TW385313B - Method for the production of rDSPA alpha 1 - Google Patents

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A7 B7 五、發明説明（1 發明範圍 本發月係有關分離及純化吸血编竭（Desniondus rotundus) 唾液纖維蛋白溶酶原化劑a 1(rDspA江之方法，以此方 法純化之rDSPA α 1 .，含如此純化的rDSPA α、的醫藥组合 物，以及使用rDSP A α 1作治療的方法。 發明背景 血栓係由血管内產生血塊所形成。靜脈血栓（包括肺栓塞） a動物血检（包括集性心肌梗塞）有分別。肺栓塞及心梗塞 疋威脅生命的疾病，需立即作醫•藥處理。

、此類動脈及靜脈血栓的一般查·療方式是使用纖維蛋白溶 酶原化劑以完成酶性血栓溶解（c〇Uenetal，ΑηηMM ()’ 09 405 _ )。此等物質稱爲血栓溶鮮劑，將纖 維蛋白溶酶原，血液中纖維蛋白溶解系統的未活化的酶前 體（proenzyme)，轉化成活性的蛋白質溶解酶，纖維蛋白溶 酶。而纖維蛋白;容酶又溶解纖維樣物質纖維蛋白，纖维蛋 白是血凝塊的主要成分；導致阻塞的血管再楊通並恢復血 流。然而由於纖维蛋白溶酶是較非特異性的蛋白酶，也可 能經由蛋白質落解作用破壞血液中不可缺少的維持完整止 血的成分（例如纖維蛋白原），增加出血的危險。 第-類酶性血拾溶解劑’鏈激酶及尿激酶，是這樣的化 p物，&人循環中後，即㈣地轉化 成纖维蛋白溶酶，引起系統性蛋白質溶解。是=用= :合物做血检溶解治療伴生與出血有關的併發症錢= 展成較新的血栓溶解治療，此治療以使用—般稱杯Μ的 Λ 本纸張尺度中國國家標準(

，.且織型的纖維蛋白溶酶原活化劑爲基礎，但也受較數種缺 點的，擾，包括嚴重的出血併發症，較常發生的再阻塞， 不都疋有效，以及不會被纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑， 如1型的纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑（pAI_丨），所抑制 (Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, V〇l. 14, No. 1 (1988))。 ’ 最近已由吸血蝙蝠（Desm〇ndus r〇tundus )唾液及唾液腺純 化出纖維蛋白溶酶原活化劑蛋白質（歐洲公佈的專利申請案 〇 383 417(BaldUS等）；歐邱公佈的專利申請案〇 352 U9(Du〇ng等）。此類纖維蛋白溶酶原活化劑（稱爲DSPA) 爲絲胺酸蛋白酶，催化纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶 酶，但對結合有纖維蛋白的纖維蛋白溶酶原展現較大的選 擇性，因之在用作血栓溶解治療時可能較少引起出血的嚴 重程度及頻率。此外，DSPA不易被血漿抑制劑，如pAi_ 1，所非活化，所以可能眼起再阻塞的頻率也較低。 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 於蝙蝠唾液内可找到二種高分子量的〇51>入（稱之爲沈丄及 α 2 ) ’此二種都由幾個區（d〇main )構成，包括蛋白酶區， 二者在有，維蛋白的存在下也都能緊密結合於纖維蛋白溶 酶原上。此等形式的DSPA已藉重組生物技術由哺乳動物的 細胞培養製成（KrStzschmer et al.，Gene (1991), 105 : 229 - 237 ;歐洲公佈的專利申請案〇 352 ^號⑺训％以al))， 也有人説明重組製成的DSPA(rDSPA)的小尺度純化（Witt et al·，Blood (1992)，79 ·· 1213 _ 1217)。但並未揭示商業尺 度的rDSPA的分離和純化，也未述及其純度適於作醫藥調 ____-5- { CNS ) ( 210x297^^ ) ' ~ 五、發明説明（ 3 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 配物。 本申請係關於重組DSPA λ 1 (rDSPA π 1)的商業規模的 純化。如此處所述，本發明製成足夠純的rDSpA汉i，其 安定性足以供商業販售及可作臨床使用。 本發明概述 本發明提供商業尺度的分離及純化rDSpA戌i的方法，所 製得的產物適於臨床使用。 Q之，本發明一方面係導向於由生物培養基純化r〇SpA π 1的方法，該方法包括如下_的-步驟： (a) 在承载條件下將培—養基加至陽離子交換樹脂，結果使 rDSPA α 1選擇性地結合於陽離子交換樹脂上； (b) 視需要，洗滌此陽離子交換樹脂，除去#rDspA “ i 蛋白質及蛋白質污染物； (Ο自陽離子交換樹脂上選擇性地溶析結合的rDspA “ 1 ； (d) 將步驟（c)所得含rDSPA “ i的洗出液在承載條件下加 土疏水性又互作用樹脂上，使rDSpA α丨選擇性地結合於 疏水性交互作用樹脂上； (e) 視需要，洗滌此疏水性交互作用樹脂，除去非① α 1蛋白質及非蛋白質污染物； (f) 自疏水性交互作用樹脂上選擇性地溶析結合的出卯八 α Λ ； (g) 將步驟（f)所得含rDSPA 的洗出液在承载條件下加 至於親合性層析樹脂上，使①“八a i選擇性地結合於親 (請先閲讀背面之注意事項^^寫本頁) -装·

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五、發明説明（4 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 合性層析樹脂上； (h)視需要，洗滌此親合性層析樹脂，除去非rDSpA a j 蛋白質及非蛋白質污染物； (1)自親合性層析樹脂上選擇性溶析結合的rDSPA α 1， 製成實質上純的rDSPA α 1水溶液。 本發明另一方面是依本申請案之方法分離出並純化的 rDSPA α 1蛋白質。 本發明另一方面係有關含有依本申請案之方法分離出並 、’.屯化的rDSPA α 1及醫藥上可_接受的載劑的醫藥組合物。 本發明另一方面是使用依本+請案之方法分離出並純化 的rDSPA λ 1治療罹患動脈或靜脈血栓的人的方法。 本發明詳述 在本説明及所附申請專利範圍中，除非另有説明，以下 各詞有所示的意義： ”生物培養基"意爲用於在培養中繁殖細胞所用的正確的 鹽及營養劑處方。 ”制約培養基”意馬細胞曾在其内生長的生物培氧基。所 以，此培養基已被細胞的生長所制約，含有細胞生長中排 入此培養基内的產物。此等產物可以是細胞生長所產生的 廢物或蛋白質，係由細胞在生長中所製造並排入培養基内 的。 ”陽離子交換樹脂"意爲天:然的或人造的物質，—般是固 體，能與週邊液體培養基所產生的離子作結合離子的交 換。陽離子交換樹脂具負官能固定離子，.交換正相對^ _____-7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) .裝. 訂

