JPS5963184A - 新規なプロテア−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なプロテアーゼＦ　−１［−ＨＭ−２７
’Ｆ’−Ｔ−ＴＪｕ−ｃＡｖ　　Ｔ　　ｒｔｕｚ−、、
−−−１［−ＨＭ−６４に関する。これらの４種の新規
酵素は、ミミズに水性溶媒を加えて適当な時間、適当な
温度に保持して抽出を行い、抽出液をそのまま又は適当
な時間、適当な温度に保持したのち濃縮又は乾燥したの
ち゛吸着剤、極性有機溶媒、塩折、限外ｒ過、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロ
マトグラフィー又は疎水的クロマトグラフィーのいずれ
か又はそれらの組合せで処理することにより得ることが
できる。即ち、これらの４種の新規な酵素はミミズ由来
のプロテアーゼであり、いずれも線維素溶解活性（以下
線溶活性と称する。）を有する。

新規なプロテアーゼＦ−１１［−ＱＭ−２７は、以下の
理化学的性質を有する酵素である。

Ａ）活性と基質特異性： Ｆ−１１［７ＨＭ−２７は、フィブリン塊に対してフィ
ブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を
有し、カゼイン、Ｐ−）ルエンスルホニルー、Ｌ−アル
ギニンメチルエステル塩酸塩（以下Ｔ　ＡＭ　ｅと称す
る。）およびＮ−α−Ｐ−）シルーＬ−リジンメチルエ
ステル（以下ＴＬＭｅと称する。）に作用する。然し、
Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラこンメチルエステル（以下Ｂ
ＡＭｅと称する。）およびＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシ
ンエチルエステル（以下ＢＴＥｅと称する。）にはほと
んど作用しない。

■　フィブリン分解活性はＡｒｃｈ　、　Ｂｉｏｐｈｙ
　、　、　４０　：３４６（１９５２）にＴ　、Ａｓ　
ｔ　ｒｕｐらが記載したのと類似の方法で測定した。凝
固可能性蛋白が０．１５％になるようにフィブリノーゲ
ンを０．０１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１７Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解後１．０ｍｌを直径８０闘
の、殺菌シャーレに流し込み、トロンビン溶液（２０ｕ
　／ｍｌ、　）を０５ｍ１加え混和し、蓋をして室温に
て］時間放置する（標準フィブリン平板）。被検酵素液
０．０３ｍ７を標準フィブリン平板上に垂直に滴下し、
濾紙を蓋の間に挾み、１０分間放置後３７℃の恒温器に
入れて１８時間反応させる。このフィブリン塊のフィブ
リン分解活性（線溶活性）は標準フィブリン平板上にで
きた溶解部分の長径と短径とを測り、その積（−）をも
って表示した。

■　プラスミノーゲン活性化活性は、プラスミノーゲン
（シグマ社製）　５　ｕ／ｍｌのもの１ｏμｔ、被検酵
素水溶液２０μｚ、−０，０１Ｍ塩化す）　ＩＪウムを
含む０１７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，８）　３０μＬを
混和し３７℃、１０分間放置したのち、この反応液の０
．０３ｍ７をプラスミノーゲンフリーのフィブリン平板
（マイルズ社製品）に垂直に滴下し、３７℃、１８時間
反応させ、溶解部分の面積を測定した値（−でもって表
示する）を（Ａ）とし、同じように反応系中のプラスミ
ノーゲンのかわりに０１７Ｍホウ酸緩衝液１０μｔを用
いたもので同じように測定して得られた値を（Ｂ）とし
、プラスミノーゲン活性化活性は（Ａ）　−（Ｂ）で表
示した。

■　カゼインの加水分解活性はＪ　、　Ｇｅ　ｎ　、　
ｐｈｙｓｉｏｌ、。

３０：２９１（１９４７）にＭ、Ｋｕｎｉｔｚが記載し
たのと類似の方法で測定した。１５％ミルクカゼイン（
メルク社製）のリン酸緩衝液（０，ｉＭ　、　Ｉ）Ｈ８
，Ｏ）溶液１ｍＡに一被検酵素水溶液１ｍｔを加え、３
７℃で３０分間反応させた後、０．４Ｍ）！ＪクロルＭ
２、　Ｏｍｔを加えて反応を停止させたのち、１５分間
インキュベートし、４０００ｒｐｍ、１５分間で遠心分
離し、その上清液をとり波長２８０　ｎｍにおける吸光
度を測定した。カゼイン溶液、トリクロル酢酵、被検酵
素水溶液の順に加えて同様に操作したものを対照とし、
活性単位をＫｕｎｉｔｚ単位で表わした。

■　ＴＡＭｅの加水分解活性はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

１９：４１（１９７０）に記載の方法により測定した。

０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ１４８．０　）　５０ｍＡ
に１９．７　ｍｆのＴ　Ａ　Ｍ　ｅを溶解させ、このＴ
ＡＭｅ溶液３、０　ｍｔと被検酵素水溶液０．１５ｍＡ
を２５℃で反応させ、１分間経過後の波長２４７　ｎｍ
における吸光度を測定した。なお同測定系において酵素
水溶液の代わりに精製水を用いたものを対照とした。活
性単位は１分間に１ＭモルのＴＡＭｅを加水分解すると
きの酵素量を１単位とした。

■　ＴＬＭｅの加水分解活性は前記■Ｔ　Ａ　Ｍ　ｅの
代わりにＴＬＭｅを用い、測定波長２５０　ｎｍを使用
する以外はすべてＴＡＭｅの活性測定法と同じ操作法に
より測定した。活性単位は１分間に１μモルのＴＬＭｅ
を加水分解するときの酵素量を１単位とした。

■　ＢＴＥｅの加水分解活性はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９：３１（１９７−０）に記載
の方法により測定した。

