CZ294827B6 - Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu alfa1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA alfa1) z kondicionovaného média - Google Patents

Abstract

Způsob izolace a čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu .alfa.1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA .alfa.1) z kondicionovaného média, zahrnující řadu kroků, aplikaci tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, promývání, selektivní eluování vázaného rDSPA .alfa.1, aplikování eluentu obsahujícího rDSPA .alfa.1 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, případně promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice, selektivní eluování vázaného rDSPA .alfa.1, aplikování eluentu obsahujícího rDSPA .alfa.1 na afinitní chromatografickou pryskyřici, případné promývání této afinitní chromatografické pryskyřice, selektivní eluování vázaného rDSPA .alfa.1 z afinitní chromatografické pryskyřice za získání v podstatě čistého rDSPA .alfa.1 ve vodném roztoku. Tento postup je možno provozovat v průmyslovém měřítku, přičemž čistota získaného produktu je adekvátní klinickým standardům.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al), z kondicionovaného média.

Dosavadní stav techniky

Trombózy vznikají vytvořením krevní sraženiny v krevních cévách. Je možno rozlišovat mezi žilními trombózami, které zahrnují plicní embolii a tepennými trombózami, které zahrnují akutní infarkt myokardu. Plicní embolie a srdeční infarkt jsou lidský život ohrožující příhody, které vyžadují urychlenou lékařskou pomoc.

Obecně rozšířený způsob terapie takovýchto tepenných a žilních trombóz je použití aktivátorů plazminogenu za účelem provedení enzymatické trombolýzy (viz publikace Collen a kol., Ann., Rev. Med., (1988), 39, 405-423). Tyto látky, zvané trombolytika, přeměňují plazminogen, neaktivní proenzym fíbrinolytického systému v krvi, na plazmin, což je aktivní proteolytický enzym. Plazmin poté rozpouští vláknitou látku fibrin, která je základní složkou krevní sraženiny; to vede k opětovnému otevření ucpaných cév a k obnovení toku krve v těchto cévách. Nicméně, jelikož je plazmin relativně nespecifická proteáza, může také proteolýzou proteinů v krvi zničit složky, nepostradatelné pro intaktní hemostázu (jako například fibrinogen) a tudíž se zvyšuje riziko krvácení.

První enzymatická trombolytika, streptokináza a urokináza, jsou sloučeniny, které, jakmile jsou vstříknuté do oběhu, soustavně přeměňují plazminogen na plazmin a indukují systematickou proteolýzu. Trombolytické způsoby léčení, které používají tyto sloučeniny, jsou tudíž doprovázené komplikacemi souvisejícími s krvácením. V poslední době byly sice vyvinuty novější způsoby trombolytické terapie, které jsou založené na použití aktivátorů plazminogenu tkáňového typu, obvykle nazývaných t-PA (tissue Plasminogen Activators), nicméně jsou omezeny řadou nevýhod, zahrnujících vážné komplikace spojené s krvácením, relativně častým výskytem reokluze, neschopnost být stejnoměrně účinné a náchylnost k inaktivaci inhibitory plazminogenového aktivátoru typu 1 (PAI-1) (viz publikace Loskutof, Seminars in Trombosis and hemostasis, Vol. 14, No. 1 (1988)).

Později byly purifikovány plazminogen aktivující proteiny ze slin a ze slinných žláz netopýra vampýra (Desmondus rotundus) (publikovaná evropská patentová přihláška 0 352 119 (Duong a kol.)). Tyto aktivátory plazminogenu (nazývané DSPA) jsou serinové proteázy, které katalyzují přeměnou plazminogenu na plazmin, které však jeví větší selektivitu na plazminogen vázaný na fibrin a z tohoto důvodu, jestliže jsou používány pro trombolickou terapii, mohou být spojovány se snižující se závažností a frekvencí krvácení. Kromě toho není DSPA snadno inaktivován plasmovými inhibitory, jako například PAI-1 a z tohoto důvodu mohou být spojovány s menší frekvencí reokluzí.

V netopýřích slinách mohou být nalezeny dvě formy DSPA s vysokou molekulovou hmotností (označované al a a2), obě z nich sestávají z několika domén, zahrnujících proteázovou doménu, přičemž obě z nich jsou schopné pevné vazby na plazminogen za přítomnosti fibrinu. Různé formy DSPA byly získány z kultur savčích buněk rekombinantní biotechnologií (viz publikace: Kratzschmer a kol., Gene (1991), 105: 229-237; publikovaná evropská patentová přihláška 0 352 119 (Duong a kol.)), přičemž bylo rovněž popsáno čištění rekombinantně vyrobeného DSPA (rDSPA) v malém měřítku (viz publikace: Witt a kol., Blood (1992), 79: 1213-1217).

-1 CZ 294827 B6

Izolace a čištění rDSPA v komerčním měřítku a do stupně čistoty, vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích, nebyly doposud objeveny.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález se týká způsobu izolace a čištění rekombinantního DSPA al (rDSPA al) v komerčním měřítku. Vynález, tak jak je popsán, vede k dostatečně čistému a stabilnímu rDSPA al, aby mohl být komerčně prodejný a klinicky použitelný.

Podstata tohoto způsobu čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al) zkondicionovaného média podle předmětného nároku spočívá vtom, že sestává z následujících kroků (a) aplikace tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7 a za podmínek vedoucích k selektivní vazbě rDSPA al na kationtovýměnnou pryskyřici, (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA ala neproteinových nečistot, (c) selektivního eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice, (d) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, který byl získán v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 a za podmínek vedoucích k selektivní vazbě rDSPA al na tuto hydrofobní interaktivní pryskyřici, (e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice, (g) aplikování eluentu obsahujícího rDSPA al, který byl získán ve stupni (f), na afínitní chromatografickou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4 vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto afínitní chromatografíckou pryskyřici, (h) promývání afínitní chromatografícké pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afínitní chromatografícké pryskyřice za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80% celkového podílu proteinů.

Kationtová iontoměničová pryskyřice z kroku (a) je výhodně zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami. Konkrétně je možno uvést, že výhodně je kationtová iontoměničová pryskyřice tvořena matricí z částic silikagelu, kovalentně vázaných k polyethyleniminsilanu, přičemž aminové skupiny polyethyleniminsilanu jsou modifikovány karboxylovými skupinami.

Ve výhodném provedením tohoto postupu podle vynálezu podmínky aplikace v kroku (a) zahrnují aplikování média při pH v rozmezí od 4 do 7.

-2CZ 294827 B6

Podle dalšího výhodného provedení je eluování rDSPA al v kroku (c) prováděno za použití pufru obsahujícího 50 mM Na₃PO₄ a od 100 mM do 500 mM NaCl nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.

