JPS6226231A - 生理活性物質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトに由来する正常二倍体細胞を利用して高収
率で新規なプラスミノーゲン活性化因子　　ごを生産す
る方法に関するものである。

（従来の技術） 現在、プラスミノーゲン活性化因子としては、人尿また
は培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼおよび微
生物由来のストレプトキナーゼが、血栓溶解剤として実
用に供されている。

しかし、これらは、フィブリンに対する親和性の点で劣
るので、治療に際し必要な効果を得るには、大量に投与
する場合が多く、内出血などの副作用が発現することが
知られている。すなわち１これらＫよって循環血液中で
生成されるプラスミ／は、血中のプラスミンインヒビタ
−と結合して速やかに失活するため、治療効果をあげる
ためには、これらを大量に投与して、血中のプラスミン
インヒビタ−の量を上回るプラスミンを生成する必要が
ある。その結果、大量のプラスミンが生成され、フィブ
リノーゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起
こすことになる。

これに対しフィブリンに親和性が高く、フィブリン上で
プラスミンを生成することができれば、循環血液中のプ
ラスミンインヒビタ−の影１’！けることなく、少量で
フィブリンを分解することができ、循環血液中のフィブ
リノーゲンを分解する作用も弱くなる。このような実情
から、フィブリンに対して親和性が高く、少量でかつ血
栓溶解性が高く、シかも副作用の少ない血栓溶解剤が望
まれている。

本発明者らは、既にヒトの正常二倍体細胞の培養液中に
、下記性質を有するフィブリン親和性が高い新規なプラ
スミノーゲン活性化因子を見い出した。（特開昭５９−
５１２２０） ａ）分子量：　　６３０００±１００００ｂ）等電点：
７．０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：　ありｄ）コンカナバ
リンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐＨ：　７．０〜
９．５ｆ ）抗ウロキナーゼ特異抗体と反応しない。

更に１実用に供すべく検討した結果、ヒトの正常二倍体
細胞と接触させて該因子を生成せしめる溶液中に１多量
の動物肉酵素分解ペプトンを存在させ、該因子の生成量
を高める効率的な生産方法も、既に見い出した。（特開
昭５９−１３４７３３）（発明が解決しようとする問題
点） しかしながら、該因子を大量に工業的規模で提供するた
めには、上記方法では不十分で、さらに高収量で該因子
を得る生産方法の開発が望まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、この目的のために鋭意研究を重ねた結果
、ヒトの正常二倍体細胞と動物肉酵素分解ペプトン又は
植物由来ペプトンと、キニンを同時に１又は動物肉酵素
分解ペプトン又は植物由来ペプトンと、キニン及びトロ
ンビンを同時に添加した溶液と接触させる事によって該
因子の生成量が飛躍的に増加することを見い出しこの知
見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち本発明はヒトに由来する正常二倍体細胞であっ
て、フィブリン親和性の高いプラスミノーゲン活性化因
子を生成する能力を有する細胞を動物肉酵素分解ペプト
ン又は植物由来ペプトンと、キニンを同時に、又は動物
肉酵素分解ペプトン又は植物由来ペプトンと、キニン及
びトロンビンを同時に添加した溶液と接触させることを
特徴とする該因子の生産方法に関するものである。

本発明で用いられる細胞は、ヒトに由来する正常二倍体
細胞であって、プラスミノーゲン活性化因子を生成する
能力を有する細胞が対象となる。

このようなものとしては、例えば、ヒトの腎、腸、心臓
、輸尿管、皮膚、包皮、舌、甲状線、胎盤、子宮由来の
細胞及び全胎児由来の細胞を、より好ましくけ、ヒトの
肺又は包皮由来の細胞をあげることができる。ここでヒ
ト由来の細胞とは、胎児及び新生児由来の細胞を含む。

これらの細胞は通常の動物細胞の培養に用いられる培養
方法、例えばη曾曾ｕｅ　Ｃ’ｕｌｒｅ　Ｍｅｔ’ｈ”
；ｄｓ’；ｒ、ｚ、！ｉ″　Ａ：１行で７７゜ｎｓＪ　
　（Ｍ、、ｌｙ＆−：、　　Ｔ、、’、ｉ”）誇ンｉイ
・肖ττγ、８゜◇ご２乙を會３．ネマ７戴、８ｒζ。

