NO832399L

NO832399L - Trombolytisk middel

Info

Publication number: NO832399L
Application number: NO832399A
Authority: NO
Inventors: Hisashi Mihara; Hiroyuki Sumi; Akira Matsuura; Tadahiko Inukai
Original assignee: Amano Pharma Co Ltd; Hisashi Mihara
Priority date: 1982-10-02
Filing date: 1983-06-30
Publication date: 1984-04-03
Also published as: CA1198697A; ES523754A0; FI832383L; US4568545A; DK300883A; EP0105092A2; DK300883D0; FI832383A0; AU1629383A; ES8504246A1; EP0105092A3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt trombolytisk

I middel hvilket som virksom bestanddel omfatter minst en

\ protease valgt fra gruppen protease F-III-l-HM-27 (i dét

følgende kalt HM-27), protease F-III-2-HM-89 (i det føl-

<1>gende kalt HM-89), protease F-O-HM-45 ( idet følgende kalt HM-45), protease F-I-l-HM-54 ( i det følgende kalt HM-54),

i protease F-I-2-HM-15 (i det følgende kalt HM-15), protease F-II-HM-64 ( i det følgende kalt HM-64) protease F-III<1>

1 1 2

protease F-II , protease F-I og protease F-I . Hver av disse proteaser er et hvitt amorft pulver fremstilt ved å rense det ekstraherte materiale fra vev av metemark til-hørende familien Lumbricidae såsom Lumbricus rebellus ogkarakterisert vedfibrinoppløsende aktivitet, dvs. fibr::no-lytisk aktivitet, og aktivitet ved oppløsning av trombi,

En slik virksom bestanddel er ikke beskrevet noe sted i litteraturen tidligere.

Blant de ovenfor nevnte proteaser er HM-27, HM-89, HM-45, HM-54, HM-15 og HM-64 alle en renset protease med en enkel 1 112\ bestanddel mens proteasene F-III , F-II , F-I og F-I alle er en blanding bestående av to eller tre typer av de ovenfor nevnte enkeltproteaser. Dvs. protease F-III''" er en blanding av HM-2 7 og HM-89, protease F-I er en blanding 1 i HaMv -H5M4 -o5g 4 HoMg -H1M5-. 1P5 roog teparse otFe-asIe I Fe-r I 2 en er hean lvb-rleanndseint g prav otHeMas-j!-e45,

hovedsakelig bestående av HM-64.

Disse nye proteaser kan fremstilles i rå form ved å ekstira-here metemarkvev med et vandig ekstraksjonsløsningsmiddéilved passende temperatur over et passende tidsrom, om nødi-vendig etterfulgt av at ekstraktløåningen holdes tilstrekkelig lang tid på en passende temperatur eller i rensetj form ved å rense de ovenfor erholdte rå produkter ved en kjent metode.

I senere år har fagfolk innenfor medisin og farmasi rettet sin oppmerksomhet mot forskjellige sykdomstyper som skyldes koagulering av blod som i mange tilfeller opptrer hos__|

, yngre og eldre voksne av geriatrigrunner. Flere av de vel-

<1>kjente sykdommer av slik art er f.eks. myokardialt infarkt,

I cerebral trombose, syndrom av disseminert intravaskulær i koagulering o.l., og som man vet, brukes urokinase av i

menneskeopprinnelse og streptokinase som terapeutisk medi-

i; kament for dette.

i i

I ■

<:>Disse medikamenter er imidlertid ikke helt tilfredsstillende I :- i flere henseender. F.eks. fremstilles urokinase av menn!e-

i skeopprinnelse fra menneskeurin som utgangsmateriale, slik<1>at forrådet av dette er begrenset av tilgjeng*eligheten ;il dette utgangsmateriale i store volumer. Streptokinase er ubrukbart p.g.a. antigenisitet. Dertil må begge disse medikamenter brukes ved instillasjon slik at pasienten under

behandling nødvendigvis har store smerter.

Man har derfor lenge ønsket å utvikle et nytt fibrinolytiisk aktivt middel som kan brukes som et terapeutisk medikament

i

i de ovenfor nevnte sykdommer uten problemene til de tidligere kjente medikamenter. Dvs. at et av de nyere probj-lemer innenfor farmasi har vært å utvikle et nytt fibrinolytisk aktivt middel som ikke har tilgjengelighetsbegrejis-ning til utgangsmaterialet i store mengder og er i stancl til å kunne gis til pasienten ikke ved instillasjon, men på andre måter, fortrinnsvis oralt, uten at pasienten får smerter.

Det er derfor et formål for foreliggende oppfinnelse å

tilveiebringe et nytt og virksomt trombolytisk middel fritt for de ovenfor beskrevne problemer og ulemper ved tidligere kjente terapeutiske medikamenter med f ibrinolytisk ellei: trombolytisk aktivitet. Dvs. at man har søkt å finne enj substans med den overnevnte aktivitet i stor utstrekning\

og funnet at vev fra metemark inneholder flere proteaset med en aktivitet som øker den fibrinolytiske aktiviteten

i mennetskets perifere blod, hvilket har ført til foreliggende oppfinnelse.

i Således omfatter det trombolytiske middel ifølge fore-J

liggende oppfinnelse som en vesentlig bestanddel derav,I minst en protease fra gruppen av de ovenfor nevnte proteaser HM-27, HM-89, HM-45, HM-54, HM-15 og HM-64 i en terapeutisk virksom mengde og, om nødvendig, en bærer. Dette oppfunnede trombolytiske middel er egnet for administrering i form av enten et oralt administrerbart medikament eller et ikke-oralt administrerbart medikament, men det sterkest foretrukne medikament er det oralt administrerbare fordi de-: som senere beskrevet har fortreffelig fibrinolytisk eller trombolytisk aktivitet ved oralt administrering til mennesker .

Fig. 1-6 viser alle kurver for den relative fibrinolytiske aktiviteten til de 6 proteaser, HM-27, HM-89,

HM-45, HM-54, HM-15 og HM-64 ved forskjellige pH-verdier.

i Fig. 7-12 er alle kurver som viser den fibrinolytiske rést-aktiviteten til de 6 proteaser, ved forskjellig<!>e pH-yerdier etter opphold ved 37°C i 60 minutter. Fig. 13-18 viser alle kurver for relativ fibrinolytiskj aktivitet av de 6 proteaser som funksjon av

temperaturen.

Fig. 19-24 viser alle kurver for fibrinolytisk restaktiyitet av de 6 proteaser ved forskjellige temperaturer etter 6 0 minutter ved en pH på 7.8. Fig. 25-40 er alle flytediagrammer for fremstillings- og renseprosessen til foreliggende trombolytiske middel. Fig. 41 er en kurve for pH-gradient, resultatene av den spektrof otometriske måling og den f ibrinoly tisice aktiviteten for fraksjonene oppnådd ved isoelektrisk fokusering av et metemarkekstrakt. Fig. 42 er en kurve som viser % tromboly.se som. funksjon av konsentrasjon til HM-27 og HM-89. Fig. 43 er en kurve som viser den fibrinolytiske aktivitet til det perifere blod fra tre pasienter som oralt har fått foreliggende protease F-III"'" i tidens løp. Fig. 44. viser den fibrinolytiske aktiviteten og den optiske densiteten ved 280 nm for fraksjoner erholdt ved kolonnekromatografisk fraksjonering av metemarkekstraktet i eksempel 13. Fig. 45a og 45b viser euglobulinoppløsningstiden og fibrin-oppløsningsaktiviteten, henholdsvis til det perifere blod fra menn som har fått oralt protease-fraksjonene (se eksempel 15).

Fig. 46 viser den fibrinolytiske aktiviteten og den op-

i tiske densiteten ved 280 nm til de erholdte fralk-sjoner ved kolonnekromatografisk fraksjonering avi metemarkekstraktet i eksempel 16.

Fig. 47 viser elueringskurvene i kolonnekromatografisk

rensing av proteasene HM-2 7 og HM-89 i eksempel 17.

I første omgang gis en karakteriserende beskrivelse av proteasene som de virksomme bestanddeler i det trombolytiske

middel. Hver av proteasene er et enzym erholdt som et hvitt amorft pulver med følgende fysikals-kjemiske egenskaperj. A) Aktivitet og substratspesifitet

De ovenfor angitte nye proteaser med en aktivitet til spaltning av fibrin, en aktivitet til plasminogenaktiveiring, en aktivitet for hydrolysen av casein og flere typer av andre substrater som gitt nedenfor. Metodene for måling av de respektive aktiviteter er beskrevet senere.

HM-2 7 har en aktivitet til fibrinolyse av koagulert fibrin og en aktivitet til plasminogenaktiveringen. Det er aktkvt_.

på casein, tosy1-L-arininmetylesterhydroklorid (i det føl-;. gende kalt TAMe) , N-a-tosyl-L-lysinmetylesterhydroklorid (i det følgende kalt TLMe) , L-pyroglutamylglycin-L-argirjin-p-nitroanilidhydroklorid (normalt kalt Testzym S-2444 kromogent substrat, et handelsprodukt fra Daiichi Kagaku Yakuhin Kogyo Co., og i det følgende kalt S-2444) og H-j-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid (normalt kalt Testzym S-2251 kromogent substrat, et handelsprodullt fra samme firma som S-2444 og i det følgende kalt S-2251). Det er imidlertid nesten inaktivt mot N-benzoy1-L-alaninmetylester ( i det følgende kalt BAMe) og N-benzoyl-L-tyrosinetylester (i det følgende kalt BTMe).

HM-89 har en aktivitet for fibrinolyse av koagulert fibrin og en aktivitet til plasminogenaktivering. Det er aktivi på casein, TAMe, TLMe, S-2444 og S-2251 men nesten inaktivt mot BAMe og BTEe.

HM-45 har en aktivitet til fibrinolyse av koagulert fibrin og en aktivitet til plasminogenaktivering. Det er aktivt I på casein, TAMe og BTMe og meget svakt aktivt på S-244 4 og! i S-2251, men nesten inaktivt på BAMe og TLMe.

HM-5 4 har en aktivitet ved fibrinolyse av koagulert fibrIi<n>I og en aktivitet ved plasminogenaktivering. Det er aktivt på! casein, TAMe og BTMe og svakt aktivt påTLMe og S-2444, menj nesten inaktivt på BAMe og S-2251.

HM-15 har en aktivitet ved fibrinolyse av koagulert fibrin og en aktivitet ved plasminogenaktivering. Det er aktivt i på!Icasein, TAMe og BTEe og svakt aktivt på TLMe og S-2444,|men, nesten inaktivt på BAMe og S-2251. !

'! i HM-64 har en aktivitet ved fibrinolyse av koagulert fibrin j og en aktivitet ved plasminogenaktivering. Det er aktivt på;

casein og noe mindre sterkt aktivt på TAMe og svakt aktivt på TLMe og S-2444 men meget svakt aktivt på S-2251, menJ nesten inaktivt på BAMe og BTEe. i

J

Fra den ovenstående sammenfatning fremgår at hver av disI seI 6 typer nye proteaser har mer eller mindre forskjellig

substratspesifitet fra hverandre. Verdiene til aktiviteten av disse seks proteasene i enzymenheter u/mg på de forskjellige substrater som er nevnte ovenfor, er vist i tabell 1 nedenunder sammen med aktivitetstallene for fibrinolyse

åv koagulert fibrin og aktivitet ved plasminogenaktiverjin<g>uttrykt i enheten mm^/mg. I overnevnte forklaring svarer uttrykkene "aktiv", "mindre sterkt aktiv", "svakt aktiv", "meget svakt aktiv" og "nesten inaktiv" til aktivitetstallene 1 u/mg eller større, minst 0,1 men mindre enn 1 u/mg, minst 0,01 men mindre enn 0,1 u/mg, minst 0,001 men mindre enn 0,01 u/mg og mindre enn 0,001 u/mg er angitt med N.D., dvs. "ikke påvisbar", i tabellen.

(1)Bestemmelse av fibrinolyseaktiviteten for koagulert

fibrin ble utført ved en lignende metode som er beskrevet av T. Astrup i Arch. Biophys. , bind 40, side 346 (1952) ji. Således ble fibrinogen oppløst i en 0,17M boratpufferløs-ning ved en pH på 7,8 inneholdende 0,0IM natriumklorid i en slik mengde at konsentrasjonen av det koagulerbare protein i løsningen var 0,15 % og 10 ml av løsningen ble tatt i en sterilisert glass-skål med 80 mm diameter i blanding med 0,5 ml trombinløsning med 20 u/ml konsentrasjon etterfulgt av henstand ved romtemperatur i 1 time med et glasslokkj. Dette kalles standardfibrinplate.

En vandig løsning av enzymet under prøve i en passende konsentrasjon ble fremstilt, f.eks. ved å oppløse det pulverformige enzym i en konsentrasjon på 1 mg/ml etter^-

I

fulgt av hensiktsmessig fortynning og 0,0 3 ml av den for-tynnede løsning ble dryppet loddrett på den midtre del av den overnevnte fremstilte standardfibrinplate som etter henstand omtrent 10 minutter med et filterpapir innsatt mellom glass-skålen og loo kket, ble holdt 18 timer i en termostat innstilt på 37 C for å bevirke reaksjonen. Deni fibrinolytiske aktiviteten til enzymet, dvs. aktivitetenifor spaltning av fibrin, på det koagulerte fibrin ble 1

u■ ttrykt i mm 2 av produktet, til hovedakse■ n og den ' kortere I

akse i mm av det oppløste området på standardfibrinplate;nI multiplisert med fortynningsforholdet. Sluttresultatene er

gitt i mm 2/ml for enzymet erholdt som en vandig løsning og

;i mm 2/mg for enzymet erholt i pulverform.

(2) Metoden for bestemmelse av aktiviteten ved plasminogenaktivering var som følger. Eri vandig løsning ble fremstilt

ved å blande 10 ul av en løsning av plasminogen (et produkt fra Sigma Co.) i en konsentrasjon på 5 u/ml, 20 ul av den vandige løsning av enzymet under prøving og 30 pl av en 0,17M boratpufferløsning ved en pH på 7,8 inneholdende 0,01M natriumklorid og, etter henstand av denne i 10 minutter, ble 0,03 ml av løsningen dryppet på en fibrinplate fremstilt med plasminogenfritt fibrin ( et produkt fra Miles Laboratories, Inc.) som ble holdt på 37°C i 18 timer for å bevirke denne reaksjonen. Området X hvori oppløsningen.fant i<2>sted ble målt og uttrykt i mm som produkt av den minste og største akse i mm. Lignende målinger ble foretatt mederstatning av den overnevnte plasminogenløsning med samme volum av 0,17M boratpufferløsning og det oppløste område Y ble målt og uttrykt i mm også som et produkt av den størsté og minste akse i mm. Aktiviteten for plasminogenaktiver:.ngeh!<.>var gitt ved X - Y.

(3) Bestemmelse av aktiviteten for hydrolysen av casein ble

utført ved en lignende metode som beskrevet av M. Kunitz i J. Gen. Physiol., bind 30, side 291 (1947). Således ble 1 ml av en vandig løsning fremstilt ved 1,5 vekt-% melke-casein (et produkt fra Merck Co.) i en 0,IM fosfatpuffer-løsning ved en pH på 8,0 blandet med 1 ml av den vandige løsning av enzymet under prøving for å bevirke reaksjonen ved 37°C i 30 minutter, hvoretter reaksjonen ble avbrutt ved å tilsette 2,0 ml av en 0, 4M vandig løsning triklorj-eddiksyre, og etter 15 minutters inkubering separert ved sentrifugering ved 4.000 o.p.m. i 15 minutter, hvilket ga en klar supernatant løsning som ble målt spektroskopisk ved en bølgelengde på 280 nm ved bruk av en referanseløsning ' fremstilt på lignende måte som overnevnte ved etterfølgende blanding av caseinløsning, vandig løsning av„trikloreddlk-:_

syre og en vandig løsning av enzymet under prøving. Res--ultatene er uttrykt i Kunitz-enheten.

I

! i

ii(4) Aktiviteten ved hydrolysen av TAMe ble målt ifølge den

metode som er beskrevet i Methods in Enzymology, bind 19,

, side 41 (1970). 19,7 mg TAMe ble oppløst i 50 ml åv en 0i,IMtri/saltsyrepufferløsning med pH 8,0 og 3,0 ml av denne løsning ble blandet med 0,15 ml av vannløsningen av enzymet under prøving for å bevirke reaksjon véd 25°C i • 1 minutt etterfulgt av fotometrisk bestemmelse av absorpsjonen til løsningen ved en bølgelengde på 247 nm ved biruk av en referanseløsning fremstilt på samme måte som ovenfor untatt bruk av rent vann i stedet for enzymløsningen. Mengden av enzymet som var i stand til å hydrolysere 1 U mol TAMe i 1 minutt ble tatt som 1 enhet for aktiviteten.

(5) Fremgangsmåten for aktivitetsbestemmelsen for hydror

i lysen av TLMe var hovedsakelig den samme som ved aktivitetsbestemmelsen for hydrolysen av TAMe beskrevet ovenfor, j bortsett fra at man brukte TLMe i steden for TAMe og brukte en bølgelengde på 250 nm i steden for 247 nm ved spektrp-fotometri. Enzym-mengden som kunne gi en absorbsjonsøkning på 1,0 ved 250 nm i 1 minutt av reaksjonen ble tatt som 1 enhet for aktiviteten.

(6) Aktiviteten til enzymet ved hydrolysen av BTEe ble målt

ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i Methods in Enzymology, bind 19, side 31 (1970). 15,7 mg BTEe ble opp-løst i 30 ml metylalkohol etterfulgt av fortynning med vann til et totalvolum på 50 ml og ytterligere blanding med j 46,7 ml av en 0, IM tri/saltsyrepuf f erløsning med pH 8,0l;.

