NO742216L - - Google Patents

Description

Isolering av koagulasjonsfaktorer fra biologisk materiale."

Nærværende oppfinnelse vedrorer isolering av blodkoaguerings-faktorene I (fibrinogen), VIII (antihemofilifaktoren, forkortet AHF) og faktor IX (også kalt B-faktoren) i hoye utbytter fra animalsk vevmateriale, slik som blod og blodprodukter (slik som plasma) eller plasmafraksjoner, eller renses B-faktoren fra et B-faktorkonsentrat, ved en fremgangsmåte som omfatter det ves-entlige adsorbsjonstrinn (slik som ved affinitetskromotografi)

av minst en av disse faktorer, i et væskesystem på en.ikke vannloselig gelmatrise, som består av et tverrbundet sulfaterat eller sulfonaterat, geldannende karbohydrat slik som tverrbundet dextran-sulfat-agaros, tverrbundet dextran-sulfat-dextran, tverrbundet heparin-agaros og andre lignende gelmatrisedannende substanser, f.eks. ex-benzidin-2,2-disulfonsyre-agaros.

Meget arbeid har gjennom årene vært lagt ned på å klarlegge mekanismene for blodets koagulasjon og å isolere de deltagende komponenter. Den store interessen for blodets koagulasjon kan henfores dels til den rent vitenskapelige interessen for systemet som sådant. Men fremfor alt er kunnskapen om hvordan blodets koagulasjon foregår og hvordan den kan påvirkes ytterst viktig ut fra klinisk synspunkt. Det' finnes fremdeles en rekke uklare punkter vedrorende mekanismene for blodets koagulasjon, men enighet hersker om at blodets koagulering kan beskrives som en prosess hvor okt aktivering av en sporkomponent ledsages av en suksessiv aktivering av en rekke komponenter som til slutt resulterer i dannelsen av et koagel (en clot). En relativt liten initieringseffekt resulterer således i en verdifull slutteffekt.

Imidlertid har bare et fåtall av de forskjellige komponentene i blodkoagulasjonssystemet hittil kunnet isoleres i ren form. Disse komponentene pleier vanligvis kalles koagulasjonsfaktorer og er trolig 12 i antall, hvorved hver og en betegnes med romerske siffre, dvs. faktor I, faktor II etc, ifolge den nomenklatur som opprettes av International- Commission on Hae-mostasis and Thrombosis (Thromb. Diathes, Haemorrhag. Suppl.13, 1964) .

I tilslutning til koagulasjonsfaktorene finnes også grunn til å nevne to andre system. Det ene er det system av inhibitorer som regulerer blodets koagulasjonstendens og forhindrer at blodpropper dannes. I dette system inngår bl.a. antitrombin III, faktor X a inhibitor, ' faktor XI ainhibitor. Det andre er det system som svarer for at eventuelt dannede blodpropper loses opp og kalles vanligvis det fibrinolytiske systemet. Som vik-tige komponenter inneholder dette plasmin og plasminogen.

Koagulasjonsfaktor I, fibrinogen, er i det strukturelement som bygger opp gel som man får ved blodets eller plasmaets koagulasjon og (2) et protein med en molekylvekt av ca 340.000„ Konsentrasjonen i plasmaet er ca 2 mg/ml plasma. Ved koagu-las jonsprosessen dannes et enzym, nemlig trombin som hydroly-tisk avspalter 2 peptider fra fibrinogenet. Avspaltingen av disse peptider fra fibrinogenet forer til at det sistnevnte forandrer struktur og begynner å polymerisere. Denne poly-merisering forer til dannelsen av en gel, dvs. et koagel.

Klinisk anvendes fibrinogen for å stoppe visse typer av blodninger. Å tilvirke fibrinogen for klinisk bruk er relativt vanskelig. Da fibrinogen er et omtålelig molekyl må fraksjon-eringsprosedyrene være meget skånsomme. Den storste vanske-ligheten er å få et fibrinogen av god kvalitet med hby koagu-lerbarhet som samtidig viser god stabilitet i vannlosning.

Koagulasjonsfaktor VIII, antihemofile faktoren (AHF) er et protein med molekylvekt omkring 1 million. Det forekommer i meget liten mengde i blodplasma, normalsentraksjonen er ca 10,ytg/ml plasma. En av de mest kjente arvelige koagulasjonsde-fektene kjennetegnes mangel på biologisk aktiv faktor VIII (AHF). Denne mangel er den klassiske hemofilin eller hemofili A. Alvorlig hemofili ytrer seg som en kraftig okt blodningstendens hvor det minste sår kan gi anledning til livsfarlig blodning.

Sykdommen opptrer allerede ved meget lav alder og mange forskjellige typer av komplikasjoner kan inntreffe. Meget vanlig er det at pasientene får gjenntatte blodninger som kan gi anledning til inflamasjoner i ledd og så etterhvert til invaliditet.

Dette gjor at flertallet pasienter med alvorlig hemofili er sterkt bevegelseshemmet allerede i 20-årsalderen hvis de ikke har fått behandling med preparater som inneholder AHF.

Den terapi som kan anvendes ved hemofili er transfusjon av humant fullstendig blod eller plasma og også forskjellige konsentrater som inneholder AHF. De medisinske fordeler ved å anvende konsentrat er påtagelige. De AHF-konsentrater som for nærværende finnes tilgjengelige kan inndeles i 2 forskjellige typer, dels hoykonsentrerte og dels lavkonsentrerte preparater. De preparater som hittil har vært mest anvendt er av den lavkonsentrerte typen. Eksempel på sådanne er kryoprecipitat ifolgé Pool (Pool J., Hershgold, E.K., Pappenhagen, A., Nature 203 (1964) sid. 312), og Cohn fraksjon 1-0 (ref. Blombåck M. Arkiv Kerai 12 (1958) sid. 387).

Begge disse lavkonsentrerte AHF-pr epar at er inneholder betydelige mengder fibrinogen. Ulempen ved denne typen preparater er at pasientene må infunderes med relativt store mengder AHF-opp16s-ning. I den seneste tid har såkalte høykonsentrerte AHF-preparater utviklet seg. Med dem kan en adekvat dose AHF gis i en opplosningmengde tilsvarende 10-15 ml. Denne typen av AHF-konsentrat er betydelig lettere å anvende enn den tidligere typen.

Klinisk synes de høykonsentrerte preparatene å virke godt, men visse ulemper finnes også ved disse. Fra isoleringssynspunkt blir utbyttet av AHF-aktivitet fra plasma relativt lavt.

Videre ivaretas i allminnelighet ikke ovrige proteiner som forekommer i de fraksjoner, fra hvilke man utvinner AHF.

Endelig krever disse metoder et utgangsmateriale av meget hoy klasse, dvs. blodplasmaet må være friskt eller frosset umid-delbart etter tilretteleggelsen.