Ｃを一、　、Ｄ、７．）胤・１９７３’ｌ記載の方法で
増殖させた後、炭素源、窒素源及び必要な場合は無機塩
類又は／及びその他の添加物を含む溶液と接触させる事
によって、プラスミノーゲン活性化因子を生産せしめる
ことができる。共存させる添加物としては、アミノ酸類
、ビタミン類、ペプチド類、糖類、有機酸類などを、あ
げることができる。そのような例としては、天然に存在
する２０種類のアミノ酸の他、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ
−ビオチン、カルシフェロール、Ｄ−ノ七ントテン酸カ
ルシウム、コレ・ステロール、塩化コリン、葉酸、ｉ−
イノシｌ−ル、メナジオン、ニコチンアミド、ニコチン
酸、゛ピリドキサール、ピリドキシン、リゼ７ラビン、
チアミン、ＤＬ−α−トコフェロール、ツイーン８０、
　　ビタミンＡ１アデニン、ＡＴＰ（アデノシン三リン
酸）、ＡＭＰ（アデノシン−リン酸）、デオキシリホー
ス、リダース、グルタチオン、グアニン、チミン、ヒボ
キサンチン、ウラシル、キサンチン、ラクトアルブミン
加水分解物、ポリペプトン、カゼイン加水分解物、グル
コース、マルｔ−−ス、フラクトース、マンニット、テ
キストラン、フマル酸、リンゴ酸、オキザロ酢酸、クエ
ン酸、コバ、り酸、ピルビン酸、ＮａＣ１，ＫＣ１，Ｍ
ｇＣ１２。

ＭｇＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２
ＰＯ４＋ＣｕＳＯ４、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４，
ＭｎＣｌ２．（ＮＨｄＭ　ｏ　０４　、　Ｚ　ｎ　Ｓ　
０４等を挙げることができる。さらに本発明の方法に従
って、動物肉酵素分解ペプトン又は植物由来４プドンと
、キニンを同時に、又は動物肉酵素分解ペプトン又は植
物由来ペプトンと、キニン及びトロンビンを同時に添加
することによって、該因子の生成量を飛躍的に向上させ
ることができる。

本発明に用いられる動物肉酵素分解ペプトンは、一般に
細菌の培養培地に用いられるものであり、通常プロテオ
ースペプトン、プロテオーゼイプトン、獣肉ペプトンと
呼ばれるものである。この動物肉酵素分解ペプトンの調
製方法は公知であり、例えば、「細菌培地学講座第二集
」　（坂崎利−著。

納谷書店、１９６７刊）記載の方法にしたがえばよい。

すなわち、動物肉としては、牛、豚、ニワトリ、羊、ク
ジラなどの肉又は内臓がもちいられるが、このうち牛肉
が最もふつうに用いられる。分解用の酵素としては、ト
リプシン、ノ９ノンイン、ペプシン、パンクレアチンな
どがある。これらの動物肉は絹挫され、水と混合され、
炭酸ナトリウム、濃塩酸などで、酵素分解に適したｐＨ
に調整される。

これに、酵素を加え、２０〜４０℃で１〜２０日間、通
常は３７℃で２〜３日間酵素分解を行う。

消化後は分解酵素を不活性化するためと、未消化のタン
ｉＲりを熱凝固させるために１００℃以上に加熱し、ろ
過によってこれを除去したのち、濃縮、乾燥、細末化す
る。濃縮、乾燥の方法には、煮つめて粉末にするのと、
真空装置を用いて低温で濃縮後、細末化するのがある。

市販品としてはディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社のプロテオー
スベプトン（ＰｒｏｔｅｏｓｅＰｅｐｔｏｎｅ）、プロ
テオースペプトンＮｏ、　２、プロテオースペゾトンＮ
ｏ、３、チオペゾトン（Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｎｅ）、オ
キソイド（Ｏｘｏｉｄ）社のプロテオースベプトンＬ、
４６、ペプトンＰＬ４６、ＢＢＬ社のチオトン（Ｔｈｉ
ｏｔｏｎｅ）、大五栄養化学社のプロテオースペプトン
などがある。動物肉酵素分解ペプトンの添加濃度は、用
いる細胞、共存させるアミノ酸類、ビタミン類、ペプチ
ド類、糖類、有機酸類の種類、濃度によって異なるが、
通常０．１〜４チ（重量／体積）の濃度範囲が好ましい
。

