JPS6226232A - 生理活性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトに由来する正常二倍体細胞を利用して高収
率で新規なプラスミノーゲン活性化因子を製造する方法
に関するものである。

（従来の技術） プラスミノ−ｒン・アクチベーターとしては今日、尿ま
たは培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼ、およ
びストレプトコツキより採取されるストレプトキナーゼ
が血栓溶解剤として実用に供されている。

しかし、これらはフィブリンに対する親和性の点で劣る
ので、治療に際し必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。すなわち、これらによって循環血液中で生成さ
れるプラスミノは、血中のプラスミンインヒビタ−と結
合して速やかに失活するため、治療効果をあげるために
は、これらを大量に投与して、血中のプラスミンインヒ
ビタ−の量を上回るプラスミンを生成する必要がある。

しかし、大量のプラスミンが生成されるとフイブリノー
ゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフィブリンに親和性が高く、フィブ
リン上でプラスミンを生成することができれば、循環血
液中のプラスミンインヒビタ−の影１を受けることなく
、少量でフィブリンを分解することができ、循環血液中
のフイブリノーゲンを分解する作用も弱くなる。かかる
実情からフィブリ／親和性が高く、少量でかつ血栓溶解
活性が高く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている
。

本発明者らは既にヒトの正常二倍体細胞の培養液中に下
記性質を傳するフィブリン親和性が高い新規なプラスミ
ノ−ｒン活性化因子を見い出しく＃開昭５９−５１２２
０）、史に実用尤供すべく検討した結果、ヒトの正常二
倍体細胞と接触して該因子を生成せしめる溶液に、多量
の動物肉酵素分解ペプトンを存在させ、該因子の生成量
を高める効率的な製造法も、既に見い出した（特開昭５
９〜１３４７３３　　ン　。

ａ）分子量：　６３，０００±ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　。

ｂ）等４点：７．０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：めつｅ）至適ｐ
ｉ（：７〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体と反応しない。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、該因子を大世に工業的規模で提供するた
めには、上記方法を含む従来の方法では不十分で、更に
高収量で該因子を得る製造法の開発が望まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはこの目的のために鎖意研究を重ねた結果、
ヒト正常二倍体細胞と動物肉酵素分解ペプトン又は植物
由来ペプトンとトロンビンとを同時に添加した溶液と接
触させることによって該因子の生成量が飛躍的に増加す
ることを見い出し、この知見に基づいて本発明をなすに
至った。

すなわち本発明はヒトに由来する正常二倍体細胞であっ
てフィブリン親和性の高いプラスミノーゲン活性化因子
を生成する能力を有する。７＋ｉＩＩ胞を動物肉酵素分
解ペプトンまたは植物由来ペプトンと、トロンビンとを
同時に添加した溶液と接触させることを％徴とする該因
子の製造法に関するものである。

本発明で用いられる細胞は、ヒトに由来する正常二倍体
細胞であって、ｒｒ７°ラスミノーケ９ン活性化因子を
生成する能力を有する細胞が対象となる。

このようなものとしては、たとえば、ヒトの腎、腸、肺
、心臓、輸尿管、皮膚、包皮、舌、甲状腺、胎盤、子宮
由来の細胞および全胎児由来の細胞を、より好ましくは
ヒトの肺又は包皮由来の細胞をあげることができる。こ
こでヒト由来の、細胞と（工、胎児および新生児由来の
細胞を含む。

これらの細胞は通常の動物細胞の培養に用いられる培誉
方法、たとえばＵティシュ　力ルチャーメンツズ　アン
−アプリケーション」（ビー。

ケイ、クルーズ　アンド　エム、ケイ、パターンｌアカ
デミツクプレス、　ニューヨーク　サン７ランシスコ、
ロンドン１９７３　）　（ｒＴｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕ
ｒｅＭｅｔｂｏｄｓ　　ａｎｄ　　ＡｐｐＨｃａｔｉｏ
ｎＪ　　（Ｐ、に、　　Ｋｒｕｓｅ　　ａｎｄ　　Ｍ。