Koagulasjonsfaktor IX er også kjent som B-faktoren fordi en

type av blodsykdom, nemlig hemofili B, beror på arvelig mangel i koagulasjonsfaktor IX. Hemofili B ytrer seg i en kraftig okt blodningstendens ved trauma og kirurgiske inngrep. I van-skelige tilfelle kan store subkutane og intramuskulære hematom opptre. Leddblodninger med sekundære leddeformeringer med invaliditet som folge er også relativt vanlig i forbindelse med hemofili B. Den behandling som kan gis er forskjellige former av substitusjonsterapi, dvs. transfusjon av blod, plasma eller en av de faktor IX konsentrat som nå finnes tilgjengelig.

Behandlingen kan enten være profylaktisk og gis over en lang

tid, bl.a. for å forebygge oppkomsten av forannevnte ledd-skader eller også kan den gis i forbindelse med tannuttrekninger, operasjoner og i andre tilfeller hvor blodningsrisikoen er stor. De behandlingsmetoder som nå finnes har flere ulemper. Transfusjon av blod og plasma innebærer en risiko for å overfore hepatit samt i noen grad å fremkalle immunisering. Med de nå forekommende faktor IX konsentratene gjelder at risikoen for

overforing av hepatit er påtagelig. Ved foreliggende oppfinnelse gis mulighet for å eliminere ovennevnte ulemper. De forskjellige metoder som omfattes av oppfinnelsen for å isolere koagulasjonsfaktorene I, VIII og IX har det felles at de inkluderer det ves-entlig nye trinnet å adsorbere en eller flere av dem fra et

væskesystem til et adsorbsjonsmiddel som er et sulfaterat eller en sulfonatgruppe som inneholder tverrbundet gelmatrisedannende karbohydrat. Således er koagulasjonsfaktorene bundet til gelen og renset på denne måten. Ved rensing eller isolering av koagulasjonsfaktor VIII anvendes den sulfaterte gelmatrisen for å adsorbere den dominerende fraksjonen, dvs. fibrinogen ut fra utgangsmaterialet.

Forsok med å anvende blodplasma som utgangsmateriale viste at under egnede betingelser kunne såvel faktor 1 som faktor IX bringes til å bindes nesten kvantitativt til heparininnholdende agarosegeljdvs. hver og en av disse faktorer separat.

Hver og en av faktorene I resp. IX ble deretter eluert ved å bringe den adsorbat-forende gelen i kontakt med en buffert,

som skiller seg i sammensetningen fra den hvor proteinmaterialet er lost. Renheten på proteinfraksjonene i utgangsmaterialet var dog varierende. Betydelig bedre resultat ble imidlertid oppnådd da Cohn fraksjon I pasta (Journal of the American Chemical

Society, 1946, vol. 48, sid. 459) resp. B-faktorkonsentrat ble anvendt som utgangsmateriale.

En utforingsform av oppfinnelsen består i at både' koagulasjonsfaktor I og faktor VIII kan isoleres parallelt fra samme utgangsmateriale, nemlig fra Cohn fraksjon 1-0 eller kryoprecipitat (Pool et al ovan). For eksempel viste forsoket med den gel som anvendes ved de forsok som ble gjennomfort ved denne fase av oppfinnelsen med dextransulfatagarose (agarosen kalt SEPHAROSE 4B, en perleformet agarosegel fremstilt ved å la 4%-ig agarose-opplosning forgele i perleform, et produkt fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J., USA, og Uppsala) at det var mulig å adsorbere hoveddelen av fibrinogenet på gelen og å få AHF-aktiviteten tilnærmet kvantitativt i den ikke adsorberte opp-16sningen.

Deretter kunne gelen skilles fra og det AHF som var tilbake i opplosningen kunne felles ut etter kjente metoder (f.eks. ifolge ovenfor sid. 4, rad 13-14, i Pool, Hershgold and Pappenhagen).. Deretter kan en høykonsentrert opplosning av AHF oppnås i en opplosning av denne felling i en liten mengde buffert. Fibrinogenet kunne elueres fra dextransulfat-SEPHAROSE-gelen ved en buffert med oket jonestyrke (f.eks. ved tilsetting av ikke adsorbert opplosning). Dette fibrinogen kunne senere felles ut og separeres og en høykonsentrert opplosning fremstilles fra denne.

Denne art av fremgangsmåte har mange fordeler i sammenligning med tidligere brukte til oppnåelse av høykonsentrerte AHF-preparater, f.eks. ble fremfor alt AHF-utbyttet betraktelig hoyere.

En ytterligere fordel er at foruten det hoye AHF-utbyttet kan fibrinogenet, som er eluert fra gelmatrisen, i samme isolering samtidig utnyttes. Et ytterligere verdifullt fremskritt er at også utdatert blod eller blodplasma kan anvendes som utgangs-materiåle for såvel AHF.som for fibrinogen ved denne nye metode.

Ved fremstillingen av faktor IX anvendes som utgang smat er iale et flakto<r>IX-konsentrat som fremstilles gjennom adsorbsjon av faktor IX sammen med diverse andre proteiner fra séntrifugatet fra Cohn (metode 6) fraksjon I til DEAE-SEPHADEX (en epiklorhydrin tverrbundet diaminoetyldextran i perleform, fremstillt av Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J., USA og Uppsala). Fremstilling av dette konsentrat finnes nærmere beskrevet av Tullis og medar-beiderne (New England Journal of Medicine, vol. 273 sid. 667, 1965). Koagulasjonsfaktor IX ble adsorbert fra dette konsentrat til heparin-SEPHAROSE 4B gel og andre lignende geler (som neden-for eksemplifiseres) og ble eluert fra gelen gjennom forandring av buffertkomposisjonen, dvs. ved å heve dens jonestyrke fra ca 0,06 M til ca 2 M natriumklorid. En slik oppnådd faktor IX viste spor av en ytterligere komponent som kunne påvises ved hjelp av immunelektroforese. Videre fra'ksjonering ved gelfiltrering på SEPHADEX G-150 (en epiklorhydrin tverrbundet dextran i perleform for gelfiltrering, som har en vanngjenvinningsverdi på 15/ml/gm, dvs. milligram pr. gram torrvekt, fremstillt av ovennevnte Pharmacia Fine Chemicals) ga et immunologisk rent preparat.

Imidlertid ble en viss heterogenitet oppnådd med hensyn til molekylvekt. Senere studier viste at dette berodde på at pre-parasjonen inneholdt både aktivert faktor IX og faktor IX i ikke aktivert form. Ikke aktivert faktor IX hadde en molekylvekt på ca 80.000 og den aktiverte faktoren hadde en molekylvekt på ca 50.000. Ved tilsetting av 0,002 M p-amino-bensamidin (en prote-asinhibitor) til bufferten som ble anvendt for opplosning av proteinutgangsmaterialet innen opplosningen ble blandet med den adsorberende gelen, oppnådde man en faktor IX preparasjon som var helt fritt for aktivert faktor IX og kun inneholdt ren faktor IX i ikke aktivisert form.

