JPH02312588A - 細胞の培養方法及びプロテアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、動物細胞の培養方法及びプロテアーゼの製造
法に関する。

従来の技術 動物細胞を、インビトロで培養する目的の一つとして、
該細胞の産生ずる生理活性物質やその他の存用蛋白質の
分離・採取が知られている。一般的に動物細胞からの有
用蛋白質の産生量は極めて微量であることが多く、この
産生量の増大は重要な課題である。動物細胞のインビト
ロでの培養において、特に培養液から有用蛋白質の分離
・採取を行う場合には、培養用培地の組成が問題とされ
ることが多い。培養用培地組成としては種々のものが知
られている。多くの場合血清、特に子牛或は牛胎児から
得られる血清が培養用培地に添加されて使用されている
。これらの血清は高価であり、血清自体のロフトの同一
性を欠く欠点がをる。また微量の有用蛋白質を分離・精
製するには、培地への添加物がすくなければすくないほ
ど望ましい。

このような技術的課題を解決するために、プロテアーゼ
阻害剤を培地に添加する方法（特公昭６２−３８３２５
、特開昭６ｌ−１９４８６）が提案されている。しかし
、これらの方法は高価なプロテアーゼ阻害剤を回収・再
使用できないという欠点が有る。

発明の解決しようとする課題 本発明の目的は、動物細胞の培養において有用蛋白質の
取得量を安価な方式で増加させる方法を提供することに
ある。本発明の他の目的は精製工程を簡素化する方法を
提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明者らは、動物細胞の培養において種々の培養方法
及び有用蛋白質の分離・精製法を検討し、固定化プロテ
アーゼ阻害剤を培養液に接触させることにより上記課題
が達成されることを見いだし、この知見に基いて本発明
を完成した。すなわち本発明は、 （１）動物細胞の培養に際して、その培養液を１、固定
化プロテアーゼ阻害剤に接触させることを特徴とする細
胞培養方法。

（２）プロテアーゼ阻害剤が、ペプスタチン類である第
（１）項記載の方法。

（３）人の組織から分離された細胞のクローンであって
組織培養用培地で増殖し、かつ次の性質を有するプロテ
アーゼ： ■フィブリンを分解する活性を有し； ■ゲル濾過法で約１７万、ＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動法で約８．３万の分子量を示し；■ペプスタチン
Ａ、で阻害され、ふつ化フェニルメチルスルホニル（Ｐ
ＭＳＰ）　、Ｐ−クロロ安息香酸第二水銀（ＰＣＭＢ）
　、１．２−エボキン−３−（Ｐ−ニトロフェノキシ）
−プロパン（ＵＰＮＰ）、０−フェナントロリンおよび
ロイペプチンにより阻害されない。

を産生する能力を有するヒト由来細胞株を培養するに際
して、その培養液を、固定化プロテアーゼ阻害剤に接触
させることを特徴とする細胞培養方法。

（４）第（３）項記載のプロテアーゼを産生ずる能力を
存するヒト由来細胞株を培養するに際して、固定化プロ
テアーゼ阻害剤に培養液を接触させ、該固定化プロテア
ーゼ阻害剤より該プロテアーゼを回収することを特徴と
するプロテアーゼの製造法に関するものである。

本発明において゛培養液°゛とは、動物細胞の培養にお
いて、その中で動物細胞が生育している液状物のことで
あり、その中には培地成分のみならず、細胞からの代謝
成分、産生成分など数多くの成分が含まれている。

本発明で使用される固定化プロテアーゼ阻害剤はプロテ
アーゼ阻害剤を培養液に不溶性の担体に共存結合するこ
とにより得られる。培養液に不溶性の担体は、水不溶性
の担体であればいずれでも良い。水不溶性の担体として
は、例えば、ボリアチリルアミド等の合成高分子や、セ
ルロース、アガロース、デキストラン、キトサン等の天
然高分子を架橋したもの、多孔性ガラス等の無機物が挙
げられる。担体には、アミノ基やヒドロキシル基等のカ
ルボキシル基と共有結合しうる官能基が含まれているこ
とが好ましい。この場合、スペーサーが存在しても良い
。スペーサーとしては、通常用いられるメチレン基が２
個から６個存在するものでもよい。

担体に共有結合させるプロテアーゼ阻害剤としてはペプ
スタチン類が挙げられる。その中で、Ｃ末端がカルボキ
シル基である事が好ましい。例えば（３Ｓ、４Ｓ、）−
４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプクン酸を
ＡＩＩＭＨＡ　と略記すると、アセデル−アラニル− ル−ＡＨ旧ＩＡ．アセチル−ハリルーＡＨ旧＋Ａ　、バ
リル−ハリルーＡＩＩＭＨＡ　、イソバレリル−バリル
−バリル−＾ＩＩＭＩＩＡ　、ハリルーＡｌｌ旧ＩＡ　
　−アラニル−ＡＩＩＩＡ　。