Ｋ、　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　５ａｎＦｒａｎｓｉｓｃｏ　
Ｌｏｎｄｏｎ　１９７３　）　）記載の方法で増殖させ
た後、炭素源、窒素源２よび必要な場合は無機塩類また
は／およびその他の添加物を含む溶液と接触させること
によって、プラスミノーゲン活性化因子を生産せしめる
ことができる。共存させる添加物としてはアミノ酸類、
ビタミン類、ペプタイド類、糖類、有機酸類などを挙げ
ることができる。そのような例としては天然に存在する
２０種類のアミノ酸類の他、Ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−
ビオチン、カルシフェロール、Ｄ−パントテン酸カルシ
ウム、コレステロール、塩化コリン、葉酸、１−イノシ
トール、メナジオン、ニコチンアミド、ニコチン酸ビリ
ｒキサール、ビリＰキシン、リボフラビン、チアミン、
ＤＬ−α−トコフェロール、ツイーン８０、ビタミンＡ
１アデニン、ＡＴＰ。

ＡＭＰ　、デオキシリボース、リボース、グルタチオン
、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、ウラシル、キサ
ンチン、ラクトアルブミン加水分解物、ポリペプトン、
カゼイン加水分解物、グルコース、マルトース、７ラク
トース、マンニット、テキストラン、７マル酸、リンゴ
酸、オキゾロ酢酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン酸、
ＮａＣＪ　、　ＫＩＪ　、　ＭｇＣＪ！２　。

ＭｇＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４ｒ　　Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４、ＣｕＳＯ４゜Ｆｅ（ＮＯ３）３　、　　Ｆ
ｅＳＯ４１ＭｕＣ１２、（ＮＨ４）２Ｍｏ０４　ｒ　Ｚ
ｎＳＯ４等を挙げることができる。さらに本発明の方法
に従って、動物肉酵素分解ペプトンまたは植物由来ペプ
トン及びトロンビンを同時に添加することによって該因
子の生成量を飛躍的【向上させることができる。

本発明において用いられる動物肉酵素分解ペプトンは、
一般に細菌の培養培地に用いられるものであり、通常プ
ロテオースペプトン、プロテオーゼペゾトン、獣肉ペプ
トンと呼ばれるものである。

この動物肉酵素分野ペプトンの調製法は公知であり、た
とえば「細菌培地学講座第二集」（坂崎利−著、納谷書
店、１９６７年刊）記載の方法にしたがえばよい。すな
わち、動物肉としては、牛、豚、ニワトリ、羊、クジラ
などの肉または内臓が用いられるが、このうち牛肉が最
もふつうに用いられる。分解用の酵素としては、トリプ
シン、パパイン、ペプシン、パンクレアチンなどがある
。

これらの動物肉は細挫され、水と混合され、炭酸ナトリ
ウム、濃塩酸などで酵素分解に適したＰＨ［′ｐ４整さ
れる。これに酵素を加え、２０〜４０’Ｏで１〜２０日
間、通常は６７℃で２〜６日間酵素分解を行なう。消化
後は分解酵素を不活性化するためと、未消化のタンパク
を熱凝固させるために１００℃以上に加熱し、濾過によ
ってこれを除去したのち、濃縮、乾燥、細末化する。濃
縮、乾燥の方法には、煮つめて粉末にするのと、真空装
置を用いて低温で濃縮後細末化するのがある。市販品と
してはｒイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社のプロテオースペゾト
ンｌ＠２、プロテオースペゾトンＮ［Ｌ３、チオペプト
ン（Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｎｅ　）、オキソイ）’　（Ｏ
ｘｏｉｄ）社のプロテオースペゾトンＬ４６、ペプトン
ＰＬ４６、ＢＢＬ社のチオトン（Ｔｈｉｏｔｏｎｅ）、
大五栄養化学社のプロテオースペゾトンなどがある。

動物肉酵素分解ペプトンの添加濃度は用いる細胞、共存
させるアミノ酸類、ビタミン類、ペプタイー類、糖類、
有機酸及びトロンビンの種類、濃度〈よって異なるが、
通常０．１〜４％（ｗｔ／ｖ）の濃度範囲が好ましい。

本発明に用いられる植物由来ペプトンは、たとえば大豆
油、綿実油をトリプシン、パパイン、ペプシン、パンク
レアチン等の蛋白分解酵素を用いて加水分解することに
より、製造することができる。市販品としては、大豆油
を原料としたものとして、ポリペプトンＳ（大工栄養化
学■製）ソイトン５ｏｙｔｏｎ　（Ｄｉｆｃｏ社製）、
ファイトンｐｈｙｔｏｎｅ（ＢＢＬ社製）、ペプトンｍ
、■ｃシグマ社製）等を挙げることができる。綿実油を
原料としたものとしてはｃｏｔｔｅｎｓｅｅｄ　ｃｎｚ
ｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（シグマ社製）
等を挙げることができる。

