацевтическую композицию, которое нетоксично и не оказьівает вредного влияния на соответствующую биологическую активность данной фармацевтической композиции, должно бьть, при необходимости, сопоставимо с физиологическими условиями. Подходящими наполнителями являются соединения, такие как маннитол, сукцинат, глицин или сьівороточньйй альбумин. "Терапевтически зффективное количество" относится к такому количеству 5РА о, которое при введение человеку, нуждающемуся в нем, является достаточньм для зффективной терапии, как указано ниже, для заболевания-состояния, характеризуемого тромбозом. Количество соединения, которое составляет

"терапевтически зффективное количество" будет варьироваться в зависимости от данного соединения, данного заболевания-состояния и его серьезности, но может бьть определено традиционно любьм специалистом в данной области знаний. "Лечение" или "терапия", используемье здесь," относятся к терапии болезни-состояния у человека, чья болезнь-состояние характеризуется тромбозом, и включаєет: () предупреждение возникновения данной болезни-состояния у человека, в частности, когда такой человек предрасположен к данному заболеванию-состоянию, но еще не диагностирован в качестве его обладателя; (ії) подавление данного заболевания-состояния, например, остановкой его развития; или (її) облегчение данного заболевания-состояния, например, ообеспечением регрессии данного заболевания-состояния. "Необязательньй" или "необязательно" означаєт, что соответствующие последовательно описьіваемье собьтия или обстоятельства могут или не могут происходить, и что данное описание включает примерньі, когда указаннье собьтия или обстоятельства происходят, и примерь, в которьїх они не происходят.

Настоящее изобретение относится к способу вьіделения и очистки "05РА с в промьішленном масштабе и в форме, подходящей для использования в фармацевтических препаратах. гО5РА получали путем ферментации линии клеток млекопитающего, способной секретирования гО5РА-продукт в культуральную среду. Кондиционную среду, например, среду, которую получают из биореактора, содержащую определеннье клетки млекопитающего, собирали, и полученньійй "ГО5РА о отделяли от других белков и примесей серией хроматографических стадий, начинающихся с использования ионообменной смоль, с последующей селективной злюцией (Ю5РА из смольі. Зту гГО5РА-фракцию, получаемую путем селективной злюции из катионообменной смольі, наносили затем на гидрофобно-взаимодеиствуюшую смолу, селективная злюция которой из данной матриць! обеспечиваєт второй уровень очистки. Зту злюированную "Ю5РА с1-фракцию наносили затем на смолу для аффинной хроматографии, где селективная злюция обеспечиваєт дальнейший уровень очистки. Зтот вьіделенньй очисткой гО5РА далее концентрировали с помощью традиционньх методик, такой как ультрафильтрация, и затем лиофилизировали.

Конкретное осуществление настоящего изобретения описьіваєтся ниже.

А. Вьіделение и очистка 1. Культуральная среда и клеточнье линии

Культуральная среда включаєт основную среду, подходящую для роста клеток млекопитающих, такую как

ОМЕМ или Хозмса Е12. Конкретная среда представляет собой среду Е Вильямса (УМіПатв, (.М. и Сипп, 9.М.,

Ехр. Сеї! Невз., (1974) 89:139). Для соответствующей инокуляции ростовой фазьї в данную основную среду, обьікновенно, добавляли источник серь), обьчно бьчью сьворотку (85) или сьіворотку новорожденного теленка (С5), представленную концентрацией в соответствующем диапазоне, от около 0,195 до 1095, по весу, обьічно, представленную, около 195-595, по весу. Можно таюже добавлять другие ростовье факторь! или буферьї, такие как НЕРЕ5. В течение данной перфузируемой ростовой фазьі концентрация данной сьіворотки обьічно поддерживаєтся на одном и том же концентрационном уровне, обьічно находящемся в диапазоне от около 395 до 895, обьікновенно, находящемся около 595.

Клеточнье линии, подходящиеєе для использования в настоящем изобретений, включают клеточнье линий млекопитающих, способнье к росту в суспензионной культуре и/или к росту на микроносителях. Конкретнье клеточнье линии, которне отвечают зтим требованиям, включают линии клеток яичника китайского хомячка (ОНО), ВНК-клеток или НЕК293-клеточную линию (Кгаї25сптег с соавт., (зепе, (1991) 116:281-284; Рейн, Т., 9.

ВіоТесппоіоду, (1995) 39:75-83).

Особенно предпочтительной СНО-клеточной линией является ЮХВ11, которая описана у Шігацо а. и

Спавзіп С.А. Ргос. Май. Асай. Осі. БА, (1980) 77:4216-4220. Зти клетки кот-рансфицировали соответствующими зкспрессирующими векторами рОМРА!1 и РООНЕНВІ, которье, соответственно, содержат кодирующие последовательности для "05РА с и для мьішиной дигидро-фолатредуктазь (Рей Т., там же).

Полученную трансформированную линию клеток ОНО, используемую в настоящем изобретениий, обозначили 2016 и депонировали в Американской Коллекции Типовьїх Культур, НоскміПе, Магуїапа (АТСС) и присвоили

АТСС Я СВІ 12023. 2. Рост культурьі и фаза образования продукта

После инокуляции с помощью либо сливного мундштука или других частей биореактора для культивирования данную клеточную культуру виращивали до получения плотности обьічно в диапазоне около (1-40)х109 клеток/мл.

По достижении требуемой плотности клеток на гранулах-микроносителях начинали перфузию свежей средой с добавленной сьівороткой. Альтернативно, клетки могли вьіращивать в суспензионной культуре.