AT B7 五、發明説明（5 ) 子。 1---_---,--~| (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 商業上可購得的陽離子交換器内的碇系團（anchor group) —般是-C6H5〇-，-S03-，-coo·，_P〇3•，或 _As〇3-。較 弱陽離子交換樹脂是陽離子結合強度不高的陽離子交換樹 月EJ ’如有複基或羧基烷基官能度的。此外，弱陽離子交換 樹脂一般是於酸性pH不充分解離的。本發明所用特定的弱 陽離子交換樹脂係由以雙鍵結合於聚乙烯亞胺矽烷上的二 氧化矽顆粒基質所構成，其中聚乙晞亞胺的胺基已由幾基 所衍生。此種樹脂可由J T Baker以商品名WideJ)〇re CBX® 層析樹脂購得。 ”疏水性交互作用樹脂"意爲天然的或人造的物質，一般 是固體，含不帶電子的基團，如甲基、乙基或其他烷基。 此種基團與蛋白質部分上的基團構成疏水鍵，以蛋白質與 樹脂上的基團的交互作用強度爲基礎分離出蛋白質。特定 的疏水交互作用樹脂係由半剛體球形珠構持成，而此球形 珠係由乙二醇與曱基丙烯酸丁酯的聚合物合成。此類樹脂 可由 Toso-Haas 以商品名 Toyo-Pearl® 650M C4 購得。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 "親合性層析樹脂π意爲天然的或人造的物質，一般是固 體，用以純化蛋白質。此樹脂之分離蛋白質係以親合力爲 基礎，而此親合力表現於蛋白質上的基團與樹脂上的基團 之間。於本發明中’用作親合性層析的樹脂是按大小排除 的樹脂’以大小爲基礎分離蛋白質。特定的親合性層析樹 脂是烯丙基葡聚糖與Ν，Ν，-亞甲基雙丙烯醯胺交聯的共聚 物，係珠形，能分離20,000至8,〇〇〇,〇〇〇千道爾頓之間的球 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A? B7 、 五、發明説明（6 ) 形蛋白_質。此類樹脂可由Pharmacia以商品名Sephacryl S-400購得。 "烷基"意爲由碳和氫構成的直鏈或支鏈的單價基團，不 含不飽和的並有一至十八個後原子，例如曱基，乙基，正 丙基’異丙基’（1-曱基乙基）’正丁基.，三級丁基（.1,1-二 曱基乙基），二級丁基（1-甲基丙基），正戊基，正己基，等 等。 實質上純的"一詞使用於rDSPA α 1產物時，係指在本申 請詳述的純化方案中，終純：[匕差物中rDSPA α 1純度大於 8 0 %，較佳是rDSPA α 1純度大於9 0 %，最佳是分離出的 總蛋白質的9 8 %是rDSPA α 1。蛋白質含量及純度係以反 相HPLC及S D S頁膠分析爲基礎。 非rDSPA π 1蛋白質及非蛋白質污染物”意爲除rDSPA α 1之外的出現於用以純化rDSPA α 1的生物培養基内的所 有物質。 . ”醫藥上可接受的賦形劑”意爲可接受的載劑，及任何與 生理條件相容的醫藥上可接受的助劑，爲無毒的並對懸浮 於其内或包括於其内的醫藥组合物的生物活性無不良影 響。適宜的賦形劑可以是類如甘露糖醇，丁二酸鹽，甘胺 酸，或血清部蛋白。 "治療有效量·'意爲rDSPA α 1的量，以此量給予人時足以 進行治療因血栓引起的疾病。構成”治療有效量”的化合物 的量因化合物、疾病狀態及其嚴重性而異，但可由精於此 技藝者根據其知識及本揭示決定。 - _^^_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I----Γ---— — 裝 — I (請先閱讀背面之注意事項本頁)