Podle dalšího výhodného provedení je hydrofobní interaktivní pryskyřice z kroku (d) pryskyřice bez náboje, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 10 atomů uhlíku nebo aryl-alkylovými skupinami, přičemž tato pryskyřice bez náboje je výhodně zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťovaný polymethakrylátový polymer. Podle dalšího výhodného provedení je pryskyřice bez náboje tvořena semirigidními sférickými granulemi syntetizovanými kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů methakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.

Podle dalšího výhodného provedení aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v krou (c) při pH v rozmezí od 3 do 5. Konkrétně je možno uvést, že výhodně aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), v 50 mM Na₃PO₄, 500 mM NaCl a při hodnotě pH upravené na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.

Podle dalšího výhodného provedení se eluování v krou (f) provádí za použití pufru, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu v rozmezí od 25 % do 30 %, podle ještě výhodnějšího provedení v rozmezí od 28,5 % a 30 %, nejvhodněji 29 %.

Afínitní chromatografícká pryskyřice v kroku (g) je ve výhodném provedení podle vynálezu přestavována zesíťovaným kopolymerem allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru, který je v rozmezí od 25 do 70 μηι, přičemž tyto granule jsou schopné frakcionovat globulární proteiny o velikosti od 20 000 do 8 000 000.

Podle dalšího výhodného provedení je eluování v kroku (i) prováděno s použitím pufru, obsahujícího 200 mM glycinu a při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.

Postup podle předmětného vynálezu dále zahrnuje výhodně koncentrování vodného roztoku rDSPA al, přičemž je rovněž výhodné, jestliže tento postup dále zahrnuje lyofilizaci koncentrovaného roztoku rDSPA al.

Výhodně tento postup podle vynálezu zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al a lyofilizaci tohoto koncentrovaného roztoku rDSPA al.

Podle vynálezu je tedy výhodný postup, který konkrétně zahrnuje následující kroky:

(a) aplikování média, které má pH v rozmezí od 4 do 7, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto kationtovýměnnou pryskyřici, (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného nebo pufrem ekvivalentní iontové síly, (d) přivedení eluentu z kroku (c), který obsahuje rDSPA al, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu,

-3 CZ 294827 B6 zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto hydrofobní interaktivní pryskyřici, (e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu větší než 25 %, (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, z kroku (f) při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4 na afinitní chromatografíckou pryskyřici, představovanou zesíťovaným polymerem allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve tvaru granulí s průměrem v rozmezí od 25 do 75 pm vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto afinitní chromatografíckou pryskyřici, (h) promývání této afinitní chromatografické pryskyřice k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo pufru ekvivalentní iontové síly, za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.

Podle vynálezu je dále výhodný postup, který konkrétně zahrnuje následující kroky:

(a) aplikování tohoto média, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém byly aminoskupiny modifikovány karboxylovými skupinami vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto kationtovou iontoměničovou pryskyřici, (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 použitím 100 mM acetátu sodného a 50 mM Na₃PO₄ při pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při ph 7,5, (d) aplikování eluovaného podílu z kroku (c) obsahujícího rDSPA al při hodnotě pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto hydrofobní interaktivní pryskyřici, (e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HC1, která obsahuje 19 % ethanolu, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5, (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografíckou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu, která frakcionuje globulámí proteiny o hmotnosti mezi 20 000 a 8 000 000, vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto afinitní chromatografíckou pryskyřici,

-4CZ 294827 B6 (h) promývání této afínitní chromatografícké pryskyřice za použití 20 mM HC1 k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (i) eluování vázaného rDSPA al z afínitní chromatografícké pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.

Postup izolace a čistění rDSPA al z biologického média podle předmětného vynálezu je možno provozovat v komerčním měřítku a získat tak produkt, který je vhodný pro klinické použití.

Rekombinantní aktivátor plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al) je možno použít pro přípravu farmaceutického prostředku obsahujícího tento rDSPA al, který byl izolován a čištěn způsobem podle předloženého vynálezu, a farmaceuticky přijatelný excipient.

Takto získaný rDSPA al, izolovaný a čištěný způsobem podle předloženého vynálezu, je možno použít pro léčení člověka s tepennými nebo s žilními trombózami.

V popise předloženého vynálezu a přiložených nárocích jsou používány některé termíny, které pokud není uvedeno jinak, mají následující význam:

Výraz „biologické prostředí“ se vztahuje na přesně určené složení solí a živin používaných za účelem rozmnožování buněk v kultuře.

Výraz „kondicionované prostředí“ se vztahuje na biologické prostředí, ve kterém byly pěstovány buňky. Prostředí bylo z tohoto důvodu ovlivněno (kondicionováno) růstem buněk a obsahuje produkty vyloučené do prostředí buněk buněčného růstu. Tyto produkty mohou být buď odpadní produkty vytvořené během růstu, nebo proteiny, které byly produkovány a vyloučeny do prostředí buňkami během růstu.

Výraz „kationtová iontoměničová pryskyřice“ se vztahuje na přírodní nebo uměle vyrobenou látku, obvykle pevnou látku, která je schopná vyměňovat vázané ionty za ionty z okolního tekutého prostředí. Kationtová iontoměničová pryskyřice má vázané záporné funkční ionty a vyměňuje odpovídající kladné ionty.

Aktivní složky iontoměničů v komerčně dostupných kationtových měničích jsou obvykle -C6H5O“, -SO3', -COO“, -PO₃ ^_, nebo -AsO₃~. Mezi slabší kationtové iontoměničové pryskyřice patří katové pryskyřice, ve kterých vazebná síla kationtů není vysoká, jako například látky, které obsahují karboxylové nebo karboxyalkylové funkční skupiny. Dále je třeba uvést, že slabší kationtové iontoměničové pryskyřice nejsou obvykle úplně disociované při kyselém pH. Konkrétní slabá kationtová iontoměničová piyskyřice, používaná při provádění postupu podle předloženého vynálezu, sestává z matrice částic oxidu křemičitého (silikagel), kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém aminoskupiny polyethyleniminu byly modifikovány karboxylovými skupinami. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti J. T. Baker pod chráněným obchodním označením chromatografícká pryskyřice Widepore CBX^R.

Termín „hydrofobní interaktivní pryskyřice“ se vztahuje přírodní nebo uměle vyrobenou látku, obvykle pevnou látku, která obsahuje elektricky nenabité skupiny, jako například methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo další alkylové skupiny. Tyto skupiny vytvářejí hydrofobní vazby se skupinami na proteinových skupinách, které procházejí pryskyřicí a vedou k oddělení proteinů, založenému na síle interakce mezi proteinovými a pryskyřicovými skupinami. Konkrétně je možno uvést, že hydrofobní interaktivní pryskyřice je tvořena polopevnými sférickými granulemi, které se získají kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu modifikovaných butylovými skupinami. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti Toso-Haas, pod chráněným obchodním označením Toyo-Pearl^R 650M C4.