本発明に用いられる植物由来ペプトンは、大豆゛　油、
綿実油をトリジン’７　、ｚｅ　ノｅイン、ペプシン、
ノンクレアチン等の蛋白分解酵素を用いて加水分解する
ことにより生産することができる。市販品としては、大
豆油を原料としたものとして、ポリペプトンＳ（大玉栄
養化学（株）社製）、ソイトン５ｏｙｔｏｎ　（ディフ
コ社製）、ファイトンＰｈｙｔｏｎ　（ボルチモア・）
々イオロジカル・クジラトリー社製）、ペプトン■、■
（シグマ社製）等を挙げることができる。綿実油を原料
としたもののとしては、コツトン・エンザイマテイツク
・ハイドロライゼート（ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ　ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ、シグマ社製）
等を挙けることができる。

植物由来ペプトンの添加濃度は、用いる細胞、共存させ
るアミノ酸類、ビタミン類、ペプチド類、糖類、有機酸
類の種類、濃度によって異なるが、通常０．５〜８％（
重量／体積）の濃度範囲が好ましい。

本発明に用いられるキニンとは、プラスマキニンとも呼
ばれるものであり、ブラジキニン、カリジン、メチオニ
ルリシルブラジキニンの３種の活性ペプチドをいう。い
ずれも不活性前駆体蛋白質であるキニノーゲンから男す
クレインによって遊離され、血圧降下作用、平滑筋収縮
作用、膜透過元通作用を示す。ブラジキニンの構造は、
次式で示される。

式：　Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡｒｇＯＨ カリジンは、ブラジキニンのＮ末端にリジンがついたも
のであり、メチオニルリシルブラジキニンは、さらに、
Ｎ末端にメチオニンがついたものである。

該キニンは、高等動物より、得られる天然物に限らず、
合成によって得られるキニンであってもよく、また、本
目的のためには、必ずしも高純度のものを用いる必要は
ない。本目的に使用されるペプチドとしては、基本的に
上記のキニンの構造を有していればよく、幾つかのアミ
ノ酸の付加及び置換されたペプチドであってもよい。

例えば、Ｔｈｒブラジキニン（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ｖａｌ
：　Ｔｈｒ−ブラジキニン（Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｐｂｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、キニン
梨プチドＴＨ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−８ｅｒ）、フィロキニン（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−１
１ｅ−Ｔｙｒ）、キニンＢＯ−ｍ（Ａｒｇ−Ｐｒ　ｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈ　ｅ−８ｅ　ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｓ　−Ｐｈ　ｅ　−Ｈｉ　ｓ　）、
ポリストキニン（ＷＡ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　−）　（Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｌｅ　
ｕ−Ａｒ　ｇ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌ　ｙ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）、Ａｌａ−
Ａｒｇ−プラノキニン（Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−ＡｒＨ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ）又は（Ａｌｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｌａ）、
ベスプラキニン１　（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）−
Ｊが挙げられる。

市販品としては、シグマ社製、・ζシグマ社製、ニー・
シー・ビー社製、ペニンシュラ・ラゲラトリーズ社製、
ケンブリノ・ジ・リサーチ・ノ々イオケミカル社製、ペ
プチド研究所社製等を挙げることかでさる。

該キニンの添加濃度は、用いる細胞、共存させるアミノ
酸類、ビタミン類、ペプチド類、糖類によって異なるが
、濃度範囲は、比較的広く、１０ｎＭ〜１００μＭの濃
度範囲が好ましい。

更に、本発明に用いられるトロンビンは、ヒト由来に限
定されることなく、ウシ、ウマ等の動物由来のトロンビ
ンも用いることができ、工業的生産のためには、必ずし
も高純度のものを用いる必要はない。市販品としては、
持出製薬社製、ウシ血漿由来日本薬局方トロンビン、シ
グマ社製のウシ、ウマ又はヒトの血漿由来のトロンビン
等を挙げることができる。

トロンビンの濃度は、用いる細胞、共存させるアミノ酸
類、ビタミン類、ペプチド類、糖類、有機酸類、動物肉
酵素分解ペプトンの種類、濃度によって異なるが、通常
０５〜１００　ｕｌｌの濃度範囲が好ましい。

該因子の生産は通常細胞１０万個あたり０．２ゴ以上の
培賽液を用いて２５〜４０℃、好ましくは、３１〜３７
℃の温度範囲で、６．０〜＆０好ましくは、７．０〜７
．４のｐＨの範囲で行われる。

ｐＨの維持は、ＣＯ２／ＨＣＯ３の緩衝系を利用して行
うことができるが、細胞が多量にＣＯ２、または乳酸等
の有機酸を生産して上記のｐＨの維持が困難な場合には
、ＨＥＰＥＳ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスル
ホン酸）等の緩衝剤を用いてもよい。