Обьічно концентрация сьіворотки в свежей среде находится в диапазоне от приблизительно 295 до 1095 по весу, более типично в ряду от около 395 до 895 по весу, и, более обьічно, составляєт около 595 по весу.

Вначале скорость перфузии находится в диапазоне от около 0,25 до 0,75 культуральньїх обьемов в день, обьічно около 0,5 культуральньїх обьемов в день. С увеличением клеточного роста данную перфузи-онную скорость повьішают до конечной скорости в диапазоне от около 1,5 до 2,5 культуральньїх обьемов в день, обьічно после периода от 2-х до 10 дней. Во время зтого роста стерильнье предварительно уравновешеннье гранульь микроносителя добавляли в реактор для поддержания соотношения гранул микроносителя и плотности клеток в диапазоне от около 0,5 до 1,0 грамма гранул микроносителя на 109 клеток. Грануль- микроносители добавляли в реактор с использованием аспиратора через соответствующую трубку для образца.

По достижении требуемого уровня клеточной плотности добавление соответствующей сьворотки к свежей культуральной среде уменьшали, обьічно до концентрации в диапазоне от около 0,1 до 2,095 весовьїх, обьічно - 195.

Культура в продукционной фазе требуеєет внимания к множеству параметров ферментации: температуре,

рН и оопределенному уровню растворенного кислорода, контролируемьх ежедневно. Добавочная культуральная среда, сьшворотка и щелочь, необходимье для снабжения, в виде запасньїх емкостей исчерпьівались. Образцьі кондиционной средьі, охарактеризованньюе в качестве средьі, которая содержит продукт, анализировали традиционно, как минимум, каждьсе два дня, чтобь! увериться в том, что продукция остаєтся свободной от загрязняющих примесей.

Соответствующая процедура отбора кондиционной средьі! из биореакторов минимизирует сбор урожая клеток при использований сит с приблизительньм диаметром пор 100-150 микрон. Суспензионнье культурь используют проточньій фильтр с перемешиванием для удержания клеток в данном биореакторе. Полученньй урожай собирали в стерильнье емкости и хранили до 38 дней перед дальнейшей обработкой. "05РА с1, обнаруживаемьй в биореакторном урожає, секретировался из соответствующих СНО-клеток в процессированной форме, которая обладает полной биологической активностью и готова для очистки. 3. Катионообменная хроматография

После доведения рН до значения от 4 до б, предпочтительно до около 5, данньй г(О5РА с в кондиционной среде наносили на катионообменную матрицу (обьічно упакованную по соответствующей форме колонки) в условиях, вьібранньїх для создания полного связьввания гО5РА о1 с данной матрицей.

Поскольку другие белки будут также связьіваться, соответствующая начальная стадия связьівания создаєт первьій уровень разделения для ряда ненужньїх или примесньїх белков и других соединений, таких как феноловьій красньй, неспособньїх в кондиционной среде связаться с матрицей и, позтому протекающих через матрицу. Кроме того, ГО5РА о1 очищали путем селективной злюции из матриць, когда данную злюцию можно вьіполнить либо ступенчатой злюцией, либо линейной градиентной злюцией, увеличивая ионную силу данного буфера. В любом случає данньй гО57РА с1 собирали для дальнейшей очистки, как описано ниже.

Подходящие катионообменнье матриць включают широкое разнообразие смол, дериватизированньх катионньми функциональньми группами, которье обладают способностью связьшвать гО5РА с1.

Предпочтительньми являются синтетические смоль, такие как смоль, которне включают частиць силикагеля, поперечно-сшитую агарозу или поперечно-сшитье полимерь полиметакрилата, дериватизированнье катионньіми функциональньіми группами, такими как карбоксильная, карбоксиметильная, суль-фонильная, фосфорильная и т.п. Особенно пригодньіми являются относительно слабье смоль, такие как смольі, обладающие карбоксильной или карбоксиалюшшной функциями, такими как карбоксиметильная или карбоксизтильная. Особенно предпочтительная смола включаєет матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанньїх с о полизтилениминсиланом, с оаминогруппами данного полизтилениминсилана, дериватизированного карбоксильньмми группами. Такая смола представляет собой

Вакег У/ідероге СВХФ (с размером грануль! 45мм), которая коммерчески доступна от 9.Т.Вакег.

Соответствующие условия связьшшания и злюции варьируются в зависимости от силь! связьівания катионной смольм. Для слабьх катионньх смол, такой как Вакег Мідероге СВХ, связьивание может бьть зффективнь!м при низкой ионной силе в слегка закис-ленньїх условиях, обьічно при рН 4-7, предпочтительно, около рН 5. После промьввания матриць! ГО5РА с1 можно селективно злюировать, вбідерживая матрицу в подвижной фазе, обладающей повьишшенной ионной силой, применяя либо линейную, либо ступенчатую злюцию. Для указанной Вакег М/ідероге СВХ смоль гО5РА с/1 будет злюироваться при рН около 7,5 с солевой концентрацией между около 100мМ и 500мМ МасСі. Колонку можно затем вьібить и регенерировать для последующего использования.

Предпочтительно, что касается ВаКкег М/ідероге СВХ матриць, смолу вначале уравновешивали буфером из 100мМ натрийа-цетата, рН 5. Буфер наносили на колонку при скорости потока от 0,2 до 2,0 колоночньх обьемов в минуту, до тех пор пока рН вьтекающего потока не достигнет 5. Кондиционную среду, содержащую

БРА 01, фильтровали через 1,2мкм фильтр и затем титровали до рН между 4 и 7, найиболее предпочтительно -5, используя ледяную уксусную кислоту. Зту среду наносили затем на колонку обьічно с использованием механического насоса при скорости потока не более, чем 2,0 колоночньїх обьема в минуту.