Belysende for de ikke vannloselige gelene som er virksomme ved prosessen ifolge oppfinnelsen er at disse har sulfatgrupper bundet til et gelformende polysakarid, som på sin side er bundet til en annen polysakariddel, slik som tverrbundet dextransulfat-agarose, tverrbundet dextransulfat-dextran, tverrbundet heparin-agarose, tverrbundet chondroitinsulfat-agarose og tverrbundet dextransulfat epiklorhydrin-agarose og geler som i forste rekke består av benzi-dinsulfonsyre-agarose bundet til en polysakariddel, slik som benzidin-2,2-disulfonsyre-agarose og benzidin-2,2-disulfonsyre-dextran. Den vanligste fremstillingsmetoden for disse geler in-diseres ved hjelp av evanogenbromid ved alkalisk pH.

Folgende eksempel belyser oppfinnelsen uten å innskrenke den:

Eksempel 1

Separering av AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon 1- 0 ved adsorbsjon av fibrinogenet til dextransulfat- SEPHAROSE- gel

Beredning av tverrbundet dextran-agarose-gel med anveldelse av SEPHAROSE 4B agarose. Cyanogenbromid (35 g) lostes i 500 ml vann, hvoretter 30 g dextransulfat ble tilsatt. Ca 1.000 ml SEPHAROSE

4B gel og 300 ml vann ble tilsatt og blandet.

Blandingen fikk stå under omroring og ble holdt konstant ved pH 11 i 7 minutter ved tilsetning av lut. Etter dette ble luttilsetningen stoppet og pH fikk langsomt synke. Omroringen ble fortsatt 2 dogn ved romtemperatur hvoretter gelen ble vasket. Den tverrbundne dextransulfat-SEPHAROSE 4B gelen var deretter ferdig for anvendelse.

Forsok vedLrorende fraksjonering av fibrinogen og AHF fra Cohn fraksjon 1- 0

Ca 10 g frysetorket Cohn fraksjon 1-0 fra friskt frosset plasma inneholdende ca 1.500 enheter AHF ble lost i 1.500 ml 0,02 M

citratbuffert pH 6,8. Torrsuget dextransulfat-SEPHAROSE 4B gel

(1.000 ml) ble tilsatt opplosningen og blandingen rort om i 30 minutter. Gelen ble deretter skilt fra og vasket med 200 ml citratbuffertopplosning. Den ikke adsorberte opplosningen og vaskevæsken ble slått sammen. Analyse av denne opplosningen inneholdt 6% av den opprinnelige proteinmengde og 65% av det AHF-aktive materialet som fantes i utgangsmaterialet Cohn fraksjon 1-0. AHF ble felt ut ved tilsetning av natriumcitrat ved pH 7,1 til den blandede opplosningen. Opplosning.av 0,4 g av dette AHF-precipitat i ca 35 ml av glycin-NaCl-fosfatbuffert (pH 6,9) gav en opplosning med en spesifikk aktivitet på 21 AHF-enheter/ml. Totalutbyttet AHF fra Cohn.fraksjon 1-0 var 55%. Desorbering av på gelen bundet fibrinogen skjedde ved eluering med 2 M NaCl. Størstedelen av fibrinogeninnholdet i utgangsmaterialet Cohn fraksjon 1 ble gjenvunnet.

AHF-analysene ble utfort etter J.J. Veltkampf m.fl., Thromb. Diath. Haemorrhag. 19-20 (1968) s. 279. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved å måle UV-absorbsjonen ved 280 nm.

Eksempel 2

AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon 1 pasta fra kryoprecipitat fra utdatert plasma gjennom adsorbsjon av fibrinogenet til dextransulf at- ECD- SEPHAROSE- qel ( ECD- SEPHAROSE betyr epiklorhydrin behandlede agaroseperler)

Ca 1 liter SEPHAROSE 4B ble blandet med 1 liter 1 M natriumhydroxyd, 20 ml epiklorhydrin og 5 g natriumborhydrid (NaBH^)• Blandingen ble holdt ved 60 C under omroring 1 h. Gelen ble vasket med varmt vann og blandet med 500 ml av en 2 M natrium-borhydridopplosning. Blandingen ble autoklavert ved 120°C i en time. Gelen ble deretter vasket med 500 ml av en 0,2 M natriumhydroxydopplosning som inneholdt 2,5 g natriumborhydrid. Iseddik ble tilsatt langsomt til blandingens pH.hadde sunket til ca 4. Gelen ble vasket med vann og. koblet med dextransulf at under anvendelse av cyanogenbromid på samme måte som beskrevet i eksempel 1.

Fraksjonering av fibrinogen og AHF fra Cohn fraksjon 1 pasta

Til en liter av en opplosning av Cohn fraksjon 1 pasta (fra utdatert plasma) i 0,02 M natriumcitrat buffert (pH 6,8) ble satt 1 liter av denne tverrbundne dextransulfat-ECD-SEPHAROSE som er fremstillt som ovenfor angitt. Blandingen fikk stå under omroring i 15 minutter , hvoretter gelen sammen med det bundne adsorbatet ble suget av på et filter. Den buffrede opprinnelige opplosningen, som for adsorbsjonstrinnet inneholdt ca 10 mg protein/ml opplosning og 0,5 enheter AHF/ml, inneholdt etter adsorbsjonen utstromning av 1,4 mg protein/ml og 0,36 AHF enheter/ ml. Fra denne opplosningen ble det AHF-aktive materialet utfelt ved tilsetning av natriumcitrat ved pH7,l. Opplosningen av 1 g av fellingen etter ovenstående i ca 20 ml glycin-NaCl fosfat buffert resulterte i en opplosning med en spesifikk aktivitet på 16 AHF enheter/ml. Totalutbyttet AHF var 62 prosent.

Desorbsjon av det på gelen bundne fibrinogen skjedde ved eluering med 2 M natriumkloridopplosning. Over 90% av fibrinogenet ble gjenvunnet.