生産の日数は通常４〜３０日であるが３０日を越えるこ
とも可能である。該因子の生産速度は生産の後半では、
次第妬遅くなるので、工業的生産の場合には、最も効率
のよい日数が選ばれる。

工業的規模の大量培養を行う際には、ローラーゼトル培
養法、多層平板培養法、ホローファイ・々−培養法、プ
ラスチックノ々ッグ培養法、マイクロキャリア培養法等
の培養法を適用することができるが、より大量の培養を
行うには、マイクロキャリア培養法が好ましいう 該因子は、前記の条件下で細胞から溶液中に放出され、
その生成量の測定は、次の方法ん行った。

９５チ凝固フイブリノーゲン（プラスミノーゲン含量約
５０カゼイン単位／ｇ凝固蛋白）を原料として作製した
寒天加フィブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品と
するプレート法で測定した。

該因子の溶液を、１％ゼラチン、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．１チ窒化ナトリウムを含む０．０６７Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈し、フィブリン平
板上でｌ０ＩＵ／ｄのウロキナーゼと同じ溶解窓を示す
該因子溶液の濃度をＩＯＵ／ｍ／とじた。ウロキナーゼ
が混入する溶液を測定する場合には、ウサギより得た抗
ウロキナーゼＩｇＧを１００μｇ／ｍｌになるように被
験溶液に添加して測定したつ所望の生成景または日数に
達した時に、溶液を採集して該因子を回収する。

該因子の回収は、下白質の回収方法として通常用いられ
る収着法、塩析法、透析法、クロマトグラフィー法、ゲ
ル濾過法などを単独であるいは組合せて適用すればよい
。そのようなＮ製法の例として、フィブリンを結合させ
たセファロースを用いるフィブリンセファロースカラム
クロマトグラフィー、カルゼキシメチル基を結合させた
セファロースを用いるＣＭセファロースカラムクロマト
グラフィー、リジンを結合させたセファロースを用いる
リジンセファロースカラムクロマトグラフィー、亜鉛キ
レートセファロースを用いる配位子交換クロマトグラフ
ィー、コンカナバリンＡを結合させたセファロースを用
いるレクチンカラムクロマトグラフィー、本発明物質と
特異的に結合する抗体を結合した抗体アフィニティーク
ロマトグラフィー、架橋したデキストラン粒子を用いる
ゲル濾過等を挙げることができる。

具体的な分離精製の一例を挙げれば、本発明の方法に従
って得た組織培Ｎ液を０：１％ツイン８０および０１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭアセテート緩衝液（Ｐ
Ｉ（４，０）で平衡化したＣＭセファロースカラムに吸
着させる。０．１チツイン８０および０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２０　ｍ　Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４
，０）で洗浄した後、０．１係ツイン８０および１Ｍ塩
化ナトリウムを含む２０　ｍ　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，９）で溶出し、本願のプラスミノーゲン活性化
因子活性を有する部分の溶液を集める。

この溶液を０．１　Ｍロダンカリ、０，１チツイン８０
．０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液に対［２て４℃、−晩透析し、これと同一の緩衝
液で平衡化したリジンセファロースカラムに吸着させ、
平衡化した緩衝液で洗浄した後、０．０５Ｍ塩化ナトリ
ウム、１Ｍロダンカリ、０．２Ｍ　　Ｓ−アミノ−ｎ−
カプロン酸および０．１％ツイン８０を含む２０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液で溶出する。この溶出液を限外濾過用中
空糸で濃縮し、セファクリルＳ　　２００のカラムにて
ゲル濾過を行なうことによって目的のプラスミノーゲン
活性化因子が得られる。

かくして得られるプラスミノーゲン活性化因子の物理化
学的性質について、以下に説明する。

ａ）分子量：６３，０００±１０，０００１．５Ｍ塩化
ナトリウム、０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．１Ｍアルキニ
ンおよび０，１チツイン８０（花王アトラス登録商標）
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）で平衡
化したセファデックスＧ−１５０を用いるゲル濾過法に
て測定した。

５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）電気泳動法による非
還元状態の分子量測定結果は約７０．　ＯＯＯであった
。

ｂ）等電点：７．０〜＆５ アンフオライトを用いた等電点電気泳動法にて等電点分
面し測定した。

Ｃ）フィブリ／に対する親和性 生理食塩水に溶解したプラスミノーゲンを含有しないフ
ィブリノーゲン溶液（０，２％）９５０μｍ１本発明に
よって得られるプラスミノーゲン活性化因子溶液（ｓ　
ｏ　ｏＵ／−）　２０μ２を加え、室温で１時間臆する
。生じたフィブリンを分収し、脱水後１生理食塩水で洗
浄する。２Ｍロダンアンモニウム溶液ｉｙでフィブリン
中の該因子を抽出したところ該因子は約７０％がフィブ
リンに取り込まれた。