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AT B7 、發明説明（7 ) , &療（treating)’’或”治療（treatment)，，包括對人疾病的治 療’此疾病以血栓爲其特點，包括： (0預防此疾病發生於人，特別是在此人已有此疾病傾向 但尚未診斷出時；. (II) 抑制此疾病狀態，即阻止其發展；或 (III) 減輕及病狀態，即使疾病狀態退化。 、"視需要的"或，’視需要地，，意爲後面所述的環境事件可能 或不可能發生，此敘述包括該事件或環境發生或不發生 事例。 - 實施例説明 ；' 本發明係有關於以商業規模分離及純化供醫藥調配物使 用的形式的rDSPA α 1的方法。此rDSPA or 1係由發酵能分 DSPA α 1產物至培養基的哺乳動物細胞系生產。收穫 =叻的培養基，即由含哺乳動物細胞的生物反應器製得的 ^培蚕基，以一系列層析步驟由其他蛋白質及污染物分離 、A從1，此系列步驟從使用陽離子交換樹脂開始，繼 〈由樹脂選擇性地溶析rDSPA π 1。錢將由陽離子交 樹脂選擇溶析所得的册A α !载於疏水交互作 ’在由基質作選擇溶析完成二次純化。再將溶析出的 ΡΑ α 1部分載於親合性層析樹脂上，作選擇溶析完成 —步純化。在用習用技術，如超過濾，將純化的出卯 心1濃縮，然後凍乾。 本發明係如下實行。 Α ·分離及純化 本紙張尺度適用巾關家標準（GNS )糾秘（MG/297公楚） -----Γ--— II^II (請先閲讀背面之注意事項^^寫本頁) 訂 A7 ___B7___1 五、發明説明（8 ) 1. 培養基及細胞系 此培養基含適於哺乳動物細胞，如DMEM或Ham's F12， 生長的基礎培養質。特別的培養基是William、E培養基 (Williams, G.M. and Gunn, J.M. Exp. Cell Res., (1974) 89 ： 1 3 9)。作接種生長相時，基礎培養基内一般加血清源，一 般是牛血清（B S )或新生牛血清（C S )，血清濃度爲約0.1 % 至1 〇 %重量比，一般是約1 %至5 %重量比。也可加其他生 長因子或緩衝劑，如HEPES。在灌注生長相中，血清濃度 一般維持於相同濃度，一般是鈞3 %至8 %，更常是約5 %。 適用於本發明的細胞系包括能在懸浮液培養基内非粘連 生長的及/或在微載體珠内粘連生長的哺乳動物細胞系。 符合此要求的特定細胞系包括.中國鼠卵巢（C Η Ο )細胞系， ΒΗΚ 細胞，或 ΗΕΚ293.細胞系（Kr^tzschmer et al., Gene, (1991) 116 ： 281 - 284 ； Petri, T., J. BioTechnology, (1995) 39 ： 75-83) ° 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -----^— I---— II ? / (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 特佳的 CHO 細胞系是DXB11，見 Urlaub, G. and Chasin， L.A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77 : 4216 - 4220 所 述。以表達載體pSVPAl 1及pUDHFRl使細胞共轉染（co-transfected)，此表達載體内分別含DSPA α 1的编碼序列及 鼠二氫葉酸鹽還原酶（Petri，Τ.,同前）。本發明所用轉化 CH Ο 細胞系.是指定的 C D 1 6，存於 American Type Culture Collection，Rockville, Maryland (ATCC)，編號爲 ATCC#CRL 12023 。 2. 培養物之擴大與生產相 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 、發明説明（9 在以融合旋動培養物或其他生物反應器培養物接種後， 知細胞培養物擴展至生產密度，一般是約細胞/ 毫升。 在達微載體珠上的細胞密度後，開始以血清作新鮮培養 基補充灌/主。或者使細胞在懸浮液培養物内生長。新鮮培 養基内血清濃度一般是約2 %至1 〇 %重量比，更常是約.3 % 至8%重量比，更多用的是約5%重量比。開始時灌注率可 爲約0.25至〇_75培養物容積/天，一般是約〇 5培養物容積 /天。隨著細胞生長的增加_，灌注率最初增至約1;5至2.5 培養物容積/天的範圍内，一般約需2至1〇天。在擴展過 程中，將滅菌的、預先平衡的微载體珠加於反應器内，維 持微載體與細胞密度比在約0.5至克微载體珠比1 個細 胞範圍内。較方便是用吸器經樣品線將微載體珠加於反應 器内。 在細胞密度達生產水平後，加至新鮮培養基内的血清可 減少，一般是減至約〇. 1至2.0重量比的濃度，典型的是 1% 〇 須注意生產相中的培養物的多種發酵參數：溫度，p Η， 溶解氧的含量都須每天測定。隨著供應罐中培養基、血 清、及驗之消耗’此等物質須時加補充。制約培養基，如 萷所界定的含產物的培養基，樣品應作常規檢查，至少每 二天檢查一次，以確保產物耒受污染。 使用約100 - 150微孔直徑的篩收取生物反應器内的制約培 養基可使細胞的收穫降至最低。懸浮液培養物使用旋渦流 -12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (锖先閱讀背面之注意事項寫本頁) •裝. 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 Ί 五、發明説明（1Q) 過濾器以維持細胞於生物反應器内。收穫物收取於滅菌容 器内，.在進一步加工前儲存達38天。生物反應器内的 rDSPA π 1係由C Η 0細胞所分泌，已成加工過的形式，具 有充分生物活性，即可純化。 3 .陽離子交換層析 在ρ Η調整至4至6的範圍後，較佳是約5，將制約培養基 内的rDSPA α 1載於陽離子交換基質（一般是管柱形）上，承 載條件是使rDSPA α 1與基質完全結合。由於其他蛋白質 也會被結合，所以第一結合步趣要使制約培養基内的不需 要的或污染的蛋白質及其他成分，如酚紅，不結合於基質 上而流過基質。進一步用選擇溶析由基質純化rDSPA π 1，溶析可以分階段溶析完成，也可以藉增加緩衝液的離 子強度以線性梯度溶析完成。不論是用何種溶析，收取的 rDSPA α 1都依下法進一步純化。 適宜的陽離予基質包括各種由陽離子官能度的樹脂，能 結合rDSPA α 1。較佳的是合成樹脂，如由二氧化矽膠微 粒，交聯瓊脂糖，或交聯聚甲丙晞酸酯聚合物，由陽離子 官能度如羧基，羧基曱基，磺醯基，磷醯基，等構成的樹 脂。特別有用的是較弱的樹脂，如有羧基或羧基烷基官能 度的，如羧基甲基或羧基乙基。特佳的樹脂是係由以共價 鍵結合於聚伸乙基亞胺矽烷的二氧化矽微粒基質構成的， 其聚伸乙基亞胺矽烷的胺基衍生自羧基。此類樹脂是Baker Widepore CBX®(45 毫米珠），可由 J_T. Baker購得。 結合及溶析條件視陽離子樹脂的結合強度而定。如係弱 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- --' (請先閱讀背面之注意事項#/¾寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 ' 五、發明説明（) 陽離子樹.，如Baker Widepore CBX，結合可在低離子強度 在較酸性條件，一般是pH 4-7，較佳是约5，進行。在洗過 基質後，可將基只曝露於高離子強度的移動相選擇性地溶 析rDSPA α 1，可使用線性溶析或分步驟溶析。如係用 Baker Widepore CBX樹脂，可於pH 約 7.5 溶析 rDSPA α 1， 鹽濃度界於約100 mM及500 mM NaCl間。然後將管柱清洗 供下次使用。 較佳是使用Baker Widepore CBX基質，開始時將樹脂以 100 mM醋酸鈉緩衝液，pH 5_，平衡。緩衝液以流速0.2至 2.0管柱容積/分鐘使用於管柱上，直至洗出液的p Η穩定 於5。用1.2微米過濾器過濾含rDSPA π 1的制約培養基， 然後用冰醋酸滴定至ρ Η界於4 - 7間，最佳是5。然後將培 養基載至管柱上，一般是用變速泵，流速不大於2.0管柱容 積/分鐘。並用過濾器除去可能阻塞管柱基質的微粒。然 後用醋酸鹽平衡缓衝液再平衡管柱基質至ρ Η穩定於5，一 般是需2至7管柱容積。然後用含50 mM磷酸鈉的洗緩衝液 載於管柱上，流速0.1至0.2管柱容積/分鐘直至洗出液p Η 穩定於7.5。然後用含5 0 mM的磷酸鈉，500 mM氯化鈉， pH 7.5的溶析緩衝液由管柱溶析rDSPA α 1。用溶析缓衝液 一直洗，直至不能從管柱溶析蛋白質爲止。再用含2.0 Μ 醋酸鈉的洗蘇緩衝液，pH 8，洗管柱備下此使用。儲存缓 衝液含1 0 %醋酸及4 5 %乙醇。 4 .疏水性交互作用層析 然後將由陽離子交換基質收取的rDSPA π 1部分在容許’ __-14-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝. 訂 五 '發明説明（12 rDSPA α 1結合於高離子強度及低？}1的基質的條件下載於 ^水夂互作用基質（一般是管柱形）。然後提高加至管柱的 私動相之有機溶劑濃度採用線性或分段梯度，選擇性地溶 析rDSPA α ：!。收取rDSPA α !部分供進一步純化。此步驟 減少DNA污染1〇〇至1000倍，也使可能的病毒污染物失去 活性。 適宜的疏水交互作用基質包括各種不帶電子的樹脂，有 以共仏相聯的疏水基團，如丙基，丁基，辛基，苯基等。 此樹脂可以是交聯的有機聚今物，如苯乙烯-二乙晞基苯， =氧化矽，瓊脂糖，聚曱丙烯酸酯，或其他各種適宜的微 粒支撑物。特佳的樹脂係由乙二醇及衍生自丁基甲丙烯酸 酯型聚合物的共聚物合成的半剛體球珠。此類樹脂是T〇y〇_ Peail 650M(4 0-90微米珠），可由丁〇5〇_以&5購得。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I----; r---^-- (請先閲讀背面之注意事項^域寫本頁) 結合於疏水性交互作用管柱上是在高離子強度下，一般 是PH 3-5，更常.是约4進行。實質上所有由陽離子交換樹脂 溶析的含rDSPA α 1部分的蛋白質都結合於疏水交互作用 管柱。此各種蛋白質可以與基質上的疏水基團的不同的疏 水乂互作用強度爲基礎作選擇性溶析，即以蛋白質疏水性 的增加順序爲基礎。溶析可用分階段或線性梯度完成，一 般是使用醇洗出液，如乙醇或異丙醇。特佳的醇是己醇。 車义佳是，使用Toyo-Pearl C4基質，平衡可用有50 mM醋 酸鈉，500 mM氯化鈉的平衡緩衝液，pH 4，完成。在由離 子父換管柱收取的rDSPA α 1部分滴定至pH 4後，將其使 用於C 4基質上，然後此基質再用上述缓衝平衡液再平衡。 15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13) 此管柱然後用下述二種緩衝液相繼溶析。第一洗（洗使用 至少二管柱容積的含20 niM HC1的緩衝液？繼續洗至洗出 液不再含蛋白質，此可藉安定的紫外線吸附測知。此基質 再以含1 9 %乙醇，20 niM HC1的不少於1 0管柱容積的缓沖 液洗（洗2)，繼續以含2〇·5 〇/〇乙醇，2〇 mM HC1緩衝液洗， 直洗至溶析不出蛋白質爲止。使用含2 9 %乙醇，2〇 mM HC1的缓街液，PH 2.5，溶析rDSPA π 1產物。溶析產物 後’管柱用不少於二管柱容積的含i〇〇 mM NaOH的缓衝液 洗滌。此管柱用洗1緩衝液儲存-。 5 .親合性層析 二 將由疏水交互作用收取的rDSPA α 1部於容許rDSPA α 1 結合於親基質的條件下用於親基質（一般是管柱形）。在 rDSPA α 1仍結合於管柱時，用2 _ 3管柱容積的2〇 HC1 洗此管柱以溶析污染物。此步驟便於緩衝液交換以助醫藥 調配及溶解度，.也有助於可能的病毒污染物的非活化/除 去。較佳是用2.5管柱容積的缓衝液。然後用含2〇〇 mM甘 胺酸，游離態鹼，的p Η爲4至5的緩衝液選擇性地溶析 rDSPA α 1。收取此rDSPA α 1部分供濃縮。 於本發明中作爲親樹脂用的樹脂是一般用作大小排除的 樹脂。適宜的親基質包括由烷基葡糖及Ν，Ν，-亞甲基雙丙 烯酿胺的交聯聚合物構成的樹脂，爲直徑2 5至7 5微米的珠 开少。特佳的樹脂是Sephacry 400®，可由Pharmacia講得，能 分離介於20,〇〇〇至8,000,000千道耳頓的球蛋白。 rDSPA α 1之結合於親樹脂上是在滴離子強度及低pH條 ___ -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .--Γ--r--秀-- (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) '言 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 Α7 Β7 五、發明説明（14) 件下完成。實質上所有由疏水交互作用樹脂收取的rDSPA «1都結合於此管柱上。可藉升高pH&/或離子強度選擇 性地溶析rDSPA π 1。溶析可用分階段或線性梯度完成， 一般是使用含200 mM甘胺酸，游離態的鹼作洗出液。 較佳是使用Sephacryl S-400基質，平衡可用含i 9 %乙 醇’ 20 mM HC1的缓衝液芫成，直至溶析物ρ η維持不變。 此基質係加至由疏水交互作用管柱收取的rDspA π j部 分’然後用含20 mM HC1的緩衝液洗，直至由溶析物發出 的紫外線信號爲穩定的。結舍的rDSPA從i的溶析係用含 200 mM甘胺酸的緩衝液完成。產物溶析後，管柱用不少於 二管柱容積的含100 mM NaOH的緩衝液洗滌。此基質在用 不少於一管柱各積的洗緩衝.液（2〇 mM HC1 )洗後，以此緩· 衝液儲存基質。 6 .濃縮 本發明純化的蛋白質可再加濃縮，一般是藉過遽等方法 濃縮，事實上也可以凍乾，或加於習用的醫藥製劑内。有 用的濃縮法及凍乾法詳見於科學文獻。 B .調配物 1 ·醫藥組合物 本發明提供有重要價値的試劑，以前述方法純化的 rDSPA α 1，可用於治療動脈及靜脈金栓。 .重組的rDSPA α 1 .，如此處所.述純化的，可給予病人。此 试劑可與其他成分合併供治療使用，例如與習用的醫藥上 可接受的載劑或稀釋劑，以及與生理上無害的安定劑及賦 _ -17- ' I----Γ--,--丨|II 一 (讀先閲讀背面之注意事項ί寫本頁) -s r 千 你 xr- I ' i Λ 1/ η ιΝ < 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 形劑合用_。此等合併物可以作滅菌過遽並以劑量小瓶凉·乾 製成劑形成儲存於安定的水性製劑内。 此試劑的#效治療量決定於許多不同的因素，包括給予 方法，病人的生理情況，及其他給予的藥物。一般而言， 活體外所用的劑量可作爲原位給予此等試劑的量的有用的 指導。給動物治療所用的有效劑量的試驗也可進一步預估 使用於人的適應症的既量。各種考量見，_例如’ Gilman et al., (eds)(1990) Goodman and Gilman's ： The Pharmaceutical Bases of Therapeutics, 8th _Ed., Pergamon Press ； and Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co·, Easton, Penn ·;今都附上供參考。其内及下 面也討論了給予方法’例如’經口給予’靜脈内給予’或 肌肉内給予，經皮擴散等。醫藥上可接受的載劑可包括 水，生理鹽水，缓衝液，及其他於，例如，Merck Index， Merck & Co.，Rahway, New Jersey所述的化合物。以其他所 需纖維蛋白溶酶原活化劑之劑量爲基礎，總劑量可預期爲 80 至 11.0 毫克（Physicians’ Desk Reference，49th ed. (1995),