Готовили фильтр для удаления макрочастиц, которне могут закупоривать матрикс данной колонки. Затем зту колоночную матрицу вновь уравновешивали уравновешивающим ацетатньм буфером до значения рн, установленного на 5, что обьічно требует от около 2 до 7 колоночньїх обьемов. Промьівочньій буфер, содержащей 5О0мММ натрийфосфата, рН 7,5, наносили на колонку от около 0,1 до 0,2 колоночньїх обьемов в минуту до достижения рН озлюента значения 7,5. Затем из зтой колонки злюировали (5РА сі с использованием злюирувдего буфера, содержащего 5Х0ОММ натрийфосфата, 500мМ натрийхлорида, рН 7,5.

Злюирующий буфер пропускали до тех пор, пока белок более не обнаруживали в злюенте из колонки. Затем на зту колонку наносили десорбирующий буфер, содержащий 2,0М натрийацетата, рН 8, с целью регенерировать данную матрицу. Соответствующий буфер для хранения содержит 1095 уксусной кислоть и 4595 зтанола. 4. Хроматография гидрофобного взаимодействия

Фракцию гО5РА 01, собранную с катионообменной матриць, затем наносили на матрицу для гидрофобного взаймодействия (обьічно в форме соответствующей колонки) в условиях, позволяющих связьіваться данному ГО5РА с с матрицей, обьічно - вьісокой ионной силь! и низкого рН. Затем гО5рРА сі селективно злюировали увеличивающейся концентрацией органического растворителя подвижной фазьї, наносимого на данную колонку с использованием линейного или ступенчатого градиента. Злюируе-мую фракцию гО5РА с1 собирали для дальнейшей очистки. , Зта стадия снижает примесь ДНК в 100-1000 раз и инактивирует потенциальньсе вируснье примеси.

Подходящие гидрофобно взаймодействующие матриць! включают широкое разнообразие незаряженньх смол, обладающих ковалентно присоединенньми гидрофобньми группами, такими как пропильная, бутильная, октальная, фенильная и им подобнье. Зти смоль! могут представлять собой поперечно-сшитье органические полимерьї, такие как стиролдивинилбензол, силикагель, агароза, полиметакрилат или любую одну из широкого множества других подходящих частиц-носителей. Особенно предпочтительная смола включаєт полужесткие сферические грануль), синтезированнье еополимеризацией озтиленгликоля и полимеров метакри-латного типа, дериватизированньїх бутильньми группами. Такая смола представляет собой Тоуо-Реаї! (40-дОмкм-овнье грануль!), которая коммерчески доступна от Тозо-Наазв.

Связьввание с гидрофобно взаимодействующей колонкой зффективно в условиях вьісокой ионной силь, обьічно при кислом рН 3-5, более обьічно, около 4. Практически весь белок, содержащийся во фракции ГО5РА аї, которьій злюировали с катионообменной смоль, связьівается в гидрофобно взаймодействующей колонке.

Разнообразньюе белки могут бьіть селективно злюированьі на основе их отличающихся сил гидрофобного взаймодействия с соответствующими гидрофобньми группами на данной матрице, например, в порядке увеличения гидрофобности соответствующего белка. Злюцию можно осуществить ступенчатьм или линейньм градиентом обьчно алкогольньм злюентом, таким как зтанол или изопропанол. Особенно предпочтительньїм алкоголем является зтиловьїй спирт.

Предпочтительно, что касается матриць Тоуо-Реа! 04, уравновешиваниє можно осуществить уравновешивающим буфером, содержащим 50мМ натрийацетата, 500мМ натрийхлорида, рН 4. Затем фракцию гО5РА «1 с ионообменной колонки титруют до рн 4 и наносят на 04-матрицу, а матрицу затем вновь уравновешивают вьшеописанньм уравновешивающим буфером. Колонку промьвают последовательно двумя буферами следующим образом. В первой промьівке (промьівка 1) использовали, как минимум, два колоночньїх обьема буфера, содержащего 20 мМ НС. Промьівание продолжали до получения вьтекающего потока, не содержащего белка, что устанавливали по стабильной УФ-абсорбции. Данную матрицу вновь промьівали (промьївка 2) не менееє, чем 10 колоночньіми обьемами буфера, содержащего 1995 зтанола, 20МмМ

НОЇ, и промьівание продолжали буфером, содержащим 20,595 зтанола, 20мММ НСІ, до тех пор, пока белок не прекращал злюироваться. Злюция г05РА с1-продукта зффективна с использованием буфера, содержащего 2995 зтанола, 20мММ НОЇ, рН 2,5. После злюции продукта колонку промьшвали не менеє, чем двумя колоночньми обьемами буфера, содержащего 100мМ МаоОнН. Данную матрицу хранили в первом промьівочном буфере. 5.Аффинная хроматография

Фракцию гО5РА а1, собранную с гидрофобно взаймодействующей смоль, наносили затем на аффинную матрицу (обьічно в форме соответствующей колонки) в условиях, которне позволяют связьвваться гГО5РА с с аффинной матрицей. До тех пор, пока ГО5РА с11 остается связанньм в колонке, примеси злюируют путем промьшвания колонки 2-3 колоночньми обьемами 20мМ НсСІ. Зта стадия облегчаєт обмен буфера с добавленньм фармацевтическим препаратом и растворимость, а также помогает инактивировать/удалять потенциальнье вируснье примеси; Предпочтительно, используют 2,5 колоночньїх обьемов данного буфера.