植物由来ペプトンの添加濃度は用いる細胞、共存させる
アミノ酸類、ビタミン類、ペプタイＶ類、糖類、有機酸
類及びトロンビンの種類、濃度によって異なるが、通常
１〜８　％　（ｗｔ／ｖ）の濃度範囲が好ましい。

更に本発明釦用いられるトロンビンはヒト由来に限定さ
れることはなく、クシ、ウマ等の動物由来のトロンビン
も用いることができ、工業的生産のためには必ずしも高
純度のものを用いる必要はない。市販品としてはモチダ
社製、ウシ血漿由来日本薬局方トロンーン、シグマ社製
のウシ、ウマ又はヒトの血漿由来のトロンビン等を挙げ
ることができる。

トロンビンの濃度は用いる細胞、共存させるアミノ酸類
、ビタミン類、ペノタイｆ類、糖類、有機酸類、動物肉
酵素分解ペプトン又は植物ペプトンの種類、濃度によっ
て異なるが通常１〜１００Ｗの濃度範囲が好ましい。

該因子の生産は通常細胞１０万個あたり０．２ゴ以上の
培養液を用いて２５℃〜４０’Ｃ，好ましくは６１°Ｃ
〜３７°Ｃｆ）　ｍ　度範囲テロ、０〜８．０　、好ま
しくは７．０〜７．４の−の範囲で行なわれる。

−の維持はＣ０２ＡｃＯ３−の緩衝系を利用して行なう
ことができるが、細胞が多量にｃｏ２、または乳酸等の
有機酸を生産して上記の−の維持が困難な場合にはＨＥ
ＰＥＳ等の緩衝剤を用いてもよい。

生産の日数は通常４日ないし６０日であるが６０日を越
えることも可能である。該因子の生産速度は生産の後手
では次第に運くなるので工業的生産の場合は最も効率の
よい日数が選ばれる。

工業的規模の犬１１培養を行う際には、ローラーボトル
培養法、多層平板培養法、ホローファイバー培養法、フ
０ラスチックバッグ培養法、マイクロキャリア培養法等
の培養法を適用することができるが、より大量の培養を
行うにはマイクロキャリア培養法が好ましい。

該因子は、前記の条件ｒで細胞から溶液中に放出され、
その生′ＦＲ，ｔの測定は、次の方法で行なった。

９５％凝固フィブリノ−ｒン（プラスミノ−ダン含量約
５０カゼイン単 として作製した寒天加フィブリン平板を用い、ウロキナ
ーゼを標準品とするプレート法で測定した。

該因子の溶液を、１チゼラチン、［］、ｉＭ塩化ナトリ
ウムおよび０．１窒化ナトリウムを含む０．０　６　７
Ｍ　トｌ／ス塩酸緩衝液（ｐｉ−１８．０）で希釈し、
フィブリン平板上で１　０　ＩＵ７ｆｎｌのウロキナー
ゼと同じ溶解窓を示す該因子溶液の濃度を１　０　Ｕ／
ｌｈｌとした。

ウロキナーゼが混入する溶液を測定する場合には、ウサ
ギより得た抗つロキナ−ｔ”Ｉｇ（）を１００μＶｆｎ
１になるように被験溶液に添加して測定した。

所望の生成量または日数に達した時に、溶液を採集して
該因子を回収する。

該因子の回収は、蛋白質の回収方法として通常用いられ
る吸着法、塩析法、透析法、クロマトグラフィー法、デ
ル濾過法などを単独であるいは組合せて適用すればよい
。そのような精製法り例として、フィブリンを結合させ
たセファロースを用いるフィブリンセファロースカラム
クロマトグラフィー、カルボキシメチル基を結合させた
セファロースを用いるＣ　Ｍセファロースカラムクロマ
トグラフィー、リジンを結合させたセファロースを用い
るリジンセファロースカラムクロマトグラフィー、亜鉛
キレートセファロースを用いる配位子交換クロマトグラ
フィー、コンカナバリンＡを結合させたセファロースを
用いるレクチンカラムクロマトグラフィー、本発明物質
と特異的に結合する抗体を結合した抗体アフィニティー
クロマトグラフィー、架橋したデキストラン粒子を用い
るデル濾過等を挙げ，ることかできる。