-5CZ 294827 B6

Výraz „afínitní chromatografícká pryskyřice“ se vztahuje na přírodní nebo synteticky (uměle) vyrobenou látku, obvykle pevnou látku, která je používaná pro čistění proteinů. Tyto pryskyřice odděluje proteiny na základě afinity, která se vyskytuje mezi proteinovými skupinami a pryskyřicovými skupinami. V předloženém vynálezu je piyskyřice, používaná jako afínitní chromatografícká pryskyřice, obvykle používána jako pryskyřice pro vylučování separaci, při které se oddělí proteiny podle jejich velikosti. Jako konkrétní příklad této afínitní chromatografícká pryskyřice je možno uvést zesíťovaný kopolymer allyldextranu a N,N'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí, která je schopna frakcionace globulámích proteinů o molekulové hmotnosti v rozmezí od 20 000 do 8 000 000. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti Pharmacia, pod chráněným obchodním označením Sephyciyl^R S-400.

Výraz „alkyl“ se vztahuje na jednovazný zbytek s lineárním nebo rozvětveným řetězcem, který sestává výhradně z uhlíku a vodíku, neobsahuje nenasycené vazby a obsahuje jeden až osmnáct atomů uhlíku, výhodně jeden až šest atomů uhlíku, jako například methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina, isopropylová skupina (l-methylethyl)ová skupina, n-butylová skupina, t-butylová skupina, (1,1-dimethylethylová skupina), sek-butylová skupina (1-methylpropylová skupina), n-pentylová skupina, n-hexylová skupina a podobně.

Termíny vztahující se k čistotě získaného produktu, a termín, „v podstatě čistý“ používaný v popisu předmětného vynálezu v souvislosti s čistotou požadovaného rDSPA al (tedy podílem rDSPA al v konečném produktu představujícím směs všech proteinů) po provedení čisticího postupu podle předmětného vynálezu, detailně popsaného v tomto popisu, znamená, že více než 80 % celkového množství proteinů přítomných v konečném vyčištěném produktu je rDSPA al, výhodně více než 90 % celkového podílu proteinů je rDSPA al. Obsah a čistota proteinu jsou určovány metodou HPLC s reverzními fázemi (vysokoúčinná kapalinová chromatografíe) a gelovou analýzou SDS-PAGE (polyakrylová gelová elektroforéza s použitím dodecylsulfátu sodného).

Výraz „proteiny, které nejsou rDSPA al a neproteinové nečistoty“ se vztahuje na všechny materiály, jiné než rDSPA al, vyskytující se v biologickém nebo kondicionovaném prostředí, ze kterého byl rDSPA al čištěn.

Výraz „farmaceuticky přijatelný excipient“ se vztahuje na přijatelný nosič a kteroukoli farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, u nichž je požadována kompatibilita s fyziologickými podmínkami, které jsou netoxické a nepůsobí nepříznivě na biologickou účinnost farmaceutické kompozice v něm suspendované nebo obsažené. Vhodnými excipienty jsou takové sloučeniny jako například mannit, sukcinát (jantaran), glycin, nebo sérový albumin.

Výraz „terapeuticky účinné množství“ znamená takové množství rDSPA al, které, jestliže je podáváno potřebnému člověku, je dostatečné pro uskutečnění léčby chorobných stavů charakterizovaných trombózu, ve smyslu uvedeném níže. Množství sloučeniny, které tvoří „terapeuticky účinné množství“ se liší v závislosti na dané sloučenině, chorobném stavu a jeho závažnosti, přičemž může být určeno běžným způsobem odborníkem pracujícím v daném oboru, který je obeznámen s předmětným vynálezem.

Výrazy „léčení“ nebo „léčba“, používané v popisu předmětného vynálezu, znamenají léčbu chorobného stavu člověka, přičemž chorobný tento stav je charakterizován trombózou, a zahrnují:

(i) zabránění vzniku chorobného stavu u člověka, obzvláště pokud se jedná o člověka s predispozicí vzhledem k tomuto chorobnému stavu, u kterého ale ještě diagnóza neprokázala, že se u něj tento stav vyskytuje;

(ii) inhibice chorobného stavu, to jest zastavení jeho vývinu; nebo

-6CZ 294827 B6 (iii) ulehčení chorobného stavu, to jest způsobení ústupu chorobného stavu.

Výrazy „případný“ nebo „popřípadě“ znamenají, že následně popsaný výskyt okolností může nebo nemusí nastat, přičemž popis předloženého vynálezu zahrnuje jak případy, kdy jmenovaná událost nebo okolnost nastane, tak i případy, kdy jmenovaná událost nebo okolnost nenastane.

Předložený vynález se týká způsobu izolace a čistění rDSPA al v komerčním měřítku a ve formě, vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích. Tento rDSPA al je produkovaný fermentací savčí buněčné linie, schopné sekrece produkovaného rDSPA al do kultivačního prostředí. Kondicionované (ovlivněné) médium, to znamená médium získané zbioreaktoru a obsahujícího savčí buňky, se shromáždí a rDSPA al se oddělí od jiných proteinů a nečistot v řadě za sebou provedených chromatografíckých kroků začínajících použitím kationtové iontoměničové pryskyřice, načež následuje selektivní eluování rDSPA al z pryskyřice. Frakce rDSPA al, získaná selektivní elucí z kationtové iontoměničové pryskyřice, se potom aplikuje na hydrofobní interaktivní pryskyřici, kde selektivní eluování z matrice představuje druhý stupeň čistění. Eluování frakce rDSPA al se potom aplikuje na afínitní chromatografíckou pryskyřici, kde selektivní eluování poskytuje další stupeň čištění. Čištěný rDSPA al je dále koncentrován obvyklými technikami, jako například ultratitrací a potom lyofilizací.

Postup podle předmětného vynálezu se konkrétně provádí následujícím způsobem.

A. Izolace a čištění

1. Kultivační prostředí a buněčné linie

Kultivační prostředí obsahuje základní médium vhodné pro růst savčích buněk, jako například DMEM nebo Hamovo médium F12. Konkrétně je možno uvést, že tímto médiem je zejména Williamsovo E médium (viz publikace Williams, G. M., and Gunn, J. M., Exp. Cell Res., (1974) 89:139). Ve fázi růstu naočkovaných buněk se toto základní médium obvykle doplnění zdrojem séra, obvykle hovězím sérem (BS) nebo sérem novorozeného telete (CS), přítomného v koncentraci v rozmezí od přibližně 0,1% do přibližně 10% hmotnostních, obvykle přítomného v koncentraci v rozmezí od přibližně 1 % do přibližně 5 % hmotnostních. Kromě toho mohou být přidány další růstové faktory nebo pufry, jako například HEPES. Během perfuzní růstové fáze je koncentrace séra obvykle udržována na stejné koncentraci, která je obvykle v rozmezí od přibližně 3 % do přibližně 8 % hmotnostních, obvykle okolo 5 % hmotnostních.