Medical Ecnomics Date Production Company, pp. 1083 -1085)。 治療調配物可以任何習用的劑量調配物給予。雖則此活 性成分可單獨給予，但較佳是製成醫藥調配物給予。調配 物.含至少一種上述的活性成分及一種或多種可接受的載 劑。每一載劑必須是醫藥上及生理上可接受的，並且是與 其·他成分相容的及對病人無害的。調配物包括適於經口或 -------- -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4W (训X 297公釐） (請先閔讀背面之注意事項寫本肓) -裝- 、17 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（16) 非&財丁（包括皮下’肌肉内，靜脈内及皮内）的調配 物。調配物可方便地製成單位劑形，也可以此藥學技藝週 知的方法裝備。見’例如’ Gilman et al.，如前，及 Remington,如前。 總之，在本發明概述中所述的本發明較佳具體實施例如 下： 一種由生物培養基分離並純化rDSPA沒i的方法，該方法 包括如下的步驟： (a)將pH 5的培養基使用於_陽籬子交換樹脂，此交換樹脂 由以雙價接合於聚伸乙基亞胺石夕燒的二氧化珍顆粒構成， 其中胺基係由羧基衍生，結果使rDSPA π 1選擇性地結合 於陽離子交換樹脂上； (b )用 pH 7.5 的 100 mM NaOAc 及 50 mM NaP04 洗此 pH 5 的陽離予交換樹脂，移除非rDSPA A 1蛋白質及非蛋白質 污染物； (c) 用含50 mM鱗酸鈉及500 mM氯化鈉的還衝液，pH 7·5，由陽離子交換樹脂溶析結合的rDSPA從1 ; (d) 將收取自步骤（c )的pH 4的含rDSP A α 1的洗出液使 用於疏水交互作用樹脂，此疏水交互作用樹脂由共聚合乙 二醇及以丁基衍生的曱丙缔酸酯型聚合物合成的半剛體珠 構成，結果使rDSP A α 1選擇性地結合於疏水交互作用樹 脂； (e) 用20 mM HC1洗疏水交互作用樹脂，然後用含19% EtOH的20 mM除去非rDSPA α 1蛋白質及非蛋白質污染 -19- (請先聞讀背面之注意事項t寫本頁) $ "° \— (ί 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )从規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 ' 五、發明説明（17) 物； (f) 用含29%乙醇及20 ιηΜ鹽酸於pH 2.5由疏水交互作用 樹脂上溶析結合的rDSPA π 1 ; (g) 使用由步驟（f)收取的pH 2.5的含rDSPA α 1的洗出液 於親合性層析樹脂/此親合性層析樹脂係由烯丙基葡聚糖 與Ν , Ν ^亞甲基雙丙烯醯胺的交聯聚合物構成，能分離 20,000至8,000,000千道爾頓的球蛋白質，結果使1〇3卩八“ 1選擇性地結合於親合性層析樹脂上； (h) 用20 mM HC1洗此親合」!生—層析樹脂去除非rDSPA π 1 蛋白質及蛋白質污染物； : (i) 用200 mM甘胺酸的pH 4至5的緩衝液由親合性層析樹 脂溶析結合的rDSPA α 1，製成實質上純的rDSPA α 1水溶 液。 下述特定的製備及實例供實行本發明的指導與幫助，並 非意爲對本發明.範圍的限制。 實例1 ^ rDSPA π 1的細胞培養物製備 將取自DSPA Working Cell Bank的小瓶融化，接種於生長 培養基（WEC 5_0培養基，Williams E改良的）内由5%牛血 清的滾瓶（roller bottle )内。在二星期内將細胞擴展入4個 滚瓶内，將細胞由滚瓶胰蛋白酶化（trypsinized)，接種於 四個1公升的旋轉燒瓶内，接著密度爲4x 108細胞/公升生 長培養基。四天後，將此四個旋轉瓶内的培養物接種於10 公升的生物反應器。於接種的當天將另外1公升生長培養 _-20-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -----Λ'------裝-- -3- .! . (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁)