具体的な分離精製の一例を挙げれば、本発明の方法に従
って得た組織培養液を０．１チツイン８０および０．１
　５　Ｍ塩化ナトリウムを含む２　０　ｍＭアセテート
緩衝液ＣｐＨ４．０）で平衡化したＣ　Ｍセファロース
カラムに吸屑させる。０．１チツイン８０および０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０鮨アセテート緩倚液（ｐ
Ｈ４．０）で洗浄した後、０．１チツイ／８０および１
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　ｌ□　ＩＪス塩醒援
衝液（ｐＨ８．９）で溶出し、本願のプラスミノーケ９
ン・活性化因子活性を有する部分の溶液を集める。この
溶液を０．１　Ｍ　Ｏダンカリ、０、１　％ツイン８０
、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む２Ｑ　ｍＭ　）　’
）ス塩酸緩衝液に対して４“Ｃ１−晩透析し、これと同
一の緩衝液で平衡化したリジンセファロースカラム忙吸
着させ、平衡化した緩衝液で洗浄した後、０．０５Ｍ塩
化ナトリウム、１Ｍロダンカリ、０．２Ｍε−アミノ−
ｎ−カプロン酸および０．１　％ツイン８０を含む２　
０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液で溶出する。この溶出液を
限外濾過用中空糸で濃縮し、セファクリルＳ−２０００
カラムにてｒＪｖ濾過を行なうことによって目的のプラ
スミノーゲン活性化因子が得られる。

かくして得られるプラスミノ−ｒン・活性化因子の物理
化学的性質について、以下に説明する。

ａ）分子蓋：　６　３，０　０　０±ｉ　ｏ，ｏ　ｏ　
。

１、５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ　ｇＤＴＡ，　　０
．１　Ｍアルギニンおよび０．１％ンイン８０（花王ア
トラス登録商標）を含む０．０　１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝
液（　ｐＨ７、０）で平衡化したセファデックスＧ−１
５０を用いるデル濾過法にて測定した。

ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトｖウム）′心気泳動法によ
る非還元状態の分子量測定結果は約７０，０　０　０で
あった。

ｂ）等′成魚：７．Ｏ〜８．５ アンフオライトを用いた等電点電気泳動法にて等電点分
画し測定した。

Ｃ）フィブリンに対する親和性 生理食塩水に溶解したプラスミノーゲンを含有しないフ
イプリノーデン溶液（ｏ．２％）９５０μへ本発明によ
って得られるプラスミノーゲン活性イと因子溶液（５０
０°Ｕ／ｒｕｌ）　２０　ｐｌを加え、室温で１時間放
置する。生じたフィブリンを分収し、脱水後、生理食塩
水で洗浄する。２ＭＣｌダンアンモニウム溶液１１ｒＬ
ｌでフィブリン中の該因子を抽仕したところ該因子は約
７０％がフィブリンに取り込まれた。一方、組織培養ウ
ロキナーゼは全く取り込まれなかった。

ｄ）コンカナバリアＡに対する親和性二本発明によって
得られるプラスミノーゲン・活性化因子（３０Ｕ／ｄ）
２Ｍを生理食塩水に溶解してコンカナバリンＡ−セファ
ロース（ファルマシア社製〕のカラム（Ｃ１，５Ｘ４ｃ
ＩｒＬ）に吸着させ、１Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し
たところ、はぼ１００％が吸着した。

ｅ）至適ｐＨニア　〜９．５ 生理食塩水に溶解した本発明によって得られるプラスミ
ノーゲン・活性化因子５０μぎに、１Ｑチグリセリンを
よむ生理食塩水に溶解したプラスミノーゲン８Ｃ職ゼ）
５０μｌおよび０．１０　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．
０５　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０゜６．０）、リン
酸緩１ｆ（ｐＨ６，０，７，０，８，０＞　ｉたはグリ
シン−水酸化ナトリウム緩ｍＷ　（ｐＨ８，ｏ。

９．０．　１０．０．　１１．０　）　（ｐＨ５，０，
６，０，７，０゜８．０．９．０．１０．０．１１．０
の７種）を１００μｌずつ混合し、６７°Ｃで６０分間
ブレインキュベートする。次いで、０．１５Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で溶解したＢａｃ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡを５００μノ加え、さらに３７℃
で１５分間インキュベートした後、酢酸１ｒＬｌを加え
反応を停止させて、生成するアミノメチルクマリンを螢
光法にて測定し、至適−を求めた。測定結果を第１図に
示す。