Eksempel 3

AHF og fibrinogen fra kryoprecipitat ved initial- adsorbsjon av fibrinogenet på tverrbundet dextransulfat- SEPHAROSE- qel Tverrbundet Dextransulfat-SEPHAROSE 4B gel ble fremstillt som i eksempel 1. Til 1 liter av en opplosning av 10 g kryoprecipitat i 0,02 M natriumcitratbuffert (pH 6,8) ble tilsatt ca 1 liter av denne dextransulfat-SEPHAROSE-gel. Blandingen ble omrort i 15 minutter, hvoretter gelen ble suget av på et filter, og den ikke adsorberte opplosningen ble tatt vare på. Den opprinnelige opplosningen hadde inneholdt ca 14 mg protein/ml ikke-adsorbert opplosning og 1,4 AHF enheter/ml opplosning. Etter adsorbsjonen fantes 3,1 ml protein/ml opplosning og 0,97 AHF. enheter/ml. Det AHF-aktive materialet ble deretter feilt med natriumcitrat slik som tidligere beskrevet i eksempel 1 og 2. Desorbsjon av fibrinogen fra gelen skjedde med 2 M NaCl slik som beskrevet i eksempel 1 og 2. Utbyttet avAHF var 65% og av fibrinogen 8 2%.

Eksempel 4

AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon 1- 0 ved initial adsorbsjon av fibrinogenet til tverrbundet dextransulfat- dextran gel 15 g dextran "500" (gjennomsnittlig målvekt 500.000 ble opplost i 200 Imi vann. 10 g cyanogenbromid ble opplost i 100 ml vann, hvoretter 5 g dextransulfat "500" ble tilsatt. Opplosningene ble blandet og pH justert til 11 ved hjelp av natriumhydroxyd og holdt ved denne verdi i 7 minutter samtidig som blandingen ble rort om. Den gel som ble dannet under dette forlop fikk henstå i 24 timer under omroring og ble deretter vasket med 0,1 M natrium-bikarbonat-buffert og deretter med vann.

Fraksjonering av fibrinogen og AHF fra Cohn fraksjon 1- 0

De generelle fraksjoneringstrekk som er beskrevet i eksempel 1, ble utfort på Cohn fraksjon 1-0 fra ferskt frosset plasma som ble anvendt som utgangsmateriale. Dette resulterte i at de foran oppnådde gelene adsorberte 62% av proteinmaterialet. AHF-utbyttet var 90%. Fibrinogenet ble eluert kvantitativt med 2 M NaCl.

Eksempel 5

AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon l- O ved initial adsorberinq av fibrinogenet til tverrbundet Heparin- SEPHAROSE- gel

Tilberedning av Heparin- SEPHAROSE 4B gel

5 g cyanogenbromid ble opplost i 100 ml vann, hvoretter 1,5 g

heparin ble tilsatt opplosningen og opplosningen fikk stå under omroring, hvorved pH ble holdt konstant ved 11 i 7 minutter ved tilsetning av natriumhydroxyd. Etter dette ble luttilsetningen

stoppet og pH fikk langsomt synke. Omroringen fortsatte i 48 h i romtemperatur hvoretter gelen ble vasket på samme måte som i

eksempel 4.

Fraksjonering av fibrinogen og AHF fra Cohn fraksjon 1- 0

Til 30 ml av en opplosning av frysetorket Cohn fraksjon 1-0 fra

ferskt frosset plasma i 0,02 M natriumcitrat pH 6,8 ble tilsatt

10 g torrsuget heparin-SEPHAROSE-gel. Blandingen fikk henstå under omroring i 15 minutter, hvoretter gelen med adsorbatet ble suget av på et filter. 63% av den opprinnelige AHF-aktiviteten var tilbake i den ikke adsorberte opplosningen likesom 4% av den fibrinogenmengde som fantes fra begynnelsen. Det AHF-aktive materialet ble deretter feilt ut med natriumcitrat pH 7,1 som i eksempel 1. Fibrinogenet ble eluert fra gelen med 2 M NaCl. Utbyttet av fibrinogen var 85%.

Eksempel 6

AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon 1- 0 ved adsorbsjon av fibrinogenet til chondroitinsulfat- SEPHAROSE- gel

Tilberedning av tverrbundet chondroitinsulfat- SEPHAROSE- gel

1 g cyanogenbromid ble tilsatt en vannopplosning som inneholdt

250 mg chondroitinsulfat C, hvoretter 40 ml SEPHAROSE 4B gel ble tilsatt. Blandingen fikk henstå ved pH 11 under omroring i 7 minutter, hvoretter pH fikk synke og den resulterende gelen fikk stå under omroring i 2 dogn. Gelen ble så vasket og var ferdig for anvendelse.

Fraksjonering av fibrinogen ogAHF fra Cohn fraksjon 1- 0

Ca 0,2 g frysetorket Cohn fraksjon 1-0 fra ferskt frosset plasma ble opplost i 20 ml citratbuffert pH 6,8. Deretter ble 20 ml av den ovennevnte gelen tilsatt, og opplosningen fikk henstå i 15 minutter under omroring, hvoretter gelen med adsorbatet ble skilt fra ved filtrering. Analyse av filtratet viste at 44% av fibrinogenet hadde blitt adsorbert til gelen. AHF-utbyttet var 80%. Fibrinogenet ble desorbert fra gelen med 2 M NaCl slik som i noen av eksemplene 1, 2, 3, 4 eller 5.

Eksempel 7

AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon 1- 0 ved initial adsorbsjon av fibrinogen til dextransulfat- SEPHAROSE- gel preparert gjennom epiklorhydrinindikert tverrbinding

Tilberedning av tverrbundet dextransulfat- SEPHAROSE- gel ifolge ECD- fremgangsmåten 1 liter SEPHAROSE 4B gel blandes med 500 ml av en vannopplosning som inneholder 30 g dextransulfat. Til denne blanding tilsettes 1 liter M natriumhydroxydopplosning, 40 ml epiklorhydrin og 10 g natriumborhydrid. Blandingen holdes ved 60°C under omroring i en time. Den resulterende gelen vaskes med varmt vann og blandes med 500 ml 2 M natriumhydroxydopplosning og 5 g natriumborhydrid.

Blandingen ble autoklavert i en time ved 120°C, hvoretter gelen ble vasket med en lutopplosning som inneholdt natriumborhydrid. Deretter ble iseddik langsomt satt til pH 4. Gelen ble vasket med vann og var deretter ferdig for anvendelse.

Fraksjonering av fibrinogen og AHF fra Cohn fraksjon 1- 0

Frysetorket Cohn fraksjon 1-0 fra ferskt frosset plasma ble dispergert inn i citratbufferten og blandet med den tverrbundne dextransulfat-SEPHAROSE 4B gelen slik som beskrevet i eksempel 1. Gelen med sitt adsorbat, den ikke adsorberte opplosningen og vaskingen av gelen ble behandlet som i eksempel 1. Den ikke adsorberte opplosningen som ble oppnådd etter fibrinogenadsorb- sjon på gelen hadde 5% av det opprinnelige proteininnholdet tilbake, og .57% av sin AHF-aktivitet. Det AHF-aktive materialet kunne siden bli feilt ut med natriumcitrat, f„eks. som

i eksempel 2. Eluering av fibrinogenet fra gelen med 2 M NaCl gav 90% utbytte.