Затем зтот ОБРА о1 селективно злюируют с использованием буфера, содержащего 200мМ глицина, свободное основание при рН между 4 и 5. Получаемую фракцию гО5РА с собирают для концентрирования.

В настоящем изобретении соответствующие смоль" используемье в качестве аффинньїх смол, представляют собой смоль, которье обьчно используются как смольй для зксклюзии по размеру.

Подходящие аффинньсе матриць! включают смольі, включающие поперечно-сшитьй полимер аллилдекстрана и М,М'-метиленбисак-риламида в форме гранул с диаметром между 25 и 75мкм. Особенно предпочтительной смолой являєтся бЗерпасгу! 4009, которьій коммерчески доступен от Рпаптасіа и обладаєт способностью фракционировать глобулярнье белки между 20000 и 8000000ОкД.

Связьівание О5РА с с аффинной смолой осуществляєтся в условиях низкой ионной силь и низкого рн.

Практически весь гО5РА с, собранньійй с гидрофобно взаймодействующей смоль, связьувается в колонке.

Связавшийся ГО5РА осі можно селективно злюировать путем повьішения рН и/или ионной силь. Злюцию можно осуществить ступенчать!м или линейнь/м градиентом, обьчно злюентом, содержащим 200мМ глицина, свободное основание.

Предпочтительно" что касаєтся матриць берпасгу! 5-400, уравновешивание можно осуществить буфером, содержащим 1995 зтанола, 20ММ НС, до тех пор, пока рН в вьтекающем потоке не останется неизменньм. Матрицу нагружали полученной из указанной гидрофобно взаймодействующей колонки фракцией гО5РА «11, а затем промьівали буфером, содержащим 20мМ НСЇІ до получения неизменяющегося

Уф-сигнала в витекающем потоке. Злюция связанного ГОРА ос зффективна с использованием буфера, содержащего 200мМ глицина. После злюции продукта колонку десорбировали не менее, чем двумя колоночньми обьемами буфера, содержащего 100мМ МаонН. После промьівания матриць, как минимум, двумя колоночньми обьемами соответствующего промьівочного буфера (20мМ НСЇ) очищенную матрицу хранили в зтом буфере. 6. Концентрирование

Вьіделенньійй очисткой белок настоящего изобретения можно затем сконцентрировать обьічно путем фильтрации или подобньїм образом, и можно, в конечном счете, лиофилизировать или иньім образом ввести в стандартнье фармацевтические препарать!. Пригоднье методьі концентрирования и лиофилизации хорошо описань! в научной литературе.

В. Приготовление лекарственного средства 1. Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение предлагает реагент с существенной терапевтической ценностью. 5РА с, которьій должен бьть пригоден для лечения артериальньх и венозньїх тромбозов, вьіделяли очисткой соответствующими описанньіми способами.

Рекомбинантньій О5РА с11, очищенньй, как здесь описано, можно вводить пациенту. Зтот реагент можно сочетать для терапевтического использования с другими ингредиентами, например, с фармацевтически приемлемьми традиционньми носителями или разбавителями, вместе с физиологически безвредньми стабилизаторами и наполнителями. Зти сочетания могут бьіть стерильно отфильтрованьі и размещень в дозированнье формьі! путем лиофилизации в дозируемьх флаконах или сохранень! в стабилизированньх водньїх препаратах.

Соответствующие количества реагента, необходимье для зффективной терапии, будут зависеть от многих различньїх факторов, включающих способьй введения, физиологическое состояние конкретного пациента и другие вводимье медикаменть. Позтому терапевтические дозьі следуеєет подбирать, чтобь обеспечить безопасность и зффективность. Обьчно дозьі, используемье 2л міо, снабжень! полезньім руководством по пригодности соответствующих количеств для введения зтих реагентов іп віш. Тестирование на животном зффективньїх доз для терапии обеспечивает прогнозируемьй критерий дозирования для человека.

Каждое в отдельности соображение описано, например, у Сіїтап с соавт. (ед5) (1990) Соодтап апа

Сіїтап'є: Тне Рнаптасоїодіса! Вазез ої Тнегарешційс5, 8 Ей., Регдатоп Ргев5; и Ветіпдіоп'є Рнагптасешіісаї!

Зсієпсев, 181!" вд. (1990), Маск Рибіїєніпд Со., Еавіюп, Регпт.

Здесь и ниже обсуждаются способь! введения, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинноеє или внутримьлшечное введение, чрезкожная диффузия и другие. Фармацевтически приемлемье носители будут включать воду, физраствор, буферь и другие описьіваемье соединения, например, в Мегеск Іпаех,

Мегек 5 Со., Вапжмау, Мем дегзеу. На оснований назначенньїх доз других активаторов плазминогена нужную тотальную дозу следует рассчитьввать между 80 и 110 мг (РНузісіапв' ОезК Веїегепсе, 49!" єй. (1995), Медісаї

Есопотісв бага Ргодисіоп Сотрапу, рр 1083-1085).

Терапевтические препарать! могут бить введень в любом удобном дозированном составе. Поскольку соответствующий активньй ингредиент можно назначать сам по себе, предпочтительно представлять его в виде фармацевтического препарата. Препаратьй включают, как минимум, один активньй ингредиент, указанньй вьіше, вместе с одним или несколькими приемлемьми носителями. Каждьй носитель должен бьть одинаково приемлем, фармацевтически и физиологически, в смьсле совместимости с другими ингредиентами и не навредить конкретному пациенту. Препарат включаєт компоненть!, подходящие для перорального или парентерального (включая подкожное, внутримьшечное, внутривенное и интрадермальное) введения. Соответствующие препаратьі могут бьть удобно представленьй в форме дозовой единиць и могут бьіть изготовленьі любьмми способами, хорошо известньіми специалистам аптечного дела. Смотрите, например, Сіїтап с соавт., там же, и КНетіпдюп там же.