*1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（18) 基加於生物反應器培養物内。第二天’生物反應器内裝入 10公升生長培養基。依此方案，用或不用微載體珠作二種 培養。培養基p Η控制於7_0 - 7.4，一直用散佈系統維持充 氣。溫度維持於3 4 - 3 9 °C。 接種當天生物反應器内細胞的密度是8, ix 1 〇5細胞/毫 升，二天後細胞密度加倍，此時灌注速率定於0.5培養容積 /天（c v /天）。灌注速率隨細胞密度增加，這樣在生物反 應器接種後第九天細胞密度已達6.2x10 6細胞/毫升，灌注 速率也增至2 cv/天。 _ 然後將生物反應器換成生產嬉養基（WEC 5.0培養基内有 1 %牛血清），二天後開始收取生物收穫，繼續長達丨〇星 . 期。於此生產相中，平均細胞密度爲丨5 χ 1 0 6細胞/毫升， 有約7 5 %存活。平均rDSPA “I生產爲40毫克rDSPA “ 1 / 公升，平均特異生產率爲6皮克rDSPA α 1 /細胞/天。 發酵各積之擴展係藉將一個反應器内一半的内容物轉移 至另一反應器達成。二生物反應器内都置有生產培養基， 以2cv/天罐注，立即開始收取產物收穫。 實例2 rDSPA π 1之純化 1.陽離子交換層析（管柱Α)。將生物反應器收穫儲於周邊 溫度（1 5 - 2 5 °C )。然後用〇 45微米過濾器過滤，再載於陽 離子交換管柱上。以管柱層·析步驟開始收穫物的純化，用 J.T. Baker製的CBX樹脂（管柱A)。此一步驟完成重要的蛋 白質純化。 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項ί寫本頁) -裝. 訂 AT B7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（19