Reaksjonen ble utført ved å blande 3,0 ml av den således

i fremstilte løsning av BTEe og 0,15 ml av den vandige løs-ning av enzymet ved 25°C i 1 minutt og den fotometriske absorbsjon av løsningen ble målt ved en bølgelengde på 256 nm ved bruk av en referanseløsning fremstilt på samme

måte som ovenfor bortsett fra at man brukte rent vann i| .

i steden for enzymløsning. Den mengde enzym som er i stand<1>til å hydrolysere 1 u mol BTEe i 1 minutt ble tatt somk

, enhet for aktiviteten.

i

(7) Fremgangsmåten for bestemmelsen av hydrolyseaktivit^ten til BAMe var hovedsakelig den samme som i aktivitetbestém-

I

meisen for hydrolysen av BTEe beskrevet ovenfor, bortsett fra at man brukte en løsning fremstilt ved å oppløse 1917

!mg BAMe i 50 ml av den samme pufferløsning i stedet for BTEe-løsningen og bruken av en fotometrisk bølgelengde på 255 nm i steden for 256 nm. Enzymmengden som var i stan;

til å gi en absorbsjonsøkning på 1,0 ved 255 nm i 1 minutt av reaksjonen ble satt som 1 enhet for aktiviteten-

(8) Hydrolyseaktiviteten til S-2444 ble målt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i The Journal of Biological Chemistry, bind 265, side 2005 (1980). Således ble S-24^4 oppløst i en 0,05M tri/saltsyrepufferløsning med en pH på 7,4 og inneholdende 0,IM natriumklorid i en konsentrasjon på 0,5 mM og 1 ml av denne substratløsning blandet med 10 ul av den vandige løsning av enzymet for å bevirke reaksjonen ved 25°C i 1 minutt etterfulgt av bestemmelse av økningen i absorpsjonen ved en bølgelengde på 405 nm. Den mengde enzym som hydrolyserte 1 u mol S-2444 i 1 minutt ble satt som 1 enhet for aktiviteten. (9) Fremgangsmåten for bestemmelse av aktiviteten for hydrolysen av S-2251 var hovedsakelig den samme som i til- \ felle S-2444 beskrevet ovenfor, bortsett fra at man brukte S-2251 i steden for S-2444, og konsentrasjonsøkningen tii l substratet til 0,1 mM fra 0,5 mM. Den mengde enzym som kunne hydrolysere 1 u mol S-2251 i 1 minutt av reaksjonen ble satt som 1 enhet for aktiviteten. i Tabell 1 nedenunder viser resultatene av aktivitetsbestem- meisen for kombinasjonen av de 6 enzymer, dvs. HM-2 7, HM-89, HM-45, HM-5 4, HM-15 og HM-6 4, og de ovenfor nevnte for-j skjellige substrater. I tabellen betyr "N.D." at nesten ingen aktivitet ble påvist for kombinasjonen. B) Områder for optimum pH og pH stabilitet.

Optimum pH for hver av proteasene ble målt for fibrinolyse av koagulert fibrin ved aktivitetsmålinger ved forskjellige pH-verdier. Resultatene i målingen av den relative aktivitet er plottet i fig. 1-6 for HM-27, HM-89, HM-45, HM-54, HM-15 og HM-64 idet høyeste verdi settes som 100 %. De hvite og sorte sirkler på kurvene i disse figurer betyr de data som erholdes ved bruk av en fosfatpufferløsning og en tri/glycinpufferløsning, henholdsvis. Verdiene for den optimale pH er oppført i tabell 2.

Videre ble området for pH for stabilitet målt for hver av proteasene ved å måle restaktiviteten til proteasen etter 60 minutter ved 37°C under forskjellige pH-verdier. Resultatene i bestemmelsen av den relative restaktivitet for de ovenfor nevnte 6 proteaser er plottet i fig. 7-12, henholdsvis, idet høyeste verdi settes som 100 I.De hvite sirkler, sorte sirkler og trekanter på kurvene i disse figurer representerer de data som oppnås ved å bruke en acetatpufferløsning, en fosfatpufferløsning og en tri/- glycinpufferløsning, henholdsvis. Områdene av pH for stabilitet er oppført i tabell 2. C) Område for operabel temperatur.

Den relative aktiviteten til hver av proteasene for fibrinolyse av koagulert fibrin ble målt ved forskjellige tempera-j turer ved reaksjon i 2 timer ved en pH på 7,8. Resultatene av den relative aktivitet for de ovenfor nevnte 6 proteaser, er plottet inn i fig. 13-18, henholdsvis, idet høyeste j verdi settes som 100 %. Områdene for operabel temperatur

samt optimumstemperaturer er oppført i tabell 2. j

i D) Deaktiveringstemperatur.

Hver av de 6 proteaser ble holdt på forskjellige tempera-; turer fra 30 - 70°C i 60 minutter med en pH på 7,8 og rést-aktiviteten for fibrinolysen av koagulert fibrin ble målt. Resultatene er plottet inn i fig. 19-24 for de ovenfor nevnte 6 proteaser, idet begynnelsesaktiviteten settes som 100 %. Som man ser av disse tall var proteasene fullstendig deaktivert etter 60 minutter ved 70°C. E) Molekylvekt.

Molekylvekten til hver av de 6 proteaser ble målt ved elektroforese med SDS polyakrylamidgel med bovinserumalbu-min (molekylvekt 67.000), ovalbumin (molekylvekt 43.000) og kymotrypsinogen A (molekylvekt 25.000) som standard for molekylvektbestemmelsen. Resultatene er oppført i tabell 2, alle med en usikkerhet på - 2.000.

F) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum.

Alle de 6 proteaser har et absorpsjonsmaksimum ved en bølgelengde på ca. 2 80 nm og et absorpsjonsminimum på ca. 25 0 nm.

G) Isoelektrisk punkt.

I

i i i Tabell 2 viser også pH-verdiene ved det isoelektriske punkt for de 6 proteaser. Usikkerheten i hver av verdiene er - 0,1.

I H) Inflytelse av inhibitorer.

Inflytelsen av forskjellige enzyminhibitorer på aktiviteten av de 6 proteaser ble undersøkt på følgende måte. 80 ul av en vandig løsning av en av proteasene i en konsentrasjon på

2,5 ug/ml for HM-27 og HM-89, 25 ug/ml for HM-45 og HM-64 og 12,5 ug/ml for HM-54 og HM-15 ble blandet med 20 ul av

en vandig løsning av en inhibitor i en konsentrasjon på

4 mg/ml, og etter.henstand i 10 minutter ved 37°C, ble aktiviteten til proteaseløsningen for fibrinolyse av koagulert fibrin målt ved å ta 30 ml av løsningen. Resultatejie er sammenfattet i tabell 3, idet uinhibert aktivitet settes som 100 %. De undersøkte inhibitorer var: limabønnetrypsin-inhibitor som en proteaseinhibitor; difluorfosfat som ejt senn reagens; N-ety 1-maleimid som et SH reagens; soyabønne-trypsininhibitor; dinatriumetylendiamintetraacetat ( kalt EDTA i tabell 3) som et chelateringsmiddel for toverdige kationer; eggehvitetrypsininhibitor; pepstatin; Antipain; kymostatin; trans-4-(aminomety1)cykloheksankarboksylsyre j (kalt t-AMCHAi tabell 3); Leupeptin; Trasylol (handelsnavn fra Bayer Co.); og C-aminokapronsyre. Som man ser fra tabell 3 adskiller de inhiberende effekter for disse inhti-bitorer seg meget blant de 6 proteaser bortsett fra lima-bønnetrypsininhibitoren og difluorfosfatet, ved hvilke j ingen av proteasene ble noe inhibert. j

I) Sammensetning av aminosyrer.

Aminosyreanalysen på hver av de 6 proteaser ble utført i en automatisk aminosyreanalysator etter hydrolysering av 0 [. 2 mg av proteasen fortynnet til et volum på 0,5 ml ved å blande norleucin med en intern standard og surgjøre med 6N saltsyre etterfulgt av oppvarming ved 110°C i 24 timer. Resultatene er sammenfattet i tabell 4 i %-mol.

J) Elementæranalyse.

Resultatene av elementæranalysen for hver av de 6 proteaser er vist i tabell 4 for karbon, hydrogen, nitrogen og svovel. I det følgende beskrives fremgangsmåten for fremstilling av de 6 nye proteaser som virksomme bestanddeler i foreliggende trombolytiske reagens.

I det første tilfelle erholdes en råblanding av proteasene ved å ekstrahere metemarkvev med et vandig ekstråksjonsi

middel hvori metemarkvevet dispergeres finfordelt og holdes tilstrekkelig lenge ved en passende temperatur, hvoretter ; uoppløselig stoff fjernes, og etter at den vandige ekstirakt-løsningen er holdt tilstrekkelig tid ved en passende temperatur etter behov, konsentreres eller tørkes ekstrakt-løsningen. Utgangsmaterialet, dvs. metemarkvev, kan være finmalte levende metemarker samt friske metemarklegemer uten innvoller, og innvollene og pulverene av metemarkehe som oppnås ved vakuumtørking eller frysetørking med eller

i uten avfetting. Det sterkest foretrukne utgangsmateriale er et frysetørket pulver av metemarker med eller uten avfetting.

I

Det vandige ekstraktet bør ha en pH på 5 til 10 eller, for-j trinnsvis, 6 til 8. Egnet vandig ekstraksjonsmiddel er ! f.eks. vann, fysiologiske saltløsninger, pufferløsninger og fremstilte saltløsninger enten alene eller som blanding av to typer eller fler. Det vandige ekstraksjonsmiddel kan blandes med et lite volum av et vannblandbart, polart i organisk løsningsmiddel, såsom metanol, etanol, propanol, aceton, dietyleter, dioksan o.l. avhengig av behov. De sterkest foretrukne vandige ekstraksjonsmidler er fysiologisk saltløsninger og pufferløsninger, idet sistnevte kan være en fosfatpufferløsning, acetatpufferløsning, boratpuffer-løsning, sitratpufferløsning, tri/saltsyrepufferløsning| o.l. med en pH fra 5 til 10 eller, fortrinnsvis, 6 til 8 enten brukt alene eller som en blanding av to typer eller mer. Den ovenfor nevnte fremstilte saltløsning medfører en fortynnet vandig løsning fremstilt ved å blande vandigei j løsninger av en vannblandbar uorganisk eller organisk syre,

f.eks. saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, melke-syre, sitronsyre og ravsyre, og et alkali inneholdende hydroksyder eller karbonater av et alkalimetall, f.eks.j

! ; natri• um ■ eller kalium, og ammoniakkvann til en pH fra 5 t1 il 10, fortrinnsvis 6 til 8.

Den ovenfor nevnte passende tid betyr et tidsrom opptil 500 dager, fortrinnsvis i området fra 30 minutter til ca. 30 dager og den ovenfor nevnte egnede temperatur betyr en

i temperatur ikke høyere enn 60 oC, fortrinnsvis i området

fra 5°C til 40°C. Det vandige ekstraksjonsmiddel bør settes til utgangsmaterialet i en mengde på 1 til 100 ganger vekten eller, fortrinnsvis 5 til 30 ganger vekten beregnet på basis av det tørre materiale.

Ekstraksjonen av metemarkvevet med vandig ekstraksjonsmiddel utføres fortrinnsvis ved først å fremstille et homogenisat av bestanddelene i metemarkceliene ved bruk av et egnet instrument, såsom en homogenisator, blander, ultralydoppbryter, presscelledestruktør, maler eller lignende som ofte brukes for celledestruksjon i kroppsvev og innkubere homogenisatet før man foretar den vanlige j ekstraksjonsoperasjonen såsom røring, risting eller motj-strømsekstraksjon gjennom et bed av utgangsmaterialene.j Når ekstråksjonen med det vandige ekstraksjonsmiddel er ferdig, filtreres blandingen eller sentrifugeres for å fjerne det uløselige stoff og den klare ekstraktløsning; konsentreres etter henstand i tilstrekkelig tid ved egnet temperatur om nødvendig, ved en kjent metode såsom vakuuim-inndampning, oppvarming og ultrafiltrering eller tørkes1

i ved vakuumtørking eller frysetørking til et råprodukt av proteaseblandingen. Det foretrekkes å tilsette et anti-j septisk middel til ekstraksjonsblandingen eller ekstrakt-løsningen under inkubering for å forhindre denatureringi av de virksomme bestanddeler. Tilsetningen av et lite volum polart organisk løsningsmiddel som ovenfor nevnt er virk- j somt også i så henseende i tillegg til å øke ekstråksjohens virkningsgrad.

Det ovenfor nevnte råprodukt av proteaseblandingen kan renses ved å underkaste den konsentrerte ekstraktløsning

I

eller et dehydratisert materiale derav oppløst.i et lite

' I

volum vandig løsningsmiddel for en kjent rensemetode for

proteaser. Den foretrukne anvendelige metode i dette til-

1 felle er som følger. Den konsentrerte ekstraktløsning er-

!holdt i ovenfor beskrevne ekstraksjonsmetode eller en vandig løsning fremstilt ved å oppløse det dehydratiserte råprodukt i et lite volum av et vandig løsningsmiddel undér-

<:>kastes eh behandling hvorved forurensningene fjernes ved

én eller en kombinasjon av de kjente metoder innbefattende adsorpsjon på en adsorbent, fraksjonert utfelling med et polart organisk løsningsmiddel, utsalting, ultrafiltréring, ionebyttekromatografi, gelfiltréring, affinitetskromator grafi, hydrofob kromatografi og lignende. Adsorbenten som brukes i den ovenfor nevnte adsorpsjonsmetode kan være et aktivt karbon, sur leire, aktivert leire, syntetisk harpiksbaserte adsorbenter såsom f.eks. Amberlite XAD o.l.

I

De polare organiske løsningsmidler som brukes i den ovenfor nevnte fraksjonerte utfelling innbefatter metylalkohiol, etylalkohol, propylalkohol, aceton, dietyleter, dioksanj o.l., hvorunder etylalkohol, propylalkohol og aceton foretrekkes. Saltene som brukes i den ovenfor nevnte utsalting er ammoniumsulfat, natriumsulfat, magnesiumsulfat, kalium-fosfat, natriumklorid, kaliumklorid, natriumsitrat o.l.i

hvorav ammoniumsulfat foretrekkes. Egnede ionebyttere som brukes i den ovenfor omtalte ionebyttekromatografi innbefatter sådanne som er fremstilt på basis av et hydro-filt polysakkarid såsom cellulose, dekstran, agarose o.l. Spesielt innbefatter foretrukne anionbyttere dietylamino-etylcellulose (i det følgende kalt DEAE-cellulose), tri-etylaminoetylcellulose ( i det følgende kalt TEAE-cellulose), aminoetyl-cellulose (i det følgende kalt AE-cellulose), reaksjonsprodukt av cellulose med epiklorhydrin og trietanolamin (i det følgende kalt ECTEOLA-cellulose), ! kvaternalisert aminoetylcellulose (i det følgende kalt i QAE-cellulose), polyetylenimincellulose (i det følgende! i kalt PEI-cellulose), dietylaminoetylcellulofin (i det j følgende kalt DEAE-dellulofin), dietylaminoetylsefarose

(i det følgende kalt DEAE-sefarose) o.l. og foretrukne kationbyttere innbefatter karboksymetylcellulose ( i det

' følgende kalt CM-cellulose) , f osf ocellulose. ( i..det fø li-

gende kalt P-cellulose), fosfometylcellulose (i det følgende kalt PPM-cellulose), sulfoetylcellulose (i det følgende kalt SE-cellulose), sulfometylcellulose (i det følgende kalt SM-cellulose), sulfopropylcellulose (i det følgende kalt SP-cellulose) , o.l. Ionebytterharpiks i handelen e:: også egnet som ionebyttere i ionebytterkromatogråfi innbefattet angitt med handelsnavn, svakt sure kationbytte::-harpikser såsom Amberlite IRC-50, Amberlite IRC-75, Amberlite IRC-84, Dowex GCR-2 o.l. og sterke eller svake basiske ionebytterharpikser såsom Amberlite IR-4B, Amberlite IR-45, Amberlite IRA-400, Dowex 3 o.l. Gelfiltreringen utføres ved bruk av en bærer såsom, slike med handelsnavnene,

Sephadex, Sepharose, Biogel, Toyopearl Ultragel, Cellulø-fine o.l. og affinitetskromatografi utføres ved bruk avjet adsorpsjonsmiddel såsom agarose og cellulose med alifatiske, alicykliske eller aromatiske grupper eller aminosubstitu-erte grupper derav som hydrofobe grupper bundet til disse.

! Flere av prosessforløpene for fremstillingen av råproduktene samt rensede produkter av proteasene er illustrert som flowcharts i fig. 25-40.

I det følgende gis en beskrivelse av et aktuelt eksempel

for fremstillingen ifølge oppfinnelsen av trombolytiske midler og de fysikalskkjemiske egenskapene og farmasøytiske aktivitene til de nylig fremstilte proteaser F-I 2 , F-IIj<1>og F-III 1 for mer fullstendig å illustrere renhetene og; 1

. i virkningsgraden til de nye proteaser som effektive bestand-, deler i det trombolytiske middel. ! ij !i

; i Således ble et avfettet og frysetørket pulver av metemark

i dispergert i 10 ganger vekten av en 50 mM fosfatpufferløs-ning med en pH på 7,0 og blandingen ble inkubert ved 37°C

i

i 200 timer for å ekstrahere proteasene etterfulgt av j fjerning av det uløselige stoff ved filtrering og konsen-trering av ekstraksjonsløsningen ved ultrafiltréring. Den konsentrerte løsning ble fraksjonert ved tilsetning av j etylalkohol og utfellingene ble igjen oppløst i vann og|

behandlet ved bruk av DEAE-cellulose for å fremstille tre fibrinolytisk aktive fraksjoner F-I, F-II og F-III. Hver av fraksjonene F-I og F-II ble utsaltet med ammoniumsulfat etterfulgt av behandling med Sephadex G-75 og fraksjonen med aktivitet ble frysetørket. Fraksjon F-III ble befriet for salt og frysetørket som sådan, hvilket ga et renset proI-dukt .

