JPS63126826A - プラスミノ−ゲン活性化因子誘導物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血栓溶解剤として注目されているプラスミノ
ーゲン活性化因子を生成する能力を有する細胞から、該
プラスミノーゲン活性化因子を著量生成させることので
きるプラスミノーゲン活性化因子誘導物質に関するもの
である。

（′ｇＥ米の技術） 我国は勿論、洋の東西を問わず心筋梗塞、脳硬塞などの
いわゆる循環器系疾患が原因とされる死亡率は、悪性新
生物（ガン）によるそれよりも蓬かに高く、これらの有
効な治療薬の開発が切望されている。

プラスミノーゲン活性化因子は蛋白質分解酵素の一樵で
、血栓に対する治療薬として用いられる血栓溶解剤とし
て注目されている。プラスミノーゲン活性化因子は、そ
の物性や反応機作の差異などからウロキナーゼ聾プラス
ミノーゲン活性化因子と組織屋プラスミノーゲン活性化
因子とに分類されている。プラスミノーゲン活性化因子
は、動物（ヒトを含む）の尿や腎、肺、小腸、子宮、卵
巣、胎盤、精巣、血管などの器官や組織、あるいはこれ
らの組織由来の正常細胞の培養液、さらには＠膓細胞の
培養液中などに見出される。

本出願人は、ヒ）Ｋ由来する正常二倍体細胞と接触して
プラスミノーゲン活性化因子を生成せしめる溶液に動物
肉酵素分解ペプトンを存在させることによって、該プラ
スミノーゲン活性化因子の生成量が飛躍的に増加するこ
とを認め、すでに特許出願した（特開昭５９−１５４７
５５号）。

動物肉酵素分解ペプトンは、一般に細菌の培養培地に用
いられるものであシ、通常、プロテオースペプトン、プ
ロテオーゼペプトン、獣肉ペプトンと呼ばれるものであ
る。この動物肉酵素分解ペプトンの調製法は公知であシ
１例えば、「細菌培地学講座　第二集」（坂崎利−著、
納谷書店。

１９６７年刊）記載の方法にしたがえばよい。

すなわち、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、クジラなど
の肉ま次は内臓が用いられるが、中でも牛肉が最も普通
に用いられる。分解用の酵素としテｕ、）ｌＪ７’シン
、ハハイン、ペプシン、パンクレアチンなどがある。こ
れらの動物肉は細片化され、水と混合され、炭酸す）　
ＩＪウム、濃塩酸などで酵素分解に適したｐＨＫ１１整
される。これに酵素を加え、２０〜４０Ｃで１〜２０日
間１日間上通常Ｃで２〜３日間酵素分解を行なう。消化
後は、分解酵素を不活性化するためと、未消化蛋白質を
熱凝固させるためＩＣ１００ｔｌ’以上に加熱し、濾過
によってこれを除去する。さらに１このＦ液を濃縮、乾
燥、細末化するか、あるいは真空装置を用いて低温で濃
縮後、細末化する。市販品としては、ディ７コ（Ｄｉｆ
ｃｏ　）社のプロテオースベブトン（Ｐｒｏｔｅｏｓｅ
　ｐｅｐｔｏｎｅ　）　、グロテオースベプトン７ｆＬ
２．プロテオースベブトン＆５、チオペプトン（Ｔｈ１
ｏｐｅｐｔｏｎｅ　）、オキソイド（０ｘｏｉｄ　）社
のプロテオースペフトンＬ４６．ペプトンＰＬ４６、Ｂ
ＢＬ社のチオトン（Ｔｈ１ｏｔｏｎｅ　）　、大五栄養
化学社のプロテオースペプトンなどがある。

（発明が解決しようとする問題点〕 動物肉酵素分解ペプトンを用いてプラスミノーゲン活性
化因子を効率的に製造する方法は、前記特許出願におい
てずでに提案されているが、このような動物肉酵素分解
ペプトン中には、表１から分るように、灰分をはじめ塩
類、シん酸塩、窒素、金属など種々の物質が混在し、さ
らには、異種蛋白質としての抗原性物質も含まれておシ
、動物肉酵素分解ペプトン中のどのような物質がプラス
ミノーゲン活性化因子の飛躍的生成に寄与しているのか
は不明確であった。また動物肉酵素分解ペプトン中には
、該プラスミノーゲン活性化因子の生成Ｋｔつたく関与
しない夾雑物質が多量に含まれ。

培養液中に生成された該プラスミノーゲン活性化因子を
単離・精製する上で好ましくなく、動物肉酵素分解ペプ
トン中のプラスミノーゲン活性化因子を生成させること
のできる有効物質だけを培養液中に存在させることは非
常に有意義である。