管枉A緩衝液含有緩衝液A 1 :平衡缓衝液（5〇 mM

Na〇AC ’ PH 5 〇)，緩衝液 A2 :洗缓衝液（50 mM NaPCU， pH 7.5) ’ 緩衝液A3 :溶析緩衝液（5〇 NaP〇4，5〇〇 mM NaCl ’ pH 7.5)，緩衝液A4 :洗滌緩衝液（2Μ ，pH 8.0)及缓衝液A5 :儲存緩衝液（45% Et〇H，1〇% H〇Ac)。 下述官柱操作參數適於裝有6公升樹脂及管柱容積爲15 公升的嘗柱。每次操作時加至管柱上的rDSPA “ 1不能超 過4.5克。管柱的載流速度大於2公升/分鐘，也不大於2〇 磅/吋2官柱壓。管柱及監埤器的規格須在每次操作前檢 查。於使用前載物料及層析緩橋液都須用氦擴散去氣。 生物反應器收穫物用1 2毫米過濾器過濾，然後使用冰醋 酸滴定至pH 5.00 (±〇.1〇)。載前，管柱用不少於3〇公升的 缓衝液A 1平衡至流出物p H爲5,00 ( ± 2.0 )。管柱一但平衡 後，即將收穫物載於管柱上。此管柱再用不少於8 〇公升的 缓衝液A 1平衡。在流出物ρ η爲5.00 ( ± 2.0 )並達紫外線底 線後’此管柱再作適宜的再平衡。用不少於145公升的緩 衝液Α2洗此管柱。在流出物pH爲7.50( ± 2.0)並達紫外線 底線時，適宜地洗此管柱。 用不少於3 0公升的緩衝液A 3由管柱上溶析產物，收取入 另一容器内。在安定的紫外線底線出現時便認爲溶析已完 全。溶析產物後，用不少於3 0公升的缓衝液a 4洗滌此管柱 至安定的紫外線底現出現。再將管柱清洗供下次使用（不能 使用5 0次以上）。蔣管柱A產物儲存於2 - 8 °C。平均收取率 爲9 3 %，溶析物平均（蛋白質）純度爲8 1 %。_ -22- 私紙張尺度適用中國國家搞準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- il.--1... (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 訂 Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（20) 2 _疏水叉互作用層析（管柱b ):於c b X樹脂上作層析 後’用C4疏水交互作用樹脂（T〇s〇_Haas)(管柱B)層析 rDSPA α 1產物。此步驟促使除去非蛋白質污染物並有助 於可能有的病毒污染物之非活化/除去。管柱Β緩衝液包 括缓衝液Β 1 :平衡緩衝液（50 mM NaoAc，500 mM NaCl， pH 4.0)，缓衝液B2 :洗及儲存缓衝液（2〇 mM HC1)，缓衝 液B3 _·溶析緩衝液（20 mM HC1，19% EtOH)，缓衝液 B4 :洗緩衝液（20 mM HC卜20.5% EtOH)，缓衝液B5 :溶 析緩衝液（20 mM HC】，29.5> EtOH)，及缓衝液B6 :洗務 緩衝液（0.1 N NaOH)。以下管柱操作參數適於管柱容積j 5 公升。每次操作可於管柱上載不多於9克的rDSPA Λ 1。管 柱的載流速爲不多於2公升/分鐘，管柱壓不大於丨5時/ 吋2。管柱及監視器的規格須在每次操作前檢查。 加至前，將管柱平衡至流出物pH爲4.00 (±〇·2〇)。用冰 醋酸將管柱溶析物滴定至pH 4_ 00 ( ±0.10)，去氣，加至。 再用不多於3 0公升的緩衝液B 1將管柱再平衡至流出物p H 爲4_00 ( ± 0·20 )及達安定紫外線底線。此管柱用三種缓_ 液洗。第一次洗使用不多於45公升的緩衝液Β2。在流出物 ρ Η爲1.90( ± 0.20 )及達安定紫外線底線時適宜地洗管柱。 第二次洗管柱用不多於145公升的缓衝液B3，洗至達安定 紫外線底線。第三次用不多於30公升的緩衝液B4洗，在達 安定紫外線底線時即洗完。’ 以不多於30公并的緩衝液b%由管柱上溶析rDSPA以i， 收取入另一容器。溶析至達安定紫外線底線。然後清洗管 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4雜（210X2.97公釐） :----—裝丨· (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) -訂 五、發明説明（21) AT B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 柱以備下次使用（重複使用不超過50次）。管柱B產物（或溶 析物）存於2 - 8 C ’存儲時間距下次使用不超過丨5天。平均 回收爲9 1 % ’溶析物平均（蛋白質）純度爲9 7 %。 3.親合性層析管柱c)。然後用Sephacry s_4〇〇 (Pharmacia).(管柱C)將管柱B產物作層析。此步驟促進緩衝 液交換以助調配，並有助於病毒污染物的非活化/除去。 此管柱c緩衝液包括緩衝液C1 :平衡緩衝液（2〇mMHci， 19% EtOH)，緩衝液C2 :洗缓衝液（2〇 mM Ηα)，緩衝液 C3 :落析及儲存緩衝液（2〇〇_mM甘胺酸，滅菌過濾的）， 及緩衝液C4 :洗滌緩衝液（〇 1N Na〇H)。以下管柱操作參 數週於管柱答積1〇公升。每次操作可於管柱上載不多於 克的rDSPA α 1。管柱的载流速爲不多於〇 5公升/分鐘， 管柱壓不大於叫收集—或多次管㈣操作的溶析 物，然後用一份緩衝液C2及二份缓衝液5溶析物稀釋。最 終乙醇濃度約爲.1 9 % 〇 〇 加至前，用不多於15公升的缓衝液C1平衡管柱至流出物 的ρΗ=ι.80 (土 〇.20)。加至後，用不多於3〇公升的緩衝液 C2洗管柱。在紫外線信號安定後適宜地洗管柱。用不多於 20公升的缓衝液C3由管柱溶析產物，收集入另—容器。产 析繼續至達安定紫外線底線。 ^ 產物溶析後’用不少於12公升的缓衝液C4洗務柱，儲存 備下次使用，重複使用不超過20次。用緩衝液c3將管柱c 產物稀釋至濃度d毫克/毫升，除存於厂代，以被進一 步加工” DSPA d平均回收爲97%，溶析物平均（蛋白質） 本紙張尺度適用中國國家標準（cns) A4^m I-----I--— 裝-- (請先閱讀背面之注意Ϋ項寫本頁) 訂 m • - HI I. i · • ml t 1 · ——. -24- A7 -*-- - —_ B7 1 五、發明説明（22) 純度爲9 8 %。 上述對S-400親管柱溶析物的純化步驟完成後，在儲存 不多於70天内進行濃縮及調配步驟。集中管柱c溶析物， 乂螺旋超過濾膜濃縮，除去低分子量物質（3 〇,〇〇〇道爾頓以 下）。收集產物於無熱原的容器内，使其濃度大於8亳克/ 毫升。加甘露糖醇至其終濃度爲4%。 加碉配緩衝液（200 mM#胺酸，4%甘露糖醇（重量//重 量）），使批量調配的產物濃度至7.5毫克毫升。然後將批 量έ周配產物滅菌過濾，分裝衿小瓶内並凍乾。 雖則本發明已用特定的具體會施例作了説明，精於此技 藝者應了解到，但還可作各種改變或以相似物替代而仍不 離本發明精神及範圍。此外，還可作多種修改及用類似物 替代而仍不離本發明精神及範圍。而且，還可作多種修改 以適應特定情況、物料、物質組合物、加工，加工步骚以 達本發明目的、精神及範圍。所有的此類修改都在所附本 發明申請專利範圍内。 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印袋 -J*. -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210X297公釐）