Etterfølgende beskrivelse illustrerer de fysikalskkjemiske 2 11 egenskapene som er felles for disse proteaser F-I , F-II og F-III"'' og aktivitetene derav. (1) Aktivitet: fibrin solubiliseres.

(2) Substratspesifitet: fibrin spaltes raskt.

i

(3) Optimum pH og pH for stabilitet: optimum pH er

rundt 8 til 10, og pH for stabilitet er i området;

ca. 5 til 10. !

i

(4) Aktivitetsbestemmelse: 10 ml av en løsning fremstilt ved å oppløse fibrinogen i en 0,17M boratpuffer-løsning med pH på 7,8 og inneholdende 0,01M natriumklorid i slik mengde at konsentrasjonen av det koa- i gulerbare protein deri var 0,15 % ble tatt i en steril glass-skål med 80 mm diameter og blandet med 0,5 ml av en 20 u/ml løsning av trombin etterfulgt av henstand såsom ved romtemperatur i 1 time med et glass-lokk lagt på. Dette kalles standard fibrinplaten.jEn 0,03 ml porsjon av løsningen under prøving ble dryppet loddrett på denne fibrinplaten og, etter hen-j stand som sådan i 10 minutter med et filterpapir

innsatt mellom glass-skålen og lokket, ble glass-;

skålen plassert i en termostat på 37°C hvor den ble holdt i 18 timer for å bevirke reaksjonen. Den fibrino-! 2 lytiske aktiviteten ble uttrykt ved produktet i mm

av lengdene i mm av hovedaksen og den mindre aksej av det oppløste område som-ble dannet på fibrinplaten.

(5) Stabilitet: minst 92 % av restaktiviteten erholdtes

i hver av 2 de vand1ige løsninger 1s" om inneholdt protéII-åsene F-I , F-II eller F-III med en pH på 7,5 eller 9,0 etter 30 minutter ved 50°C.

: i

(6) Inhibitorer: den fibrinolytiske aktiviteten til

2 11 I proteasene F-I , F-II og F-III ble inhibert medj Trasylol (et handelsnavn fra Baeyer Co.), Transamine (et handelsnavn fra Daiichi Seiyaku Co.), soyabønne-trypsininhibitor (et produkt fra Miles Lab., Inc.

og blodserum.

(7) Fibrinolytisk aktivitet: proteasene F-I 2 , F-II1 og F-III"<*>" har en aktivitet for plasminogenaktivering hvorved fibrin oppløses indirekte og også oppløser fibrin ved direkte virkning på dette.

i

i i i Det følgende er en ytterligere detaljert beskrivelse av fremgangsmåten for fremstilling av proteasene F-I 2 , F-II i og F-III , hvori utbyttene av de respektive fraksjoner og j den fibrinolytiske aktivitet derav er gitt. j I

! i i Frysetørkede metemarker ble avfettet med aceton og 1 kgj av , det således avfettede og tørkede pulver ble dispergert i

10 liter 50 mM fosfatpufferløsning med en pH på 7,0. Etter 100 timers røring ved 37°C ble dispersjonen filtrert og; vaskevæsken av resten med tre liter av samme pufferløsning i ble slått sammen med filtratløsningen og ga et totalvolum i på 12,8 liter. Denne løsning hadde en fibrinolytisk aktivitet på 490 mm 2 /ml fortynnet 10 ganger. Væskevolumet av<;1>denne løsning ble redusert til 1,75 liter ved ultrafiltréring og ga en konsentrert løsning med en fibrinolytisk aktivitet på 55 mm 2 /ml fortynnet 60 ganger. Denne konsentrerte løs1<->ning ble utfelt fraksjonelt ved først å tilsette 1,75 liter etylalkohol til dette etterfulgt av filtrering og deretter i ved å tilsette 7,0 liter etylalkohol til filtratet erholdt! i overnevnte filtrering. Utfellingene erholdt i denne tp- i trinns utfellingen ble samlet pg oppløst i 1,1 liter av den samme f osf atpuf ferløsning og ga en løsning med en...i

<!>fibrinolytisk aktivitet på 694 mm 2 /ml fortynnet 60 gange'r.

Denne løsningen ble så behandlet med DEAE-sefarose (et produkt fra Pharmacia Co.) og fraksjonert i tre fibrinolytisk aktive fraksjoner F-I, F-II og F-III. Hver av fraksjonene F-I og F-II ble utsaltet med 60 % metning med j 'ammoniumsulfat og videre behandlet med Sephadex G-75 ogj deretter frysetørket til et pulverformig produkt. Ut- j

2 1 ' byttet av produktene, dvs. F-I fra F-I og F-II fra F-II, var henholdsvis 625 mg og 665 mg, og den fibrinolytiske aktiviteten derav var 12.300 mm 2/mg henholdsvis 10.700

mm 2/mg. Fraksjonen F-III ble befridd for salt og konsen-

i trert som sådan etterfulgt av frysetørkning til 1.200 mg av et pulverformig produkt kalt F-III 1 med en fibrinolytisk aktivitet på 11.500 mm<2>/mg.

Proteasen F-I<2>erholdt i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan fraksjoneres videre og renses ved behandling ved bruk av f.eks. DEAE-cellulofin eller Toyopearl eller en| kombinasjon av behandlingen ved bruk av dem til en-kom-: i

r ponents produkter av nye proteaser HM-45, HM-54 og HM-15 eller en proteaseblanding F-I 1 som er en blanding av

HM-5 4 og HM-15. På lignende måte kan behandling 1 eller kombinasjon av behandlinger med proteasen F-II ved bruk av f.eks. Toyopearl, Heksylsefarose eller DEAE-cellulofin gi et renset en-komponent av den nye protease HM-6 4. Videre: gir på lignende måte rensing av proteasen F-III"'' ved behandling eller kombinasjon av behandlinger med ETI (egge- i hvitetrypsininhibitor)-sefarose, DEAE-cellulofin eller : ! Toyopearl gi rensede en-komponentprodukter av nye pro- j teaser HM-2 7 og HM-89. Det betyr at proteasene F-III'<*>",'F-I og F-II ikke hver er et en-komponentprodukt men en halv-renset blanding av proteaser hvis innhold av proteaser! er minst 5 % eller, i de fleste tilfeller, minst 50 %. '■

En alternativ fremgangsmåte for fremstilling av disse proteaser er som følger. 300 g av et frysetørket pulver avj metemark ble dispergert og homogenisert i 3 liter av enj

ii f3y7°sC ioi lo2gi0 sk dagsear ltlføosr nå ing ekosg trhahomeore gende isvatiorkr sbomlme e i..nbkeusbteanrt ddevéledr...

etterfulgt av filtrering derav og frysetørking av filtråt-løsningen til et pulverformig produkt med de samme egen--skaper som beskrevet ovenfor.

Fig. 41 illustrerer pH-gradientkurven til denne ekstrak-f-sjonsløsningen, dvs. filtratet bestemt ved isoelektrisk fokusering vist ved kurven plottet med de hvite firkanter og resultatene av den spektrofotometriske bestemmelse véd en bølgelengde på 750 nm ved bruk av kobber-Folin reagens for fraksjonene i et volum på 2,5 ml som vist ved kurven plottet med svarte sirkler. Som man ser i disse kurvene er det tydelig at løsningen inneholdt flere proteaser med isoelektriske punkter ved 1,5, 3,4 og 5,6 pH. Fig. 41 inneholder også kurvene for den fibrinolytiske aktiviteten til ekstraksjonsløsningen, dvs. filtratet som sådan og dialyse

plottet med de hvite sirkler og henholdsvis de hvite trekanter. Som man skjønner av disse resultater inneholdt ekstraksjonsløsningen før dialyse et materiale med sterk fibrinolytisk aktivitet som kom til syne i fraksjonen méd et isoelektrisk punkt nær pH 3,4 og også fibrinolytisk aktive materialer om mindre aktive, med isoelektriske

I

punkter nær pH 1,5 og 4,0, mens materialet med et isoelektrisk punkt nær pH 5,6 ikke hadde fibrinolytisk akti1 vi-|i tet. Dialysen av ekstraks jonsløsningen fjernet det fibrino-! lytisk aktive materiale ved det isoelektriske punkt på ca. pH 1,5, hvilket levnet det fibrinolytisk aktive materiale ved det isoelektriske punkt på ca. 3,4. Følgelig er materi-, alet med et isoelektrisk punkt på ca. pH 3,4 fibrinolytisk j aktivt, mens materialet med et isoelektrisk punkt på ca; pH 5,6 ikke hadde noen fibrinolytisk aktivitet.

I det følgende gis resultatene av den farmakologiske prøve

og effektivitetsprøven som ble foretatt med de ovenfor r erholdte proteaser.

i

Prøve på akutt toksisitet: Prøvene på akutt toksisitet hos j

. ■ i de nye proteaser ble foretatt med de respektive proteaser i erholdt i de senere beskrevne eksempler. Fire uker-gamlé ' hannmus av ddy-linjen, hver med en kroppsvekt på 30 -_2.lg,. I I ble brukt som forsøksdyr i grupper som hver besto av fem. Hver mus ble gitt en løsning av proteasen oppløst i en fysiologisk saltløsning oralt, intraperitonealt eller intravenøst og observert over et tidsrom på 14 dager et:er administreringen etter opptreden av toksiske symptomer og eventuell død. Verdiene for LD^q ble beregnet ifølge Litchfield-Wilcoxons metode beskrevet i J. Pharmac. Exp. Ther., bind 96, side 99 (1949). Når administreringen av proteasen ble utført oralt, ble ingen mus drept i hver av gruppene selv med en maksimal teknisk mulig dose på 5.000 mg/kg og toksiske symptomer hosj den levende mus og abnormaliteter ved disseksjonsinspeksjon kunne overhodet ikke finnes. Når administrering ble utført intraperitonealt, fant man i noen steder at dyret døde i etter 90 minutter fra administreringen fulgt av asfyksiale konvulsjoner. Disseksjonsinspeksjon av den således drepte mus indikerte hematisk abdominal dropsi og flekkvis blød-ning på de peritoneale og enteriske vegger. På den annen side indikerte disseksjonsinspeksjon av de overlevende eksemplarer ingen abnormalitet. Intravenøs administrerini g av proteasen førte til død hos musene i noen tilfeller fulgt av asfyksial konvulsjon. Disseksjonsinspeksjon avj de således drepte mus tydet ikke på abnormalitet bortsejtt fra blødning i lungene. Disseksjonsinspeksjon av de overlevende tydet ikke på noen abnormalitet som i den intra- ' < peritoneale administrering. Tabell 5 nedenunder sammen-) fatter LDC«-verdiene for hver av proteasene som er målt oven-I 50cI for. i Bestemmelse av den trombolytiske aktivitet ved Chandlers sløyfemetode: prøveløsningen og kontrolløsningen ble fremstilt ved å oppløse proteasen og urokinasen (et produkt|fra Otsuka Seiyaku Co.) henholdsvis i en fysiologisk saltvanns-løsning. Blodet ble tatt fra venen til en enkel sunn voksen hann og blandet umiddelbart med et tiéndels volum av en 3,8 % vandig løsning av natriumsitrat. Referanseløsningen for blindprøve var den fysiologiske saltvannsløsning. Dannelse av trombi og målinger av oppløsningen derav ble utført på følgende måte. 0,8 ml av det ovenfor erholdte friske blod blandet med natriumsitrat og 0,1 ml av en 3 % vandig løsning av kalsiumklorid som CaCl-j^r^O ble inn-ført i et rør av polyvinylkloridharpiks med en innvendig diameter på 3 mm og en lengde på 250 mm og rørets ender ble forbundet med hverandre under dannelse av en sløyfe i som ble plassert koaksialt på et vendebord med en skrå-j vinkel på 60° og dreiet ved 37°C i 30 minutter med en has-tighet på 17 o.p.m. for å danne trombi deri. Deretter ble j 0,1 ml av en av proteaseløsningene, urokinaseløsningen i j eller referanseløsningen innført i sløyfen som ble dreiet J under de samme betingelser som ovenfor i 60 minutter. Dei t gjenværende trombi i røret ble tatt ut og etter fiksering med et Buins reagens, dvs. en løsning fremstilt ved å til- i sette 25 ml handelsformalinløsning og 5 ml iseddik til j i 75 ml av en mettet vandig løsning av picrinsyre, og vekten av de våte trombi ble målt. Den trombolytiske aktiviteten til proteasene og urokinasen ble uttrykt som forholdet av den derved målte våte vekt av trombi til den gjennomp snittlige våtvekt, dvs. 4 3,3 mg av trombi med ca. 3 mm j diameter og 10 mm lengde erholdt i blindprøven ved bruk; av fysiologisk saltvannsløsning som referanse. Resultatene! er J sammenfattet som % trombolyse i tabell 6. '! i ]

Fig. 42 er én kurve som viser % trombolyse som funksjon av konsentrasjonen av HM-2 7 og HM-89 i blod erholdt ved å plotte inn data fra tabell 6. Alle kurvene angir konsenj trasjonen av de respektive proteaser i blodet som kreves

I

for a gi 50 % trombolyse. Tabell 7 nedenunder gir de så<y>ledes målte konsentrasjoner for 50 % trombolyse for hver av de rensede og halv-rensede proteaser samt urokinase.

i Den ovenfor beskrevne Chandlers sløyfemetode for bestemmelser av den trombolytiske aktivitet er, selv om den er en inJ vitro-metode, vidt akseptert som en enkel prøvemetode som|er i stand til å gi resultater som gått simulerer in vivo- i prøving (se J. Exp. Physiol., XLIV (4), sidene 377-384;

(1959)) og resultatene erholdt i denne prøven representerer; godt den trombolytiske virkningen til proteasene ifølgej\oppfinnelsen. ! i In vivo-aktivitetsprøve på proteasene ifølge oppfinnelsen: j ved bruk av proteasene ifølge foreliggende oppfinnelse som j et terapeutisk medikament for menneskelige pasienter ved oral administrering, kan rått eller delvis rensede produk-

i ter i forskjellige mellomtrinn av rensingen i overnevnte beskrevne rensemetode brukes selv om det er åpenbart at|

sterkt rensede sluttprodukter utgjør den sterkest fore-j trukne form og utmerket trombolytisk effektivitet kan oppnås ved oral administrering. Således fikk tre mannlige pasienter på 60, 73 og 59 år som led av arteriosklerose hver oralt 600 mg frysetørket produkt av F-III<1>fremstilt i eksempel 1 senere og det perifere blodtrykket til hver pasient ble målt periodisk med mellomrom, for hvilke deA fibrinolytiske aktivitet i mm 2 ble undersøkt ved euglobu-linfraksjonering og ga resultatene som er vist i fig 43 | 1 hvilken de hvite ringer angir fullstendig'oppløsning ig sorte ringer angir ufullstendig oppløsning og kurvene I, II og III tilsvarer pasientene på henholdsvis 60, 73 og 59 år. Som man ser klart fra disse resultater begynte den fibrinolytiske aktiviteten i det perifere blodet å øke cia. 2 timer etter administrering av forsøksmedisinen og nådde en maksimumsverdi ved 4 til 6 timer etter administrering.

De nye proteaser ifølge foreliggende oppfinnelse er nye harmløse enzymer som først erholdtes ved foreliggende opp- |i finnelse fra metemarker og spesielt med følgende kliniske virkninger som skyldes de utmerkede fibrinolytiske og trombolytiske aktiviteter. j

i f Generelt utgjør fibrin omdannet fra fibrinogen av enzymer j en av de viktige faktorer når trombose og infarkt opptrer, Derfor forventes de nye proteaser ifølge foreliggende oppfinnelse å ha forebyggende og terapeutiske virkninger

i i ved de overnevnte aktiviteter mot tromboser i perifere i

i vener og arterier, lunge-embolier, koronaer okklusjon, | myokardialt infarkt, cerebralt infarkt, retinal trombose, ! hemorrhagia corporis vitrei, hyfema o.l. Videre kan en syn-ergistisk effekt mot malignante tumorer forventes ved ! • kombinert bruk av det med et antitumormiddel og virkninger ! kan forventes ved bruk av dem som antikoagulant ved blod- j

I

transfusjon for forebygning av embolusdannelse langs søm-linjene ved vaskulær operasjon og for langtidsoppretthold- j else av virkningen til den vaskulære shunt i blod-dialyse. |

Medikamentformen til det trombolytiske middel kan være jjralt eller ikke-oralt når det gis til pasienter i terapeutisk hensikt, selv om det fortrinnsvis bør v^ ære i en egnet foirm for oral administrlering. En estimert klinisk dose ligger fortrinnsvis i området fra 0,1/ug til 1.000 mg eller fortrinnsvis fra 10 ug til 300 mg pr. dag pr. pasient: Proteasene er selvfølgelig virksomme også innenfor veterinær-medisin som et trombolytisk middel for pattedyr med en foretrukken daglig dose på 0,1 ug til 100 mg pr. kilo kroppsvekt.