Buněčné linie vhodné pro použití podle předloženého vynálezu zahrnují savčí buněčné linie schopné neadherentního růstu v suspenzní kultuře a/nebo adherentního růstu na mikronosičových granulích. Konkrétní buněčné linie, které vyhovují těmto požadavkům zahrnují buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO), BHK buňky, nebo buněčné linie HEK293 (viz publikace: Kraztschmer a kol., Gene, (1991) 116: 281-284; Petři, T., J. BioTechnology, (1995) 39:75-83).

Zvláště výhodná CHO buněčná linie je DXB11, která je popsaná v publikaci Urlaub, G., and Chasin, L. A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4216-4220. Tyto buňky byly kontransfektovány expresními vektory pSVPAIl a pUDHFRl, které zahrnují sekvence kódující DSPA al respektive myší dihydrofolátovou reduktázu (Petři, T., ibid). Transformovaná CHO buněčná linie, používaná v předloženém vynálezu, je označovaná CD 16 a byla deponována v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC) pod označením ATCC # CRL 12023.

-7 CZ 294827 B6

2. Růst kultury a produkční fáze

Po inokulaci buď sloučenými kulturami získanými centrifugací, a nebo částí jiných kultur z bioreaktoru se buněčná kultura rozroste na produkční hustotu, typicky v rozmezí okolo 1 až 40 x 10⁶ buněk/ml.

Po dosažení požadované hustoty buněk na mikronosičových granulích je zahájena perfuze čerstvého média, doplněného sérem. Alternativně mohou buňky růst v suspenzní kultuře. Obvykle je koncentrace séra v čerstvém médiu v rozmezí od přibližně 2 % do přibližně 10 % hmotnostních, obvykleji je tato koncentrace séra v rozmezí od přibližně 3 % do přibližně 8 % hmotnostních, zejména je tato koncentrace séra v rozmezí okolo 5 % hmotnostních. Rychlost perfuze je zpočátku v rozmezí od přibližně 0,25 do přibližně 0,75 násobku objemu kultury/den, obvykle v rozmezí okolo 0,5 násobku objemu kultury/den. Se zvyšujícím se růstem buněk se zvyšuje rychlost perfuze až ke konečné rychlosti v rozmezí od přibližně 1,5 do přibližně 2,5 násobku objemu kultury/den, obvykle v průběhu přibližně 2 do přibližně 10 dnů. Během expanze jsou sterilní, předem ekvilibrované granule mikronosiče přidávány do reaktoru aby se udržel poměr množství granulí mikronosiče k buněčné hustotě v rozmezí od přibližně 0,5 do přibližně 1,0 gramu mikronosičových granulí na 10⁹ buněk. Granule mikronosiče jsou výhodně přidávány do reaktoru použitím nasávacího zařízení vzorkovací trubicí.

V okamžiku kdy hustota buněk dosáhne produkční úrovně, se přidávání séra do čerstvého kultivačního prostředí omezí, obvykle na koncentraci v rozmezí od přibližně 0,1 % do přibližně 2,0 % hmotnostních procent, obvykle 1 % hmotnostní.

Kultura v produkční fázi vyžaduje pozornost týkající se několika parametrů fermentace: teplota, pH a stupeň rozpuštěného kyslíku jsou monitorovány denně. Dodatečné kultivační médium, sérum a alkalické látky je třeba dodávat, jakmile se vyčerpají zásobní nádrže. Vzorky kondicionovaného (ovlivněného) prostředí, definovaného jako prostředí, které obsahuje produkt, jsou analyzovány běžným způsobem alespoň každé dva dny, aby se zajistilo, zda produkce pokračuje bez kontaminace.

Způsob odběru kondicionovaného prostředí z bioreaktorů minimalizuje odebírání buněk použitím sít s póry o průměru přibližně 100 až 150 mikrometrů. Suspenzní kultury používají vírový filtr za účelem udržení buněk v bioreaktoru. Odebrané médium je odebíráno do sterilních zásobníků a uchováváno po dobu až 38 dnů při dalším zpracováním. rDSPA al, který se nachází v látce shromážděné z bioreaktoru, se sekretuje zCHO buněk ve zpracované formě, která je plně biologicky aktivní a která je připravena k čistění.

3. Chromatografie s kationtovou výměnou

Po nastavení pH na hodnotu v rozmezí od přibližně 4 do přibližně 6, výhodně okolo 5, je rDSPA al, který se nachází v ovlivněném prostředí, aplikován na kationtovou iontoměničovou matrici (obvykle plněnou ve formě kolony) za podmínek zvolených tak, aby byla zajištěna v zásadě úplná vazba rDSPA al na matrici. Ostatní proteiny se budou rovněž vázat, přesto úrovní vazebná etapa poskytuje první stupeň separace, neboť množství nežádoucích nebo kontaminujících proteinů a jiných sloučenin, jako například fenolová červeň v kondicionovaném prostředí nebude schopno vazby na matrici a tudíž proteče matricí. V dalším postupu je rDSPA al čištěn selektivním eluováním z matrice, přičemž toto eluování může být provedeno buď eluováním po krocích, nebo metodou eluování s lineárním gradientem, při které se zvyšuje iontová síla pufru.

V obou případech je rDSPA al odebírán za účelem dalšího čistění, jak bude popsáno níže.

Mezi vhodné kationtové iontoměničové matrice je možno zařadit velký počet různých pryskyřic modifikovaných kationtovými funkčními skupinami, které jsou schopné vázat rDSPA al. Výhodné jsou synteticky připraveny pryskyřice, jako například pryskyřice sestávající z částic

-8CZ 294827 B6 silikagelu, zesíťované agarózy nebo zesíťovaných polymethakrylátových polymerů, modifikovaných kationtovými funkčními skupinami, jako například karboxylová skupina, karboxymethylová skupina, sulfonová skupina, fosforylová skupina a podobně. Zvláště použitelné jsou relativně slabé pryskyřice, jako například takové pryskyřice, které mají karboxylovou nebo karboxyalkylovou funkční skupinu, jako je například karboxymethylová skupina nebo karboxyethylová skupina. Zvláště výhodná pryskyřice sestává z matrice z částic oxidu křemičitého, kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, s amino skupinami polyethyleniminsilanu modifikovanými karboxylovými skupinami. Takovouto pryskyřicí je produkt Baker Vadepore CBX^R (velikost granulí 45 mm), která je komerčně dodávaná společností J. T. Baker.

Vazebné podmínky a podmínky eluování se liší v závislosti na síle vazby kationtové pryskyřice. Pro slabé kationtové pryskyřice, jako například Baker Vadepore CBX, může být vazba vytvořena při nízké iontové síle za mírně kyselých podmínek, obvykle při pH v rozmezí od 4 do 7, výhodně okolo pH 5. Po eluování matrice může být rDSPA al selektivně eluován vystavením matrice působení mobilní fáze se zvyšující se iontovou silou, přičemž se použije buď lineární eluování, nebo eluování po krocích. V případě pryskyřice Baker Videpore CBX bude rDSPA al eluován při pH okolo 7,5, s koncentrací soli mezi přibližně 100 mM a přibližně 500 mM NaCl. Kolonu je možno potom podrobit stripování a regenerovat za účelem následného použití.