Eksempel 8

AHF og fibrinogen fra Cohn fraksjon 1- 0 ved adsorbsjon av fibrinogenet til benzidin disulfonsyresubstituert SEPHAROSE- gel Tilberedning av benzidin disulfonsyresubstituert SEPHAROSE- gel

250 ml SEPHAROSE 4B gel ble blandet med 100 ml vann og tilsatt 10 g cyanogenbromid opplost i 100 ml vann. Ved tilsetting av en opplosning av natriumhydroxyd okte pH til 11 og ble holdt

på dette nivå under omroring i 7 minutter, hvoretter den behandlede gelen ble suget av på glassfilter og vasket med isvann. 14 g benzidin-2,2-disulfonsyre ble opplost i 60 ml vann under samtidig luttilsetning for å holde pH ved 7. Benzidindisulfon-syreopplosningen ble tilsatt gelen og blandingen fikk stå under omroring ved +5°C over natten, hvoretter gelen ble vasket med buf f er topp 16 sn ing er.

i

Fraksjonering av fibrinogen og AHF fra Cohn fraksjon 1- 0

Ca 1/2 g frysetorket Cohn fraksjon 1-0 fra ferskt frosset plasma ble opplost i 40 ml vann og 10 ml torrsuget gel ble tilsatt, hvoretter blandingen ble rort om i 30 minutter. Gelen ble fil-trert av, og fibrinogenet eluert fra gelen med 2 M NaCl opplosning slik som i noen av de tidligere eksemplene. Det AHF-aktive materialet ble feilt ut og fjernet ved anvendelse av natriumcitrat slik som beskrevet i tidligere eksempler. 85%

av det opprinnelige fibrinogenet hadde blitt adsorbert til matrisen og AHF-utbyttet var 80%.

Eksempel 9

Faktor IX oppnådd ved adsorbsjon av plasma til heparin- SEPHAROSE- qel

Heparin-SEPHAROSE-gel ble preparert ved at 100 ml av en vannopplosning av heparin inneholdende 5.000 enheter/ml ble blandet med 200 ml SEPHAROSE 4B gel, hvoretter 4 g cyanogenbromid ble tilsatt. pH ble justert til 11 og ble holdt der i 7 minutter, hvoretter pH ble tillatt å synke. Gelen fikk så stå under omroring over natten, ble vasket dagen derpå og var dermed ferdig til anvendelse.

På en kolonne (volum 200 ml) pakket med den tverrbundhe heparin-SEPHAROSE-gelen og i likevekt med 0,02 M tris(hydroxymetylamino-metan), 0,01 M citrat, 0,15 M NaCl buffert pH 8,4 ble applikert 40 ml menneskeplasma. Ved eluering av denne tverrbundne gel med samme iIbuffert gikk den ikke adsorberte hoveddelen av plasmaet rett gjennom kolonnen. Adsorbatet i kolonnen ble deretter eluert ved gradienteluering med 0,05 M citratbuffert pH 5, hvis jonestyrke ble oket kontinuerlig med tilsetning av 2 M NaCl. Dialyse av dette eluat mot destillert vann og påfolgende frysetørking av dialysatet gav en fraksjon med faktor IX aktivitet, der den spesifikke aktiviteten var 60 ganger opprinnelsesplasmaets regnet pr. mg protein. Utbytte 35%.

Bestemmelse av faktor IX aktivitet ble gjort ved koagulasjons-analyse ifolge metoden i J.J. Veltkampf et al. (Thromb. Diath. Haemorrhag., 19-20 (1968) s. 279).

Eksempel 10

Faktor IX oppnådd av B- faktorkonsentrat ved adsorbsjon til heparin- SSPHAROSE- gel

B-faktorkonsentratet som anvendes som utgangsmateriale med en aktivitet av 8 faktor IX enheter/ml ble preparert ved adsorbsjon av overvæsken fra Cohn fraksjon 1 (Jour. Am. Chem. Soc, supra sid. 6, radene 18-19) til DEAE-SEPHADEX-gel og etterfolgende

eluering fra denne gel.

Ca 0,5 g frysetorket protein inneholdende omkring 400 enheter faktor IX ble opplost i 35 ml 0,03 M natriumcitrat 0,06 M NaCl pH 7,6 buffert. Opplosningen ble applikert på en kolonne (volum 210 ml) av tverrbundet heparin-SEPHAROSE 4B gel preparert ifolge eksempel 5, som hadde likevekt med denne citrat-NaCl buffert. Ved eluering av denne tverrbundne gel. med samme buffert gikk den ikke adsorberte hoveddelen av opprinnelseskon-sentratet rett gjennom kolonnen. Desorbsjon av adsorbert faktor IX kom frem ved gradienteluering med 0,1 M eddiksyre natrium-acetat buffert pH 5,0 ved kontinerlig oking av jonestyrken ved tilsetning av tilsvarende buffert inneholdende 2 M NaCl. Frysetorking av dette eluat gav i utbytte en proteinfraksjon med hoy faktor IX aktivitet..

Beregning av aktivitetsutbyttet viste at 86% av aktiviteten

var blitt gjenvunnet. Immunoelektroforese viste at dette pro-

dukt inneholdt sporelement av ytterligere en komponent. Ytterligere gelf iltrering på ...SEPHADEX G-150 gav aktivitet på to om-råder, dels ved eluering,'.tilsvarende en molvekt på ca 80.000 og dels ved eluering ved molvekt på 50.000. Materialet med den lavere molvekten er sannsynligvis aktivert faktor IX. Rensningsgraden av materialet med den hoyere molvekten jamfort med utgangsmaterialet viser en ca 40 gangers rensning.

Eksempel 11

Faktor IX fra B- faktor konsentrat ved adsorbsjon på tverrbundet heparin- SEPHAROSE- gel i nærvær av en proteas- inhibitor

Ca 0,5 g frysetorket B-faktorkonsentrat (som i eksempel 10) inneholdende omkring 400 enheter faktor IX ble opplost i 35 ml 0,03 M citrat, 0,06 M NaCl, 0,002 M p-aminobenzamidin buffert pH 7,6. (p-aminobenzamidin er en proteas-inhibitor som inhi-

berer bl.a. trypsin og trombin). Opplosningen ble applikert på

en kolonne inneholdende tverrbundet heparin-SEPHAROSE 4B gel,

som deretter ble eluert som i eksempel 10.

En fraksjon med hoy faktor IX aktivitet ble oppnådd etter eluering med 0,01 M tris(hydroxymetylaminometan)buffert„ Videre separering på SEPHADEX G-150 gel gav et aktivt homogent protein med en molekylvekt av 82.000. Totalutbyttet faktor IX aktivitet var 370 enheter (92%) og 5 2 gangers rensning..