Medikamentformen av proteasene kan fremstilles ved forskjellige metoder, f.eks. ved en fremgangsmåte hvori enj vandig løsning av proteasene frysetørkes med eller utenj tilsetning av additiver til pulverform, eller ved den metode hvori et frysetørket pulver av proteasene blandes med additiver avhengig av behovet. Additivene som skal til-settes proteasene inneholder avhengig av administreringens spesielle hensikt, stabilisatorer såsom manitol, dekstrin, albumin, gelatin, hydroksyetylert stivelse, glycin, lysin, arginin, sucrose, polyvinylpyrrolidon, natriumhydrogen-i sulfit o.l., pH kontrollerende middel såsom natriumfosfat, natriumsitrat, hatriumhydroksyd o.l., isotoniske midler såsom natriumklorid, manitol, sorbitol, glucose o.l. og plasmin-inhibitoraktiverende midler eller absorpsjons-akseleratorer såsom sulfatestere av sukkere såsom dekstran og sucrose samt natriumsalter derav. Det foretrekkes at I den proteaseholdige trombolytiske blanding ifølge oppfinnelsen formuleres i en medikamentform ved tilsetning av j minst en type av de ovenfor nevnte additiver. Medikamentformene av det trombolytiske middel som er egnet for oral administrering innbefatter vanlige tabletter, kuler, pul-

i vere, granulater, sukkertrukne tabletter, filmtrukne tab- i letter, tracheer, kinntabletter og enteriske eller ikkej-enteriske kapsler samt den medikamentform hvori de virksomme bestanddeler inneholdes av mellomrommene til de kjente liposomer fremstilt fra fosforlipider.

i

Ethvert lipid kan brukes for fremstillingen av de ovenlfor nevnte liposomer i en medikamentform av det trombolytiske middel forutsatt at det ikke er giftig og fysiologisk akseptabelt og metaboliserbart. Typisk anvendelige lipider er fosforlipider som eksemplifisert ved fosfatidylcholin, dvs. lecitin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin, sfingomyelin og fosfatidinsyre samt kolesterol, chenodeoksy cholinsyre, ursodeoksycholinsyrejog lignende. De brukes enten alene eller som en kombinasjon av to arter eller fler etter behov. Videre er vegetabilske lecitiner som inneholder store mengder fosforlipider samt vegetabilske oljer som inneholder dem også egnet.

Når en ikke-oral medikamentform av det trombolytiske middel er ønsket, spesielt for ekstern applikasjon, er formen fortrinnsvis en salve, melk, flytende salve, suppositorium o.l. Basen for proteasesalven kan være olin eller emulgert eksemplifisert ved flytende parafin, isoper (e/t produkt fra ESSO, Co.), white soirit, silikonvæske, alij-

i fatiske høyere alkoholer med 16 - 20 karbonatomer pr. i

molekyl, høyere fettsyrer med 14 - 20 karbonatomer pr. I molekyl, vokser med 16 - 30 karbonatomer pr. molekyl, ; kastorolje, hydrogenert vegetabilske oljer, lanolin og derivater derav, squalen ogsqualan. Videre er egnede amulgeringsmidler og dispergeringsmidler for fremstilling av salve ikke-ioniske overflateaktive midler av typen j | estere av polyhydriske alkoholer såsom monoglycerider og

I

sorbitanestere av fettsyrer med 14 - 20 karbonatomer pr. molekyl, estere av sucrose og polyglycerin med fettsyre! r ji med 14 - 20 karbonatomer pr. molekyl, og polyoksyetylen- ! baserte ikke-ioniske overf lateaktive midler såsom etere; j av polyoksyetylen med en alifatisk alkohol med 12 — 18 | • karbonatomer pr. molekyl, estere av polyoksyetylen med en fettsyre med 12 20 karbonatomer pr. molekyl og derivater! av polyoksyetylen med polyhydrisk alkohol, f.eks. sorbiltan-i i estere av fettsyrer med 14 - 20 karbonatomer pr. molekyl o.l. Fuktemidlet i salven kan være glycerin, propylenglycol, sorbitol eller en aminosyre. Det er selvfølgelig

valgfritt om det trombolytiske middel i form av en salvie _..

skal formuleres med andre kjente additiver såsom stabilisatorer og/eller anti-oksydanter uten toksisitet.

--r I

i Egnede former av melken som medikamentform av det trombolytiske middel inneholder risteblandinger, emulsjoner og løsninger. Risteblandingstypemelk kan fremstilles ved å; bruke et suspensjonsmiddel såsom natriumalgenat, traga-1 ' 1 i kant, metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose, poly-etylenglykol, propylenglycolmonostearat, o.l. enten alene

l eller som en kombinasjon av to typer eller flere. Emul-j sjonstypemelkene fremstilles ved å bruke et emulgerings-j-middel som fortrinnsvis er et ikke-ionisk overflate-

aktivt middel såsom polyoksy-40 stearat, sorbitanmono-stearat, natriumlaurylsulfat og sådanne som selges under handelsnavnene Span 20 og Tween 20. Melk-type-medikament-

i formen av det trombolytiske middel kan selvfølgelig formu-i leres med et kjent og trygt antiseptisk middel såsom benzylbenzoat, mety1-4-hydroksybenzoat, propyl-4-hydroksybenzoat o.l. j

De flytende salver som medikamentform av det trombolytiske middel fremstilles med en base såsom olivenolje, sesam-! olje, mandelolje, bommulsfrøolje o.l. vegetabilske oljer.

Suppositorieformen av de trombolytiske midler fremstilles

ved bruk av kakaosmør, Witepsol, Sabanal, polypropylen-glycol, glycerogelatin eller gelatinkapsler.

I det følgende gis flere eksempler på formuleringen av medikamentformene som inneholder det trombolytiske middel og beskrivelse av fremstillingen av de virksomme bestanddeler ved ekstraksjon fra metemarkvev.

Preparat 1. ( Tabletter)

i Pul verbestandde lene som er vist J. formule riti gen nedenunder ble blandet jevnt og blandingen ble tablettert til tablettejr

i som hver veide 150 mg ved bruk av en tabletteringsmaskin.

Preparat 2. ( Tabletter)

Pulverbestanddelene som er vist ved formuleringen nedenunder ble blandet jevnt og blandingen ble tablettert til tabletter som hver veide 100 mg ved bruk av en tabletteringsmaskin.

i

Preparat 3. ( Kuler)

Pulverbestanddelene som er vist i formuleringen nedenunder ble blandet jevnt og blandingen ble formet til kuler ved

• bruk av en ekstrudermaskin.

.1

i

I

Preparat 4. ( Kuler)

Pulverbestanddelene som er vist i formuleringen nedenunder ble blandet jevnt og blandingen ble formet til kuler ved bruk av en ekstrudermaskin.

Preparat 5. ( Kuler)<:>Protease F-I<1>, krystallinsk cellulose, lactose og maisstivelse ble blandet jevnt ifølge den nedenfor viste formulering og blandingen ble formet i kuler ved bruk av en fluidisert bed-granulator under påsprøyting av en 5 % vandig løsning av hydroksypropylcellulose som vist i formu- i leringen som et bindemiddel etterfulgt av tørking.

Preparat 6. ( Kuler)

Protease F-I-2-HM-15, krystallinsk cellulose, mannitol, potetstivelse og polyvinylpyrrolidon ble jevnt blandet ifølge' formuleringen som er vist nedenfor og blandingen ble formet til kuler ved bruk av en fluidisert bed-grahulator

i under påsprøyting av en 5 % vandig løsning av hydroksy-j propylcellulose vist i formuleringen som bindemiddel etterfulgt av tørking.

I

Preparat 7. ( Kapsler) Protease F-III-l-HM-27, krystallinsk cellulose, lactose ; i mannitol, maisstivelse og polyvinylpyrrolidon ble blandet jevnt ifølge formuleringen vist nedenunder og blandingen ble formet til kuler -tøed bruk av en fluidisert bed-granulator under påsprøyting av en 5 % vandig blanding av hydroksypropylcellulose vist i formuleringen som et bindemiddel etterfulgt av tørking. Harde kapsler ble fremstilt ved å innkapsle hver 160 mg av kulene i en Nr. 3 hard kapsel.

Preparat 8. ( Kapsler)

Harde kapsler ble fremstilt ved å innkapsle hver 160 mg av kulene oppnådd i Preparat 6 i en Nr. 3 hard kapsel.

Preparat 9.( Kapsler) i

I

i Harde kapsler ble fremstilt ved innkapsling av hver 200 i mg av kulene oppnådd i Preparat 3 i en Nr. 2 hard kapsel,

I

Preparat 10.( Kapsler)

i Pulverbestanddelene vist ved formuleringen nedenunder ble blandet jevnt og enteriske kapsler ble fremstilt ved inn-

t kapsling av hver 200 mg av pulverblandingen i en Nr. 2<1>gelatinkapsel etterfulgt av enterisk overtrekning. j

i Preparat 11. ( Kapsler) !

i En vandig løsning i et volum på 300 ml ble fremstilt ved å | oppløse 1 g av protease F-I 2 og 199 g natriumdekstransulfat inneholdende 17,0 - 2 0,0 % svovel og med en innvendig viskositet på 0,022 - 0,028 destillert vann og løsningen ble, etter justering av pH til 7,0 ved tilsetning av di- ' natriumhydrogenfosfat, fullstendig frysetørket. Dette fryse-tørkede materiale ble pulverisert og blandet med 98 g mannitol og 2 g magnesiumstearat og hver 300 mg porsjon av.

i pulverblandingen ble innkapslet i en Nr. 1 gelatinkapsel og

i i ga et kapslet medikament. i j

\ r i Preparat 12. ( Kapsler)

En vandig løsning ble fremstilt ved å oppløse 2 g protease F-I-2-HM-15 og 198 g dekstransulfatester inneholdende 3',0..- 6,0 % svovel og med en innvendig viskositet på 0,030 - !• 0,045 i 300 ml destillert vann etterfulgt av justering av pH til 7,0 ved å tilsette et lite volum av en 5 % vandig løsning natriumhydroksyd og løsningen ble fullstendig frysetørket. Det frysetørkede materiale ble pulverisert)og blandet med 49 g mannitol, 49 g albumin og 2 g maghesium-stearat og enteriske kapsler ble fremstilt ved å innkapsle

200 mg av pulverblandingen i en Nr. 2 gelatin kapsel etterfulgt av enterisk overtrekning.

Preparat 13. ( Kuler) j j

Et frysetørket materiale ble fremstilt hovedsakelig på

samme måte som i Preparat 12 bortsett fra bruk av protease F-I1 i stedet for protease F-I-2-HM-15 og en 1 a porsjon

i

av dette frysetørkede materiale ble tilsatt og blandet

jevnt med 65 g krystallinsk cellulose, 15 g mannitol, 15 g maisstivelse og 3 g hydroksypropylmetylcellulose og 1 g, av en kopolymer av vinylpyrrolidon og vinylacetat (et produkt fra General Aniline & Film Corp.) og blandingen ble formet;

i

ved bruk av en ekstrudermaskin til kuler. j

Enteriske kuler ble fremstilt ved å forsyne de ovenfor i fremstilte kuler med en overtreksblanding omfattende 74%

hydroksypropylmetylcelluloseftalat, 11,6 % glyceryltri-: acetat, 11,6 % stearinsyre og 2,8 % vannfri lett kiselsyre som faste bestanddeler.

Preparat 14. ( Tabletter)

■ i

Tabletter ble fremstilt ved å bruke en tabletteringsmaskin på en pulverblanding med nedenfor viste formulering.

Disse tabletter ble videre forsynt med enterisk overtreki<k>med en overtrekksblanding med formuleringen vist neden-j j under pr. tablett. ! I 1! i l

Preparat 15. ( Kuler)

En pulverblanding av den følgende formulering ble formet til kjerner ved sentrifugering eller rulling.

Den således kjerneformede blanding ble fortynnet med en eksepient med formuleringen nedenunder og formet til kuler ved bruk av et konvensjonelt bindemiddel etterfulgt av overtrekning. Disse kuler ble videre overtrukket med 30 mg av den enteriske overtrekksblanding brukt i Preparat 14 hvilket ga | enteriske kuler og medikamentkapsler ble fremstilt hver!ved å innkapsle 160 mg av de enteriske kuler i en Nr. 3 gelatinkapsel. i I

I

.i

Preparat 16. ( Pulver)

En pulverformig medikamentform ble fremstilt ved å jevnt blande bestanddelene med den følgende formulering. j

I I

: ' i Preparat 17. ( Sukkerovertrukne tabletter)

I

En pulverformig blanding fremstilt ved å blande bestanddelene med den samme formulering som i Preparat 14, bort-

„ 'i sett fra a erstatte proteasen F-II-HM-64 med samme mengde j protease F-I-l-HM-54 ble formet til basetabletter ved bruk i av en tabletteringsmaskin. Disse basetabletter ble først!forsynt med et filmovertrekk på vanlig måte etterfulgt av

et sukkerovertrekk også på vanlig måte til sukkerovertrukne

tabletter.

Preparat 18. ( Tracheer)

En jevn blanding sammensatt av 116,0 g lactose, 116,0 g sucrose 18,0 g tragakantpulver, 1,0 ml peppermintolje og en liten mengde av et antiseptisk middel ble godt knadd ved tilsetning av en vandig løsning av 0,3 g protease F-III-1-HM-27 i 40 ml destillert vann. Denne knadde blanding ble spredd ved bruk av en rullepinne på en glassplate påstrødd potetstivelse i en arklignende form med ca. 5 mm tykkelse, som var punchet ut av en stanser i stykker med trachéform etterfulgt av tørking etter 10-24 timers opphold i et,!

I I

kjøleskap, hvilket ga tracheer som hver veide 1 g og inneholdt proteasen.

Preparat 19. ( Tracheer)

Sukkergranulat ble fremstilt med 970 g pulverformig sucrose fuktet med ca. 110 g etylalkohol etterfulgt av tørking ved 35°C eller lavere. Dette sukkergranulat ble blandet medjen jevn pulverformig blanding av 1 g protease F-III-2-HM-89 i og 20 g tørr lactose og videre med 10 g magnesiumstearat og den godt knadde blanding ble formet til tracheer som hver veide 1 g ved bruk av en stanser med 15 mm diameter.

Preparat 20. ( Tracheer) ji

En blanding av 500 g sorbitol og 500 g polyetylenglycolI 6.000 inneholdende 2 g natriumsaccarin og en liten mengde av et smakstoff ble blandet med en pulverformig blanding av 3 g protease F-III"'" og 20 g dekstrin etterfulgt av videre tilsetning av 10 g magnesiumstearat. Denne blandingen ble godt knadd og formet til tracheer som hver veide 1 g og' inneholdt proteasen. :<!>Preparat 21. ( Kinntabletter)

<1>i Kinntabletter inneholdende protease F-I som hver veide 1 g, ble fremstilt ved hovedsakelig samme fremgangsmåte og samme, formulering som i Preparat 20 bortsett fra reduksjon av natriumsaccarinmengden til 0,2 g og erstatning av protease F-III med samme mengde protease F-I . i j<1>!

Preparat 22 ( Salve)

En blanding bestående av 5 g renset lanolin, 5 g hvit bivoks og 89,6 g white spirit ble gjort flytende ved smelting og blandet med en liten mengde antiseptisk middel og en anti- I

i oksydant etterfulgt av avkjøling. Deretter ble 0,4 g protease F-I-l-HM-54 tilsatt etterfulgt av homogenisering til en salve inneholdende proteasen.

I Preparat 23.( Salve)

! En salve inneholdende protease F-O-HM-45 ble fremstilt ved , hovedsakelig samme fremgangsmåte som i Preparat 22 med føl-

1 gende formulering.

i i »

Preparat 24 .( Salve ) 1 I En salve inneholdende protease F-I ble fremstilt ved hovedsakelig samme fremgangsmåte som i Preparat 22 med følgende formulering. j i

Preparater 25A til 25F.

Medikamentformene som er vist i de følgende formuleringer 25A til 25F bør gjøres fullstendig før bruk ved å tilsette små mengder av et antiseptisk middel, en antioksydant og et smakstoff.

Formulering 25A ( Salve)

Formulering 25B ( Salve)

Formulering 25C ( Salve) . Formulering 25D ( Melk)

Tilsett renset vann for å få et totalvolum på 100 ml.

Formulering 25E ( Melk)

Tilsett renset vann for å få et totalvolum på 100 ml.

Formulering 25F ( Flytende salve)

i 1 i Tilsett en 0,67 % vandig løsning av Tween 80 for å få et totalvolum på 100 ml.

i

I

i Preparat 26. ( Suppositorium)

En blanding av 27,0 g Witepsol E-85 og 72,7 g Witepsol W-35, ble smeltet til en homogen blanding og deretter videre i!

! " I

blandet med et lite volum av en løsning inneholdende 0,05_c

i , metyl p-hydroksybenzoat og 0,05 g butyl p-hydroksybenzoa,t som antiseptiske midler i propylenglycol etterfulgt av tilblanding av 0,2 g pulverformig protease F-III-2-HM-89 vid ca. 50°C. Blandingen i smeltet tilstand ble grundig blandet

' i

og støpt i en aluminiumsform etterfulgt av kjøling, hvilket

ga en størknet suppositoriumsform.

j Preparat 27. ( Suppositorium)

En blanding bestående av 57,6 g gelatin, 2 0,6 g glycerin, 0,1 g metyl p-hydroksybenzoat, 0,02 g propy 1 p-hydroksy-j-benzoat, 0,14 g etylvanilin, 3,0 g 40:60 vektdeler blanding av titandioksyd og glycerin, 0,6 g gul Nr. 5 lake og 10 g renset vann ble smeltet sammen etterfulgt av tilsetning av en vandig løsning fremstilt ved å oppløse 0,3 g protease

1 I

i F-I i 7,6 4 g renset vann og en suppositorieform av denijie blandingen ble fremstilt på samme måte som i Preparat 26.