一方、組織培養ウロキナーゼは全く取り込まれなかった
。

ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：本発明によって
得られるプラスミノーゲン活性化因子溶液（３０Ｕ／１
ｔｒｌ　）　２μｍを生理食塩水に溶解してコンカナツ
クリンＡ−セファロース（ファルマシア社製）のカラム
（０，５Ｘ　４ｃＰｎ）に吸着させ、１Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液で洗浄したところ、は１丁１００チが吸着した。

ｅ）至適ｐＨニア〜９．５ 生理食塩水に溶解した本発明によって得られるプラスミ
ノーゲン活性化因子溶液５ｏｔｔＡＩｌへ　１゜チグリ
セリンを含む生理食塩水に溶解したプラスミノゲン８　
Ｕ　／ｙｔｌ　）　５０μ℃および０．１０Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．０５　Ｍクエン酸緩衝Ｈ（ｐＨ５，０
，６，０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，０，７，０，ｓ、
ｏ）またはクリンン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ＆
０．９．０．１０．０゜１１．０　）　（ｐＨｓ、ｏ、
　６．０．７．０．　ｓ、ｏ、　９．０．１０．０．、
１１．００７種）を１００μλずつ混合し、３７℃で３
０分間プレインキュ被−トする。次いで、０．１５Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）で溶解したＢｏｃ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｇ−Ｌｙｓ−ＭＣＡを５００μ２加え、さらに
３７℃で１５分間インキニベートした後、酢酸１ｍを加
え反応を停止させて、生成するアミンメチルクーリンを
螢光法にて測定し、至適ｐＨを求めた。測定結果を第１
図に示す。

ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体との反応性：精製ウロキナ
ーゼ（比活性１５０，０ＯＯＩＵ／？ＦＩｇ蛋白）を７
０インドの完全アジュバントと共に１ウサギに７日間間
隔で３５日間免疫した後、採血して精製した５０μｇ／
ｄの抗ウロキナーゼ特異抗体溶液と、本発明によ、つて
得られる２０Ｕ／ａ！＋のプラスミノーゲン活性化因子
の溶液とを、１：１に混合し、その混合液の活性を前述
の方法により測定したが、活性の低下は全く認められな
かった。

それに対し、比較対照として入れた２　０　Ｉ　Ｕ／ｄ
のウロキナーゼ溶液と該抗ウロキナーゼ抗体溶液の混合
液のウロキナーゼ活性は、１００％阻害された。

以上のごとく、本発明によって得られるプラスミノーゲ
ン活性化因子は、抗ウロキナーゼ抗体とは反応しないも
のである。

かくして得られたプラスミノーゲン活性化因子の用途と
しては、血栓溶解剤としての医薬用途以外にまたとえば
、人工血管、人工臓器等の材料に結合させ、血栓の形成
を防止する薬剤として、あるいは血栓症等の診断薬とし
ての粗塗があげられる。

（発明の効果） 本発明の方法は、従来、用いられてきたウロキナーゼ、
またはストレプトキナーゼより少量で効果を有し、かつ
血栓溶解活性が高く、副作用の少ない、プラスミノーゲ
ン活性化因子を工業的規模で大量に安定供給する生産方
法として好適である。

（実施例） 次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（フロー・ラダラドリ
ーズ社）に対して、プロテオースベプトｙ　Ｎｏ、　３
　（ディフコ社製）又はポリペプトンＳ（大豆栄養化学
社製）とプラジキニン（シグマ社製）とを共存させた培
地の新プラスミノーゲン活性化因子生成促進効果につい
て調べた。

１２穴マルチプレートに上記細胞をｌＸＩＯ３個／穴の
密度で接種し、１０チウシ胎児血清を含むメジウムＭＥ
Ｍを１．０ｍｌ添加して、炭酸ガス培養装置を用いて、
３７℃、５％炭酸ガスを含む空気中で充分単層を形成す
るまで、増殖させた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム１９９を１ｍｌ添加し、７日目毎に全量培地交換
した。回収した培養液中のプラスミノーゲン活性化因子
の生成置台測定した結果を表１に示す。

表　　　　１ 実施例２ ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（フロー・ラダラドリ
ーズ社）を用いて、プロテオース被ブト７　Ｎｏ、　３
（ティ７コ社製）と、ブラジキニン（シグマ社製）とを
それぞれ各種濃度で組み合わせて、プラスミノーゲン活
性化因子生成促進効果について調べた。