S matricí Baker Widepore CBX je možno pryskyřici zprvu výhodně ekvilibrovat pufrem 100 mM octanu sodného s hodnotou pH 5. Tento pufr se aplikuje na kolonu s rychlostí průtoku rovnou 0,2 násobku objemu až 2,0 násobku objemu kolony za minutu až do doby, než se pH vystupující tekutiny ustálí na 5. Kondicionované médium obsahující rDSPA al se filtruje 1,2 pm filtrem a potom se titruje až na pH mezi 4 a 7, nejvýhodněji 5, za použití ledové kyseliny octové. Toto médium se potom přivede do kolony, obvykle za použití zubového čerpadla, při rychlosti toku nepřesahující dvojnásobek objemu kolony za minutu. Za účelem odstranění částic, které by mohly ucpat matrici kolony, je použit filtr.

Matrice kolony se potom znovu ekvilibruje ekvilibračním octanovým pufrem až do doby, než se pH stabilizuje na 5, což typicky vyžaduje množství pufru of přibližně dvojnásobku do přibližně sedminásobku objemu kolony. Potom je na kolonu aplikuje promývací pufr obsahující 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, rychlostí přibližně 0,1 násobku do přibližně 0,2 násobku objemu kolony za minutu až do doby, než se pH eluentu stabilizuje na 7,5. Potom se rDSPA al eluuje z kolony za použití elučního pufru obsahujícího 50 mM fosforečnanu sodného, 500 mM chloridu sodného, pH 7,5. Tento eluční pufr je ponechán procházet kolonou až do doby, kdy už nedochází k eluování proteinu z kolony. Na kolonu se potom aplikuje stripovací pufr obsahující 2,0 M octanu sodného, pH 8 za účelem regenerování matrice. Zásobní pufr obsahuje 10% kyseliny octové a 45 % ethanolu.

4. Hydrofobní interaktivní chromatografie

Frakce rDSPA al shromážděná z matrice kationtového iontoměniče je potom aplikována na hydrofobní interaktivní matrici (obvykle ve formě kolony) za podmínek, které umožní vazbu rDSPA al na matrici, obvykle za vysoké iontové síly a nízkého pH. V dalším postupu se potom rDSPA al selektivně eluuje zvýšením koncentrace organického rozpouštědla mobilní fáze aplikované na kolonu, za použití lineárního nebo krokového gradientu. Frakce rDSPA al je odebírána z kolony za účelem dalšího čistění. Tento krok sníží 100 až 1000 krát DNA kontaminaci a inaktivuje potenciální virové nečistoty.

Mezi vhodné hydrofobní interaktivní matrice je možno zařadit velké množství elektricky nenabitých pryskyřic, které obsahují kovalentně vázané hydrofobní skupiny, jako například propylovou skupinu, butylovou skupinu, oktylovou skupinu, fenylovou skupinu a podobně. Těmito pryskyřicemi mohou být zesíťované organické polymery, jako například styren-divinylbenzen, oxid křemičitý, agaróza, polymethakrylát, nebo kterýkoli z velkého množství jiných vhodných částico

-9CZ 294827 B6 vých nosičů. Zvláště výhodná pryskyřice sestává ze semirigidních sférických granulí, které se syntetizují kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů methakrylátového typu modifikovaných butylovými skupinami. Takovouto pryskyřicí je Toyo-Pearl^R 650M (granule 40 až 90 pm), která je komerčně dostupná od společnosti Toso-Haas.

Vazba na hydrofobní interaktivní kolonu se uskuteční za podmínek vysoké iontové síly, obvykle při kyselém pH od 3 do 5, zejména okolo pH 4. V podstatě všechen protein obsažený ve frakci rDSPA al, která byla eluována zkationtové iontoměničové pryskyřice, je vázán na hydrofobní interaktivní kolonu. V závislosti na různých schopnostech hydrofobních interakcí s hydrofobními skupinami na matrici mohou být selektivně eluovány různé proteiny, to znamená v pořadí stoupající hydrofobicity proteinu. Eluování kolony může být provedeno za použití krokového nebo lineárního gradientu, obvykle za použití alkoholového eluentu, jako je například ethanol nebo isopropanol. Zvláště výhodný alkohol je ethylalkohol.

Ekvilibrace matrice Toyo-Pearl C4 může být výhodně provedena ekvilibračním pufrem, který obsahuje 50 mM octanu sodného, 500 mM chloridu sodného, o pH 4. Poté, co byla frakce rDSPA al z kolony iontoměniče titrována na pH 4, byla tato frakce aplikována na C4 matrici, tato matrice se potom znovu ekvilibruje ekvilibračním pufrem, který byl popsán výše. Tato kolona se potom následně promyje postupně za použití dvou pufrů, jak vyplývá z následujícího výkresu. Při prvním promývání (promývání 1) se používá pufr, jehož objem činí alespoň dvojnásobek objemu kolony a který obsahuje 20 mM HC1. Promývání je opakováno až do doby, než vystupující tekutina neobsahuje další protein, jak je patrno ze stálé UV absence. Matrice je potom promývána (promývání 2) za použití pufru, jehož objem činí nejméně desetinásobek objemu kolony a který obsahuje 19 % ethanolu, 20 mM HC1 a v promývání se pokračuje pufrem obsahujícím 20,5 % ethanolu, 20 mM HC1 až do doby, dokud už není vymyt žádný další protein. Vymývání produktu rDSPA al je prováděno za použití pufru, který obsahuje 29 % ethanolu, 20 mM HC1, pH 2,5. Po vymytí produktu je kolona stripována pufrem, jehož objem činí nejméně dvojnásobek objemu kolony a který obsahuje 100 mM NaOH. Matrice je uchovávána v pufru z promývání 1.

5. Afínitní chromatografíe

Frakce rDSPA al odebraná z hydrofobní interaktivní pryskyřice je dále aplikována na afínitní matrici (obvykle ve formě kolony) za podmínek, které umožní vazbu rDSPA al na afínitní matrici. Zatímco rDSPA al zůstává vázaný na kolonu, nečistoty jsou eluovány promýváním kolony 20 mM HC1, jehož objem činí dvojnásobek až trojnásobek objemu kolony. Tento krok ulehčuje výměnu pufru, čímž napomáhá vytváření farmaceutického prostředku a zlepšuje rozpustnost a také pomáhá při inaktivaci/odstranění potenciální virové kontaminace. Výhodně je používán pufru, jehož objem činí 2,5 násobek objemu kolony. V dalším postupuje potom rDSPA al selektivně eluován za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, volnou bází o pH mezi 4 a 5. Frakce rDSPA al je odebírána za účelem zkoncentrování.