ｆ）　　抗ウロキナーゼ特異抗体との反応性：精製ウロ
キナーゼ（比活性１５０，０００　ｘＵ、Ｉｎ９蛋白）
を７０インげの完全アジュバントと共に、ウサギに７日
間間隔で６５日間免疫した後、採血して精製した５０μ
ｆｌ／ｍｌの抗ウロキナーゼ特異抗体溶液と、本発明に
よって得られる２０Ｕ／ｄのプラスミノーゲン・活性化
因子の溶液とを、１：１に混合し、その混合液の活性を
前述の方法により測定したが、活性の低下は全く認めら
れなかった。

それに対し、比較対照として入れた２　０　ｘＵ／ｍｌ
のウロキナーゼ溶液と該抗りｑキナーゼ抗体溶液の混合
液のウロキナーゼ活性は、１００％阻害された。

以上のごとく、本発明によって得られるプラスミノーゲ
ン・活性化因子は、抗ウロキナーゼ抗体とは反応しない
ものである。

かくして得られた新プラスミノーゲン活性化因子の用途
としては、血栓溶解剤としての医薬用途以外に、たとえ
ば、人工面前、人工臓器等の材料に結合させ、血栓の形
成を防止する薬剤として、あるいは血栓症等の診断薬と
しての用途があげられる。

（発明の効果） 本発明の方法は、従来、用いられてきたウロキナーゼ、
またはストレプトキナーゼより少量で効果を有し、かつ
血栓溶解活性が高く、副作用の少ない、プラスミノーゲ
ン活性化因子を工業的規模で大量に安定供給する製造方
法として好適である。

（実施例） 次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（フロー・ラボラトリ
−社）に対するプロテオースペプトンＮα３　（Ｄｉｆ
ｃｏ社）又はポリペプトンＳ（大豆栄養化学社）とトロ
ンビン（持田製薬社）とを共存させた培地のプラスミノ
−ｒン活性化因子生成促進効果について調べた。

１２穴マルチプレートに上記細胞を９　Ｘ　１０’個／
穴の密度で接種し、１０％ウシ胎児血清を含むメジウム
ＭＥＭを１，５ｍ／添加して、炭酸ガス培葉装置を用い
て３７１Ｅ、５％炭酸ガスを含む空気中で充分単層を形
成するまで増殖させる。

次いで生理食塩水で洗浄した後各種添加物を含むメジウ
ム１９９を１．５＋ｍ添加し、上記条件で培養し、７目
間毎に全量培地交換する。回収した培養液中のプラスミ
ノ−ｒン活性化因子の生成量を測定した結果を表１に示
す。

表　　１ 実施例２ ヒト胎児肺由来またはヒト胎児包皮由来の正常二倍体細
胞（いずれもフロー・ラポラ）ｌ−社）を実施例１と同
様の方法で増殖させた後、プロテオースペプトンｍ　３
　（Ｄｉｆｃｏ社）とトロンビン（持田裏薬社）をそれ
ぞれ各種濃度で組合わせて添加したメジウム１９９を添
加し、５％炭酸ガスを含む空気中で培養した。７日目毎
に培地を全量交換して２１日間培養し、回収した培養液
中の該因子の活性を測定した。ヒト脂児肺またはヒト胎
児包皮由来の細胞が主題する該因子の痣生産量を生産培
養開始時の細胞数１０６個あたり１日あたりの生産量に
換算して表示した結果をそれぞれ図２及び図６に示す。

実施例６ 本実施例では１類の異なる細胞に対してプロテオースペ
プトンＮＩＬ　５　（Ｄｉｆｃｏ社）又はポリペプトン
Ｓ（大五栄養化学社）及びトロピンの新プラスミノーゲ
ン活性化因子の生成促進効果釦ついて述べる。

種々の細胞全実施例１の方法に従って２穴マルチプレー
トで十分増殖させた後、６種添加物を含むメジウム１９
９に培地変換し、５％炭酸ガスを含む空気中で７日間保
持した。該因子生成量測定実施例４ 本実施例ではヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（マイク
ロパイオロジカルアソシエーツ社）を用いて種類の異な
るペプトン類とトロンビン（持田調薬社）を共存させる
ことによるプラスミノーゲン活性化因子生成促進効果に
ついて調べた。