Б итоге соответствующе предпочтительнье вариантьь осуществления настоящего изобретения, описанньсе в Кратком изложенийи существа изобретения, являются следующими: способ соответствующего вьіделения и очистки ГО5РА со из биологической средьі, отличающийся тем, что указанньійй способ включает следующие стадии: (а) нанесение средь при рН 5 на катионообменную смолу, включающую матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанньх с полизтилениминсиланом, в котором соответствующие аминогруппь! дериватизированьї карбоксильньіми группами, что приводит к селективному связьванию гО5РА с с данной катионооб-менной смолой; (б) промьтвание данной катионообменной смольі с рН 5 100мМ МаОАс и 50мМ МаРоО»4 с рН 7,5 для удаления белка не принадлежащего к гО5РА «11, и небелковьїх загрязняющих примесей; (с) злюция связанного гО54РА с11. с катионообменной смоль! буфером, содержащим 50мМ натрийфосфата и 5Б00мММ натрийхло-рида с рн 7,5; (4) нанесение злюента со стадии (с), содержащего данньй гО5РА сої, при рН 4 на гидрофобно- взаймодействующую смолу, включающую полужесткие сферические грануль), синтезированнье сополимеризацией зтиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированньїх бутильньми группами, что приводит к селективному связьіванию гО5НРА «1 с гидрофобно взаймодействующей смолой; (е) промьівание гидрофобно взаймодействующей смольі 20мМ НОСІ, а затем 20мМ НСЇІ, содержащей 1995

ЕЮН для удаления белка, не принадлежащего к гО5РА с1 и небелковьх загрязняющих примесей; () злюция связанного ГО5РА сі с гидрофобно взаимодействующей смоль! буфером, содержащим 2995 зтанола и 20мМ хлористоводородной кислоть с рн 2,5; (4) нанесение злюента со стадии (Ї), содержащего данньй гО5пРА са, при рН 2,5 на смолу для аффинной хроматографии, включающую поперечно-сшитьйй полимер аллилдекстрана и М,М'-метиленбисакриламида, которьій фракционируеєет глобулярнье белки между 20000 и 8000000кД, что приводит к селективному связьіванию гО5пРА ев! со смолой для аффинной хроматографии; (п) промьвание зтой смольй для аффинной хроматографии 20мМ НС! для удаления белка, непринадлежащего г05РА с, и небелковьїх загрязняющих примесей; () злюция связанного ГО5РА с со смольі для аффинной хроматографии буфером, содержащим 200мММ глицина с рН между 4 и 5, для получения практически чистого гО5РА с в водном растворе.

Нижеследующие конкретнье препаратьь и примерь! предлагаются в качестве руководства для практического применения настоящего изобретения и не подразумевают ограничения обьема настоящего изобретения.

Пример 1

Культура клеток, продуцирующая гО5РА с1

Оттаивали ампулу из ОБРА Ууоїкіпд СеїЇ Вапк и инокулиро-вали в роллерную бутьіль с 595 сьіворотки теленка в ростовой среде (МЕС 5.0 среда, модифицированная по УЛіІПШатв). Через двухнедельньй период зти клетки размещали в четьіре роллернье бутьмли, полученнье клетки трипсинизировали из зтих четьірех роллерньїх бутьілей и инокулировали в четьіре 1 литровне вращающиеся колбь, каждая с 4х108 клеток віл ростовой средь. Спустя четьіре дня полученньсе из зтих четьірех вращающихся колб культурь! использовали для инокулирования 10 литрового биореактора. Дополнительньій іл ростовой средьі добавляли в оту биореакторную культуру в день инокуляции. На следующий день зто биореактор заполняли до 10л ростовой средой. Культивирование с добавлением и без добавления микрогранул-носителей осуществляли по зтому протоколу. рН данной средьі поддерживали на уровне 7,0-7,4, а уровень насьищщения кислорода поддерживали постоянно с помощью барботажной системьі. Температуру поддерживали на уровне 34-3970.

Плотность клеток составляла в день инокуляции в биореакторе 8,1х105 клеток на мл, а спустя два дня клеточная плотность удвайивалась, за время, когда скорость перфузии составила 0,5 культуральньїх обьемов в день (см/день). Скорость перфузии увеличивали по отношению к плотности клеток так, чтобьї через девять дней после инокуляции данного биореактора указанная плотность достигала 6,2х1092 клеток/мл, и перфузию увеличивали до 2 см/день.

Затем биореактор переключали на продукционную среду (195 сьворотки теленка в среде М/ЕС 5.0) и двумя днями позже начали собирать урожай клеток и продолжили в течение 10 недель. В течение продукционной фазь средняя плотность клеток составляла 15хХ106 клеток на мл с приблизительной жизнеспособностью 7595. Продукция ГО5РА с составляла, в среднем, 40мг "г05РА со на литр, а средняя удельная продуктивная скорость равнялась 6 пикограммам гО5рРА сі на клетку в день.

Нарастание обьемов ферментирования осуществляли путем перенесения половиньі данного содержимого из одного реактора в новьій сосуд. Продуктивную среду, размещенную в обоих биореакторах, перфузировали при 2 см/день и сразу же собирали полученньй урожай клеток.