アセチル−ハリルーＡＨ旧（Ａ−アラニル−ＡＩ（Ｉｎ
、イソバレリル−バリル−Ａｌｌ旧ＩＡ　−アラニル−
Ａ　ＩＩ　Ｍ　Ｈ＾、イソバレリル−バリル−ハリルー
ＡＨ旧（Ａ−アラニル−Ａ　Ｈ　Ｍ　ｌ（　Ａおよびヒ
ドロキシペプスタチン等が挙げられる。担体との結合は
ペプスタチン類のＣ末端のカルボキシル基と担体または
スペーサ上の官能基とを共有結合することによる事が好
ましい。この場合、カルボキシル基を予め、例えば、Ｎ
−ヒｌＩ：ｌキシコハク酸で活性エステルにして反応さ
ゼてもよいし、１−エチル−３−（　３−ジメチル−ア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等で、ペプスタチ
ン類のＣ末端のカルボキシル基と担体またはスペーサ上
のアミノ暴とを直接反応させてもよい。

担体上のプロテアーゼ阻害剤の担持量は、担体の形態に
も依るが、１戚容積当り０．１　〜１０μｍｏｌｅが好
ましい。更に好ましくは、１　ｍｌ容積当り０．５〜５
μｍｏｌｅである。

担体の形態は、粉末状、ビーズ、ベレット、膜状などい
ずれであってもよく、いずれにするかは、培地と固定化
プロテアーゼ阻害剤との接触方式〇こより主に決められ
る。

本発明の方法の実施に当たって、培地と固定化プロテア
ーゼ阻害剤との接触は種々の方式によることが出来る。

例えば、細胞を培養している系中に固定化プロテアーゼ
阻害剤を存在させてもよい、その場合細胞と固定化プロ
テアーゼ阻害剤とが直接接触しないように、培養液と固
定化プロテアーゼ阻害剤とを接触することが望ましい。

また培養系から培養液を取り出して、予め固定化プロテ
アーゼ阻害剤を充填したカラムに該培養液を流すことに
より接触させた後の培養液を再び培養系へ戻すことによ
ることもできる６該カラムに培養液を通過させるときの
流速はカラムの形状、担体の形態・性状等にも依るが、
０．０３〜１０ｍ／ｃｆｌ・分であることが好ましい。

上記いずれの場合でも培養液と固定化プロテアーゼ阻害
剤との接触は連続的に行うこともできるし、間欠的に行
うこともできる。

該接触時の温度としては０°Ｃ〜３７°Ｃで良いが、培
養系に戻す培養液の温度としては可及的に細胞培養の温
度である３７゛Ｃ近辺であることが好ましい。

本発明に用いられる細胞としては、ペプスタチンにより
阻害されるプロテアーゼの産生細胞であり、好ましくは
、本発明に記載のプロプアーゼを産生ずる細胞が挙げら
れる。

本発明のプロテアーゼの製造に使用する細胞は、本発明
のプロテアーゼを産生ずるものであればいずれでもよい
。例えばヒト膵癌由来細胞株、ＮＰＣ−ＹＯを挙げるこ
とができる。該細胞株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に昭和６３年４月２６日付で寄託され、受託番号：
微工研菌寄第１０００３号（　ＦＥＲＭＰ−１０００３
＞が付与されている。

本発明の培養のために用いられる培地としては血清培地
でも良いが、無血清培地を用いる場合にその効果が顕著
である。かかる無血清培地としては、動物細胞の培養に
開発され使用されている合一９＝ 成培地であればいずれでも良い。例えば、イーグルｌ’
ｌＥＭ培地、イーグルＢＭＥ培地、、ダルヘノコ変法イ
ーグル培地、イスコツ培地、！、−１５培地、マノコイ
５Ａ培地、１９９培地、Ｆ１０培地、ハムＦ　１２培地
、ｌ？ＰＭ１１６４培地等、或はこれらを混合した培地
が挙げられる。更にこれらの培地に細胞の増殖に有効と
考えられている因子、例えば、インシュリン、トランス
フェリン、ステロイドホルモン、エビダーマルグロース
ファクター、ファイブロブラストグロースファクター、
エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、亜セレ
ン酸ナトリウム等を必要に応じて添加した培地が挙げら
れる。また無血清培地として市販されている培地、例え
ば、１１Ｂ−１０２培地（ハナ・メディア社製）　、Ｈ
Ｌ−１培地（ベントレフト社製）　、ＡＳＦ培地（味の
素社製）、ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬社製）等を用いる
こともできる。

