JPH01304881A - ウロキナーゼ前駆体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明はウロキナーゼ前駆体（以下、単に前駆体と省略
）の製造方法に関する。詳細には、抗体アフィニティー
クロマトグラフィー処理により得られた前駆体含有画分
中に混在する抗体を含む夾雑蓋白を除去することを目的
とする前駆体の製造方法に関する。

〔従来技術］ 前駆体は生体内に存在する線維素溶解酵素の一種であり
、その詳細は特開昭６０−６２９８１号公報に記載され
ている。前駆体はそのままでは不活性であるが、プラス
ミン処理することにより酵素活性を発現する、いわゆる
チモゲンであり、ヒト腎細胞の無血清培地中にて生成で
きる。

前駆体は、アミノ酸４１１個からなる１本の鎖状構造を
有する分子量的５００００〜５５０００の蛋白である。

前駆体は上記の如く酵素活性を示さないが、プラスミン
処理により発現するブラスミノーゲンアクチベータ活性
は、抗ウロキナーゼ抗体により完全に阻害される。前駆
体はフィブリンに対して特異的な親和性を有し、また血
栓を構成する線維であるフィブリンを選択的に分解する
など、従来のウロキナーゼとは異なる血栓溶解特性を有
する。

ウロキナーゼとは異なる優れた特性を存する前駆体は線
維素溶解酵素として臨床上の幅広い利用が期待される。

前駆体の精製方法としては、ＣＭ−セファデックス処理
、抗前駆体抗体によるアフィニティークロマトグラフィ
ー処理（特開昭６Ｏ−６２９８１）、抗ＵＫ抗体による
アフィニティークロマトグラフィー処理、ＣｏｎＡ−セ
ファロース処理（特開昭６１−１７７９８７公報）等が
知られている。特に抗体アフィニティークロマトグラフ
ィー処理による方法は高純度の前駆体を得るために有用
な手段である。

〔発明が解決しようとする課題〕

このアフィニティークロマトグラフィーを利用すれば、
目的物質を簡単に効率よく純化することがｔきるが、一
方、このアフィニティークロマトグラフィーで使用する
抗体としては、人以外の動物に免疫して得られた抗体（
ＩｇＧ）、すなわち異種タンパクの場合が多く、また、
このアフィニティークロマトグラフィーのクロマト条件
においては、一般的にｐＨの変動が大きいなど過激な条
件で使用する場合もあるため、不溶性担体にリガンドと
して固定化した抗体、すなわち異種タンパクが多少なり
とも脱離してくるという問題点がある。

〔問題点を解決するための手段〕

゛そこで、本発明者らは、上記の事情に鑑み、各種検討
を重ねた結果、前駆体含有画分を、アミノベンズアミジ
ン、アミノフェニルグアニジン、塩基性アミノ酸から選
ばれる化合物を水不溶性担体に結合させた固定化担体を
用いて処理し、その非吸着画分を回収することにより、
抗体成分等を含む夾雑蒼白を除去できることを見出し、
本発明を完成した。

即ち、本発明はウロキナーゼ前駆体含有水溶液を、アミ
ノベンズアミジン、アミノフェニルグアニジン、塩基性
アミノ酸から選ばれる化合物を水不溶性担体に結合させ
た固定化担体を用いて処理し、その非吸着画分を回収す
ることを特徴とするウロキナーゼ前駆体の製造方法であ
る。

本発明で使用される前駆体は、そのままではほとんど線
溶活性を有しないが、プラスミン等の酵素処理により、
二本鎖ウロキナーゼに変換されて線溶活性を示すもので
ある。また、フィブリン存在下でも若干の線溶活性を示
すものである。

本発明で使用される前駆体のまず第１の代表例は、分子
量５ｏｏｏｏ〜５５００Ｇで、−末鎖のペプチド結合構
造を有するものである。

このような前駆体としては、たとえば構成アミノ酸４１
１個（アミノ酸配列は後記実施例・実験例における前駆
体の調製の項参照）のものが挙げられる（特開昭６０−
６２９８１号公報参照）。

上記前駆体の由来には特に制限はなく、たとえば、細胞
培養法、遺伝子工学法などにより調製されたものが例示
される。細胞培養法は特開昭６０−６２９８１号公報等
に、遺伝子工学法は特開昭６０−１８０５９１号公報等
に開示されている。

本発明でいう前駆体は上記のものに限定されず、その誘
導体をも包含する概念である。かかる誘導体としては前
駆体のエビダーマルグロースファクタードメインの全領
域もしくはその一部を欠失、または該全領域もしくはそ
の一部を他のアミノ酸残基で置換されている蛋白質分子
、前駆体のフィンガードメインの全領域もしくはその一
部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他のアミ
ノ酸残基で置換されている蓋白質分子等が挙げられる。

従って、特に言及しない限り、本願明細書において前駆
体とは前駆体自体および上記のごとき前駆体誘導体をも
意味するものである。

この前駆体誘導体は、通常分子量４万〜５万程度で前駆
体自体と同様に一本鎖のペプチド結合構造を有する。ま
た、その線溶活性の発現様式も上記前駆体自体と同じで
ある。

この誘導体は、たとえば遺伝子工学的な手法により調製
される。

前駆体の比活性としては、合成基質法で測定した場合に
そのままでは活性を示さず、フィブリン存在下で１００
〜１００ＯＵＫ単位／■程度、プラスミン処理時に８万
〜２０万ＵＫ単位／■程度が例示される。

本発明の出発原料は、抗体アフィニティークロマトグラ
フィー処理を行って得られた前駆体含有画分（水溶液）
が好適に用いられる。具体的には、夾雑蛋白として、抗
ＵＫ抗体、抗前駆体抗体、抗ＩｇＧ抗体などの抗体成分
を混在している前駆体含有画分（水溶液）が好適に用い
られる。