Пример 2

Очистка г054ХА сі 1. Катионообменная хроматография (Колонка А). Урожай клеток данного биореактора хранили при температуре окружающей средь (15-257С). Затем фильтровали через 0,45 микронньій фильтр до загрузки на катионообменную колонку. Очистку полученного урожая клеток начинали со стадиий колоночной хроматографии, использующей СВХ-смолу, изготовленную ..Т.ВаКег (Колонка А). Зта стадия существенно облегчаєт очистку данного белка.

Буферь для Колонки А состоят из Буфера А1: уравновешивающий буфер (5Хо0мМ МабАс, при рн 5,0),

Буфера А2: промьівочньій буфер (5Х0мМ МарРо»х, рН 7,5), Буфера АЗ: злюируюший буфер (50мМ МаРох, 500мММ масі, рН 7,5), Буфера А4: буфер для десорбции (2М МаАс, рН 8,0), и Буфера А5: буфер для хранения (4595

ЕЮН, 1095 НОАС).

Нижеследующие рабочие параметрь! колонки свойственньі колонке, набитой бкг смольі и обладающей колоночньми обьемом і5л. Не более, чем 4,5г О5РА сі можно нагрузить на данную колонку на цикл хроматографирования. Данную колонку нагружали при скорости потока не более, чем гл в минуту и не более, чем при 2Орзі (137,9кПа) колоночного давления. Технические условия колонки и следящеє устройство проверяли перед каждьм хроматографированием. Данньійй нагружаемьй материал и хроматографические буферь! дегазировали путем барботирования гелием перед использованием.

Клетки, полученнье в данном биореакторе, фильтровали с помощью 1,2мм фильтра, затем титровали до рН 5,00 (20,10) с использованием ледяной уксусной кислотьі. Перед загрузкой данную колонку уравновешивали не менеє, чем 30 литрами буфера Аї7 до тех пор, пока рН в вьтекающем потоке не составлял 5,00 (10,20). Колонку однократно уравновешивали, на колонку нагружали полученньій урожай клеток. Зту колонку вновь уравновешивали не менееє, чем 80 литрами буфера А1. Данная колонка считается надлежащим образом уравновешенной, когда вьітекающий поток имеет рН 5,00 (20,20), и когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. Колонку промьувают не менее, чем 145 литрами буфера А2. Зта колонка является промьтой надлежащим образом, когда вьтекающий поток имеет рН 7,50 (50,20), и когда достигаєтся стабильная нулевая УФ-линия.

Соответствующий продукт злюируют из данной колонки не менее, чем 30 литрами буфера АЗ и собирают в отдельнье сосудьм. Злюция считаєтся полной, когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. После злюции продукта колонку десорбируют до стабильной нулевой УФ-линии с использованием не менее 30 литров буфера А4. Затем зту колонку обрабатьввают начисто для повторного использования (не превьішая 50 циклов использования). Продукт данной колонки А (или злюата) хранят при 2-8"С. Вьіїход в среднем составил 939, а степень чистоть (белка) из данного злюата в среднем составила 8195. 2. Хроматография гидрофобного взаймодействия (Колонка В). После хроматографирования на СвВХх- смоле данньій "05РА с1-продукт хроматографировали с использованием гидрофобно взаимодействующей смольї С4 (То50о-Наах) (Колонка В). Зта стадия способствует существенному удалению небелковьх загрязняющих примесей и помогает также в соответствующем инактивиро-ваний/удалениий возможньх вирусньїх загрязняющих примесей. Буферь! для колонки В состоят из Буфера В1: уравновешивающий буфер (БОММ МаоОдс, 500мМ масі, рн 4,0), Буфера 82: буфер для промьівки и хранения (20мМ НС), Буфера 83: промьівочньій буфер (20мМ НС, 1995 ЕЮН), Буфера В4: промьівочньйй буфер (20мМ НС, 20,595 ЕЮН),

Буфера 85: злюирующий буфер (20мМ НС, 29,595 ЕН) и Буфера 86: буфер для десорбции (0,1 М Ммаон).

Нижеследующие рабочие параметрь! данной колонки являются подходящими для колоночного обьема 15л.

Не более, чем 9г пО5РА с1 можно нагрузить на данную колонку для одного цикла хроматографирования.

Данную колонку нагружали при скорости потока не более, чем гл/мин, и не более, чем при 15рві (103,425кПа) колоночного давления. Спецификации данной колонки и следящего устройства проверяли перед каждьм циклом хроматографирования.

Перед загрузкой данную колонку уравновешивали до тех пор, пока витекающий поток не достигнет рн 4,00 (50,20). Злюат из данной колонки титровали до рН 4,00 (30,10) с использованием ледяной уксусной кислотьї, дегазировали и нагружали. Зту колонку повторно уравновешивали не менее, чем 30 литрами

Буфера ВІ до тех пор, пока рН вьітекающего потока не достигал рН 4,00 (30,20) и стабильной нулевой УФф- линии. Колонку промьявали тремя буферами. Первую промьівку осуществляли не менеє, чем 45 литрами

Буфера 82. Колонка является основательно промьтой, когда вьтекающий поток имеет рН 1,90 (350,20), и когда достигаєтся стабильная нулевая УФ-линия. Колонку промьівали второй раз не менее, чем 145 литрами

Буфера ВЗ до тех пор, пока не достигалась стабильная нулевая УФ-линия. Колонку промьівали в третий раз не менееє, чем 30 литрами Буфера Ба4, и она является полностью промьтой, когда достигаєтся стабильная нулевая УФ-линия. 5РА с1 злюировали с колонки не менее, чем 30 литрами Буфера В5 и собирали в отдельньй сосуд.