Preparat 28. ( Oralt liposom medikament)

Eggeplommelecitin, kolesterol og diacetylfosfat ble blandet sammen i et vektforhold på 7:2:1 og 100 mg av denne blanding i en flaske ble oppløst i 8 ml kloroform etterfulgt av for-! dampning av løsningsmiddelet, hvilket levnet en tynn film ! av blandingen på flaskeveggene. Denne filmen ble blandet med 13 ml av en fosfatpufferløsning med en pH på 7,2 inneholdende 100 mg protease F-III-2-HM-89 og, etter grundig risting ble blandingen ultralydbehandlet. Ca. 1 time etter slutten på ultralydbehandlingen ble den sentrifugert i 1 time ved 50.000 G etterfulgt av to gangers vask med samme pufferj-løsning, men uten protease. De derved erholdte utfellinger ble oppslemmet i 2 ml fysiologisk saltvannsløsning hvoretter mikroorganismene ble fjernet fra suspensjonen og ga et pralt liposom medikament som kunne lagres ved 0-5°C og brukesJ ved passende fortynning før bruk til medisinsk behandling.

Preparat 29. ( Oralt liposom medikament)

En løsning av 85 mg eggeplommelecitin og 15 mg kolesterbl 8 ml kloroform ble spredd på veggene til en flaske og fordampning av løsningsmiddelet lot tilbake en tynn film av blandingen på veggene. Denne filmen ble blandet med 15 ml av en fosfatpufferløsning ved en pH på 7,2 inneholdende 100 mg protease F-0-HM-45 og 50 mg albumin og blandingen ble ultralydbehandlet. Etter 30 minutters henstand "ble blandingen sentrifugert i 30 minutter ved 100.000 G og deretter vasket 2 ganger med samme pufferløsning uten protease 1 og albumin. De således erholdte utfellinger ble oppslemmet 1 2 ml fysiologisk saltvannsløsning hvoretter mikroorganismene ble fjernet og ga et oralt liposom medikament som kunne lagres ved 0-5°C og brukes ved egnet fortynning før bruk til medisinsk behandling.

Preparat 30. ( Oralt liposom medikament)

En løsning av 100 mg soyabønnelecitin bestående av 25,4] % campésterol, 26,4 % stigmasterol og 48,2 % 3-sitosterol i 5 ml kloroform ble spredd på veggene av en flaske og løs-ningsmiddelet fordampet fra blandingen, hvilket lot tilr bake en tynn film av lecitinet på veggene. Flasken ble tilsatt 15 ml fosfatpufferløsning med en pH på 7,2 inneholdende 120 mg protease F-I<1>og 50 mg mannitol og blandingen ble grundig ristet og ultralydbehandlet. Etter 1 times hen-j stand ble den således erholdte suspensjon sentrifugert i 2 timer ved 35.000 G etterfulgt av to gangers vask med i samme pufferløsning men uten protease og mannitol. Utféll-ingene ble oppsamlet og oppslemmet i 1 ml fysiologisk salt-vannsløsning, og deretter ble mikroorganismene fjernetg ga et oralt liposom medikament inneholdende protease som kunne lagres ved 0-5 o C og brukes ved hensiktsmessig for}1<->tynning før bruk til medisinsk behandling.

j Preparat 31. ( Oralt liposom medikament) i

En løsning av 5 mg fos fatidinsyre, 45 mg soyabønnelecitin

og 50 mg eggeplommeleditin i 5 ml kloroform ble spredd på

i veggene i en kolbe og fordampning av løsningsmiddelet ga en tynn film av blandingen på veggene. Kolben ble tilsatt! 5. ml

, pforostfeaatpse ufFfe-rI-lø2-snHMin-g 15m, ed 50 emn g pH dekpså tr7i,n 2 oing ne1h0 omldg enldye sin 100 og meg t

: oralt liposom medikament inneholdende proteasen fremstiLt på samme måte som i Preparat 28. Dette medikament kunne lagres ved 0-5°C og brukes ved passende fortynning før bruk ; til medisinsk behandling.

i

Preparat 32. ( Oralt liposom medikament)

i i

En løsning av 100 mg eggeplommelecitin i 5 ml kloroform ble spredd på veggene i en kolbe og fordampning av løsnings-middelet ga en tynn film av lecitin på veggene. Kolben ble tilsatt 5 ml fosfatpufferløsning med en pH på 7,2 irine-holdende 100 mg protease F-III , 40 mg mannitol og 20 mg

arginin og et oralt liposom medikament inneholdende proteasen ble fremstilt på samme måte som i Preparat 28. Detjte medikament kunne lagres ved 0-5°C og brukes ved egnet fortynning før bruk til medisinsk behandling.

Preparat 33. ( Oralt liposom medikament)

En løsning av en blanding bestående av 35 mg fosfatidylri etanolamin, 20 mg fosfatidylinositol, 35 mg fosfatidyl-j serin og 10 mg kolesterol i 10 mg kloroform ble spredd på veggene i en kolbe og fordampning av. løsningen ga en tynn film av blandingen på veggene. Kolben ble tilsatt 5 ml fos-j fatpufferløsning med en pH på 7,2 inneholdende 100 mg pro-j 1 i tease F-III-l-HM-27 og 200 mg hydroksyetylert stivelse og j 20 mg polyvinylpyrrolidon som stabilisatorer og et oralt j liposom medikament inneholdende proteasen ble fremstilt! på |

i i samme måte som i Preparat 28. Dette medikament kunne lagres ved 0-5°C og brukes ved egnet fortynning før bruk til médi-;

sinsk behandling. i j Preparat 34. ( Oralt liposom medikament)

En løsning av 100 mg eggeplommelecitin inneholdende 5 %

i fosfatidyletanolamin og 10 % sfingomyelin og 10 mg chen.p-deoksycholsyre i 10 ml kloroform ble spredd på veggene i| en

kolbe og fordampning av løsningen ga en tynn film av bl^nd-I ingen på veggene i kolben. Kolben ble tilsatt 5 ml fosfåt-

I pufferløsning ved en pH på 7,2 inneholdende 40 mg protease

I F-II-HM-64 , 20 mg blodplasma fr.a mennesker og 10 mg sucrose og et oralt liposom medikament inneholdende proteasen ble fremstilt på samme måte som i Preparat 28. Dette medikament kunne lagres ved 0-5 o C og brukes til medisinsk behandlinI<g>etter passende fortynning.

Preparat 35. ( Oralt liposom medikament)

En løsning av 60 mg soyabønnelecitin, 30 mg ursodeoksychol-syre og 10 mg eggeplommelecitin i 5 ml kloroform ble spredd på veggene i en kolbe og løsningsmiddelet fordampet og etterlot en tynn film av blandingen på veggene. Kolben ble tilsatt 5 ml fosfatpufferløsning med pH 7,2 inneholdende

2

10 mg protease F-I , 30 mg polyvinylpyrrolidon og 15 mgl

gelatin og blandingen ble grundig ristet. Et oralt liposom medikament inneholdende proteasen ble fremstilt med denne blanding på samme måte som i Preparat 28. Dette medikament kunne lagres ved 0-5 o C og brukes som medikament for medi<i->sinsk behandling.

Preparat 36. ( Fint granulat)

<!>Bestanddelene som er vist i den følgende formulering ble jevnt blandet og den pulverformige blanding ble formet ved<:>

bruk av en granulator til en medikamentform av fint granulat med en partikkelstørrelse som gikk gjennom en sikt på 30 j mesh men passerte ikke gjennom en sikt på 100 mesh ved j Tyler standard serier. j i Preparat 37. ( Fint granulat) Bestanddelene som er vist i den følgende formulering ble jevnt blandet og den pulverformige blanding ble formet j/ed bruk av en granulator til en medikamentform av fint granulat med en partikkelstørrelse som gikk gjennom en sikfpå 30 mesh med ikke gjennom en sikt på 100 mesh ved Tyler standard ' serier.

Eksempel 1.

! I

Levende metemark av arten Lumbricus rubellus som veide 84 q ble satt til en fysiologisk saltvannsløsning hvilket gaj jet totalvolum på 300 ml og malt tio l en homogen suspensjon s'om ble inkubert i 100 timer ved 37 C etterfulgt av sentrifjugal-separasjon til en ekstraktløsning og en uløselig rest. j Resten ble vasket med 150 ml fysiologisk saltvannsløsning og vaskevannet ble kombinert med ekstraksjonsløsningen til et totalvolum på 400 ml kombinert løsning med en fibrinb-lytisk aktivitet på 375 mm 2/ml etter 10 gangers fortynning. Det tørkede materiale som erholdtes fra denne kombinerte løsning ve2 d frysetørkning hadde en fibrinolytisk aktivit>etpå 142 mm /mg. i

! i

Eksempel 2.

i

I

Levende metemark som veide 84 g ble satt til 500 ml destillert vann inneholdende 0,3 g fenol og malt til en homogen I

suspensjon 'som ble inkubert i 76 timer ved 30°C hvorettér

I man filtrerte for å fjerne den uløselige rest fra den van- , dige ekstraktløsning. Resten ble vasket med 200 ml destillert vann og vaskevannet slått sammen med ekstraktløsningen til et totalvolum på 650 ml kombinert løsning med en fibrinolytisk aktivitet på 220 mm 2/ml etter 10 gangers fortynnLng.

Eksempel 3.

Levende metemark som veide 84 g ble satt til en vandig blanding av 400 ml destillert vann og 30 ml etylalkohol og malt til en homogen suspensjon som ble inkubert i 240 timer; ved 25°C hvoretter man sentrifugerte og fikk en klar ekstrakt-løsning med en fibrinolytisk aktivitet på 350 mm 2 /ml e■ tt!er 10 gangers fortynning.

Eksempel 4.

En vandig suspensjon ble fremstilt ved å blande 50 mg av et pulver av vakuumtørkede metemark med 400 ml av en fysioilo-gisk saltvannsløsning og 100 ml av en saltløsning med en pH på 6,5 fremstilt med en 1,8 % vandig løsning fosforsyre og en 1,8 % ammoniakkvann og suspensjonen ble inkubert ji 100 timer ved 38°C etterfulgt av filtrering hvilket ga ^n klar ek2 straktløsning med en fibrinolytisk aktivitet på ! j i! 725 mm /ml etter 10 gangers fortynning svarende til en 'aktivitet på 72,5 mm /mg tørt metemarkpulver. |

Eksempel 5.

\ i En vandig suspensjon ble fremstilt ved å dispergere 50 !g av et pulver av frysetørkede metemarker i en blanding av I 250 ml av en fortynnet saltløsning med en pH på 6,3 frem-

i i stilt med en 2 % vandig eddiksyreløsning og en 2 % vandig natriumhydroksydløsning, 200 ml av en fysiologisk saltvanns-løsning og 50 ml destillert vann ved tilblanding av 0,5 g natriumazid, og suspensjonen ble inkubert i 72 timer ved 37 o C, hvoretter man filtrerte og fikk en klar ekstraktl'øs<->

ning med en fibrinolytisk aktivitet på 460 mm 2/ml etter 10

gangers fortynning. I

I

EEn ksevmanpdeil g 6s. uspensjon ble fremstilt ved å dispergere 50 g av' et avfettet pulver av frysetørkede metemarker i en blanding' av 200 ml av en acetatpuf f erløsning med en pH på 7,0 , 200 iri av en boratpufferløsning med samme pH-verdi som ovenfor, 100 ml destillert vann, 10 ml propylalkohol og 10 ml diL o' ksan og suspensjonen ble inkubert i 240 timer ved 32 oC, hvoretter man filtrerte og fikk en k2lar ekstraktløsning med en fibrinolytisk aktivitet på 772 mm /ml etter 10 gangers fortynning.

Eksempel 7.

En vandig suspensjon ble fremstilt ved å dispergere 50 jg avfettet pulver fra frysetørkede metemarkkropper med invollene fjernet i en vandig blanding av 250 ml av en fortynnet salt-løsning med pH 6,8 fremstilt ved vandig syreblanding inneholdende 1,8 % fosforsyre og 3,5 % saltsyre og 2N vandig løsning av kaliumhydroksyd, 225 ml fysiologisk saltvanns-løsning og 25 ml aceton, og suspensjonen ble inkubert i' 96 timer ved 25°C etterfulgt av filtrering med vakuum, hvilket ga en klar ekstraktløsning med en fibrinolytisk aktivitet 2 I

på 6 00 mm /ml etter 10 gangers fortynning. j'i

i Eksempel 8.<1>

En vandig suspensjon ble fremstilt ved å dispergere 10 g av et avfettet pulver av metemarker dehydratisert ved høy.-temperaturflashtørking i en vandig blanding av 50 ml av i en f osf atpuf f erløsning med en pH på 6,4 og 50 ml av en sitrat-j pufferløsning med en pH på 6,5 og suspensjonen ble inkubert i 7 timer ved 37°C etterfulgt av filtrering, hvilket ga' en klar ekstraktløsning. Resten ble vasket med en fysiologisk saltvannsløsning og vaskevannet ble slått sammen med overnevnte ekstraktløsning til et totalvolum på 120 ml kombinert løsning. Denne kombinerte ekstraktløsning ble blandet med

D0e,n 1 rg ensuatltreiruemnadze id løog snvinidg ehre addine keubn erft ibri in1o0 lyttimiesk r vaked tiv3 i7t°eCt.

på 2 80 mm 2 /ml etter 10 gangers fortynning.

Eksempel 9.

En vandig suspensjon ble fremstilt ved å dispergere 10 av

et avfettet pulver av frysetørkede metemarker i en" vandig

: blanding av 50 ml fos fatpufferløsning med en pH på 7,4 og 50 ml fysiologisk saltvannsløsning, og suspensjonen ble

rørt 4 timer ved 22°C for å bevirke ekstraksjon av de vainn-løselige bestanddeler til den vandige løsning etterfulgt av sentrifugering, hvilket ga en klar ekstraktløsning. Den fibrinolytiske aktiviteten til denne ekstraktløsningen var, etter blanding med 0,07 g natriumazid og inkubering i 5 timer ved 37°C, 190 mm^/ml etter 10 gangers fortynning.

Eksempel 10.

Levende metemark som veide 10 g ble satt til en vandig blanding av 70 ml av en acetatpufferløsning med en pH på 7,0 og 30 ml destillert vann og malt til en homogen vandig suspensjon som ble rørt i 2 timer ved 20°C for å bevirke i ekstraksjon av de vannløselige bestanddeler til den vandige løsning, etterfulgt av sentrifugering for å få en klar ekstraktløsning. Resten ble vasket med vann og vaskevæsken ble slått sammen med ekstraktløsningen og ga et totalvolum på 180 ml kombinert løsning med en fibrinolytisk aktivitet, etter tilblanding av 0,1 g natriumazid og inkubering i j7 ! timer ved 37 C, 40 mm 2 /ml etter 10 gangers fortynning.

Eksempel 11.

; i En vandig suspensjon fremstilt ved å dispergere 1 kg fryse-tørket pulver av metemark i 10 liter av en vandig løsning inneholdende 0,1 vekt-% natriumbenzoat og 0,9 vekt-% natriumklorid ble rørt 96 timer ved 32°C for å ekstrahere de

i

vannløselige bestanddeler etterfulgt av filtrering. Resj teni

fra den overnevnte filtrering ble vasket med 3 liter aVj den samme vandige løsning av natriumbenzoat og natriumklori!d som ovenfor og vaskevæskene kombinert med f iltr.atet ,_.hvilkét

ga 12,5 liter av en klar ekstraktløsning med en fibrinolyt-<:>isk aktivitet på 490 mm 2 /ml etter 10 -angers fortynning!'.

Den derved erholdte ekstraktløsning ble konsentrert til et totalvolum på 0,5 liter ved ultrafiltréring og den konsentrerte løsning ble utfelt fraksjonert ved først å tilsette 0,5 liter etylalkohol for å oppnå utfellinger og deretter 'ved å tilsette et ytterligere volum etylalkohol til filtratet fra den første utfelling, hvilket ga en etylalkohol-sluttkonsentrasjon på 80 % slik at en ytterligere mengde

i utfellinger erholdtes. De erholdte utfellinger i overnevnte to-trinnsutfelling ble slått sammen og vasket med etylalkohol etterfulgt av vakuumtørking, hvilket ga 40,5 g tørt pulver med en fibtinolytisk aktivitet på 1.285 mm 2/mg.

, Det overnevnte erholdte pulver ble oppløst i 1 liter lOmM

fosfatpufferløsning med en pH på 8,0 og løsningen ble ført

gomjesnentnom ineg n akv ohloenknse ylafymiln t mmeed d haegkasryosle -seakftariovese rt fmreemd setpilikt lvoerfd-hydrin (sefarose, et produkt fra Pharmacia Fine Chemicals Co.) slik at de aktive bestanddeler ble adsorbert på denne. Etter vasking med samme pufferløsning som ovenfor, foretok

man eluering av kolonnen med den samme pufferløsning som ovenfor men inneholdende natriumklorid i en konsentrasjon på 0,25M som eluent, hvilket ga 1 liter av en eluatløsning.

i i Eluatløsningen ble, etter dialyse, tørket ved frysetørking!

i og ga 5,75 g av et dehydratisert materiale med en fibrino- i lytisk aktivitet på 7.241 mm 2 /mg.<!>j

! I

i I i i Eksempel 12. ii ! j!

Fremgangsmåten ned til. den fraksjonerte utfelling med etylalkohol etterfulgt av vakuumtørking var hovedsakelig den samme som i Eksempel 11 ovenfor og 47 g av det 2 tørkede pul-j■ ver med en fibrinolytisk aktivitet på 1.100 mm /mg ble ppp-j

løst i 1 liter av en 20mM fosfatpufferløsning med en phJ på i<!>7,0. Denne løsning ble ført gjennom en kolonne fylt med' et<1>ETI (albumen trypsin inhibitor)-sefarose fremstilt..ved...å__.

kombinere en albumen trypsin inhibitor ( et produkt fra Sigma Co.) til agarose aktivert med epiklorhydrin for å

absorbere aktive bestanddeler på denne. Etter først vasking med samme pufferløsning som ovenfor og deretter med en 3, IM

acetatpufferløsning med en pH på 5,0, ble eluering av kolonnen foretatt med den samme acetatpufferløsning som ovenfor, men inneholdende natriumklorid og alginin i konsentrasjoner på IM og 0,5M henholdsvis, som elueringsmiddel, hvilket gir 0,8 liter av en eluatløsning.