Eksempel 12

Aktivert faktor IX fra Cohn ( metode 6) fraksjon III ved adsorbsjon av tverrbundet heparin- SEPHAROSE- gel

Ca 10 kg Cohn (metode 6) fraksjon III pasta (Jour. Am. Chem. Soc. supra sid. 6 radene 18-19) ble opplost i 40 liter 0,01 M dinatrium monohydrogen- og dihydrogenfosfat, 0,15 M NaCl (pH7) buffert. Ulost materiale ble sentrifugert av. Opplosningen ble tilsatt 18 liter DEAE-SEPHADEX-gel. Denne blanding fikk stå under omroring i 1 time, hvoretter DEAE-SEPHADEX-gelen ble skilt fra og vasket med ovennevnte buffert. En kolonne ble pakkeJ: med gelen, som siden ble desorbert med 0,05 M fosfat, 1 M NaCl pH 7 buffert. En fraksjon (eluat)med 180 g protein med faktor IX aktivitet ble oppnådd. Denne fraksjon ble dialysert forst mot destillert vann og deretter mot 0,03 M eitrat, 0,06 M NaCl pH 7,6 og ble siden adsorbert til 6 liter tverrbundet heparin-SEHAROSE 4B gel. Denne adsorberende gel ble pakket på en kolonne og eluert deretter ifolge eksempel 9.

Man oppnådde en fraksjon med faktor IX aktivitet. Studier med gelfiltrering viste at dette material var hovedsakelig aktivert faktor IX, dvs. komponenten med molekylvekt omkring 50.000.

Eksempel 13

Faktor IX fra B- faktor konsentrat ved adsorbsjon til tverrbundet heparingel

Tverrbundet heparingel ble preparert ved å tilsette en opplosning av 100 ml heparin (5,000 enheter/ml) 6 g cyanogenbromid. pH ble justert til 11,0 og holdt der i 8 minutter, hvoretter pH fikk synke. Derved ble det dannet en gel som fikk stå noen timer og ble vasket med bikarbonatbuffert og deretter med vann, hvoretter den tverrbundne heparingelen var ferdig til anvendelse.

En kolonne ble pakket med denne gel og en opplosning av B-faktorkonsentrat (slik som beskrevet i eksempel 10) ble applikert på den. Adsorbsjon og eluering ble utfort ifolge eksempel 9 og en faktor IX fraksjon ble oppnådd med en relativt hoy grad av rensning, 26 ganger famfort med utgangsmaterialet B-faktorkonsentrat. Utbyttet var 62%

Faktor IX fra B- faktorkonsentrat ved adsorbsjon til tverrbundet dextransulfat- SEPHAROSE- gel

Tverrbundet dextransulfat-SEPHAROSE-gel ble preparert ved tilsetning av 100 ml SEPHAROSE 4B gel til 50 ml dextransulfat og deretter 2 g cyanogenbromid. pH ble justert til 11 og ble holdt der i 7 minutter, hvoretter det ble tillatt å synke.

Det tverrbundne dextransulfatet fikk stå over natten og ble si-

den vasket. Denne tverrbundne gel ble pakket i en kolonne og en opplosning av B-faktorkonsentrat (slik som i eksempel 10)

ble applikert. Desorbsjon og eluering ble utfort som i eksempel 9. Den oppnådde rensningen tilsvarte omtrent 12

ganger utgangsmaterialets og utbyttet var 17%.

Eksempel 15

Faktor IX fra B- faktorkonsentrat ved adsorbsjon til tverrbun-

den chondroitinsulfat C- SEPHAROSE- gel

Tverrbundet chondroitinsulfat C-SEPHAROSE-gel ble fremstilt

ved å anvende chondroitinsulfat C i en prosess tilsvarende den som ble anvendt for tverrbundet dextransulfat-SEPHAROSE-gel i eksempel 6.

Den resulterende tverrbundne gelen ble pakket i en kolonne og

en opplosning av B-faktorkonsentrat (som i eksempel 10) ble applikert på den og eluering og desorbsjon ble utfort som i eksempel 9. Den oppnådde rensningsgraden var omtrent 30

ganger utgangsmaterialets og utbyttet var 37%

Eks^ mppl 16

Rensning av faktor I, VIII og IX fra samme startmateriale

Dextransulfat-SEPHAROSE-gel ble preparert ifolge eksempel 1

med unntagelse av en okning ("uppskalning") opp til 10 liter gel. Heparin-SEPHAROSE-gel ble preparert ifolge eksempel 9 men ble okt ("uppskalades") til tilsvarende 1 liter gel. 30 kg frosset plasma ble tint opp, hvoretter eh felling av Cohn (metode 6) fraksjon 1 gjennom 8% etanol og sentrifugering i en sentrifuge fulgte. Overskuddsopp16sningen ble samlet opp og brukt til preparasjon av faktor IX, slik som beskrevet senere i dette eksempel. Fraksjon I pastaen ble skåret i biter og opplost i 9,6 liter 0,02 M citratbuffert, pH 6,8. Til opplosningen i ble tilsatt 180 ml 2% Al(OH) - i gel og opplosningen ble rort om i 30 minutter og gelen tatt bort ved sentrifugering. Til dinne opplosningen ble deretter tilsatt 10 liter dextransulf al SEPHAROSE-gel, og blandingen ble rort om i 30 minutter. Gelen ble skilt av på et filter og det AHF-aktive materialet som fantes i opplosningen ble felt ved tilsetning av natriumcitrat som tidligere beskrevet. Det felte materialet inneholdt 0,7 enheter AHF/mg protein og kunne loses opp, hvorved en opplosning ble oppnådd som inneholdt 30 AHF enheter/ml. Utbyttet slik som det ble beregnet etter AHF-innhoIdet.i plasmaet var 34%. Fibrinogenet (faktor I) kunne oppnås ved eluering av dextransulfat-SEPHAROSE-gelen med 2 M NaCl. Det oppnådde fibrinogenet var 89% rent og utbyttet 84%.

Faktor IX ble preparert fra overskuddsopplosningen etter felling av Cohn fraksjon 1. Til denne opplosning (32 liter) ble satt 5 liter svellet DEAE-SEPHAROSE-gel. Blandingen ble rort om i 1 time, hvoretter gelen ble separert ved avsugning. Etter vasking ble DEAE-SEPHADEX-gelen eluert med 0,05 M fosfat 1 M NaCl,

pH 7,0. Den oppnådde proteinfraksjonen ble dialysert mot 0,03 M citrat, 0,06 M NaCl, pH 7,6. Til denne opplosningen ble deretter tilsatt 1 liter heparin-SEPHAROSE-gel under omroring. Gelen ble pakket i en kolonne og desorbert ifolge eksempel 9.