Злюцию продолжали до тех пор, пока не достигалась стабильная нулевая УФ-линия. Затем данную колонку обрабатьвали начисто для повторного использования (не превьишая 50 циклов использования). Продукт с колонки В (или из злюата) хранили при 2-8"С не более, чем 15 дней перед дальнейшим процессированием.

Вьход в среднем составил 91952, а полученная чистота (белка) из данного злюата составила в среднем 9795.

З. Хроматография по сродству (Колонка С). Продукт с колонки В хроматографировали затем с использованием берпасгу! 5-400 (Рпаптасіа) (Колонка С). Зта стадия способствует обмену буфера и добавленного препарата, а также помогает в соответствующем инактивированиий/удалениий вирусньх загрязняющих примесей. Буферь! колонки С состоят из Буфера С1: уравновешивающий буфер (20мМ НС, 1995 ЕЮН), Буфера С2: промьівочньій буфер (20мМ НС), Буфера С3: буфер для злюции и хранения (200мМ глицина, стерильно фильтрованного) и Буфера С4: десорбционньійй буфер (0,1 М мМаон). Нижеследующие рабочие параметрь! данной колонки являются подходящими для колоночного обьема 1Ол. Не более, чем 20г

БРА о1 можно нагрузить на данную колонку для одного цикла хроматографирования. Данную колонку нагружали при скорости потока не более, чем 0,бл/мин и не более, чем при 15рзі (103,425кПа) колоночного давления. Злюать!, полученнье из одной или нескольких колонок В, обьединяли, затем разбавляли злюат одной частью Буфера С2 и двумя частями Буфера 5. Конечная концентрация зтанола составляла приблизительно 1995.

Перед загрузкой данную колонку уравновешивали не менее, чем 15 литрами Буфера СІ, до тех пор, пока витекающий из нее поток не имел рН 1,80 (20,20). После загрузки данную колонку промьівали не менее, чем

ЗО литрами Буфера С2. Колонка является основательно промьтой, когда получаемьй Уф-сигнал является стабильньім. Продукт злюировали с колонки не менееє, чем 20 литрами Буфера С3З и собирали в отдельньй сосуд. Злюцию продолжали до тех пор, пока не достигали стабильной нулевой УФ-лИНИИ.

После злюции продукта колонку десорбировали не менеєе, чем 12 литрами Буфера С4 хранили до повторного использования, не превьішающего 20 циклов. Соответствуюпщій продукт (или злюат) с колонки С разбавляли Буфером С до концентрации « імг в мл и хранили для дальнейшего процессирования. Вьіход "О5РА с11 в среднем составил 9795, а чистота (белка) из данного злюата составила в среднем 9895.

Стадии концентрирования и приготовления лекарственного препарата следовали за окончанием стадий очистки и осуществлялись на злюате аффинной колонки 5-400, которую сохраняли не более, чем 70 дней.

Злюатьі колонки С обьединяли и концентрировали при помощи спирально навивной (зріга! моипа) ультрафильтращонной мембрань), которая удаляєт низкомолекулярнье вещества (30000 дальтонная отсечка). Данньій продукт собирали в апирогенную емкость в концентрации более, чем 8мг/мл. Добавляли маннитол до конечной концентрации 495.

Добавляли конечньій рецептурньйй буфер (200мММ глицин, 495 маннитол (в/о)) для доведения массь рецептурного продукта до 7,5мг/мл. Затем полученньй ообьем рецептурного продукта стерильно фильтровали, расфасовьвали во флаконь! и лиофилизировали.

Claims (23)

1. Способ очистки рекомбинантного активатора плазминогена слюньї ЮОезтодив гоїшпаиз (ОБРА а) из биологической средьї, включающий: (а) нанесение средьї на катионообменную смолу прирНот 4 до 7; (б) промьітвание катионообменной смольі для удаления не принадлежащих к гГО5РА а1 белков и небелковьх загрязняющих примесей; (с) селективную злюцию связанного гО5РА а! с катионообменной смольі; (4) нанесение злюента со стадии (с), содержащего гО5РА ат, на гидрофобно-взаимодействующую смолу при рн от З до 5; (є) промьівание гидрофобно-взайимодействующей смоль! для удаления не принадлежащего к гГО5РА а белка и небелковьїх загрязняющих примесей; () селективную злюцию связанного гО5РА а1 с гидрофобно-взаймодействующей смольі; (9) нанесение злюента со стадии (Її), содержащего гО5РА а, на смолу для аффинной хроматографии при низком рН и низкой ионной силе; (п) промьівание смоль! для аффинной хроматографии для удаления не принадлежащего к гО5РА а! белка и небелковьїх загрязняющих примесей; () селективную злюцию связанного ГОРА аї1 со смольі для аффинной хроматографии с получением чистого ГОРА а1 в водном растворе.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологическая среда представляєт собой кондиционированную среду.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что катионообменная смола на стадии (а) включаєт частиць! силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитье полимерь полиметакрилата, дериватизированнье карбоксильньїми или карбоксиалкильньми группами.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что катионообменная смола включает матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанньх с полизтилениминсиланом, в котором аминогрупльй полизтилениминсилана дериватизировань! карбоксильньїми группами.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (а) включают нанесение средь при рН от 4 до 7.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что злюцию гО5РА аї на стадии (с) виіполняют с использованием буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия и от 100 мм до 500 мМ Масі, или буфера зквивалентной ионной силь.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смола для гидрофобного взаймодействия на стадии (а) представляєт собой незаряженную смолу, дериватизированную алкильньми цепями из 1-10 углеродов в длину или арилалкильньми группами.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что незаряженная смола включаєт частиць! силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитьй полимер полиметакрилата.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что незаряженная смола включаєт полужесткие сферические гранульі, синтезированнье сополимеризацией зтиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированньх бутильньїми группами.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (4) включают нанесение злюента со стадии (с)прирНот З до 5.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (4) включают нанесение злюента со стадии (с) в 50 мМ фосфата натрия, 500 мМ Масі, с рН, доведенньім до 4 фосфорной кислотой, или в буфере зквивалентной ионной силь.