Eluatløsningen ble, etter dialyse, dehydiratisert ved fryse-j tørkning og ga 255 mg av et dehydrati2sert materiale med en fibrinolytisk aktivitet på 70.960 mm /mg.

Eksempel 13.

En vandig dispersjon av 1 kg av et pulver frysetørket metemark i 10 liter vandig saltløsning inneholdende 0,1 % natriumbenzoat og 0,9 % natriumklorid ble rørt 72 timerj vec 30°C for å bevirke ekstraksjon av de vannløselige bestanddeler til den vandige løsning etterfulgt av filtrering for å oppnå en klar ekstraktløsning. Resten ble vasket med B liter av den samme saltløsning som ovenfor og vaskevæsken ble slått sammen med ekstraktløsningen til et totalvolum på 13 liter klar kombinert løsning med en fibrinolytisk aktivi-2 ■ I tet på 450 mm /ml etter 10 gangers fortynning. I

Den ovenfor erholdte vandige løsning ble konsentrert ved

<!>i ultrafiltréring til et væskevolum på 0,71 liter og deretter blandet med samme volum etylalkohol for å utfelle det faste materiale som ble samlet ved filtrering. Filtratet ble videre blandet med etylalkohol og ga en sluttkonsentrasjon av j etylalkohol på 80 % for å oppnå videre utfelling som ble oppsamlet og vasket med etylalkhol etterfulgt av vakuumj-tørking til et tørt pulver. Totalutbyttet av de tørre pulverprodukter i overnevnte to-trinnsutfelling var 4 2 q

og den fibrinolytiske aktiviteten var 1.322 mm /mg.

i

Det overnevnte erholdte pulverprodukt ble oppløst i 1.000 ml

destillert vann og fraksjonert ved kolonnekromatografi ved

i bruk av en adsorbent av DEAE-cellulofin (et produkt fra Chisso Co.) hvilket ga tre fraksjoner F-I, F-II og F-II".

Fig. 44 gir resultatene av den fibrinolytiske aktivitet i mm 2 .og den optiske densitet ved 280 nm av eluatfraksjonéne hver i et 20 ml volum erholdt i den overnevnte kolonnekromatograf i ved kurvene I henholdsvis II. Den brutte l:.nje i fig. 44 angir konsentrasjonen av natriumklorid i eluat-fraksjonene gitt ved den elektriske ledningsevne i m-mhoI.

Hver av fraksjonene F-I til F-III ble utsaltet ved 60

i metning med ammoniumsulfat og utfellingene ble oppløst i et lite volum av en lOmM fosfatpufferløsning med en pH på 8,0. Løsningen ble deretter gelfiltrert med Sefakryl S-200 ogj utsaltingskonsentrasjonen ved ultrafiltréring etterfulgt I av frysetørking, hvilket ga 629 mg, 879 mg eller 1.070 mg av de rensede proteaser men en fibrinolytisk aktivitet på 13.780

2 2 2

mm /mg, 9.290 mm /mg eller 17.620 mm /mg fra fraksjonene F-I, F-II og F-III henholdsvis. Disse rensede proteasefrak-2 1 1 i sjoner kalles proteaser F-I , F-II og F-III henholdsvis.

i Plasminogenaktivatoraktiviteten ble undersøkt for hver av de ovenfor erholdte rensede proteaser. Således ble den rensede protease oppløst i vann i ' en kon sentr as j-on på 0,1 mg/ml og 2 0 ul av denne løsningen ble blandet med 10 ul av plasminogenet med en aktivitet på 5 enheter/ml (et produkt fra Sigma Co.) og 30 ul av en 0,17 M boratpufferløsning med'en pH på 7,8 og inneholdende 0,01 M natriumklorid og, etter henstand i 10 minutter ved 3 7°C, ble 0,0 3 ml av den bland-ede løsningen dryppet loddrett på en fibrinplate fri for! plasminogen (et produkt fra Miles Laboratories, Inc.). I Området i mm 2 av den oppløste del ble målt på platen etter ;i 18 timers reaksjon ved 37°C. Når det ovenfor erhold2te område ble tatt som X og det tilsvarende område i mm erholdt ved bruk av 10 pl 0,17 M boratpufferløsning i stedet for plasminogenet ble tatt som Y, uttrykkes plasminogenaktiya-toraktiviteten ved X-Y. De således målte verdier for.plasminogenaktivatoraktiviteten var 2.025 mm 2 /mg, 1.721 mm2 /img

2

pg 1.2 83 mm /mg for de tørkede produkter erholdt fra fraksjonene F-I 2 , F-II 1 og F-III l henholdsvis.

Molekylvektsverdiene målt ved gelfiltréring og pH ved d=t

isoelektriske punkt for disse proteasefraksjoner var son følger: ca. 22.000 og 4,0 for protease F-I 2•, ca. 23.000 og 3,8 for protease F-II1; og ca. 28.000 og 3,7 for protease<:>F-III<1>.

Eksempel 14.

'I

De rensede proteaser erholdt i eksempel 13 ble undersøkt for reaktivitet med fibrin og fibrinogen. Således ble 0,18

ml blodplasma fra mennesker, 0,02 ml av en 250 mM vandig løsning kalsiumklorid og 0,02 ml av en vandig løsning av er av de rensede proteaser i en variert konsentrasjon blaniet og FDP (fibrinspaltdningspeptid) dannet ved reaksjon i 30 minutter ved 37°C i den overnevnte blanding ble målt ved latexkoaguleringsprøven ved bruk av et sett for trombo-Wellcoprøve (fremstilt av Wellcome Co.). Resultatene er vist i tabell 8 i kolonnene nedenunder under overskriften for 'CaCl_ ( + ) for 5 forskjellige konsentrasjoner på 10<4>10 -1ng/ml. Merkene (+), (++) og (+++) i tabellen angir

dannelse av FDP fra fibrin, økning av antallet + merker tilsvarer økningen i dannelsen av FDP, mens merket (-) angir at ikke FDP er dannet fra fibrin for hver konsentrasjon.

På den annen side ble samme prøve som ovenfor gjentatt uten kalsiumklorid, dvs. ved bruk av en fysiologisk saltvanns-løsning i stedet for den vandige løsning av kalsiumklorjid, hvilket viste av intet FDP ble dannet uavhengig av protease-fraksjonen og konsentrasjonen av denne som visti kolonnen i tabell 8 under overskriften CaCl2(-). Disse resultater understøtter konklusjonen at proteasene har reaktivitet overfor fibrin men ikke overfor fibfinogen.

i

Eksempel 15.

Hver av de frysetørkede, rensede proteaser fra fraksjonene 2 1 i I F-I til F-III i Eksempel 13 ble gitt oralt til sunne menn i en dose på 1 ug/kg kroppsvekt og det perifere blod f rai hver av individene ble tatt periodisk for å gi euglobulinfraksjonene, med hvilke målinger ble foretatt for tiden I for fullstendig oppløsning av euglobulin i timer og fibrinopp-løsningsaktiviteten i mm2 ved standard fibrinplateprøven. Resultatene er vist i fig. 45a og henholdsvis 45b.

Som vist i fig. 45a ble tiden for oppløsning av euglobulin markert øket ca. 2 timer etter oral administrering av dé 2 l i rensede proteaser fra F-I (kurve I) og F-III (kurve III) og økningen i tid for euglobulinoppløsning fortsatte koii-tinuerlig. På den annen side begynte tiden for euglobulin-oppløsning gradvis å avta ca. 6 timer etter den orale administrering av den rensede protease F-II<1>(kurve II). Disse

resultater underbygger den konklusjon at hver av proteasene 2 1 ' F-I til F-III har en forsterkende virkning på den fib^rino-

lytiske aktiviteten til det perifere blod fra mennesker gitt oralt.

I

Videre viser fig. 45b at, riktignok med betydelig forskjellar mellom individer, var den fibrinolytiske aktiviteten fra euglobulinfraksjonene erholdt fra det perifere blod" maksimum ved 2-2 7 timer ett1er den orale administrering av prote-åsene F-I til F-III (kurvene I til III henholdsvis) til individene og den fibrinolytiske aktiviteten derav fortsatte selv 10 timer etter administrering.

I

Eksempel 16.

Den samme ekstraksjonsmetode som i Eksempel 13 ble gjentatt og 42 g av et vakuumtørket pulver av rått ekstrakt med en fibrinolytisk aktivitet på ca. 1.322 mm 2/mg erholdtes. Dett= pulveret ble oppløst i 1.000 ml renset vann og den vand:.ge løsning ble kolonnekromatografert ved bruk av DEAE-cellulofin og ga 5 fraksjoner F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III som vist i fig. 46.

Hver av de ovenfor erholdte 5 fraksjoner ble renset på samme måte som i Eksempel 13 innbefattet utsalting, gel-filtrering, ultrafiltréring og frysetørkning, hvilket ga 5 rensede proteasefraks joner av 0,07 g F-0 hovedsakelig! bestående av protease HM-45,0,209 g F-I-l hovedsakelig bestående av protease. HM-54, 0,42 0 g F-I-2 hovedsakelig bestående av protease HM-15, 0,879 g F-II<1>og 1,070 g F-ljl1. Den fibrinolytiske aktiviteten til disse rensede proteasefraksjoner for koagulert fibrin var 8.816 mm 2 /mg, 15.2001 2 2 2 2 mm /mg, 12.000 mm /mg, 9.290 mm /mg og 17.620 mm /mg for F-0, F-I-l, F-I-2, F-II<1>og henholdsvis F-III<1>.

Eksempel 17.

De samme fremgangsmåter ble gjentatt som i det foregående eksempel ned til kolonnekromatografifraksjoneringen, hvilket ga eluatløsningene tilsvarende fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III og hver av de første tre f raks jonejie

. ble ført gjennom en kolonne fylt med DEAE-cellulofin ekvili-I brert med en 10 mM fosfatpufferløsning med en pH på 8,0

slik at de aktive bestanddeler ble adsorbert på adsorbenten. De aktive bestanddeler ble eluert ved eluering med samme pufferløsning i en konsentrasjonsgradient på 0 - 100 mM natriumklorid og de aktive fraksjoner ble gelfiltrert med

, Sefadex G-75, hvilket ga rensede proteaser av 0,02 g HM-45, 0,07 g HM-54 og 0,06 g HM-15 fra fraksjonene F-0, F-I-l og ' F-I-2 henholdsvis, hvor hvert forholdt seg som et en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

Eluatløsningen for fraksjon F-II ble ført gjennom en kolonne fylt med Toyopearl HW-55 (et produkt fra Toyo Soda Co.) ekvilibrert med en 30 % mettet vandig løsning av ammoniim-sulfat for å adsorbere de aktive bestanddeler etterfulg: av

eluering med en konsentrasjonesgradient fra 30 % til 10 % mettning med ammoniumsulfat. En løsning av kombinerte eLuat-fraksjoner inneholdende aktive bestanddeler ble avsaltet og

ført gjennom en kolonne fylt med heksyl-sefarose ekviliorert ' med 10 mM fosfatpufferløsning med en pH på 6,0 slik at de aktive bestanddeler ble adsorbert. Fraksjonene erholdt ved etterfølgende eluering av de aktive bestanddelene med samme pufferløsning i en konsentrasjonsgradient fra 0-150 mM

natriumklorid ble slått sammen og gelfiltrert med Sefadex G-75, hvilket ga 0,10 g renset protease HM-6 4 som forholdt seg som en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

Eluatløsningen for fraksjon F-III ble ført gjennom en kolonne fylt med sefaroseaffinitetsbærer med albumintrypsii-inhibitor (et produkt fra Sigma Co.) og ekvilibrert med en 20 mM fosfatpufferløsning med en pH på 8,0 slik at de active bestanddeler ble adsorbert etterfulgt av vasking med en 0,1 M acetatpufferløsning med en pH på 5,0 og inneholdende 1 M natriumklorid. Etterfølgende eluering av de aktive

bestanddeler med en acetatpuf f erløsning inneholdende 1 yi

natriumklorid og 0,5 M arginin ga en fraksjon F-III1 son

: ble videre renset ved kolonnekromatografi ved føring gjen-i hom en kolonne fylt med Toyopearl H^-55 ekvil^ en_

mettet løsning ammoniumsulfat etterfulgt av eluering med en konsentras jonsgradient på 30 % - 10 % mettning med ammoiiurr-sulfat, hvilket ga 0,0 70 g renset protease HM-2 7 og 0,0 50 c protease HM-89 som hver forholdt seg som et en-komponentmateriale ved elektroforesen med en polyakrylamidgel. Fig.

47 viser elueringskurvene i denne avsluttende kolonnekrsma-

I tografi gitt som fibrinolytisk aktivitet, aktivitetene for

i S-2444 og S-2251 og absorbsjonen ved 280 nm for fraksjoner med et volum på 3 ml.

Eksempel 18.

5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III erholdes

hovedsakelig på samme måte som i Eksempel 16 etter koloine-kromatografisk fraksjonering med DEAE-cellulofin. Hver av fraksjonene ble utsaltet ved 90 % mettning med magnesiumsulfat, hvilket ga fellinger som ble oppløst i et lite

volum av en 10 mM fosfatpufferløsning med pH 8,0 etterfulgt av gelfiltréring med Sefakryl S-200, avsaltingskonsentra-sjon ved ultrafiltrering og frysetørking, hvilket ga 0,04 c renset fraksjon F-0 hovedsakelig bestående av HM-45, 0,170 g

av renset fraksjon F-I-l hovedsakelig bestående av HM-54, 0,260 g av fraksjon F-I-2 hovedsakelig bestående av HM-15,

0,530 g av fraksjon F-II1 eller 0,650 g av fraksjon F-III1

med en fibrinolytisk aktivitet på 9.210, 16.300, 13.000, 10.200 eller 18.900 mm 2/mg, henholdsvis.

Eksempel 19.

1 kg frysetørket pulver fra metemark ble dispergert i 10

liter av en vandig løsning inneholdende 0,9 % natriumkloric. og 0,02 % etyl-4-hydroksybenzoat og dispersjonene ble rørt ved 30°C i 96 timer. Dispersjonen ble så filtrert og resten ble vasket med 3 liter av en vandig løsning inneholdende 0,9 % natriumklorid og 0,01 % etyl-4-hydroksybenzoat. Vaskevæskene ble slått sammen med filtratet i den

første filtrering og ga 13 liter av en klar ekstraktløs-

I ning med en fibrinolytisk aktivitet for koagulert fibrin I på 450 mm2/ml etter 10 gangers f ortynning.. Det_f_lytende] _ volumet av denne ekstraktløsningen ble redusert til 0,71I liter ved ultrafiltrering etterfulgt av tilsetning av 0,47 liter aceton for å oppnå utfelling. Etter filtrering for å

I skille fra utfellingene, ble filtratet videre blandet med aceton og ga 70 % aceton i den endelige løsning for å gl en

ytterligere mengde utfellinger som ble slått sammen med utfellingene erholdt i den første felling og vasket igjen

med aceton etterfulgt av vakuumtørkning, hvilket ga 40 g

■ tørket pulverformig produkt med en fibrinolytisk aktivitet for koagulert fibrin på 1.310 mm 2/mg.

Det ovenfor erholdte pulverprodukt ble oppløst i 1 liter

renset vann og den vandige løsningen ble fraksjonert ved kolonnekromatografi med DEAE-cellulofin som adsorbsjons-middel i 5 fraksjoner på F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III inneholdende nye proteaser. Hver av disse fraksjoner bl 2 videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17

og ga 0,019 g HM-45, 0,067 g HM-54, 0,057 g HM-15 0,095 g HM-64 eller 0,067 g HM-27 og 0 ,057 g HM-89 som hver forholdt seg som et en-komponentmateriale ved elektroforese med sn polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

Eksempel 20.

Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 16 ble gjentatt og ga 0,71 liter av en klar konsentrert ekstraktløsning etter ultrafiltréring. Ekstraktløsningen ble blandet med 0,47 liter propylalkohol og ga utfellinger som ble skilt fra ved filtrering. Filtratet ble videre blandet med propy lalkohol til en 60 % konsentrasjon i slutt.-løsningen og utfellingene erholdt i denne andre felling ble slått sammen med de som erholdtes i første felling og vasket med propylalkohol etterfulgt av vakuumtørking til 3j4 g tørt pulverformig produkt med fibrinolytisk aktivitet for koagulert fibrin på 1.280 mm 2/mg.

i

I Dette pulverformige produkt ble oppløst i 1 liter renset

1 vann og den vandige løsningen ble f raks jonert. yed_kplpjnlne^_ kromatografi med DEAE-sefarose i 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III inneholdende nye proteaser..

Hver av disse fraksjoner ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,018 g HM-45, 0,063 g HM-54, 0,054 g HM-15, 0,090 g HM-64 eller 0,063 HM-27 og

0,05 4 g HM-8 9 som hver forholdt seg som et en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis 1 F-III.

Eksempel 21.