表　１　　　動物肉酵素分解ペプトンの組成細菌培地学
講座第二集、坂崎利−者、納会書店、　１９４７年刊よ
り抜粋（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、この問題を解決するため鋭意研究を重ね
た結果、動物肉酵素分解ペプトンをゲルろ過クロマトグ
ラフィー（例えば、セファクリル３−２００あるいはセ
ファデックスＧ−２５）で分子ふるいすることにより、
プラスミノーゲン活性化因子を生成誘導させる物質を得
ることができ比。さらに、この誘導物質を用いるこ−と
Ｋよシ。

異種抗原性蛋白質や細胞培養に対して望ましくない低分
子量（１，０００ｄａ以下）の細胞毒物質と。

プラスミノーゲン活性化因子を生成する能力を有する細
胞が接することなく、該プラスミノーゲン活性化因子を
効率的に製造できることを見出し。

この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

プラスミノーゲン活性化因子を生成する能力を有する細
胞から、該プラスミノーゲン活性化因子を生成誘導させ
る物質を、動物肉酵素分解ペプトンよシ得る方法につい
て以下に述べる。

動物肉酵素分解ペプトンをセファクリルＳ−２００グル
ｐ過クロマトグラフイー、あるいはセファデックスＧ−
２５ゲルろ過クロマトグラフイー後、各画分の一定量を
Ｍｅｄｊｕｍ　１９９培養液と混合し、滅菌済フィルタ
ーで濾過除菌する。このｐ液を、あらかじめペトリ皿中
に増殖したプラスミノーゲン活性化因子を生成する能力
を有する細胞（例えば、ヒト胎児の腎、腸、肺、心臓、
皮膚。

ヒト腎、腸、肺、心臓、胎盤由来の細胞など）に添加し
、５ｓｃｏ、ガスと共に３７Ｃで培養（４〜３０日）後
、培地中に生成されたプラスミノーゲン活性化因子量を
測定する。

プラスミノーゲン活性化因子量（力価）の測定に際して
は、プラスミノーゲン活性化因子を含む培養液を希釈液
（ｏ、ｏ　ｓ　ｓウシ血清アルブミン。

０．０１　＊　Ｔｗｅｅｎ　８０　、０．１９６窒化ナ
トリウムを含むリン酸緩衝生理食塩液）で適当に希釈後
、９５％凝固フィブリノーゲン（プラスミノーゲン含量
約５０カゼイン単位／ｆ＃ｌ固蛋白質）を原料として作
製したデキストラン加フィブリン平板上にスポットし、
３７Ｃで１５±２時間保温する。平板上に形成され友溶
解円窓径を測定し、同時にスポットされ次ウロキナーゼ
標準品（ウロナーゼ６万。

持田製薬株式会社）、あるいは組織プラスミノーゲン活
性化因子標準品（クロキ国際上１国際単位と同じ溶解内
窓径を与える濃度を１単位とする）Ｋよる検量線に基き
力価を算出する。力価定量の結果から、プラスミノーゲ
ン活性化因子が生成された画分、すなわち、該プラスミ
ノーゲン活性化因子を生成誘導する物質を含む画分の分
配係数あるいは相対溶出液量を規定する。

ゲル濾過における分配係数（’Ｋａｖ）は、Ｋａｖ＝Ｃ
Ｍｅ　−Ｖｏ　）　／　（Ｖｔ　−Ｖｏ　）で表わされ
るが、これは与えられた試料が拡散しうる固定相ゲル体
積め割合を意味している。この分配係数は、真の分配係
数：　Ｋｄ　−（Ｖｅ　−Ｖｏ　）　／　Ｖｓとは異ナ
ルカ。

与えられたゲルに対してＫａｖ　：　Ｋｄの比は一定で
、溶質の性質や濃度には依存しないことや、カラムのベ
ッド体積やゲルの充填状態に無関係に溶質の挙動を定義
できる利点を有する。

ま友、他のデーター処理法の一つである相対溶出液量（
Ｖｅ　／　Ｖｏ　）によっても、プラスミノーゲン活性
化因子誘導物質を含む画分を示すことができる。ここで
用いるｖｔ、　Ｖｏ、　Ｖｓ、　Ｗｅは、それぞれ充填
したベッド体積、排除体積、固定相の体積、試料の溶出
体積を意味する。

動物肉酵素分解ペプトン溶液を高圧蒸気滅菌し、あらか
じめリン酸緩衝生理的食塩液あるめは蒸留水で平衡化し
たセファクリルＳ−２００ゲルｐ過カラムでクロマトグ
ラフィーを行うと、該ペプトン中のプラスミノーゲン活
性化因子誘導物質は。