１２穴マルチプレーｈＫ上記細胞をＩ　Ｘ　ＩＱ５個／
穴の密度で接種し°、１０％ウシ胎児血清を含むメジウ
ムＭＥＭを１．　Ｏｔｘｌ添加して、炭酸ガス培嬰装置
を用いて、３７℃、５チ炭酸ガスを含む空気中で充分単
層を形成するまで、増殖させた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム１９９を１　ｍｌ添加し、７日間維持した。回収
した培養液中のプラスミノーゲン活性化因子の生成量を
測定し、た結果を第２図に示す。

実施例３ ヒト胎児由来の各種の細胞を用いて、ポリペプトンＳ（
大工栄養化学社製）と、ブラジキニン（シグマ社製）の
プラスミノーゲン活性化因子生成促進効果について調べ
た。

１２穴マルチプレートに各Ｐｉ細胞をｌＸｌ０’個／穴
の密度で接穐し、１０％ウシ胎児血清を含むメジウムＭ
ＥＭをＬＯｘｌ添加して、炭酸ガス培養装置を用諭て、
３７℃、５％炭酸ガスを含む空気中で充分単層を形成す
るまで、増殖させた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム１９９を１耐添加し、７日間維持した。回収した
培養液中のプラスミノーゲン活性化因子の生成量を測定
した結果を表２に示す。

表　　　２ 実施例４ ヒト胎児肺由来の細胞を用いて、種類の異なるペプトン
類とブラジキニン（シグマ社製）とを組み合わせ、新プ
ラスミノーゲン活性化因子生成促進効果について調べだ
。

１２穴マルチプレートに上記細胞をｌＸｌ０’個／穴の
密度で接種し、１０％０％ラン血清を含むメジウムＭＥ
Ｍを１．０耐添加して、炭酸ガス培養装置を用いて、３
７℃、１５％炭酸ガスを含む空気中で充分幾層を形成す
るまで、増殖させた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各押部加物を含むメ
ジウム１９９を１ｍｌｍｌ添加上記条件で培養し、７日
間維持した。回収した培養液中の新プラスミノーゲン活
性化因子の生成量を測定した結果を表３に示す。

表　　３ 表３（続き） 実施例５ ヒト胎児由来の各種の細胞を用いて、プロテオースペプ
トンＮｏ、３（ディフコ社製）、ブラジキニン（シグマ
社製）、トロンビン（持田裂薬社製）のプラスミノーゲ
ン活性化因子生成促進効果について調べた。

１２穴マルチプレートに各種細胞をＩＸＩＱ５個／穴の
密度で接種し、１０チウシ胎児血清を含むメジウムＭＥ
Ｍを１．０　ｍｌ添加して、炭酸ガス培養装置を用いて
、３７℃、５チ炭酸ガスを含む空気中で充分単層を形成
するまで、増殖させた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム１９９を１ｄ添加し、７日間維持した。

回収した培養液中のプラスミノーゲン活性化因子の生成
量を測定した結果を表４に示す。

表　　４ トロンビン濃度　（Ｕ／／） （いずれも１チプロテオースペプトンを含む）実施例６ ヒト胎児由来の各種の細胞を用いて、ポリペプトンＳ（
大豆栄養化学社＆り、ブラジキニン、カリ・ジン、メチ
オニルリシルブラジキニン（ペプチド研究所社製）のプ
ラスミノーゲン活性化因子生成促進効果について調べた
。

１２穴マルチプレートに各種細胞を１×１０ｓ個／穴の
密度で接種し、１０％ウシ胎児血清を含むメジウムＭ　
Ｅ　Ｍを１．ＯＮ！添加して、炭酸ガス培養装置を用い
て、３７℃、５チ炭酸ガスを含む空気中で充分単層を形
成するまで、増殖させた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム１９９を１ｍｌ添加し、７日間維持した。

回収した培養液中のプラスミノーゲン活性化因子の生成
量を測定した結果を表５に示す。

（以下余白） 実施例７ ヒト胎児肺細胞を１２に！、容スピナーフラスコに１０
５ｃ　ｅ　１１＋ｙ”ｒｘｌの密度で３ｍｇ７’ｔｌ濃
度のサイトデツクスＩ　（＋￥ｌｆｌ胞培養用ビーズ担
体、ファルマシア社登録商標）と共に植え込み、３７℃
、５ｅＩＩ炭酸ガスを含む空気中で、成育培地として１
０チウシ胎児血清を含むメジウムＭＥＭを８ｐ′添加し
、３０ｒｐｍの回転数で攪拌しながら懸濁培養する。