V předmětném vynálezu jsou pryskyřice používané jako afínitní pryskyřice takové pryskyřice, které jsou normálně používané jako pryskyřice používané pro separaci podle velikosti molekul. Mezi vhodné afínitní matrice je možno zařadit pryskyřice sestávající ze zesíťovaného polymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru mezi 25 a 75 pm. Zvláště výhodná pryskyřice je Sephacryl 400⁵, která je komerčně dostupná od společnosti Pharmacia a je schopná frakcionace granulámích proteinů mezi 20 000 a 8 000 000 kDa.

Vazbu rDSPA al na afínitní pryskyřici je možno dosáhnout za podmínek slabé iontové síly a nízkého pH. V podstatě všechen rDSPA al odebraný z hydrofobní interaktivní pryskyřice se váže na kolonu. Tento rDSPA al může být selektivně eluován zvýšením pH a/nebo iontové síly. Toto eluování může být provedeno za použití krokového nebo lineárního gradientu, obvykle za použití eluentu obsahujícího 200 mM glycinu, ve formě volné báze.

-10CZ 294827 B6

Při použití matrice Sephacryl S-400 může být výhodně ekvilibrace provedena pufrem, který obsahuje 19% ethanolu, 20 mM HC1, až do doby, kdy pH vystupující tekutiny již zůstává neměněno. Na matrici se přivede frakce rDSPA al zhydrofobní interaktivní kolony a potom se provede vymývání pufrem, který obsahuje 20 mM HC1 až do doby, kdy je UV signál z vystupující tekutiny stálý. Eluování vázaného rDSPA al je prováděno za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu. Po eluování produktu je kolona podrobena stripování pufrem, jehož objem činí více než dvojnásobek objemu kolony, který obsahuje 100 mM NaOH. Po promytí matrice pufrem, jehož objem činí alespoň dvojnásobek objemu kolony (200 mM HC1), může být v tomto pufru matrice uchovávána.

6. Koncentrace

Vyčištěný protein získaný postupem podle předmětného vynálezu může být potom zkoncentrován, obvykle filtrací nebo podobným způsobem, přičemž může být popřípadě lyofilizován nebo jiným způsobem vpraven do obvyklého farmaceutického prostředku. Použitelné postupy koncentrace a lyofilizace jsou v tomto oboru dobře známé a popsané v odborné literatuře.

B. Příprava farmaceutických forem

1. Farmaceutické prostředky

Rekombinantní DSPA al je možno použít pro přípravu prostředku s významnou terapeutickou hodnotou. Tento rDSPA al, čištěný postupem podle předmětného vynálezu, je možno použít pro léčení tepenných a žilních trombóz.

Rekombinantní DSPA al, čištěný postupem podle předmětného vynálezu dokumentu, může být podáván pacientovi. Toto činidlo může být kombinováno za účelem terapeutického použití s jinými látkami, například s obvyklými farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly a současně s fyziologicky neškodnými stabilizátory a excipienty. Tyto kombinace mohou být sterilně filtrovány a zpracovány do dávkovačích forem, jako je například lyofilizace v dávkovačích nádobkách nebo uchovávání ve stabilizovaných vodných přípravcích.

Množství činidla, které je nezbytné pro účinnou terapii budou záležet na mnoha různých faktorech, zahrnujících způsob podávání, fyziologický stav pacienta a jiné podávané léky. Léčebné dávky by tudíž měly být titrovány, aby byla co nejvíce zvýšena bezpečnost a účinnost. Dávky použité in vitro mohou obvykle přestavovat užitečnou informaci o použitelných množstvích pro podávání těchto činidel in šitu. Pokusy na zvířatech, prováděné za účelem stanovení účinné dávky pro léčbu zvířat mohou poskytnout předběžné indikace o dávkování člověku. Různé teoretické úvahy na toto téma jsou popsané například v publikaci Gilman a kol., (eds) (1990) Goodman and Gilmaiťs: Pharmacological Bases of Therapeutics, 8^th Ed., Pergamon Press; a Remingtonů Pharmaceuticals Sciences, 18^th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.

V uvedených publikacích a v dalším popisu bude pojednáno o různých způsobech podávání, například o perorálním podávání, intravenózním podávání, intraperitoneální podávání nebo o intramuskulárním podávání, o transdermální difúzi a jiných způsobech. Farmaceuticky přijatelné nosiče budou obsahovat vodu, fyziologický roztok, pufiy a jiné složky, popsané například v publikaci The Měrek Index, Měrek & Co., Rahway, New Jersey. Vzhledem k potřebnému dávkování jiných aktivátorů plazminogenu je možno očekávat celkové dávkované množství v rozmezí od 80 do 110 miligramů (viz Physicians' Decs Reference, 49^th ed. (1995), Mecidal Economics Data Produkce Company, str. 1083-1085).

Terapeutický přípravek může být podáván v kterékoli obvyklé dávkovači formě. I když je možné podávat aktivní složku samotně, je výhodnější, aby byla podávána ve formě farmaceutického prostředku. Tyto prostředky obsahují alespoň jednu aktivní složku, definovanou výše, spolu

-11 CZ 294827 B6 sjedním nebo více přijatelnými nosičovými látkami pro tuto aktivní složku. Každá nosičová látka musí být jak farmaceuticky, tak i fyziologicky přijatelná v tomto smyslu, že je kompatibilní s jinými složkami a že neohrožuje pacienta. Tento prostředek obsahuje takové složky, které jsou vhodné pro perorální podávání nebo parenterální podávání (zahrnující subkutánní podávání, intramuskulární podávání, intravenózní podávání a intradermální podávání). Tyto prostředky jsou obvykle podávány v jednotkové dávkovači formě, přičemž mohou být připraveny ktefymkoli ze způsobů známých v oboru farmacie. Viz například Gilman a kol., ibid, and Remington ibid.

Příklady provedení vynálezu

Postup podle předmětného vynálezu bude v dalším blíže vysvětlen s pomocí konkrétních příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.

Příklad 1

Produkování rDSPA al z buněčné kultury.

Lahvička DSPA Working Cell Bank byla rozmražena a inokulována do válcové národy obsahující 5% telecí sérum v růstovém médiu (WEC 5.0 médium, modifikované médium Williams E). Během dvoutýdenní periody buňky expandovaly do čtyř válcových nádob, přičemž tyto buňky byly zpracovány trypsinem a inokulovány do čtyř jednolitrových odstřeďovacích baněk po 4x 10⁸ buněk, každý sjedním litrem růstového média. Po čtyřech dnech byly tyto kultury ze čtyř baněk použity pro naočkování do desetilitrového bioreaktoru. Do kultury v tomto bioreaktoru byl dodatečně přidán 1 litr růstového média v den inokulace. Následující den byl tento bioreaktor naplněn 10 litry růstového prostředí. Kultivace jak s přidáváním, tak bez přidávání mikronosičových granulí se řídilo tímto protokolem. pH prostředí bylo regulováno na 7,0 až 7,4 a okysličení bylo udržováno po celou dobu rozptylovacím systémem. Tepla byla udržována na 34 až 39 °C.