分配係数０．６５〜０．９５の範囲に溶出される。これ
は、相対溶出液量にして２．０〜２．７の範囲に相当す
る。この時、該ペプトン中に含まれる抗原性物質は１分
配係数０．２４〜０．２９．また、相対溶出液量１．３
〜１．５の範囲に溶出され、プラスミノーゲン活性化因
子誘導物質から分離される。この抗原性物質は１分子量
ｓ　ｓ、ｏ　ｏ　ｏ±５，０００ｄａに相当し１分子量
およそ１．Ｇｏ０〜６，０００　ｄａのプラスミノーゲ
ン活性化因子誘導物質から完全に分離される。さらに１
細胞傷害性物質は分子量およそ１．０００　ｄａ以下に
検出され、これもプラスミノーン活性化因子誘導物質か
ら分離される。

セファクリルＳ−２００ゲル濾過クロマトグラフイーに
よって部分精製された動物肉酵素分解ペプトン中のプラ
スミノーゲン活性化因子誘導物質を凍結乾燥濃縮後、培
養液に再溶解し、プラスミノーゲン活性化因子金生成す
る能力を有する細胞に加えると、添加され次乾燥粉末用
量に依存して、培養液中にプラスミノーゲン活性化因子
の生成が見られる。このことからも、上記の動物肉酵素
分解ペプトン中の細胞傷害性物質が除去され次ことが示
唆される。

動物肉酵素分解ペプトンをあらかじめリン酸緩衝生理食
塩液あるいは蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２
５ゲル濾過カラムでクロマトグラフィーを行った時にも
、前記のセファクリルＳ−２００ゲルｐ過クロマトグラ
フイーの時と同様のことが言える。すなわち、動物肉酵
素分解ペプトン中のプラスミノーゲン活性化因子誘導物
質は、分配係数０．１８〜０．６６、相対溶出液量１．
２〜１．８の範囲に溶出される。この時、該ペプトン中
の抗原性物質は、排除体積（Ｖｏ　）量に一致した溶出
液中に認められる。

（発明の効果） 種々の物質から成る混合物であるところの動物肉酵素分
解ペプトン中よシブラスミノーグン活性化因子訪導物質
を分取し、細胞培養に供することによって、プラスミノ
ーゲン活性化因子の生成Ｋまったく関与しない夾雑物質
の細胞に対する影響から回避できると共に、培養液中に
生成された該プラスミノーゲン活性化因子の単離・精製
の工程も簡略化することが可能となる。

（実施例） 実施例１ プロテオースペプト７　、ｆ、　３　（ｐｒｏｔｅｏｓ
ｅ　ｐｅｐｔｏｎｅム５　、　ｐｉｆｃｏ社）の２０係
水溶液を１２０Ｃで３０分間高圧蒸気滅菌し、あらかじ
めリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７，４）で平衡
化されたセファクリルＳ−２００ゲル濾過カラムにかけ
た。

その時の２８０　ｎｍにおける蛋白質の吸収と各画分に
含まれるプラスミノーゲン活性化因子誘導物質によって
生成されたプラスミノーゲン活性化因子量を第１図に示
した。ｗＬ１図において、点線は２８０ｎｍＫおける各
画分の吸光度、実線は各画分のプラスミノーゲン活性化
因子誘導物質によって生成されたプラスミノーゲン活性
化因子量を示す。

プラスミノーゲン活性化因子は分配係数（Ｋａｖ）０．
６５〜０．８１の間に、また、相対溶出液量（Ｖｅ／　
Ｖｏ　）　２．１〜２．７の間に検出され、その時のピ
ークは、それぞれ０．７２　、２．４５であつ友。この
時、抗原性を有する画分は分配係数０．２４〜０．２９
゜相対溶出液量１．５〜１．５の間に溶出され、プラス
ミノーゲン活性化因子を誘導させる物質と分離された。

この異種蛋白抗原性物質の分子量はｓ　ｓ、ｏ　ｏ　ａ
±５．０００ｄａであった。

実施例２ グロテオースペプトンム５の２０係水溶液を１２０Ｃで
３０分間高圧蒸気滅菌し、あらかじめ蒸留水で平衡化さ
れたセファクリルＳ−２００ゲル濾過カラムＫかけた。

実施例１ではゲルペッドの平衡化ＫＰＢＳを使用し九が
、ＰＢＳの代シに蒸留水を使用し九本実施例でも、まっ
たく同様の蛋白質吸収とプラスミノーゲン活性化因子の
生成が認められた。すなわち、分配係数０．７５〜０．
８７の間に、また、相対溶出液量２．３６〜２．５７の
間にプラスミノーゲン活性化因子の生成が認められ、そ
の時の最大ピークは、それぞれ０．７　？　、　２．４
３に認められた。