12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что злюцию на стадии (Її) вьіполняют с использованием буфера, содержащего 20 мМ НОСІ и имеющего концентрацию зтанола более чем 2595.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация зтанола составляеєт 28,5 - 3090.

14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация зтанола равна 2995.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смола для аффинной хроматографии со стадии (9) включаєт поперечносшитьїй сополимер аллилдекстрана и М,М'-метиленбисакриламида в форме гранул с диаметром от 25 до 75 мкм.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что гранульї обладают способностью фракционировать глобулярнье белки от 20000 до 8000000 кД.

17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (д) включают нанесение злюента со стадий ( прирнНот 1 до 4.

18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что злюцию на стадии (ї) осуществляют с использованием буфера, содержащего 200 мМ глицина с рН от З до 6, или буфера зквивалентной ионной сильі.

19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включаєт концентрирование водного раствора "ГО5РА а.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что дополнительно включает лиофилизацию концентрированного раствора го5РА а.

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включаєт концентрирование водного раствора "ГО5РА а1 и лиофилизацию концентрированного раствора ГОРА а.

22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает следующие стадии: (а) нанесение средьй при рН от 4 до 7 на катионообменную смолу, включающую частицьї! силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитье полимерь полиметакрилата, дериватизированнье карбоксильньіїми или карбоксиалкильньми группами; (Б) промьівание катионообменной смольі для удаления не принадлежащих к гО5РА а1 белков и небелковьзмх загрязняющих примесей; (с) селективную злюцию связанного гО5РА 41 с катионообменной смольі с использованием буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия и от 100 мм до 500 мМ Масі, или буфера зквивалентной ионной силь; (4) нанесение злюента со стадиий (с), содержащего гО5РА са1, при рН от 3 до 5 на гидрофобно- взаймодействуюшую смолу, включающую частиць! силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитье полимерь! полиметакрилата; (є) промьівание гидрофобно-взайимодействующей смоль! для удаления не принадлежащего к ГОРА а1 белка и небелковьїх загрязняющих примесей; (у селективную злюцию связанного ГОРА а! с гидрофобно-взаймодействующей смоль! буфером, содержащим мМ НС и имеющим концентрацию зтанола более чем 25965; (9) нанесение злюента со стадии (), содержащего гО5РА а1, при рН от 1 до 4 на смолу для аффинной хроматографии, включающую поперечносшитьй полимер аллилдекстрана и М, М'-«метиленбисакриламида в форме гранул с диаметром от 25 до 75 мкм; (п) промьівание смоль! для аффинной хроматографии для удаления не принадлежащего к ГОРА а! белка и небелковьїх загрязняющих примесей; () селективную злюцию связанного гГОЗРА а1 со смольі для аффинной хроматографии буфером, содержащим 200 мМ глицина, с рН от З до 6 или буфером зквивалентной ионной силь! с получением чистого ГОРА аї в водном растворе.

23. Способ вьіделения и очистки ГОРА а!1 из биологической средьі, включающий: (а) нанесение средьь при рН 5 на катионообменную смолу, включающую матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанньїх с полизтилениминсиланом, в котором аминогруппь! дериватизированьї карбоксильньїми группами; (Б) промьввание катионообменной смоль с рН 5 100 мМ МаОдАс и 50 мМ фосфата натрия с рН 7,5 для удаления не принадлежащего к ГОРА а!1 белка и небелковьїх загрязняющих примесей; (с) злюцию связанного гоб5РА а! с катионообменной смольі буфером, содержащим 50 мМ фосфата натрия и 500 ММ хлорида натрия, с рН 7,5; (4) нанесение злюента со стадии (с), содержащего гО5РА ат, при рН 4 на гидрофобно-взаимодействующую смолу, включающую полужесткие сферические грануль, синтезированнье путем сополимеризации зтиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированньх бутильньми группами; (е) промьівание гидрофобно-взаимодействующей смоль! 20 мМ НОСІ, а затем 20 мМ НС, содержащим 1995 ЕЮН, для удаления белка, не принадлежащего к гГО5РА а, и небелковьїх загрязняющих примесей; () злюцию связанного ГОРА а! с гидрофобно-взаимодействующей смоль! буфером, содержащим 2995 зтанола и 20 мМ НСІ, с рн 2,5; (9) нанесение злюента со стадии (ї), содержащего гО5РА а, при рН 2,5 на смолу для аффинной хроматографии, включающую поперечносшитьйй полимер аллилдекстрана и М,М'-«метиленбисакриламида, которьй фракционирует глобулярнье белки от 20000 до 8000000 кД; (п) промьітвание смольі для аффинной хроматографии 20 мМ НС1 для удаления белка, не принадлежащего к ГО5РА а, и небелковьїх загрязняющих примесей; () злюцию связанного ГОЗРА а1 со смольь для аффинной хроматографии буфером, содержащим 200 мМ глицина, срнН от 4 до 5, с получением чистого ГОРА а! в водном растворе.