Hustota buněk v den naočkování do bioreaktoru byla 8,1 x 10⁵ buněk na ml a po dvou dnech se hustota buněk zvětšila na dvojnásobek, v době, ve které rychlost perfuze byla nastavena na 0,5 násobek objemu kultury za den. Rychlost perfuze byla zvyšována v závislosti na hustotě buněk, tak, aby po devíti dnech uplynulých od naočkování bioreaktoru hustota dosáhla 6,2 x 10⁶ buňky/ml a perfuze se zvýšila na 2 násobky objemu kultury za den.

Bioreaktor byl potom převeden na produkční prostředí (1% telecí sérum ve WEC 5.0 prostředí) a o dva dny později začalo odebírání produkce a pokračovalo po dobu deseti týdnů. Během fáze produkce byl průměr hustoty buněk 15 x 10⁶ buněk na ml s přibližně 75% životností. Průměr produkce rDSPA al byl 40 miligramů rDSPA al na litr a průměr specifické produkční rychlosti byl 6 pikogramů rDSPA al na buňku na den.

Expanze fermentačních objemů byla dosažena přesunem poloviny obsahu reaktoru do nové nádoby. Oba bioreaktory byly umístěny do produkčního prostředí, perfuzovány dvěma násobky objemu kultury za den a ihned začalo odebírání produkce.

- 12CZ 294827 B6

Příklad 2

Čištění rDSPA al

1. Chromatografie kationtovou výměnou (Kolona A).

Odběr zbioreaktoru je uchováván za teploty okolí (15 až 25 °C). Je potom filtrován přes 0,45 mikronový filtr před přivedením na kationtovou iontoměničovou kolonu. Čištění odebraného materiálu začíná krokem kolonové chromatografie za použití pryskyřice CBX, vyrobené společností J.T. Baker (Kolona A). Tento krok umožňuje významnou část čistění proteinu.

Pufry kolony A sestávají zPufru Al: ekvilibrační pufr (50 mM NaOAc, pH 5,0), zpufru A2: promývací pufr (50 mM NaPO₄, pH 7,5), z Pufru A3: vymývací pufr (50 mM NaPO₄, 500 mM NaCl, pH 7,5), z Pufru A4: stripovací pufr (2M NaAc, pH 8,0) a z Pufru A5: zásobní pufr (45 % EťOH, 10 % HoAc).

Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro kolonu naplněnou 6 kg pryskyřice as objemem kolony 15 litrů. Nejvíce 4,5 gramů rDSPA al může být přivedeno na kolonu v jednom zpracování. Kolona je plněna při velikosti toku menší než 2 litry za minutu a při tlaku kolony nepřesahujícím 20 psi. Hodnoty kolony a monitoru jsou kontrolované před každým zpracováním. Plnicí materiál a chromatografické pufry jsou před použitím zbaveny plynů proplachováním heliem.

Odběr zbioreaktoru je filtrován 1,2 mm filtrem, potom titrován na pH 5,0 (± 0,10) za použití ledové kyseliny octové. Před plněním je kolona ekvilibrována nejméně 30 litry Pufru Al až do doby, než má vycházející tekutina pH 5.0 (± 0,20). Jakmile je kolona ekvilibrována, je na kolonu přiváděn odběr. Kolona je znovu ekvilibrována nejméně osmdesáti litry Pufru Al. Kolona je znovu správně ekvilibrována, když má vycházející tekutina pH 5,00 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je vymývána nejméně 145 litry Pufru A2. Kolona je správně vymyta, když má vycházející tekutina pH 7,50 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra.

Produkt je vymyt z kolony za použití nejméně 30 litrů Pufru A3 a odebírán do oddělené nádoby. Vymývání je považováno za dosažené, když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Po vymytí produktu je kolona stripována až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra, za použití nejméně 30 litrů Pufru P4. Kolona je potom čištěna, aby mohla být znovu použita (aniž by byla překročena hranice 50 cyklů používání). Produkt kolony A (nebo eluát) je uchováván při teplotě 2 až 8 °C. Průměrný výtěžek byl 93 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 81%.

2. Hydrofobní interaktivní chromatografie (Kolona B).

Po provedené chromatografie na pryskyřici CBX je produkt rDSPA al chromatografován za použití C4 hydrofobní interaktivní pryskyřice (Toso-Haas) (Kolona B). Tento krok ulehčuje významně odstranění neproteinových nečistot a také pomáhá při inaktivaci/odstranění možných virových nečistot. Pufry kolony B sestávají zPufru Bl: ekvilibrační pufr (50 mM NaOAc, 500 mM NaCl, pH 4,0), zPufru B2: promývací a zásobní pufru (20 mM HC1), zPufru B3: promývací pufru (20 mM HC1, 19 % EtOH), z Pufru B4: promývací pufr (20 mM HC1, 20,5 % EtOH), zpufru B5: vymývací pufr 20 mM HC1, 29,5 % EtOH), a zPufru B6: stripovací pufru (0,lN NaOH). Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro 15 litrový objem kolony. V jednom zpracování může být přivedeno na kolonu nejvíce 9 gramů DSPA al. Kolona je plněna při velikosti toku nejvíce 2 litry za minutu a při tlaku kolony nejvíce 15 psi. Hodnoty kolony a monitoru jsou kontrolované před každým zpracováním.

-13 CZ 294827 B6

Před plněním je kolona ekvilíbrována až do doby, než má vycházející tekutina pH 4,00 (± 0,20). Látka vymytá z kolony A je titrována na pH 4,00 (± 0,10) za použití ledové kyseliny octové, zbavena plynu, a přiváděna do kolony. Tato kolona je znovu ekvilíbrována nejméně 30 litry Pufru B1 až do doby, než má vycházející tekutina pH 4,00 (+ 0,20) a než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána třemi pufry. První promývání je nejméně 45 litry Pufru B2. Kolona je správně promyta, když má vycházející tekutina pH 1,90 (+ 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána po druhé nejméně 145 litry Pufru B3 až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána po třetí nejméně 30 litry Pufru B4 a promývání je úplné, když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra.

rDSPA al je vymyt z kolony za použití nejméně 30 litrů Pufru B5 a shromažďován do oddělené nádoby. Ve vymývání se pokračuje až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je potom čištěna, aby mohla být znovu použitelná (aniž by byla překročena hranice 50 cyklů používání). Produkt kolony B (neboli eluát) je uchováván při teplotě 2 až 8 °C během nejvíce 15 dnů před dalším zpracováním. Průměrný výtěžek byl 91 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 97 %.