Den første del av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 16 ble

gjentatt og ga 0,71 liter av en klar, konsentrert ekstrakt-løsning etter ultrafiltréring. Ekstraktløsningen ble blandet med 0,47 liter isopropylalkohol, hvilket ga utfellinger som ble skilt fra ved filtrering. Filtratet ble videre blandet med isopropylalkohol og ga en 60 % konsentrasjon derav i sluttløsningen og utfellingene erholdt i den andre utfelling ble slått sammen med sådanne erholdt i den første utfelling og vasket med isopropylalkohol etterfulgt av vakuumtørking, hvilket ga 37 g av et tørt pulverformig produkt med en fibrinolytisk aktivitet på 1.300 mm 2/mg.

Dette pulverformige produkt ble oppløst i 1 liter renset vann og den vandige løsning ble fraksjonert ved kolonnekromatograf i med DEAE-cellulofin i 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III.Hver av disse fraksjonene ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,017 g HM-45, 0,060 g HM-54, 0,050 g HM-15, 0,0j85 g HM-64 eller 0,060 g HM-27 og 0,050 g HM-89 som alle forholct seg som en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

Eksempel 22.

I Den første porsjonen fra ekstraksjonsprosedyren i Eksempel116 ble gjentatt og ga 0,71 liter av en klar,.._kons_ejiJ:rjer)t ekstraktløsning etter ultrafiltréring og ekstraktløsningen ble utsaltet ved 60 % mettning med ammoniumsulfat under

■ utfelling av de aktive bestanddeler. Utfellingene ble o?p-

! løst i 1 liter renset vann og den vandige løsning ble,

etter dialyse, fraksjonert ved kolonnekromatografi med i DEAE-cellulofin i 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II

i og F-III inneholdende nye proteaser. Hver av disse frak-

! sjonene ble videre renset på hovedsakelig samme måte son i ; Eksempel 17 og ga 0,020 g HM-45, 0,068 g HM-54, 0,057 g j HM-15, 0,100 g HM-64 eller 0,065 g HM-27 og 0,058 g HM-39 som hver forholdt seg som en-komponentmaterialer ved elaktro-forese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

<1>Eksempel 23.

Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 16 ble gjentatt og ga 13 liter av en ekstraktløsning av metemark me2d en fibrinolytisk aktivitet for koagulert fibrin på

540 mm /ml etter 10 gangers fortynning. Denne ekstraktløs-ning ble svakt surgjort til pH 4,0 ved tilsetning av IM vandig løsning eddiksyre og ført gjennom en kolonne fylt med Amberlite CG-50 ekvilibrert forut med 0,1 M acetatpuf ferløsning med pH 4,0 for adsorbsjon av de aktive bestanddeler. Etter vask med samme pufferløsning, eluerte man ie aktive bestanddeler med en 0,1 M acetatpufferløsning med pH 5,5. Eluatløsningen som viste aktivitet ble blandet med en 0,5 N vandig løsning natriumhydroksyd til pH 8,0 og avsaltet og konsentrert ved ultraf iltréring etterfulgt avj kolonnekromatograf i f raks jonering med DEAE-cellulof in tiil 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III inneholdelnde

nye proteaser. Hver av disse fraksjoner ble videre renset

■ på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,015 g

. HM-45, 0,050 g HM-54, 0,040 g HM-15, 0,065 g HM-64 eller 0,050 g HM-27 og 0,040 g HM-89 som hver forholdte seg som en-komponentmaterialer ved elektroforese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

Eksempel 24.

i ■

Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 15 ble gjentatt og ga 42 g av et tørt pulverformig produkt med en fibrinolytisk aktivitet overfor koagulert fibrin på 1.322 mm 2 /mg etter fraksjonert utfelling med etylalkohol, og vakuumtørking. Dette pulverformige produkt ble oppløst L 1 liter renset vann og den vandige løsningen ble fraksjonert ved kolonnekromatografi med TEAE-cellulose i 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III inneholdende nye proteaser. Hver av disse fraksjoner ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17, hvilket ga 0,022 HM-45, 0,075 g HM-54, 0,068 g HM-15, 0,090 g HM-64 ellet 0,065 g HM-27 og 0,057 g HM-89 som hver forholdte seg som ét en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

Eksempel 25.

Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 15 ble gjentatt og ga 42 g av et pulverformig produkt med en fibrinolytisk aktivitet for koagulert fibrin på 1.322 mn 2/n.g etter fraksjonert utfelling med etylalkohol og vakuumtørk-ing. Dette pulverformige produkt ble oppløst i 1 liter renset vann og den vandige løsning ble fraksjoner ved kolonnekromatografi med PEI-cellulose i 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III inneholdende nye proteaser. Hver av disse fraksjoner ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,018 g HM-45, 0,072 g HM-54, 0,058 g HM-15, 0,120 g HM-64 eller 0,066 g HM-27 og 0,060 g HM-89 som hver forholdt seg som et rent en-komp3-nentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

Eksempel 26.

Den første del av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 16 ble gjentatt og ga 42 g av et tørt pulverformig pro dukt mek erj fibrinolytisk aktivitet overfor koagulert fibrin på 1.3:22 mm /mg etter fraksjonert utfelling med etylalkohol og vakuumtørkning. Dette pulverformige produkt ble oppløst i 1 liter renset vann og den vandige løsningen ble fraksjonert ved kolonnekromatografi med AE-cellulose i 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III. Hver av disse fraksjoner ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,022 g HM-45, 0,072 g HM-54, 0,064 g HM-15,

0,100 g HM-64 eller 0,065 g HM-27 og 0,056 g HM 89 som hver forholdt seg som rent en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel fra fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2, F-II eller henholdsvis F-III.

Eksempel 27.

Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 15 ble gjentatt og ga 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III etter kolonnekromatografisk fraksjonering med DEAE-cellulofin. Hver av fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2 oq F-II ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,020 g HM-45, 0,070 g HM-54, 0,060 g HM-15 og 0,100 g HM-6 4 henholdsvis, som hver forholdt ssg som et en-komponentmateriale ved elektroforese med polyakrylamidgel.

På den annen side ble eluatet av fraksjonen F-III ført gjennom en kolonne fylt med en sefaroseaffinitetsbærer med soyabønnetrypsininhibitor (et produkt fra PL Biochemicals, Inc.) og ekvilibrert forut med en 20 mM fosfatpufferløsninc med en pH på 8,0 for å adsorbere de aktive bestanddeler og, etter vask med de samme pufferløsninger som ovenfor, men dertil inneholdende 1 M natriumklorid og så med 0,1 M acetatpufferløsning med en pH på 5,0, ble eluering utført med en 0,1 M acetatpufferløsning med en pH på 5,0 og inneholdende 1 M arginin og 1 M natriumklorid, hvilket ga ejn aktiv fraksjon F-III<1>. Denne fraksjon ble videreført gjennom en kolonne av Biogel P-30 ekvilibrert med en mettet vandig løsning av ammoniumsulfat for adsorbsjon av de aktive bestanddeler, etterfulgt av eluering med en konsentrasjons gradient fra 30 % - 10 % mettning med ammoniumsulfat, hvilket ga 0,060 g og 0,050 g renset HM-2 7 og HM-89 henholdsvis, som hver forholdt seg som et en-komponentmateriale ved i

elektroforese med en polyakrylamidgel.

Eksempel 28.

; Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 15

i ble gjentatt og ga 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II

og F-III etter kolonnekromatografisk fraksjonering med DEAE-cellulofin. Hver av fraksjonene F-0, F-I-l, F-I-2 og F-II ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,020 g HM-45, 0,070 g HM-54, 0,060 g

HM-15 og 0,100 g HM-6 4 henholdsvis, som hver forholdt seg

; siom et en-komponentmaterialé ved elektroforese med polyakrylamidgel.

På den annen side ble fraksjon F-III ført gjennom en koLonne fylt med en sefaroseaffinitetsbærer med eh bakterie-trypsininhibitor (et produkt fra Sigma Co.) og forut ekvilibrert med en 20 mM fosfatpufferløsning med en pH på 8,0 for adsorbsjon av aktive bestanddeler, og etter vask med saume fosfatpufferløsning, men inneholdende 1 M natriumklorid og

deretter med en 0,1 M acetatpufferløsning med en pH på 5,0, ble eluering foretatt med en 0,1 M acetatpuf f erløsning :ned en pH på 5,0 og inneholdende 1 M arginin og 1 M natriumklorid som elueringsmiddel, hvilket ga en aktiv fraksjon F-III<1.>Denne fraksjon ble videre ført gjennom en kolonne fylt med Toyopearl HW-55 ekvilibrert med en mettet løsning av ammoniumsulf at for å adsorbere de aktive bestanddelejr, etterfulgt av eluering med en konsentrasjonsgradient påj 30 % -10 % mettning med ammoniumsulfat for å gi hver 0,050 g

renset HM-27 og HM-89, som hver forholdt seg som et en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

Eksempel 29.

I Den første delen av ekstraksjonsprosedyren i Eksempel 16

! ble gjentatt, hvilket ga 5 fraksjoner av F-0, F-I- l , F-|l-2,

F-II og F-III etter kolonnekromatografisk fraksjonering, Hver av disse fraksjoner, bortsett fra F-II, ble videre renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17, hv:.lket ga 0,020 HM-45, 0,070 g HM-54, 0,060 g HM-15 eller 0,070 g HM-27 og 0,060 g HM-89 fra fraksjon F-0, F-I-l, F-I-2 eUer henholdsvis F-III,som hver forholdt seg som et en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

På den annen side ble fraksjonen F-II ført gjennom en kolonne fylt med Toyopearl HW-55 (et produkt fra Toyo Soda Co.), forut ekvilibrert med en vandig ammoniumsulfatløsning med 30 % mettning for adsorbsjon av aktive bestanddeler etterfulgt av eluering med en konsentrasjonsgradient på 30 % - 10 % mettning med ammoniumsulfat. De aktive fraksjoner som ble oppnådd i denne elueringen ble oppsamlet og, etter utsalting, ført gjennom en kolonne fylt med oktyl-sefarose forut ekvilibrert med en 10 mM fosfatpufferløsning med pH 6,0 for adsorbsjon av de aktive bestanddeler etterfulgt av eluering med samme pufferløsning med en konsentrasjonsgradient fra 0 - 0,5 M natriumklorid for eluering av de aktive bestanddeler. Fraksjonene som inneholdt de aktivis bestanddeler ble samlet etterfulgt av gelfiltréring med Sefadex G-75, hvilket ga 0,070 g HM-64 som forholdt seg som et renset en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

Eksempel 30.

Den første delen av ekstraksjonsprosedyren fra Eksempel 16 ble gjentatt og ga 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, F-II og F-III etter kolonnekromatografisk fraksjonering. Hver av den første av disse 3 fraksjoner ble oppløst i en 10 mM fosfatpufferløsning med pH 8,0 og løsningen ble ført gjennom en kolonne fylt med DQAE-cellulose forut ekvilibrert med samme pufferløsning som ovenfor for adsorbsjon av de ak"ive bestanddeler, etterfulgt av eluering med en konsentrasjonsgradient på 0 - 10 mM av natriumklorid, hvilket ga aktive fraksjoner som ble oppsamlet og renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,018..g HM-45 ,__0..,_06oJ g

HM-54 eller 0,050 g HM-15 fra fraksjonene F-0, F-I-l eller F-I-2 henholdsvis, som hver forholdt seg som et renset en-

I

komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

Fraksjonen F-II ble renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 med gelfiltréring ved bruk av Biogel P-100 (et produkt fra Bio-Rad Co.) i slutt-trinnet og ga 0,090 g HM-6 4 som virket som et renset en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

På den annen side ble fraksjonen F-III renset på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0 ,068 g og 0 ,0 5 7 j g HM-2 7 og henholdsvis HM-89, som begge forholdt seg som et renset en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel.

Eksempel 31.

Den første delen av ekstråksjonsprosedyren i Eksempel 16

ble gjentatt og ga 5 fraksjoner av F-0, F-I-l, F-I-2, f|-II og F-III etter kolonnekromatografisk fraksjonering. Hver av den første av disse 3 fraksjoner ble ført gjennom en kolonne fylt med ECTEOLA-cellulose ekvilibrert forut med ei 10 mM fos fatpufferløsning med en pH på 8,0 for adsorbsjon av de aktive bestanddeler, etterfulgt av eluering med en konsentrasjonsgradient på 0-100 mM med natriumklorid. De aktive fraksjoner som ble eluert i denne eluering ble samlet

I I

og utsaltet ved 60 % mettning med ammoniumsulfat. Utfellingene som ble oppnådd ved utsaltingen ble oppløst i vanng ført gjennom en kolonne fylt med Toyopearl HW-55 forut ekvilibrert med en vandig ammoniumsulfatløsning med 30 p mettning for å adsorbere de aktive bestanddeler, etterfulgt av eluering med en konsentrasjonsgradient på 30 % - 10 % mettning med ammoniumsulfat og ga aktive fraksjoner som ble renset ved utsaltning og ga 0,021 g, 0,073gog 0,065 g HM-45, HM-54 og HM-15 fra fraksjonene F-0, F-I-l og henholdsvis F-I-2, som hver forholdt seg som et renset en-komponentmateriale ved elektroforese med en polyakrylamidgel. J

Fraksjonen F-II ble videre renset på hovedsakelig samme(måte som i Eksempel 17, bortsett fra at Biogel P-30 ble brukt i 'stedet for Sefadex G-75 i gelfiltrering" en og ga 0 ,090 gi,

s HM-6 4, som forholdt seg som et renset en-komponentmateriale vied elektroforese med polyakrylamidgel. I I

På den annen side, ble fraksjonen F-III videre rensed på hovedsakelig samme måte som i Eksempel 17 og ga 0,068 gjog 0,065 g HM-27 og henholdsvis HM-89, som hver forholdt séig som et renset en-komponentmateriale ved elektroforesen med en polyakrylamidgel.

i

Claims

I I 1. Fremgangsmåte ved fremstilling av fibrinolytisk aktive proteaser F-O-HM-45, med

A) enzymatisk aktivitet og substratspesifitet omfattende fibrinolytisk aktivitet mot koagulert fibrin; plasminogen-aktiverende aktivitet; og sterk aktivitet overfor casein, tosyl-L-argininmetylesterhydroklorid og N-benzoy1-L-tyrosinetylester, og meget svake aktiviteter overfor L-pyrogluta-

mylglycyl-L-ariginin-p-nitroanilidhydroklorid og H-D-valyl-

i L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid; men nesten!

ingen aktivitet overfor N-a-tosy1-L-lysinmetylesterhydroklorid og N-benzoyl-L-alaninmetylester•, !

j B) en optimal pH i området fra ca. 8-10 for fibrinolysen med koagulert fibrin som substrat og en stabilitets-pH i området fra 4-12;

i Oi C) en operabel temperatur i området fra 30-60 C med en optimums temperatur i området fra ca. 50° - ca. 60°C i fibrinolysen mot koagulert fibrin med en pH på 7,8; i

D) fullstendig deaktivering ved oppvarming ved 70°C i 60

minutter; '

i

l E) en molekylvekt på 24.500 + 2.000; \

■ I F) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum med en maksimums- j absorpsjon på ca. 280 nm og en minimumsabsorpsjon ved ca.

2 50 nm bølgelengde; i

i G) et isoelektrisk punkt pl ved pH 4,1 + 0,1; j

H) ømfindtlighet overfor inhibitorer innbefattet fullstendig inhibering ved limabønnetrypsininhibitor, difluorfosfat, !

i soyabønnetrypsininhibitor, antipain, leupeptin, trasylol I

og chimostatin; temmelig sterk inhibering av trans-4-(aminpr metyl)cykloheksankarboksylsyre og €-aminokapronsyre; svak inhibering av eggehvitetrypsininhibitor, pepstatin og N-etylmaleimid, men hovedsakelig ingen inhibering av de natriumetylendiamintetraacetat i fibrinolysen mot koagulert fibrin;

I) en aminosyresammensetning på 12,26 % aspartinsyre, 12,22 % treonin, 9,38 % serin, 3,97 % glutaminsyre, 0,40 % prolin, 13,48 % glycin, 12,95 % alanin, 1,44 % cystein, 7,03 % valin, 0,55 % metionin, 5,83 % isoleucin, 7,47 % leucin, 3,91 % tyrosin, 2,00 % fenylalanin, 0,64 % tryptofan, 0,04 % lysin, 2,45 % histidin og 3,98 arginin i det % angivelsen refererer til mol og innbefatter uunngåelig analytisk avvik;

og

J) en elementæranalyse på 48,30 % karbon, 6,84 % hydrogen, 15,88 % nitrogen og 2,07 % svovel, idet refererer til vekt og innbefatter uunngåelig analytisk feil,

F-I-l-HM-54 med

A) enzymatisk aktivitet og substratspesifitet omfattende fibrinolytisk aktivitet mot koagulert fibrin; plasminogen-aktiverende aktivitet; og sterk aktivitet overfor casein, tosy 1-L-argininmetylesterhydroklorid og N-benzoyl-L-\ .yrosin-etylester; og meget svake aktiviteter overfor N-a-tosyl-L-lysinmetylesterhydroklorid og L-pyroglutamylglycy1-L-arginin-p-nitroanilidhydroklorid; men nesten ingen aktivitet overfor H-D-valy1-L-leucy1-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid og N-benzy1-L-alaninmetylester;

B) en optimums-pH i området fra ca. 8-10 for fibrinolyse med koagulert fibrin som substrat og en stabilitets-pH i området fra 4-12;

C) en operabel temperatur i området fra 30-60°C med en optimumstemperatur i området fra ca. 50-60°C i fibrinolyse mot koagulert fibrin ved en pH på 7,8;

D) fullstendig deaktivering ved oppvarming ved 70°C i 60 minutter;

E) en molekylvekt på 27.500 + 2.000;

F) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum med en maksimums-absorpsjon på ca. 280 nm og en minimumsabsorpsjon ved ca.