ラクトアルブミン加水分解物（Ｄｉｆｃｏ社）及びカゼ
イン、動物肉等を原料とするバクトペプトン（Ｄｉｆｃ
ｏ社）も比較対照として調べた。

種々の市販ペプトン類をそれぞれ１又は２チ（ｗｔ／ｖ
）含有するメジウム１９９にトロンビンを加えたものと
加えないものを用意し、実施例１と同様の方法で増殖さ
せた細胞に添加し、５チ炭酸ガスを含む空気中で６７℃
、７日間の培養を行なった。

得られた培養液の該因子の活性測定結果を表６に示す。

表　　　３ 表　　６　　（続き） 実施例５ ヒト胎児肺由来正常二倍体細胞を用いて各種トロンビン
とプロテオ−スペア０トンＮα３　（Ｄｉｆｃｏ　社）
の新ノ２スミノーデン活性化因子促進効果について調べ
た。

実施例１と同様に１荊胞を十分増殖させた後、各種該因
子生産用培地におきかえ、７日間培養する。

７目間に回収した培盪孜中の該因子生成量測定結果を表
４に示す。

表　　　４ 実施例６ 、ヒト胎児包皮由来の正常二倍体細＠（フローラざラト
リー社〕を用いて、各種濃度のポリペプトンＳ（大豆栄
養化学社）とトロンビン（シグマ肚）の新プラスミノー
ｒン活性化因子生成促進効果について調べた。

実施例１と同様の方法に従って１２穴マルチプレートで
細胞を十分増殖させた後、各種濃度のポリペプトンＳと
トロンビンを含む培地におきかえ、７日間培養する。回
収した培養液中の該因子生成量測定結果を表５に示す。

表　　　５ 実施例７ ヒト胎児肺細胞を１１容スピナーフラスコて１０５ｃ　
ｅ　１１　ｓ／ｌｌの密度で６ｍ９Ｚｊｄｍ度ノサイド
テックス１ｕｌｌ胞培養用ビーズ担体、ファルマシア社
登録商標）と共に植え込み、６７”Ｃ，５％炭酸がスを
含む空気中で、成育培地として１０％ウシ胎児血清を含
むメジウムＭＥＭを６００ｄ添加し、４Ｏｒｐｍの回転
数で攪拌しながら懸濁培養する。６日間培養し、細胞を
充分増殖させた後、生理食塩水で細胞が接着したビーズ
担体を洗浄し、血清をよまない１チプロテオースペプト
ン随３　（Ｄｉｆｃｏ　７ｆＪ及び１Ｑ　Ｑ％’ｄ　）
ロンビン（持田製薬社）をきむメジウム１９９　６００
ｉ／ｕＫおきかえ、４０　ｒｐｍ　（ｒ）回転数で攪拌
しながら培養する。５日口毎に、この培地を交換しなが
ら、本願のノラスミノービン・活性化因子をよむ培養液
を回収する。

このようにして得られた１　１９　ｕｙｆｕｌの濃度の
該因子を含む培養液６．９ノを、０．１％ツイン８０お
よび０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０　ｍＭアセテ
ート緩＠＊（ｐＨ４，０）　テ平衡化ｔ、ｆｃ　Ｍセ７
７ロースカラム（１６５φＸ１０ｃＩＩＬ）に吸着させ
る。

０．１％ツイン８０および０．１５　Ｍ塩化ナトリウム
をよむ２０　ｍＭアセテート緩衝液（ｐＨ４，０）洗浄
したｆｆｌ、０．１％ツイン８０および１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む２０　ｍＭ　）　リス塩酸緩衝液（ｐ）１８
．９　）で溶出し、本願のプラスミノーゲン・活性化因
子活性を有する部分の溶液９６１ａを集める。この溶液
を０．１Ｍロダンカリ、０．１％ツイン８０．０．０５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝６
５１に対して４−０１−晩透析し、これと同一の緩衝液
で平衡化したクジ／セファロースカラム（２，６φＸ１
２ｃｒＩＬ）に吸着させ、平衡化した緩衝液で洗浄した
後、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍロダンカリ、０−
２Ｍε−アミノ−ｎ−カプロン酸および０．１％ツイン
８０を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶出する。この
溶出液１６６ゴを限外濾過用中空糸で１２Ｍまで＃縮し
、セファクリルＳ−２０００カラム（２，６φＸ９８ｃ
ＩｒＬ）にてデル濾過を行なった。本願のプラスミノー
ゲン・活性化因子活性を有する部分の溶ｉＡ　Ｑｍを回
収する。