3. Afinitní chromatografie (Kolona C).

Produkt kolony B podstupuje dále chromatografíi za použití Sephacryl S-400 (Pharmacia) (Kolona C). Tento krok ulehčuje výměnu pufru, čímž napomáhá vytváření přípravku a tedy pomáhá při inaktivaci/odstranění virových nečistot. Pufry kolony C sestávají zPufru Cl: ekvilibrační pufr (20 mM HCI, 9 % Et OH) z Pufru C2: promývací pufr (20 mM HCI), z Pufru C3: vymývací a zásobní pufr (200 mM glycinu, sterilně filtrovaného) a z Pufru C4: stripování pufru (0,lN NaOH). Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro desetilitrový objem kolony. V jednom zpracování může být na kolonu přivedeno nejvíce 20 gramů rDSPA al. Kolona je plněna při rychlosti nejvíce 0,5 litru za minutu a při tlaku kolony nejvíce 15 psi. Eluáty z jednoho nebo více zpracování Kolony B jsou sloučeniny a potom jsou zředěny jedním dílem eluátu Pufru C2 a dvěma díly eluátu Pufru 5. Konečná koncentrace ethanolu bude přibližně 19 %.

Před plněním je kolona ekvilíbrována nejméně 15 litry Pufru Cl až do doby, než má vycházející tekutina pH 1,80 (± 0,20).

Po naplnění je kolona promývána nejméně 30 litry Pufru C2. Kolona je vhodně promývána dokud UV signál není stabilní. Produkt je vymyt z kolony použitím nejméně 20 litrů Pufru C3 a shromažďován do oddělené nádoby. Ve vymývání je pokračováno až do doby, než je dosaženo stálé základní linie UV spektra.

Po vymývání produktu je kolona stripována nejméně 12 litry Pufru C4 a uchovávána až do opětovného použití, které však nemá překročit 20 cyklů. Produkt kolony C (neboli eluát) je zředěn na koncentraci menší než 1 mg na mililitr Pufrem C3 a uchováván při teplotě 2 až 8 °C za účelem dalšího zpracování. Průměrný výtěžek byl 97 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 98 %.

Kroky koncentrace a přípravy farmaceutických kompozic následovaly po dokončení kroků čistění (popsaných výše) a byly prováděny s vymytým produktem afinitní kolony S-400, který byl uchováván nejdéle 70 dní. Eluáty kolony C byly sloučeny a koncentrovány by spirálově vinutou ultrafiltrační membránou, která odstraňuje látky nízké molekulové hmotnosti (propustnost do 30,000 daltonů). Produkt byl sebrán do kontejneru, který neobsahuje pyrogenní látky, v koncentraci vyšší než 8 mg/ml. Ke koncové 4% koncentraci byl přidán mannit.

- 14CZ 294827 B6

Nakonec byl přidán formulační pufr (200mM glycinu, 4 % mannitu (hmotnost/objem)), aby upravil koncentraci hromadně připraveného produktu na 7,5 mg/ml. Hromadně připravený produkt je potom sterilně filtrován, rozdělen do nádob a lyofílizován.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al) z kondicionovaného média, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků:

   (a) aplikace tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7;

   (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

   (c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;

   (d) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, který byl získán v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5;

   (e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

   (f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice;

   (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, který byl získán ve stupni (f), na afínitní chromatografíckou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4;

   (h) promývání afínitní chromatografícké pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

   (i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afínitní chromatografícké pryskyřice za získání rDSPA ais čistotou rDSPA al přinejmenším 80% celkového podílu proteinů.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že kationtová iontoměničová pryskyřice z kroku (a) je zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózou nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kationtová iontoměničová pryskyřice je tvořena matricí z částic silikagelu, kovalentně vázaných z polyethyleniminsilanu, přičemž aminové skupiny polyethyleniminsilanu jsou modifikovány karboxylovými skupinami.
4. 4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že podmínky aplikace v kroku (a) zahrnují aplikování média při pH v rozmezí od 4 do 7.
5. 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že eluování rDSPA al v kroku (c) je prováděno za použití pufru obsahujícího 50 mM Na₃PO₄ a od 100 mM do 500 mM NaCl nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.

   - 15 CZ 294827 B6
6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hydrofobní interaktivní pryskyřice z kroku (d) je pryskyřice bez náboje, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 10 atomů uhlíku nebo aryl-alkylovými skupinami.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pryskyřice bez náboje je zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózou nebo zesíťovaný polymethakrylátový polymer.
8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pryskyřice bez náboje je tvořena semirigidními sférickými granulemi syntetizovanými kopolymerací ethylenglykolu a polymerů methakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), při pH v rozmezí od 3 do 5.
10. 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), v 50 mM Na₃PO₄, 500 mM NaCl a při hodnotě pH upravené na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
11. 11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že eluování v kroku (f) se provádí za použití pufru, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu v rozmezí od 25 % do 30 %.
12. 12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že koncentrace ethanolu je mezi 28,5 % a 30 %.
13. 13. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že koncentrace ethanolu je 29 %.
14. 14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že afinitní chromatografícká pryskyřice v kroku (g) je představována zesíťovaným kopolymerem allyldextranu a N,N'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru, který je v rozmezí od 25 do 70 pm.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že granule jsou schopné frakcionovat globulární proteiny o molekulové hmotnosti od 20 000 do 8 000 000.
16. 16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že eluování v kroku (i) je prováděno s použitím pufru obsahujícího 200 mM glycinu a při teplotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
17. 17. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al.
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále zahrnuje lyofílizaci koncentrovaného roztoku rDSPA al.
19. 19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al a lyofílizaci tohoto koncentrovaného roztoku rDSPA al.
20. 20. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) aplikování média, které má pH v rozmezí od 4 do 7, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakiylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami;

    -16CZ 294827 B6 (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

    (c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného nebo pufrem ekvivalentní iontové síly;

    (d) přivedení eluovaného podílu z kroku (c) obsahujícího rDSPA al, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery;

    (e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

    (f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu větší než 25 %;

    (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al z kroku (f) při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4 na afínitní chromatografíckou pryskyřici, představovanou zesíťovaným polymerem allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve tvaru granulí s průměrem v rozmezí od 25 do 75 pm;

    (h) promývání této afínitní chromatografícké pryskyřice k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

    (i) selektivní eluování vázaného rDSPA al afínitní chromatografícké pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo pufru ekvivalentní iontové síly, za získání rDSPA ais čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.
21. 21. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) aplikování tohoto média, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém byly amino skupiny modifikovány karboxylovými skupinami;

    (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 použitím 100 mM acetátu sodného a 50 mM Na₂PO₄ při pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

    (c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;

    (d) aplikování eluovaného podílu z kroku (c) obsahujícího rDSPA al, při hodnotě pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami;

    (e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HC1, která obsahuje 19 % ethanolu, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

    - 17CZ 294827 B6 (f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;

    (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu, která frakcionuje globulámí proteiny o molekulové hmotnosti mezi 20 000 a 8 000 000;

    (h) promývání této afinitní chromatografické pryskyřice za použití 20 mM HC1 k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

    (i) eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.