Claims (1)

1. 111545.號專利申請案

   申請專利範圍 h —種自生物培養基純化rDspA α 1的方法，此方法包 括： (a) 在承載條件下將培養基加至陽離子交換樹脂上， 結‘果使rDSPA α 1選擇性地結合於陽離子交換樹脂上； (b) 視需要，洗滌此陽離子交換樹脂，除去非rDspA α 1蛋白質及蛋白質污染物； (c) 自陽離子交換樹脂上選擇性地溶析結合的①卯八 a 1 ; (d) 將步驟（c)所得含rDSPA α 1的洗出液在承載條件 下加至疏水性交互作用樹脂上，使rDSPA α 1瓔擇性地 結合於疏水性交互作用樹脂上； (e )視需要’洗務此疏水性交互作用樹脂，除去非 rDSPA ο: 1蛋白質及非蛋白質污染物； (f) 自疏水性交互作用樹脂上選擇性地溶析結合的 rDSPA a 1 ; (g) 將步驟（f)所得含rDJ..EA α 1的洗出液在.承載條件 下，:加至親合性層析樹脂上，使rDSP A α 1選擇性地結合 於親合性層析樹脂上； 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 ----------U-尽--, (讀先閎讀肯面之注意事項再填寫本頁) ,tT UK (h) 視需要’洗滌此親合性層析樹脂，除去非rDSpA « 1蛋白質及非蛋白質污染物； (1)自親合性層析樹J旨'士選擇J生—地溶析結合的rDSPA ' « 1，製成脊質上純的rDSPA α 1水溶液。 2. *據申讀專利範圍第i項之方法，其中生物培養基是制 約培養基。 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐）