実施例５ 実施例２のセファクリルＳ−２００ゲル濾過クロマトグ
ラフイーから得られた動物肉酵素分解ペプトン中のプラ
スミノーゲン活性化因子誘導物質を凍結乾燥し、乾燥粉
末を最終濃度り、５　、０．７５１．０　、１．５およ
び２．０％（Ｗ／Ｖ）になるように培養液で再溶解し九
。それぞれの溶液をｐ過除菌し、あらかじめベトリ皿中
に増殖させたヒト正常二倍体細胞（ＩＭＲ−９０：　Ａ
ＴＣＣＣＣＬ１８６　）に添加後、５ｓｃｏ！ガスと共
に３７Ｃで培養を続けた。培養最終日（第８８目）Ｋ培
地の一部を採取し、培地中に生成されたプラスミノーゲ
ン活性化因子量を測定した結果を第２図に示し友。

部分精製された動物肉酵素分解ペプトンの増量と共に、
プラスミノーゲン活性化因子の生成量は増加した。部分
精製された動物肉酵素分解ペプトン量を増加しても、プ
ラスミノーゲン活性化因子の生成が阻害されないことか
ら、部分精製動物肉酵素分解ペプトン中には、細胞傷害
性物質が混在しないことが示唆され、動物肉酵素分解ペ
プトン中のプラスミノーゲン活性化因子誘導物質は、細
胞傷害性物質から分離された。

実施例４ セファクリルＳ−２００ゲルろ過クロマトグラフイーに
よって得られたプラスミノーゲン活性化因子を誘導させ
る物質の画分を混合し真空凍結乾燥後、再び少量の蒸留
水に溶解した。この濃縮された溶液を蒸留水であらかじ
め平衡化したセファデックスＧ−２５ゲル濾過カラムに
かけた結果を第３図に示した。第３図において５点線は
２８０ｎｍにおける各画分の吸光度、実線は各画分のプ
ラスミノーゲン活性化因子誘導物質によって生成された
プラスミノーゲン活性化因子蓋ヲ示す。カラムの担体以
外の力価測定など他の条件は、すべて実施例１に記載し
たものと同一にした。その結果、プラスミノーゲン活性
化因子は分配係数０．６１〜０．６６の間に、また、相
対溶出液量１．３４〜１．７５の間に認められ、最大ピ
ークは、それぞれ０．４０　、１．４４に検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において、セファクリルＳ−２００グ
ルい過クロマトグラフィーにかけた時の各画分の吸光度
と、プラスミノーゲン活性化因子誘導物質によって生成
されたプラスミノーゲン活性化因子量を示すグラフ、第
２図は実施例５にお込て、培地中に生成され友プラスミ
ノーゲン活性比因子量を測定した結果を示すグラフ、第
３図は実施例４において、セファクリルＳ−２００ゲル
濾過クロマトグラフイーにかけた時の各画分の吸光度と
、プラスミノーゲン活性化因子誘導物質によって生成さ
れ九プラスミノーゲン活性化因子量を示すグラフである
。 第１図 面分 第２図 部分精製ｖＪ物肉Ｍ素分解物（％） 第３図 面分 手続補正書 昭和６１年１２月２６日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １　事件の表示 特願昭６１−２６’１８０１号 ２　発明の名称 プラスミノーゲン活性化因子誘導物質 ３　補正をする者 事件との関係・特許出願人 （００３）　　旭化成工業株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
明細書の図面の簡単な説明の欄 ６　補正の内容 明細書第１６頁１８行の「クロマトグラフィーにかけた
時の」を下記のとおり補正する。 「クロマトグラフィーによって得られたプラスミノーゲ
ン活性化因子誘導物質、さらにセファデックスＧ−２５
ゲル濾過クロマトグラフイーにかけた時の」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 動物肉酵素分解ペプトンから精製され、プラスミノーゲ
   ン活性化因子を生成する能力を有する細胞から該プラス
   ミノーゲン活性化因子を著量生成させることのできる下
   記のプラスミノーゲン活性化因子誘導物質。 ａ）セファクリルＳ−２００（ファルマシア社登録商標
   ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分配
   係数（Ｋａｖ）０．６５〜０．９５の範囲に溶出される
   溶出液あるいは相対溶出液量（Ｖｅ／Ｖｏ）２．０〜２
   ．７の溶出液 および／または ｂ）セファデックスＧ−２５（ファルマシア社登録商標
   ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分配
   係数（Ｋａｖ）０．１８〜０．６６の範囲に溶出される
   溶液中あるいは相対溶出液量（Ｖｅ／Ｖｏ）１．２〜１
   ．８の溶出液