６日間培養し、細胞を充分増殖させた後、生理食塩水で
細胞が接着したビーズ担体を洗浄し、血液を含まない１
％プロチオースベプトンＮｏ、３（ディフコ社）及び０
．１　ｍ　Ｍブラジキニン（シグマ社）を含むメジウム
１９９　８４！におきかえ、３０ｒｐｍの回転数で攪拌
しながら培養する。５日間毎Ｋ、この培地を交換しなが
ら、本願のプラスミノーゲン・アクチベーターを含む培
養液を回収する。

このようにして得られた６５Ｕ／ｄの濃度の該因子を含
む培養液５ｆ！、を、０．１％ツイン８０および０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭアセテートａ衝液（
ｐ　Ｈ４，０）で平衡化したＣＭセファロースカラム（
１，５φｘｉｏｃｒｎ）に吸着させる。０．１チツイン
８０および０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭア
セテート緩衝１（ｐＨ，ｏ）で洗浄した後、０１チツイ
ン８０および１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｒｎＭ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８，９）で溶出し、本願のプラスミ
ノーゲン・アクチペーター活性を有する部分の溶液１０
０ｄを集める。この溶液を０．１　Ｍロダンカリ、０．
１チツイン８０，０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液５２に対して４℃、−娩透析し、
これと同一の緩衝液で平衡化したリジンセファロースカ
ラム（Ｚ６φＸ１２（１））に吸着させ、平衡化した緩
衝液で洗浄した後、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍロ
ダンカリ、０．２Ｍ　　ε−アミノ−ｎ−カプロン酸お
よび０．１　％ツイン８０を含む２０ｍＭトＩＪス塩酸
緩衝液で溶出する。この溶出液１４０Ｒ１を限外濾過用
中空糸で１６ゴまで濃縮し、セファクリルＳ−２００の
カラム（ｚ６φｘ９８ｃｒｎ）にてゲル濾過を行々つだ
。