En fraksjon med faktor IX aktivitet ble oppnådd, som etter dialyse og frysetørking ble underkastet gelfiltrering på SEPHADEX G200. En faktor IX preparasjon ble oppnådd som inneholdt 5 2

enheter/mg protein. Det totale utbyttet fra plasmaet var 47%.

Eksempel 9 til 15 viser isolering av en enkel blodkoagulasjonsfaktor, dvs. faktor IX fra ulike utgangsmaterialer.

Eksempel 1 til 8 illustrerer tilsvarende isolering av de to blodkoagulasjonsfaktorene og AHF (Fl og FVIII) fra et tilsvarende eneste utgangsmateriale.

Eksempel 16 belyser den separate isoleringen av hver og en av de tre blodkoagulasjonsfaktorene fra et eneste utgangsmateriale.

De forskjellige eksemplene viser bruken av tilsvarende spesi-

fikke utgangsmaterialer for noen, en to eller tre av blodkoa-gulasjonsf aktorene I, VII og IX. Imidlertid kan hvilke som helst animalske blodprodukter anvendes som inneholder noen av disse blodkoagulasjonsfaktorer. Slike blodprodukter kan stamme fra et hvilket som helst dyr, det være seg av humant eller bovint eller annet pattedyr eller annet dyrs opprinnelse som inneholder noen av disse koagulasjonsfaktorer.

Uttrykket "animalt blodprodukt11 omfatter da i for ste rekke blodserum, blodplasma (enten friskt eller utdatert) liksom hvilken som helst av de fraksjoner som inneholder blodkoagula-sjonsf aktorer eller konsentrat som stammer fra humant eller bovint blod eller blod fra et annet dyr, blodserum eller blodplasma, slik som kryoprecipitat, såvel som tidligere tilgjengelige typer av AHF-konsentrat som de såkalte dels lav- og dels høykonsentrerte preparasjonene eller de såkalte konsentrerte AHF-fremstiIlingene eller B-faktorkonsentrat.

Dextransulfatet som anvendes i flere av eksemplene er i den form det leveres av tilvirkerne (tidligere nevnte Pharmacia Fine Chemicals) faktisk natriumdextransulfat. Vanligvis kalles det

bare dextranrsulfat, ikke bare av tilvirkerne<p>g i deres litteratur, men også i annen litteratur. Det leveres som natrium-

salt på grunn av den lengre lagringsstabiliteten i denne form. Det kan i oppfinnelsen anvendes i begge formene, slik at be-nevnelsen "sulfatdextran" her også anvendes for natriumsalt-formen.

SEPHAROSE 4B leveres ikke som torre perler. I de eksempler

der anvendelsen av en viss mengde av dette adsorberingsmiddel omtales anvendes den således i samme form som den leveres, nemlig i en tyktflytende men ikke fritt flytende form.

I uttrykket "tverrbundet dextransulfatepiklorhydrinagarose" betyr delen "epiklorhydrinagarose" at agarosen frittstående har reagert separat med epiklorhydrin. Således angir 'tverrbundet" i det lengste av disse to siterte uttrykk som eksempel 2 viser, at det til og med fantes en tverrbinding ved en separat tverrbindingsreaksjon mellom dextransulfat og den epiklorhydrin-behandlede agarosen.

Dessuten viser eksempel 7 at epiklorhydrinet kan anvendes som tverrbindingsmiddel i reaksjonsmediet inneholdende dextransulfat og agarose (f.eks. SEPHAROSE 4B) for å fremkalle tverrbind-ingen mellom de to polysakkaride substansene som anvendes for å preparere den tverrbundne ikke vahnloselige gelmatrisen for fremgangsmåten ifolge opprinnelsen. Således refereres til den slags gelmatrise i eksempel 11 som ECD-tverrbundet dextransul-fatagarosegel.

Den tverrbundne benzidin-2,2-disulfonsyreagarosen ifolge eksempel 8 kan i denne fremgangsmåten erstattes med tilsvarende mengde tverrbundet benzidin-2,2-disulfonsyredextran ved å er-statte den anvendte SEPHAROSE 4B ved preparasjon av dens tverrbundne benzidinagarosegel med tilsvarende mengde dextran.

Allment kan den spesifikke bufferten som ble anvendt i alle eksemplene som opplosningsmiddel for utgangsmaterialet animalt blodprodukt eller hvilket som helst adsorbat eller hvilket som helst precipitat erstattes med hvilken som helst annen buffert i vannopplosning som er forenlig med utgangsmaterialet blodprodukt, adsorbat eller precipitat og oppnår nodvendig pH for å opplose det spesifikke vevproduktet, adsorbatet eller pre-cipitatet.

Den ikke opploste delen av hvilken som helst utgangsmaterial-opplosning kan normalt vaskes ut av den adsorberte blandingen eller kolonnen gjennom en eneste mengde utgangsmaterialbuffert-opplosning lik gelmengden som anvendes i blandingen eller kolonnen.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen muliggjor å tilby (1) et fibrinogenprodukt som inneholder fra ca 80 til 90% av foreliggende fibrinogen, (2) en koagulasjonsfaktor VIII (AHF) produkt av storre renhet enn den hos noe som helst AHF-produkt som kan oppnås på markedet og det reneste koagulasjonsfaktor B (faktor IX) produktet.

Dette tilbyr en verdifull fordel ved at man meget markert re-duserer væskemengden som inneholder noen som helst av disse tre koagulasjonsfaktorer som skal injiseres i en pasient og folgelig ikke bare spare kostnader, men også minsker ubehaget for pasi-enten. AHF-produktet fra friskt plasma preparert ved metoden ifolge eksempel 2 og 16 finnes f.eks. å få i en konsentrasjon av 30 AHF-enheter pr. ml. Dette muliggjor tilforsel av en hoyst effektiv dose bare som en ordinær injeksjon gjennom en injeksjonssproyte og eliminerer behovet for dråpeinfusjon.

Oppfinnelsen er blitt forklart ved en detaljert beskrivelse av visse spesifikke detaljer derav, men det er underforstått at forskjellige modifikasjoner kan gjores innenfor rammen av ved-lagte patentkrav.

Claims (17)

1. Fremgangsmåten for isolering av minst en av blodkoagula-sjonsf aktorene fibrinogen, antihernofilifaktor VIII og faktor IX (B-faktor) fra animalske blodprodukter som inneholder minst noen av dem av fibrinogen, AHF og B-faktoren, karakterisert ved at et i vann uopploslig gelmatriseadsorb-sjonsmiddel, preparert fra tverrbundet dextransulfatdextran, tverrbundet dextransulfatagarose, tverrbundet dextransulfatepi-klorhy <l> drinagarose, dextransulfatepiklorinhydrin tverrbundet agarose, tverrbundet chondroitinsulfatagarose tverrbundet heparinagarose, tverrbundet heparin, tverrbundet benzidin-2,2-disulfonsyreagarose og tverrbundet benzidin-2,2-disulfonsyre-agarose og tverrbundet benzidin-2,2-disulfonsyredextran bringes i kontakt med nevnte animalske blodprodukter opplost i en vannopplosning som ellers er inert overfor deri opplost innehold av nevnte blodprodukt.