得られた該プラスミノーゲン・活性化因子溶液の濃度は
、４８６０　ｕＡｌで３９０００Ｕ杏蛋白の比活性を示
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によって得られるプラスミノーゲン活性
化因子の至適−城を示すグラフであり、第２図及び第６
図はそれぞれ実施例２においてヒト胎児肺細胞及びヒト
胎児包皮細胞を用いて得られた培養液のプラスミノーゲ
ン活性化因子の生成量を測定した結果を示すグラフであ
る。 特許出願人　旭化成工業株式会社 州 第２図 トロンピッ（’／ｍｌ） 第３図 １０テオースにズトン トロンごソ　　＜ｕ／ｍｌ＞ 手続補正書（自発） 昭和６０年９月　５日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１６５９０１号 ２、発明の名称 生理活性物質の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番 （００３）旭化成工業株式会社 代表取締役社長　世　古　真　臣 ４、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５、補正の内容 別紙の通り。 補正の内容 （１）　　明細書第２頁第３行「プラスミノーゲン・ア
ク　　　１チベーターとして」を「プラスミノーゲン活
性化因子として」と訂正する。 （２）同第１３頁第１１行「プラスミノーゲン・活性化
因子」を「プラスミノーゲン活性化因子」と訂正する。 （３）同第１４頁第４行「プラスミノーゲン・活性化図
」を「プラスミノーゲン活性化図」と訂正する。 （４）同第１５頁第３行「分収し、」を「分取し、」と
訂正する。 （５）同第１５頁第１０行「プラスミノーゲン・活」を
「プラスミノーゲン活」と訂正する。 （６）同第１５頁第１８行「プラスミノーゲン・活性化
因子」を「プラスミノーゲン活性化因子」と訂正する。 （７）同第１６頁第１９行「ラスミノーゲン・活性化因
子」を「ラスミノーゲン活性化因子」と訂正する。 （８）同第１７頁第７行「ミノーゲン・活性化因子」を
「ミノーゲン活性化因子」と訂正する。 （９）同第２６頁第４表「生成量」を「生成量（Ｕ／ｍ
りＪと訂正する。 ＩＩ　　同第２６頁表４生成量の欄ｒ　（Ｕ／ｒｎｌ）
　８５Ｊ訃「８５」と訂正する。 以上 手続補正書（自発） 昭和６０年１１月１１日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１６５９０１号 ２、発明の名称 生理活性物質の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号４、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 補正の内容 （１）　　明細書第２頁第３行「プラスミノーゲン・ア
クチベーターとして」を「プラスミノーゲン活性化因子
として」と訂正する。 （２）　　同第１３頁第１１行「プラスミノーゲン・活
性化因子」を「プラスミノーゲン活性化因子」と訂正す
る。 （３）同第１４頁第４行「プラスミノーゲン・活性北国
」を「プラスミノーゲン活性化図」と訂正する。 （４）　　同第１５頁第３行「分収し、」を「分取し、
」と訂正する。 （５）同第１５頁第１０行「プラスミノーゲン・活」を
「プラスミノーゲン活」と訂正する。 （６）同第１５頁第１８行［プラスミノーゲン・活性化
因子ｊを「プラスミノーゲン活性化因子Ｊと訂正する。 （７）同第１６頁第１９行「ラスミノーゲン・活性化因
子」を「ラスミノーゲン活性化因子」と訂正する。 （８）同第１７頁第７行「ミノーゲン・活性化因子」を
「ミノーゲン活性化因子」と訂正する。 （９）同第２６頁第４表「生成量」を「生成量（Ｕ／岨
」と訂正する。　　　　ν′ Ｑｌ　　同第２６頁表４生成量の欄ｒ　（Ｕ／ｍ）　　
８５Ｊを「８５」と訂正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトに由来する正常二倍体細胞であつて、下記の性
   質を有するプラスミノーゲン活性化因子を生成する能力
   を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトン又は植物由来
   ペプトンとトロンビンとを含有する溶液と接触させるこ
   とを特徴とする該プラスミノーゲン活性化因子の製造法
   。 ａ）分子量：６３，０００±１０，０００ ｂ）等電点：７．０〜８．５ ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適ｐ
   Ｈ：７〜９．５ ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体とは反応しない。