本発明の培養方法の実施にあたっては、通常、培養に用
いられる培養容器または大量培養用に考案された装置が
用いられる。例えば、マルヂウエルフレ−）、シャーレ
、培養フラスコ、スピンナーフラスコ、ジャーファメン
ター、ローラーボトル、ホローファイバーまたは杉野幸
夫編集による「細胞培養技術」　（講談社発行：　１９
８５年）の１３７〜１５０頁に記載されている装置等が
挙げられる。

培養時の温度、雰囲気等は、通常、動物細胞の培養で用
いられる条件で良い。例えば、炭酸ガスインキュベータ
ー内で、気相を炭酸ガス濃度を５％の空気にした、３７
°Ｃの状態が挙げられる。

培養液を接触させた固定化プロテアーゼ阻害剤から第（
３）項記載のプロテアーゼを回収するには、該固定化プ
ロテアーゼ阻害剤を適当な緩衝液等で洗浄後、塩濃度を
上昇したり、ｐＨを下げた緩衝液で溶出することにより
成し遂げられる。例えば、カラムに固定化プロテアーゼ
阻害剤を充填し培養液を流す。該カラムを、０．２Ｍの
食塩を含むｐｌ＋７．５のリン酸緩衝液でカラム体積の
２〜１ｏ４＠量を流速０．０３〜２０　ｍｌ、　／　ｃ
ＴＭ・分で流すことにより洗浄する。次に、Ｈｌの食塩
を含むｐＨ５，０リン酸緩衝液を流速０．０３〜２０　
ａｌｌ　／　ｃｉ・分で流すことにより該ブロチアーゼ
を溶出することが出来る。この場合０、０３〜５　ｎｉ
ｌ　／　ｃｒＡ・分の低流速で溶出することが、該プロ
テアーゼの希釈を防ぐことがらより好ましい。更に必要
に応じて、通常の方法を組み合わせて該プロテアーゼを
精製することが可能である。

例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気
泳動法などの方法を単独で、あるいは適宜組み合わせて
行うことができる。

実施例 以下本発明を更に具体的に説明するために実施例を記載
するが、本発明はそれに限定されるものでない。

実施例１〔固定化プロテアーゼ阻害剤の調製法〕ペプス
タチン（２７４ｍｇ）をＮ−ヒドロキシコバ／）酸（９
６＋ｎｇ）でジメチルホルムアミドを溶媒（３０ｍｌ　
）としてジシクロへキシルカルボジイミド（１６８ｍｇ
）にて４°Ｃ，，１６時間反応させエステル化した。Ａ
ｌ１−セファロース４　Ｂ　（１５ｇ）を蒸留水で膨潤
させた後、グラスフィルター上で濾過し、無水のジオキ
サンで、十分に洗浄した。次に、反応容器に上述のＡ）
Ｉ−セファロース４Ｂを３０ｍ１の無水のジオキサンに
懸濁させ、ペプスタチンとＮ−ヒドロキシコハク酸のエ
ステル化物のジメチルホルムアミド溶液３０ｍ１を加え
、振盪しながら室温で２４時間反応した。

反応後ゲルをジオキサンとジメチルホルムアミドの混合
溶媒でよく洗浄した後、ＩＭの食塩水、次にリン酸緩衝
食塩液（ＤＬＩ　ｌ　ｂｅｃｃｏのＰＢＳ（−））でよ
（洗い、４°Ｃで保存した。使用時には必要に応じて培
地で平衡化した後月いた。

実施例２ ヒト膵癌由来細胞株ＨＰＣ−ＹＯをハムＦ１２培地（ペ
ニシリン１００ｕｎｉｔｓ　／　ｔｉｔ、ストレプトマ
イシン１００μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウムＩ　Ｘ
ｌ０−”Ｍおよび重曹Ｌ１ｇ／ｌを含む）を５０ｍ２分
注した培養用フラスコ（コーニング社製Ｎｏ、２５１２
６）に細胞数１．５×１０５７ｍ１となるように接種し
、３７°Ｃ１５％炭酸ガスインキュベーター中で培養し
た。３日目より２４時間毎に、培養液を実施例１で作成
した固定化プロテアーゼ阻害剤１０ｍ！の入ったガラス
製のカラムに約５ｍ２／分で通過した後、再び培養フラ
スコに戻した。この操作を４日間繰り返した後、カラム
を０．２Ｍの食塩を含む９Ｎ７．４　の２０ｔｎＭ’Ｊ
ンＭ緩衝液で十分に洗浄した。次に１門の食塩を含むｐ
Ｈ５，０の２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出された分画を集
めた。この分画を限外濾過膜で濃縮して、特許請求の範
囲第三項記載のプロテアーゼを精製したものについて既
に作成しである抗血清（ウサギ）を用いた一元放射状免
疫拡散法（ｓｉｎｇｌｅ　ｒａｄｉａｌ　ｉｍｍｕｎｏ
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　：　５ＲＩＤ）により測定した。