2. Fremgangsmåten ifolge krav 1, karakterisert ved at nevnte animalske blodprodukt er blod.

3. Fremgangsmåten ifolge krav 2, karakterisert ved at nevnte blodprodukt er humant blod.

4. Fremgangsmåten ifolge krav 3, karakterisert ved at nevnte blodprodukt enten er friskt eller utdatert plasma eller en plasmafraksjon.

5. Fremgangsmåten ifolge krav 4, karakterisert ved at nevnte adsorberte faktor er B-faktor og nevnte adsorberingsmiddel er tverrbundet heparin-agarose.

6. Fremgangsmåten ifolge krav 5, karakterisert ved at nevnte blodprodukt er en plasmafraksjon.

7. ■ Fremgangsmåten ifolge krav 5, karakterisert ved at nevnte blodprodukt er isolert fra Cohn (metode 6)

8. Fremgangsmåten ifolge krav 4, karakterisert ved at nevnte blodprodukt inneholder fibrinogen og antihemofilifaktoren (faktor VIII), at fibrinogenet adsorberes derfra .på nevnte adsorbsjonsmiddel og at fremgangsmåten videre omfatter separasjon av gelmatriseadsorbsjonmiddelet som er bærer av nevnte fibrinogen fra den ikke adsorberte resten av opplosningen av nevnte blodprodukt, likesom å separere antihemofilifaktoren (faktor VIII) fra nevnte rest av den nevnte opplosning.

9. Fremgangsmåten ifolge krav 8, karakterisert ved at nevnte blodprodukt består av Cohn (metode 6) fraksjon 1 pasta, som er opplost i en uorganisk saltopplosningsbuffert for nevnte pasta ved pH ca 6,8, at den adsorberende gelmatrisen er tverrbundet dextransulfatagarose som er behandlet med epiklorhydrin, at antihemof i lif aktoren' separeres fra nevnte ikke adsorberende rest av opplosningen av nevnte pasta ved tilsetning i av natriumcitrat ved ca pH 7,1, at den utfelte antihemofilifaktoren separeres fra nevnte vannopplosning og at fibrinogenet separeres fra nevnte gelmatriseadsorberingsmiddel ved eluering med en vannopplosning av natriumklorid fra 1 M til ca 2 M.

10. Fremgangsmåten ifolge krav 4, karakteris, ert ved at nevnte blodprodukt inneholder koagulasjonsfaktor IX (B-faktor) og er opplost i en buffert for nevnte blodprodukt ved pH 7 til ca 8,4 og at nevnte metode videre inneholder separasjon av gelmatriseadsorberingsmiddel som bærer nevnte B-faktoradsorbat og separasjon av nevnte B-faktor fra nevnte ad-sorbs jonsmiddel ved eluering av faktoren ved gradienteluering med en vannopplost buffert pH 5 og fortlopende oking av jonestyrken i nevnte buffert.

11. Fremgangsmåten ifolge krav 10, karakterisert ved at nevnte blodkoagulasjonsfaktor (faktor IX) fjernes fra nevnte eluatopplosning ved dialyse av deri opploste dialyserbare emner og frysetorking av dialyseresteXK

12. Fremgangsmåten ifolge krav 11, karakterisert ved at nevnte gelmatriseadsorberingsmiddel er tverrbundet heparinagarose.

13. Fremgangsmåte: ifolge krav 11, karakterisert ved at nevnte blodprodukt er en plasmafraksjon og at den nevnte vannopploste bufferten i seg selv inneholder en vannopp-loselig proteaseinhibitor inert. mot nevnte plasmafraksjon og de 1 bufferten opploste emnene.

14. Fremgangsmåte ifolge krav 13, karakterisert ved at nevnte proteaseinhibitor er p-aminobenzamidin.

15. Fremgangsmåte ifolge krav 10, karakterisert ved at nevnte buffert består av 0,02 M tris (hydroxymety1) aminometan, 0,01 M citrat, 0,15 NaCl for å tilveiebringe en pH av ca. 8,4.

16. Fremgangsmåte ifolge krav 4, karakterisert ved at nevnte blodprodukt er plasma og inneholder fibrinogen, antihemofilifaktoren (faktor VIII) og koagulasjonsfaktoren IX (B-.faktoren) og at nevnte blodplasma er opplost i en vannopplost buffert som tilveiebringer en pH mellom 7 og 8,4, hvilken metode videre omfatter separasjon av nevnte gelmatriseadsorberingsmiddel fra den ikke adsorberte hoveddelen av plasmaet som separerer B-faktoradsorbatet fra nevnte adsorberingsmiddel ved gradienteluering med en passende buffert pH 5 og med fortlopende 6'king av ionestyrken fra omkring 0,01 M til 2 M av et passende vannopploslig uorganisk salt ved separasjon av de dialyserbare saltene fra eluatet ved dialyse og fryse-tørking av dialyseresten av B-faktoren, å endre den alkaliske bufferten i nevnte ikke adsorberte hoveddel av plasmaet til en buffert pH på ca. 6,8 og å bringe den resterende opplosningen som inneholder fibrinogenet og antihemofilifaktoren med en av de nevnte vannuopploslige gelmatriseadsorberingsmidler i en tid tilstrekkelig for å adsorbere fibrinogenet fra nevnte opplosning, se-parerende sistnevnte adosrbsjonsmiddel med dets fibrinogenadsorbat fra den nye ikke adsorberende resten av nevnte proteinopplosning og separering av fibrinogenet fra nevnte adsorbsjonsmiddel ved eluering med en vannopplosning av ca. 0,001 M til ca. 2 M natrium klorid, samt å tilsette natriumcitrat til ca pH 7,1 til nevnte ikke adsorberte opplosning for å oppnå felling av antihemofilifaktoren.

17. Fremgangsmåten ifolge krav 1, karakterisert ved at nevnte blodprodukt bringes i kontakt med nevnte ikke' vannopploslige gelmatriseadsorberingsmiddel i en tid som er tilstrekkelig for at nevnte fibrinogen eller B-faktor skal kunne adsorberes til nevnte adsorberingsmiddel og at nevnte opplosningsmiddel anvendes i en mengde som er tilstrekkelig for å adsorbere minst 15% av nevnte fibrinogen eller B-faktor.