本発明で用いられる固定化担体はアミノベンズアミジン
、アミノフェニルグアニジンあるいは塩基性アミノ酸を
水不溶性担体に共有結合させたものである。

本発明で使用される塩基性アミノ酸としては、たとえば
アルギニン、リジン等が例示される。

水不溶性担体としては、自体既知のものを使用すればよ
く、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体などが好適に使
用される。

固定化は公知の方法に準じて行えばよい。たとえば、特
公昭５７−１３２６６号公報にその開示がある。また、
共有結合のために架橋剤および縮合剤を用いることも可
能である。−例を挙げると、シアン化ブロムで活性化し
たアガロースをε−アミノカプロン酸（架橋剤）と結合
させた後、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−カルボジイミド（ｔａ合剤）の存在下、アミノ
ベンズアミジン、アミノフェニルグアニジンまたは塩基
性アミノ酸と結合させて、固定化担体を得る。

かかるものの市販品としては、たとえばベンズアミジン
−セファロース６Ｂ（登録商標、ファルマシア社？りな
どがあげられる。

本発明の処理方法としてはカラム法、バッチ法のどちら
を用いてもよい。

バッチ法の場合、ｐＨ５〜９、イオン強度０．１〜ＩＭ
程度の緩衝液〔たとえば、０．１〜ＩＭ塩化ナトリウム
含有０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（６〜７）
等］に溶解した前駆体（蛍白濃度としては０．５〜１０
％であることが好ましい）を同じ緩衝液で平衡化した固
定化担体と接触させる。その条件としては、固定化担体
１ｄに対して溶液１〜１００戚と混合させ、４±２°Ｃ
で３０分〜２時間であることが好ましい。その後、遠心
分離して上清のみを採取する。

カラム法の場合は、ｐＨ５〜９の緩衝液（前記と同様）
に溶解した前駆体（蛍白濃度としては０．５〜１０％で
あることが好ましい）を同じ緩衝液で平衡化した固定化
担体（カラム）において展開させ、非吸着の透過画分を
回収する。

こうして得られた前駆体は、必要に応じて、さらに精製
された後、公知の方法により製剤化される。

〔効果〕

本発明の方法によれば、簡便な処理工程で前駆体を製造
することができ、しかも大規模処理にも適するので工業
的製法として橋めて有用である。

また、混在する抗体成分あるいはＵＫ等の夾雑蛋白が除
去できるので、得られた前駆体は純度がさらに向上して
おり、安全性にも優れた製剤を提供することができる。

〔実施例・実験例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例および実験
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。

実施例１ 培養人腎細胞を０１１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐＨ５，５
に調整した後、ＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０ば接
触した。０．１６　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，５）でカ
ラムを洗浄した後、０．１６　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８
，５）で吸着していた前駆体を溶出した。

一方、前駆体で予め免疫したウマから得られた抗血清を
精製して抗前駆体抗体を回収した。このウマ由来抗前駆
体抗体をＢｒＣＮ活性化アガロース（セファロース４Ｂ
、ファルマシア社製）に固定化した。

この抗体カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化し、これに前記の
前駆体を含有する溶出液を接触した。０．５Ｍ塩化ナト
リウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）でカラ
ムを洗浄した後、吸着していた前駆体を０．５Ｍ塩化ナ
トリうム含有０．２Ｍグリシンー塩酸水溶液（ｐＨ２，
５）で？８出させた。

溶出液を０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐ）１６．５　）によりｉ４縮・透析した。

ウサギ由来抗つマＩｇＧ抗体（ウマＩｇＧをつサギに免
疫して得られた抗血清を精製したもの）を固定化したア
ガロース（セファロース４Ｂ・ファルマシア社製）を上
記緩衝液で平衡化しておき・この前駆体含有画分を接触
させ、非吸着画分を回収した。

さらに、この両分を、上記緩衝液で平衡化したパラアミ
ノベンズアミジン−アガロース（ベンザミジン−セファ
ロース６Ｂ、ファルマシア社製）に接触させ、その非吸
着画分を回収した。

当該画分を除菌濾過した後、凍結乾燥した。

得られた前駆体の性状は以下の通り。

分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（還元下）で約５４０００であり、単一バンドを示した
。アミノ酸は配列を第１表に示す。

〔以下余白〕

比活性はプラスミン未処理時で１００ＵＫ単位／ｍｇ蛋
白、プラスミン処理時で１４万ｔＪ　Ｋ単位／ｍｇ蛋白
であった（活性は合成基質法により測定した）。

夾雑蛋白としては、ウマ抗体、ウサギ抗体とも検出限界
以下であった。

実験例１ 本発明の方法により、主にウサギ抗体の除去効果につい
て検討した。測定はＲＰＨＡ法によった。

結果を第２表に示す。

〔以下余白〕

以上の表のごとく、ベンザミジン処理を組込むことで異
種タンパクを効率良く除去できることが判明した。数値
的にはＮ１１ｌｌでは８８．１％以上の除去率、Ｎα２
では８７．２％以上の除去率となったが、これはＲＰＨ
Ａ法の検出限界での数値であり、実際にはほぼｌＯＯ％
除去できているものと考えられる。

特許出願人　株式会社　ミドリ十字

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウロキナーゼ前駆体含有水溶液を、アミノベンズ
   アミジン、アミノフェニルグアニジン、塩基性アミノ酸
   から選ばれる化合物を水不溶性担体に結合させた固定化
   担体を用いて処理し、その非吸着画分を回収することを
   特徴とするウロキナーゼ前駆体の製造方法。
2. （２）ウロキナーゼ前駆体含有水溶液が抗体アフィニテ
   ィークロマトグラフィー処理により得られる請求項（１
   ）の製造方法。