本願のプラスミノーゲン・アクチベーター活性を有する
部分の溶液４０１Ｌ／を回収する。得られた該プラスミ
ノーゲン・アクチペーター溶液の濃度は、４７００Ｕ／
ｄで４０．　ＯＯＯ’［Ｊ　／　ｍ　ｇ蛋白の比活性を
示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によって得られるプラスミノーゲン活
性化因子の至適ｐＨ域を示すグラフであり、第２図は実
施例２において、ヒト胎児肺細胞を用いて得られた培養
液のプラスミノーゲン活性化因子の生成量を測定した結
果を示すグラフである。 時評出願人　　　旭化成工素株式会社 第１図 Ｈ 第２図 無庵加　　　　　　　　　　（ｎＭ）　　　　　　　　
　　　ＣμＭ〕７“ラシ゛Ａニン１げ艷 手続補正書（自発） 昭和６０年９月６日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１６５９００号 ２、発明の名称 生理活性物質の生産方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号４、補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」及び ５、補正の内容 （１）　　明細書の特許請求の範囲を別紙の通り補正す
る。 （２）　　同第５頁第１０行「フィブリン」を「フィブ
リン」と補正する。 メソツズ　　　　アシド　アプリケーション　　　　　
　　（ビー、ケ仁クルーズＭｅｔｈｏｄｓ　　ａｎｄ　
　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＪ　　　（Ｐ、　　Ｋ、　
　Ｋｒｕｓｅ３−り　　　サン　　フラン　　シスコ、
　　　Ｕントン　　　　　　　　）ヲＹｏｒｋ、　　Ｓ
ａｎ　　Ｆｒａｎ　　Ｃ１５ｃｏ、　　Ｌｏｎｄｏｎ　
　１９７３　　）　　Ｊ「ティシュ　カルチャー　メソ
ツズ　アンドアプリケーション」　（ピー、ケイ、クル
ーズアンド　エム、ケイ、パターラン／アカデミツクプ
レス、ニューヨーク　サンフランシスコ。 ロンドン　１９７３）　　（ｒＴｉｓｓｕｅ　　Ｃｕｌ
ｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　Ｊ　（Ｐ、　Ｋ、　Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄＭ、　Ｋ
、　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＳａｎ　ｆｒａｎｓｉｓｃｏ　Ｌ
ｏｎｄｏｎ　　１９７３）　）　ｊと補正する。 （４）同第１０頁第４〜５行［もののとしては、コツト
ン・エンザイマテイツク」を「ものとしては、コツトン
シード・エンザイマテイツク」と補正する。 （５）同第１１頁第１２行ｒ　（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｊをｒ　（Ａｒｇ−１’ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ　Ｊと補正する。 （６）　　同第１２頁第７行「パラケン社製」をｒノ＼
ツケム社製」と補正する。 （７）　　同第１４頁第９行「方法ん」を「方法で」と
補正する。 （８）　　同第１７頁第５〜６行「アルキニン」を「ア
ルギニン」と補正する。 （９）　　同第１８頁第１行「分収し」を「分取し」と
補正する。 ００　同第１８頁第９行ｒ２μｌｌをｒ２ｍｌｌと補正
する。 αυ　同第１８頁第１８行ｒ８Ｕ／ｍｉ」を「（８Ｕ／
ｍｊ２）Ｊと補正する。 （２）同第１９頁第４行［ブレインキュベート」を「ブ
レインキュベート」と補正する。 ０３１　　同第１９頁第７行「インキュベート」を「イ
ンキュベート」と補正する。 圓　同第１９頁第８行「アミンメチルクーリン」を「７
ミノメチルクマリン」と補正する。 ａ！９　　同第１９頁第１３行「アジュバント」を「ア
ジュバント」と補正する。 ＯＱ　　同第２０頁第１１行「粗塗」を「用途」と補正
する。 Ｑ７１　　同第２１頁第６行「ブラジキニン」を「プラ
ジキニン」と補正する。 ａＱ　　同第２１頁第７行「の新プラスミノーゲン」を
「のプラスミノーゲン」と補正する。 ０１　　同第２５頁第４〜５頁［の新プラスミノーゲン
」を「のプラスミノーゲン」と補正する。 Ｑω　同第２９頁下から１０行ｒ　１０５ｃｅｌｌｓ／
　ｍ　ｆｌ　Ｊをｒ　ｌ　Ｏ’ｃｅｌｌｓ／　ｍ　Ａ’
　Ｊと補正する。 （２１１同第２９頁下から３行「血液」を「血清」と補
正する。 （υ）同第２９頁下から２行「プロチオース」を「プロ
テオース」と補正する。 （ハ）同第３０頁第４行「アクチベーターを」を「活性
化因子を」と補正する。 に）同第３０頁第１４行「アクチベーター活性を」を「
活性化因子活性を」と補正する。 悴）同第３１頁第１行「カプロン酸」を「カプロン酸」
と補正する。 価）同第３１頁第６行「アクチベーター」を「活性化因
子」と補正する。 儲７キ　　同第３１頁第８行「アクチベーター」を「活
性化因子Ｊと補正する。 特許請求の範囲 （１）　　ヒトに由来する正常二倍体細胞であって、下
記の性質を有するプラスミノーゲン活性化因子を生成す
る能力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトン又は植
物由来ペプトンと、キニンを含有する溶液と接触させる
ことを特徴とする該プラスミノーゲン活性化因子の生産
方法ａ）分子量：　６３０００±１００００ｂ）等電点
：７．０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
Ｈ：　７．０〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体とは反応しない。 （２）　　ヒトに由来する正常二倍体細胞であって、下
記の性質を有するプラスミノーゲン活性化因子を生成す
る能力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトン又は植
物由来ペプトンと、キニン及びトロンビンを含有する溶
液と接触させることを特徴とする該プラスミノーゲン活
性化因子の生産方法 ａ）分子量：　６３０００±１００００ｂ）等電点：７
．０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
Ｈ：　７．０〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体とは反応しない。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトに由来する正常二倍体細胞であつて、下記の
   性質を有するプラスミノーゲン活性化因子を生成する能
   力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトン又は植物由
   来ペプトンと、キニンを含有する溶液と接触させること
   を特徴とする該プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 ａ）分子量：６３０００±１００００ ｂ）等電点：７．０〜８．５ ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
   Ｈ：７．０〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体とは反応しない。
2. （２）ヒトに由来する正常二倍体細胞であつて、下記の
   性質を有するプラスミノーゲン活性化因子を生成する能
   力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトン又は植物由
   来ペプトンと、キニン及びトロンビンを含有する溶液と
   接触させることを特徴とする該プロスミノーゲン活性化
   因子の生産方法ａ）分子量：６３０００±１００００ ｂ）等電点：７．０〜８．５ ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバトンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
   Ｈ：７．０〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体とは反応しない。