プロテアーゼの排量は６．７μｇであった。

比較例１ 上述の例において、培養途中での固定化プロテアーゼ阻
害剤による処理をのぞいた条件での実験を行った。６日
目に培養液を実施例１の固定化プロテアーゼ阻害剤１０
戚の入ったガラス製のカラムに通した後、０．２Ｍの食
塩を含むｐ）１７．４　の２０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液で十
分に洗浄した。次にＩＭの食塩を含むｐｔ＋ｓ、ｏの２
０ｍＭリン酸緩衝液で溶出された分画を集めた。実施例
２と同様にプロテアーゼの骨量を測定すると３．２Ｍｇ
であった。

実施例３（流通系での培養例〕 固定床式培養システム（千代田化工建設製　セルへスト
ｌ１１０００、タイプｌ０ＩＯＣ）の培養液循環経路中
に実施例１で作成した固定化プロテアーゼ阻害剤２０ｄ
の入ったガラス製のカラムを装着し、培養液が通過する
ようにした。ｌｌＰｃ　−ＹＯ細胞を２．５×１０７個
、培養容器中に接種した。リザーバーボトルに２０Ｏｎ
＋βのハムＦ１２培地（ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／
舵、ストＬ／ブトマイシンｌｏｏｕｇ／ｍｌ、亜セレン
酸すトリウム　ｌＸｌ０−８Ｍおよび重曹１．７８／　
ｎを含む）を入れ、循環流￥１０薇／分で、３７°Ｃ１
５％炭酸ガスインキ１ヘータ−中で培養した。６日間培
養し７た後、カラムを循環経路から取り除き、０．２Ｍ
の食塩を含むｐ　１１７　、４　の２０ｍＭ’Ｊン酸緩
衝液で十分に洗浄した。次に１列の食塩を含むｐＨ５，
０の２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出された分画を集めた。

実施例２と同様にプロテアーゼの骨量を測定すると１５
）ｉｇであった。

比較例２ 上述の例において、固定化プロテアーゼ阻害剤の代わり
にセファロース４Ｂを使用し°ζ同様の実験を行った。

６日間に培養液を実施例１の固定化プロテアーゼ阻害剤
２０ｍ！の入ったガラス製のカラムに通した後、０．２
ｈの食塩を含むｐ　１１７　、４　の２０川門リン酸緩
衝液で十分に洗浄した。次にＬＭの食塩を含むｐ　１１
５　、０　の２０＋ｎＭリン酸緩衝液で溶出された分画
を集めた。実施例２と同様にプロテアーゼの得量を測定
すると８．６Ｍｇであった。

発明の効果 本発明によれば、従来の培養法に比較し有用蛋白質の取
得量を増加することが出来る。また、精製に要する工程
を短縮することが出来る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）動物細胞の培養に際して、その培養液を、固定化
   プロテアーゼ阻害剤に接触させることを特徴とする細胞
   培養方法。
2. （２）プロテアーゼ阻害剤が、ペプスタチン類である第
   （１）項記載の方法。
3. （３）人の組織から分離された細胞のクローンであって
   組織培養用培地で増殖し、かつ次の性質を有するプロテ
   アーゼ： ［１］フィブリンを分解する活性を有し； ［２］ゲル濾過法で約１７万、ＳＤＳポリアクリルアミ
   ド電気泳動法で約８．３万の分子量を示し；［３］ペプ
   スタチンＡ、で阻害され、ふっ化フェニルメチルスルホ
   ニル（ＰＭＳＦ）、Ｐ−クロロ安息香酸第二水銀（ＰＣ
   ＭＢ）、１，２−エポキシ−３−（Ｐ−ニトロフェノキ
   シ）−プロパン（ＥＰＮＰ）、０−フェナントロリンお
   よびロイペプチンにより阻害されない。 を産生する能力を有するヒト由来細胞株を培養するに際
   して、その培養液を、固定化プロテアーゼ阻害剤に接触
   させることを特徴とする細胞培養方法。
4. （４）第（３）項記載のプロテアーゼを産生する能力を
   有するヒト由来細胞株を培養するに際して、固定化プロ
   テアーゼ阻害剤に培養液を接触させ、該固定化プロテア
   ーゼ阻害剤より該プロテアーゼを回収することを特徴と
   するプロテアーゼの製造法。