250 nm bølgelengde;

G) et isoelektrisk punkt pl ved en pH på 4,0 + 0,1;

H) ømfindtlighet overfor inhibitorer innbefattet fullstendig inhibering av limabønnetrypsininhibitor, difluorfosfat og N-etylmaleimid; temmelig sterk inhibering ved soyabønne-trypsininhibitor og leupeptin; og svak inhibering av eggehvitetrypsininhibitor, trans-4-(aminometyl)cykloheksankarbok-sylsyre og chimostatin; men ingen inhibering av antipain, trasylol, £-aminokapronsyre, pepstatin og dinatriumetylendiamintetraacetat i fibrinolysen mot koagulert fibrin;

I) en aminosyresammensetning på 15,65 %•aspartinsyre,

8,25 % treonin, 11,30 % serin, 6,05 % glutaminsyre, 0,37 % prolin, 15,39 % glycin, 9,49 % alanin, 1,09 % cystein,

5,46 % valin, 0,97% métionin, 6,54 % isoleucin, 7,95 % leucin, 3,69 % tyrosin, 1,11 % fenylalanin, 0,98 % tryptofan, 0,50 % lysin, 2,75 % histidin og 2,46 % arginin, idet

% refererer til mol og innbefatter en uunngåelig analytisk usikkerhet; og

J) en elementæranalyse med 48,93 % karbon, 6,65 % hydrogen, 15,95 % nitrogen og 1,34 % svovel, idet % refererer til vekt og innbefatter en uunngåelig analytisk usikkerhet, og F-I-2-HM-15 med

A) enzymatiske aktiviteter og substratspesifitet omfattende fibrinolytisk aktivitet mot koagulert fibrin; plasminogen-aktiverende aktivitet; og sterk aktivitet overfor casein, tosy1-L-argininmetylesterhydroklorid og N-benzoyl-L-tyro sinetylester; og meget svake aktiviteter overfor N-a-tosyl-L-lysinmetylesterhydroklorid og L-pyrolgutamylglycyl-L-arginin-p-nitroanilidhydroklorid; men nesten ingen aktivitet overfor H-D-valy1-L-leucy1-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid og N-benzoyl-L-alaninmetylester;

B) en optimums-pH i området fra ca. 8 til 10 for fibrinolyse med koagulert fibrin som substrat og en stabilitets-pH i området fra 4-12;

C) en operabel temperatur i området fra 30-60°C med en optimumstemperatur i området fra ca. 50-60°C i fibrinolyse mot koagulert fibrin ved en pH på 7,8;

D) fullstendig deaktivering ved oppvarming ved 70°C i 60 minutter;

E) en molekylvekt på 27.000 + 2.000;

F) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum med en maksimums-absorpsjon på ca. 280 nm og en minimumsabsorpsjon ved ca.

250 nm bølgelengde;

G) et isoelektrisk punkt pl ved pH 3,9 - 0,1;

H) ømfindtlighet overfor inhibitorer omfattende fullstendig inhibering ved limabønnetrypsininhibitor, difluorfosfat og N-etylmaleimid; temmelig sterk inhibering ved leupeptin og eggehvitetrypsininhibitor; og svak inhibering ved soya-bønne trypsininhibitor , antipain, trans-4-(aminometyl)cyklo-heksankarboksylsyre, C-aminokapronsyre, chimostatin, pepstatin og dinatriumetylendiamintetraacetat, men ingen inhibering av trasylol i fibrinolyse mot koagulert fibrin;

I) en aminosyresammensetning av 16,06 % aspartinsyre, 8,46 % treonin, 10,85 % serin, 6,13 % glutaminsyre, 0,41 % prolin,

15,41 % glycin, 9,45 % alanin, 1,67 % cystein, 5,51 % valin, 0,82 % metionin, 6,64 % isoleucin, 8,01 % leucin, 3,79 % tyrosin, 1,11 % fenylalanin, upåviselig mengde tryptofan, 0,53 % lysin, 2,73 % histidin og 2,42 % arginin, alle %! på molbasis innbefattet en uunngåelig analytisk usikkerhet!; ogj ii J) en elementærsammensetning av 45,15 % karbon, 6,6 4 % hydrogen, 16,02 % nitrogen og 2,05 % svovel, idet % er vekt innbefattet en uungåelig analytisk usikkerhet, karakterisert ved at man

(a) ekstraherer metemarkvev med et vandig ekstraksjonsmiddel, hvilket gir en ekstraktløsning inneholdende proteasene ;

(b) tilsetter et polart organisk løsningsmiddel til ekstrakt-løsningen og utfeller de foreliggende proteaser;

(c) fraksjonerer utfellingene ved anionebyttekromatografi

i i 5 fibrinolytisk aktive fraksjoner, hvorav 3 hver innej-holder en av proteasene F-O-HM-45, F-I-l-HM-54 og F-I-2r HM-15 ; i

I (d) fører hver av fraksjonene som hver inneholder en av:

proteasene F-O-HM-45, F-I-l-HM-54 og F-I-2-HM-15 gjennom en

i kolonne fylt med en anionebytter og adsorberer de aktive

i bestanddeler på denne; I

I (e) eluerer de aktive bestanddeler adsorbert på hver av anionebytterene i trinnet (d) ved konsentrasjonsgradient- j metoden med natriumklorid og får fraksjoner inneholdende i

i en av proteasene F-O-HM-45, F-I-l-HM-54 og F-I-2-HM-15 ;| ogj 1 i

(f) renser hver av fraksjonene som inneholder proteasene j F-O-HM-45, F-I-l-HM-54 eller F-I-2-HM-15 ved bruk av en gelionebytter.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinnet (f) utføres ved å føre fraksjonen gjen-

i nom en kolonne fylt med en gelionebytter og adsorbere den aktive bestanddel på denne, etterfulgt av eluering av dien__ aktive bestanddel ved konsentrasjonsgradientmétoden med ammoniumsulfat og deretter avsalter eluatløsningen.
3. Fremgangsmåte ved fremstilling av fibrinolytisk aktiv protease F-II-HM-6 4 med

Afi) berninzyomlyattiissk k aakkttiivviitteet t moog t skubosagturaletrspt esfiibfritinet ; pomlafsamtitnenodgéein-aktiverende aktivitet; og sterk aktiviteter overfor caselin; gode aktiviteter overfor tosy1-L-argininmetylesterhydrop klorid; svake aktiviteter overfor N-a-tosy1-L-lysinmetylesterhydroklorid og L-pyroglutamylglycyl-L-arginin-p-nitro-anilidhydroklorid; og meget svake aktiviteter overfor H>-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroaniliddihydroklorid; men nesten ingen aktivitet overfor N-benzoyl-L-alaninmetylester og N-benzoyl-L-tyrosinetylester;

B) optimum pH i området fra ca. 7-8 for fibrinolyse med koagulert fibrin som substrat og en stabilitets-pH i om- j rådet fra 5-12; j

i i C) en opreabel temperatur i området fra 30-60°C med en optimumstemperatur i området fra ca. 50-60°C i fibrinolyse mot koagulert fibrin med en pH på 7,8; j

j

D) fullstendig deaktivering ved oppvarming ved 70°C i 60 minutter; i

E) en molekylvekt på 27.000 + 2. 000 ;

j F) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum med en maksimum j absorpsjon på ca. 280 nm og en minimum absorpsjon ved ca.

250 nm bølgelengde; jG ) et isoelektrisk punkt pl ved en pH på 3,8 + 0,1; !I H) ømfindtlighet overfor inhibitorer inbefattende full-J stendig inhibering av limabønnetrypsininhibitor, difluorfosfat, soyabø nnetrypsininhibitor og N-etylmaleimid, ) temmelig sterk inhibering ved trasylol, eggehvitetrypsininhibitor, trans-4-(aminometyl)cykloheksankarboksylsyre, chimostatin og pepstatin; og svak inhibering ved antipain og £-aminokapronsyre; men ingen inhibering ved leupeptin og dinatriumetylendiamintetraacetat i fibrinolyse mot koagulert fibrin;

1) en aminosyresammensetning av 14,81 % aspartinsyre, 8,40 % treonin, 12,05 % serin, 6,0 4 % glutaminsyre, 0,44 % prolin, 14,48 % glycin, 10,27 % alanin, 0,80 % cystein, 7,77 % valin, 0,98 % metionin, 5,96 % isoleucin, 7,46 % leucin!, 3,24 % tyrosin, 0,58 % fenylalanin, 1,63 % trypto.f an, j 0,45 % lysin, 2,30 % histidin og 2,34 % arginin, idet % <\> refererer til mol og inneholder en uunngåelig analytisk usikkerhet; og

J) en elementæranalyse på 48,2 3 % karbon, 6,53 % hydrogen, 15,93 % nitrogen og 1,43 % svovel, idet % refererer till vekt og innbefatter en uunngåelig analytisk usikkerhet,

karakterisert ved at man

i i (a) ekstraherer metemarkvev med et vandig ekstraks jons-1 middel som gir en ekstraktløsning inneholdende proteasen;

i (b) tilsetter ekstraktløsningen et polart organisk løs-ningsmiddel som utfeller proteasen; !

i

(c) fraksjonerer utfellingene ved anionebyttekromatografi i 5 fibrinolytisk aktive fraksjoner, hvorav en inneholder proteasen F-II-HM-6 4; i;

i i i

(d) fører fraksjonen inneholdende proteasen F-II-HM-64 : i gjennom en kolonne fylt med en gelionbytter og adsorberer

i den aktive bestanddel på denne;

(e) eluerer den aktive bestanddel ved konsentrasjonsgradientmetoden med ammoniumsulfat og får en fraksjon inneholdende proteasen F-II-HM-6 4; I

(f) avsalter fraksjonen inneholdende proteasen;

(g) fører den avsaltede fraksjon gjennom en kolonne fylt med en adsorbent for affinitetskromatografi og adsorberer den aktive bestanddel på denne;

(h) eluerer den aktive bestanddel ved konsentrasjonsgradientmetoden med natriumklorid og får en fraksjon inneholdende proteasen F-II-HM-64; og

(i) renser fraksjonen som inneholder proteasen F-II-HM-64

i i ved bruk av en gelionebytter. j

j
4. Fremgangsmåte ved fraksjonert fremstilling av fibrinolytisk aktive proteaser F-III-l-HM-27 med

A) enzymatisk aktivitet og substratspesifitet omfattende fibrinolytisk aktivitet mot koagulert fibrin; plasminogen-aktiverende aktivitet; og sterke aktiviteter overfor casein, tosy 1-L-argininmetylesterhydroklorid, N-a-tosyl-L-lysinmetylesterhydroklorid, L-pyroglutamylglycy1-L-arginin-p-nitroanilidhydroklorid og H-D-valy1-L-leucyl-L-lysin-p-j nitroaniliddihydroklorid; men ingen aktivitet overfor ; N-benzoyl-L-alaninmetylester og N-benzoyl-L-tyrosinetyly ester;

B) en optimal pH på ca. 8 for fibrinolyse med koagulert fibrin som substrat og en stabilitets-pH i området fra 5-12;

C) operabel temperatur i området fra 30-60°C med en optimumstemperatur på ca. 50°C i fibrinolysen mot koagulert fibrin ved en pH på 7,8;

D) fullstendig deaktivering ved oppvarming ved 70°C i 60 minutter;

E) en molekylvekt på 32.400 + 2.000;

i F) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum med en maksimums- absorpsjon ved ca. 280 nm og en minimumsabsorpsjon ved cI a.

250 nm bølgelengde;

F) et isoelektrisk punkt pl ved pH 3,6 + 0,1;

H) ømfindtlighet overfor inhibitorer innbefattet fullstendig inhibering av limabønnetrypsininhibitor, difluorfosfat, soyabønnetrypsininhibitor, antipain, leupeptin og trasylol;

temmelig sterk inhibering av eggehvitetrypsininhibitorb g trans-4-(aminometyl)cykloheksankarboksylsyre; og svak inhibering av £-aminokapronsyre, chimostatin og pepstatin; men hovedsakelig ingen inhibering av dinatriumetylendiamintetraacetat og N-etylmaleimid i fibrinolysen mot koagulert fibrin;

I) en aminosyresammensetning på 15,25 % aspartinsyre,

6,09 % treonin, 10,08 % serin, 7,04 % glutaminsyre, 0,55 % prolin, 12,66 % glycin, 6,90 % alanin, 1,36 % cystein, 10,33 % valin, 1,36 % metionin, 7,89 % isoleucin, 3,73 % leucin, 4,6 3 % tyrosin, 3,09 % fenylalanin, 0,83 % tryptofan, 1,65 % lysin, 2,37 % histidin og 4,19 % arginin, idet refererer til mol og innbefatter en uunngåelig analytisk usikkerhet; og I

i J6) ,5e8 n% ehleymdernogtæenra, na14ly,s7e5 s% ammneintrsoegtnen inog g p2å ,0483 ,6% 1 sv% okvearlb, onid,et i%

refererer til vekt og innbefatter en uunngåelig analytisk usikkerhet, j

i og F-III-2-HM-89 med j

i i i A) enzymatisk aktivitet og substratspesifitet omfattende fibrinolytisk aktivitet mot koagulert fibrin; plasminogen-aktiverende aktivitet; og gode aktiviteter overfor casein, tosy1-L-argininmetylesterhydroklorid, N-a-tosy1-L-lysinmetylesterhydroklorid, L-pyroglutamylglycy1-L-arginin-p-nitroanilidhydroklcrid og H-D-valyl-L-leucy1-L-lysin-p- j nitroaniliddihydroklorid;men nesten ingen aktivitet overfor N-benzoyl-L-alaninmetylester og N-benzoy 1-L-tyrosinetyl- .._ ester;

B) en optimums-pH ved ca. 8 for fibrinolyse med koagulert fibrin som substrat og stabilitets-pH i området fra 4-12;

C) operabel temperatur i området fra 30-60°c med en'optimums temperatur i området fra ca. 50-60°C ved fibrinolyse mot koagulert fibrin ved pH 7,8;

D) fullstendig' deaktivering ved oppvarming ved 70°C i 60 minutter;

E) en molekylvekt på 32.800 + 2.000;

i i

F) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum med en maksimum i absorpsjon ved ca. 280 nm og en minimumsabsorpsjon ved ca.

i 25 0 nm bølgelengde; i

G) et isoelektrisk punkt pl ved pH 3,5 + 0,1;

H) ømfindtlighet overfor inhibitorer innbefattende fullstendig inhibering av limabønnetrypsininhibitor, difluorfosfat, soyabønnetrypsininhibitor, antipain, leupeptin and

i trasylol; temmelig sterk inhibering ved trans-4-(amino-]

i metyl)cykloheksankarboksylsyre; og svak inhibering ved <1> eggehvitetrypsininhibitor, E-aminokapronsyre, chimostatin og pepstatin, men ingen inhibering ved dinatriumetylendiamintetraacetat og N-etylmaleimid i fibrinolyse mot koagulert fibrin;

I) en aminosyresammensetning på 14,99 % aspartinsyre, 6,24 % treonin, 10,39 % serin, 7,63 % glutaminsyre, 0,57 % prolin, 12,89 glycin, 6,57 % alanin, 1,40'% cystein, 10,67 % valin, 1,34 % metionin, 7,62 % isoleucin, 3,41 % leucin, |

I 4,83 % tyrosin, 2,67 % fenylalanin, 1,09 % tryptofan, 1,67 %

lysin, -2.12 % histidin og 3,9 0 % arginin, idet % refererer til mol innbefattet en uunngåelig analytisk usikkerhet;Jog !

J) en elemetæranalytisk sammensetning på 47,53 %. karbon j _..

6,55 % hydrogen, 14,5 9 % nitrogen og 2,06 % svovel, idet % refererer til vekt og innbefatter en uunngåelig analytisk usikkerhet,

karakterisert ved at man

i

(a) ekstraherer metemarkvev med et vandig ekstraksjons- l middel og får en ekstraktløsning inneholdende proteasene;

i

i (b) tilsetter et polart organisk løsningsmiddel til ekstrakt-løsningen og utfeller proteasene;

(c) fraksjonerer utfellingene ved anionebytterkromatografi i 5 fibrinolytisk aktive fraksjoner, hvorav en inneholder proteasene F-III-l-HM-27 og F-III-2-HM-89;

(d) renser fraksjonen som inneholder proteasene ved affini-tetskromatografimetoden;!

(e) fører den affinitetskromatografisk rensede fraksjon;

fra trinn (d) gjennom en kolonne fylt med en 'gelionebytter

I og adsorberer proteasene på denne; j

i (f) eluerer proteasene ved konsentrasjonsgradientmetoden med ammoniumsulfat og får fraksjoner som hver inneholder proteasen F-III-l-HM-27 eller F-III-2-HM-89; og :

1

•: i

: i

(g) avsalter fraksjonene som inneholder proteasene.

i
5. Fremgangsmåte ved fraksjonert fremstilling av fibrino- j lytisk aktivt enzym-materiale som hovedsakelig omfatter i protease F-O-HM-45, F-I-l-HM-54, F-I-2-HM-15, F-II-HM-64 eller en blanding av F-III-l-HM-27 og F-III-2-HM-89, ij karakterisert ved at man j

(a) ekstraherer metemarkvev med et vandig ekstråksjons-middel og får en ekstraktløsning inneholdende proteasene;

i (b) tilsetter et polart organisk løsningsmiddel til ekstrakt- løsningen og får utfellinger inneholdende proteasene;

(c) fraksjonerer utfellingene ved anionebytterkromatografi i 5 fibrinolytisk aktive fraksjoner som hver inneholder minst en av proteasene; j i

(d) utsalter hver av fraksjonene og får utfellinger som inneholder proteasene; i

(e) oppløser utfellingene i en pufferløsning og får en løs-ning; j

(f) gelfiltrerer løsningen; og I

I (g) avsalter og konsentrerer den gelfiltrerte løsning ved ultrafiltréring.

i