   111545.號專利申請案

   申請專利範圍 h —種自生物培養基純化rDspA α 1的方法，此方法包 括： (a) 在承載條件下將培養基加至陽離子交換樹脂上， 結‘果使rDSPA α 1選擇性地結合於陽離子交換樹脂上； (b) 視需要，洗滌此陽離子交換樹脂，除去非rDspA α 1蛋白質及蛋白質污染物； (c) 自陽離子交換樹脂上選擇性地溶析結合的①卯八 a 1 ; (d) 將步驟（c)所得含rDSPA α 1的洗出液在承載條件 下加至疏水性交互作用樹脂上，使rDSPA α 1瓔擇性地 結合於疏水性交互作用樹脂上； (e )視需要’洗務此疏水性交互作用樹脂，除去非 rDSPA ο: 1蛋白質及非蛋白質污染物； (f) 自疏水性交互作用樹脂上選擇性地溶析結合的 rDSPA a 1 ; (g) 將步驟（f)所得含rDJ..EA α 1的洗出液在.承載條件 下，:加至親合性層析樹脂上，使rDSP A α 1選擇性地結合 於親合性層析樹脂上； 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 ----------U-尽--, (讀先閎讀肯面之注意事項再填寫本頁) ,tT UK (h) 視需要’洗滌此親合性層析樹脂，除去非rDSpA « 1蛋白質及非蛋白質污染物； (1)自親合性層析樹J旨'士選擇J生—地溶析結合的rDSPA ' « 1，製成脊質上純的rDSPA α 1水溶液。 2. *據申讀專利範圍第i項之方法，其中生物培養基是制 約培養基。 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） ABCD 六、申請專利範圍 (諳先閨讀背面之注意事磺再填寫本頁) 3. 根據中請專利範圍第η之方法，其中步驟⑷所用陽 灕子叉換樹脂係由石夕膠顆粒，交聯缓脂糖，或交聯聚 甲基丙烯酸醋聚合物，經羧基或羧基燒基衍化所構 成。 4. 根據中請專利㈣第3嚷之方法，其巾陽離子交換樹脂 =由共價結合於聚伸乙基亞胺矽燒的二氧化梦題粒基 貝所構成，其中聚伸$基亞胺矽烷的胺基係經羧基衍 化。 .' .Λ 5. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中步驟⑷之承載 條件包括添加pH 4及7之培養基。 6·根據申請專利範圍第4項之方法，其中步驟（c)中 rEiSPA α 1之溶析係使用含5〇 mM·釀卸及ι〇〇至 5〇〇 mM如〇的緩衝液，或等離子強度的緩衝液進 行。 7.根據申請專利範圍第i項之方法，其中步驟之疏水 性父互作用樹脂是不帶電的樹脂，經丨_ 1〇個碳長度的 垸基鏈或芳基烷基衍化。 8_根據申請專利範圍第7項之方法，其中不帶電的樹脂係 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由矽膠顆粒，交聯瓊脂糖，或交聯聚甲基丙烯酸酯聚 合物構成。 9. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中不帶電的樹脂係 由乙二醇及經丁基衍化之甲基丙烯酸酯型聚合物共聚 合合成的半剛體球形珠構成。 10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中步驟（d)的承載 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4現格（21〇χ297公董） B8 385S1S g ) 六、申請專利範圍 條件包括添加來自步騾（Ο之pH 3至5之洗出液。 11.根據申請專利範圍第9項之方法，其中步驟（d)的承載 條件包括添加含在50 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，以磷 酸調整至pH 4，或含在等離._子.強.度的_缓_惫液內之步驟 (_ c )之洗出液。 1Z根據申請專利範圍第9項之方法，其中步瘦(d)的溶析 係使用含20 mM HC1及乙醇濃度大於25 %的缓..街液進 行。 13. 根據申請專利範圍第I.2 .望_.之'方法，其中乙醇濃度為 28.5 %至3 0%之間。 14. 根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中乙醇濃度為 2 9%。 15. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（g)之親合 性層析樹脂係由烯丙基葡聚糖及N，N 1 -亞甲基雙丙晞 基酿胺之父聯共聚物構成，為直徑2 5至7 5微米的珠 形。 16. 稂據申請專利範園第丨5項之方法，其中珠子能分離 20,〇〇〇至8,〇〇〇,〇〇〇千道爾頓的球形蛋白質。 經濟部中央標準局消費合作社印製 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Π.根據申請專利範圍第15項之方法，其中步騾（g)之承载 條件包括哥、加來自，步驟（f)之pH 1至4的洗出液。 18·根據申請專利範園第1 5項之方法，其中步驟（丨）之溶析 '是使用含200 mM甘胺酸的pH 3至6的緩衝液，或等離 子強度的緩衝液進行。 19‘根據申請專利範圍第i項之方法，其還包括濃縮出讣八 -尺度適用中國國家標準（CNS )八概^· ( 210X297公董） A8 B8 C8 D8 38SS1E. 六、申請專利範圍 α 1之水溶液。 2〇.根據申清專利範圍第1 9項之方法，其還包括冷凍乾燥 該濃縮的rDSPA α 1溶液。 21. 根據申請專利範圍第！項之方法，其遘包括濃縮rDspA β 1之水溶液及冷凍乾燥該濃縮的rDspA 1溶液。 22, 根據申請專利範圍第j項之方法，其电此方法包括如下 步騾： (a)將pH 4至7的培養基加至陽離子交換樹脂上，而 此陽離子交換樹脂係由矽膠顆粒，.交聯瓊脂糖，或聚 甲基丙烯酸酯交聯聚合物經農基或羧基烷基衍化構 成，結果使rDSPA α 1選擇性地結合於陽離子交換樹脂 上； .(b)視需要’洗滌此陽離子交換樹脂，除去#rDspa .α 1蛋白質及非蛋白質污染物； / (C)用含50瓜吣磷酸麵及100 mM至500 mM氯化鈉的 缓衝液’或等離孝...強度缓衝液，自陽離子交換樹脂上 選擇性地溶析結合的xDSP A α 1 ; (d) 將步驟（c )所得含rD,spA α j的ρΗ 3至5洗出液加 至由矽膠顆粒’交聯瓊』旨雙，或交聯聚甲基丙雄酸酯 聚合物構成的疏水性交互作用樹脂上，使rDspA α 1選 擇性地結合於疏水性交互作用樹脂上； (e) 洗務此疏水性交互作用樹脂，除去非—a α 1 '蛋白質及非蛋白質污染物； (q用含20 mM HC1且乙醇濃度大於2 5 %的屢衝液自 -4- 本‘·.錄尺度通用宁國國家標準（c叫祕秘（2i〇x297公董） (靖先鬩讀背面之注意事咦再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 A8 B8 C8 D8 '申請專利範圍 疏水性叉互作用樹脂上選擇性氣溶析結合的rDSP Α α 1 ； (g)將步驟（f)所得含rDSPA α 1的ρΗ 1至4的洗出液 加至直徑25至75微米的由婦丙基葡聚履及N，N,_亞甲 基雙丙缔酸胺的交聯聚合物構成的珠形親合性層折辦 脂上，使rDSPA α 1選擇性崎轉合於雜合性層析趟脂 上； ' 〜…— (h )視零身，诜蘇親合性層析樹脂，除去非rDsp a α 1蛋白質及非蛋白質污染物； (.i)用含200 mM甘胺酸.的pH 3至.6的缓、衝液，或等離 子強度的缓衝液自.親舍性層析螂脂上選擇性地溶析結 合的rDSPA α 1，製成實質上純的rDSPA j hjc溶液。' 23. 一種自主物垮養基中分H純化rDSPA α 1的方法，此 、方法包括： (a )將pH 5的培養基加至陽離子交換樹脂上，此陽離 子父換樹脂由共價鍵合於聚伸乙基亞胺矽烷的二氧化 石夕顆粒基質構成’其中胺基已由羧基衍化，結果使 ,rDSPA α: I選擇性地結合梦陽離子交換樹脂上； (b) 用 pH 7_5 的 100 mM Na—Q—Ac 及 50 mM NaPCV洗務 pH 5的陽離子交換樹脂，除去非rDSpA α 1蛋白質及非 妻白質污染物； Γ (c) 用含50 mM鱗酸鈉及500 mM氯化鈉的pH 7.5的缓 衝液，自陽離子交換樹脂上選擇.性地溶析結合的 rDSPA a 1 ； 私紙银尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） ί讀洗閣讀^面之注意事預再镇寫本頁} ---'」上------1T------^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 8 1 -8 ABCD 六、申請專利範圍 (d)將步騾（c )所得含rDSPA α 1的pH 4的洗出液加至 疏水性交互作用樹脂上，此疏水性交互作用樹脂由乙 二醇及經丁基衍化的甲基丙婦酸酯型聚合物共聚.合合 ^成的半剛體球形珠構成，結果使rDSPA α 1選擇性地結 合於疏水性交互作用樹脂上； (e )用20 mM HC1然後用含19%.卫tOH的20 mM HC1洗 務此疏水性交互作用樹脂，除去非rDSPA α 1蛋白質及 非\蛋白質污染物； (f) 用含29%乙醇及20 mM鹽酸於pH 2.5的缓衝液自 ...疏水性交互作用樹脂上溶析結合的rDSPA α 1 ; (g) 將步騾（f)所得含rDSPA α 1的pH 2_5的洗出液加 至由烯丙基葡聚糖及N，N’-亞甲基雙丙烯醯胺的交聯 聚合物構成的親合性層析樹脂上，此交聯聚合物分離 20,000至8,000,000千道爾頓的球形蛋白質，使山3?八 α 1.選擇性地結合.於親合牲層杯樹脂上； (h) 用20 mM HC1洗此親合性層析.樹脂’除去非 rDSPA α 1蛋白質及非蛋白質污染物； 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (讀先《讀背面之注意事項再填寫本頁) (i) 用200 mNl甘.胺酸的..ρ_Η 4至5的缓衝兔自親合性層 析樹脂上溶析結合的rDSPA α 1，製成實質上純的 rDSPA α-l水溶液。 -6 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）