メタ／−ル３０ｍｔＫ　ＢＴＢｅ　１５．’ｌｖを溶解
させ、これに精製水５０ｍＡとＯ，’ｌ　Ｍ　）　ＩＪ
ス塩酸緩衝液（、ｐＨｓ、ｏ　）　４ｅ＋７ｒｎｔを加
えて得たＢＴＥｅ溶液３０ｒｒ＋７．と酵素水溶液０．
１５ｒｒｉｔを２５℃で反応させ、１分間経過後の波長
２５６　ｎｍの吸光度を測定した。

なお同測定系において酵素水溶液の代わりに精製水を用
いたものを対照とした。活性単位は゛１分間に１μモル
の１３ＴＥｅを加水分解するときの酵素量を１単位とし
た。

■　Ｂ　ＡＭ　ｅの加水分解活性はＢＡＭｅ　１９．７
７ｎｇを０．ＩＭＦリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０・）５
０ｍＡに溶解した溶液を用い、測定波長２５５　ｎｍを
使用する以外は前記■ＢＴＢｅの活性測定法と同じ操作
法により測定じた。活性単位は１分間に１μモルのＢＡ
Ｍｅを加水分解するときの酵素量を１単位とした。

表−１は本発明の酵素プロテアーゼｐ　−ＩＩＩ　−Ｈ
Ｍ−２７を用い種種の基質に対して得られた結果を要約
して示す。

表−１ Ｂ）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲： フイブリン塊を基質として使用したプロテアーゼＦ−１
［−ＨＭ−２７のフィブリン分解作用の至適ｐＨは図−
１に示したように約８付近である。

又、フィブリン塊を基質としてのｐＩ−１安定範囲は図
−２に示したようにｐＨ４〜１２でほぼ安定である。ｐ
Ｈ安定性は３７℃で６０分間放置した後のプロテアーゼ
Ｆ　−［−ＨＭ　−２７の残存活性を測定することによ
って決定した。

Ｃ〕　作用適温の範囲： ｐＨ７，８のフィブリン塊を用い、種種の温度で２時間
反応させたときのプロテアーゼＦ　−１［−ＨＭ−２７
のフィブリン分解作用を図−３に示した。作用適湿は３
０〜６０℃の範囲内であり、最適温度は約５０〜６０℃
である。

Ｄ）種種の温度による失活の条件ニ ブロチアーゼＦ−１［−ＨＭ−２７をｐＩ−１７，８、
各種の温度で６０分間保温した後・のフィブリン塊のフ
ィブリン分解作用の残存活性を図−４に示した。プロテ
アーゼＦ−１［−）（Ｍ−２７は７０℃で６０分間保湿
することによって完全に失活することが明らかである。

Ｅ）分子量： ２８．０００±２，０００（分子量はセファデックスＧ
−７５によるゲルｆ過法によって測定した。）牛血清ア
ルブミン（分子量：４３，０００）、キモトリプシノー
ゲンＡ（分子量：２５，０００）およびリボヌクレアー
ゼＡ（分子量：１３，７００）を、プロテアーゼｐ−１
［−ＨＭ−２７の分子量決定の標準物質として使用した
。

Ｆ）紫外線吸収スペクトル： 吸収極大は２８０　ｎｍ付近に、吸収極小は２５０ｎｍ
付近に“存在する。

Ｇ）等電点： ＰＩ＝３．７±０１ Ｈ）阻害剤の影響ニ プロテアーゼＦ−１［−ＨＭ’−２７のフィブリン塊の
フィブリン分解活性に対する種種の酵素阻害剤の影響を
検討した。即ち各種の阻害剤水溶液（４ｖｒｙ／ｍｌ　
）　２０　ｐＨをプロテアーゼＦ　−１［−’）（Ｍ−
２７水溶液（０，００８４Ａ２″ｎｍ／ｍｔ）８０μｔ
と混合し、３７℃で１０分間保温した後１反応液３０μ
ｌをとりフィブリン塊のフィブリン分解活性を測定した
。その結果を表−２に示した。

表−２ 表−２よ゛り明らかなようにプロテアーゼＦ−１［−Ｈ
Ｍ−２７はセリン試薬のジフルオロホスフェート、ＳＨ
試薬のＮ−エチルマレイミド、プロテアーゼ■害剤のリ
マ豆トリプシンインヒビター、大豆トリプシンインヒビ
ター、ペプスタチン、ロイペプチンおよびトラジロール
（商品名バイエル社製品以下同じ）によって完全に阻害
され、キモスタチンおよびイプシロン−アミノカプリン
酸によりある程度阻害され、卵白トリプシンインヒビタ
ーおよびトランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサ
ンカルボン酸ｔ−ＡＭ　ＣＨＡと略称する。）によって
かなり阻害され、る結果を示した。しかしながら二価陽
イオンキレート化剤であるＥＤＴＡ　、アンチパインは
活性を阻害しなかった。

次に、新規なプロテアーゼＦ−１’−ＨＭ−５４。

Ｆ−ｉ−ＨＭ−１５およびＦ−Ｉ［−ＨＭ−６４の各各
の理化学的性質についてはプロテアーゼＦ−１１［−Ｈ
Ｍ−２７、の項に記載した測定法と同一の方法にヨリ測
定した。以下にこれらの３種のプロテアーゼの理化学的
性質を列記する。

Ａつ活性と基質特異性： Ｆ−Ｉ−ＨＭ−５４，Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５およびＦ−■
−ＨＭ−６４は、いずれもフィブリン塊に対してフィブ
リン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有
し、カゼイン、　ＴＡＭｅおよびＢＴＥｅに作用する。

然し、Ｂ　ＡＭ　ｅおよびＴＬＭｅにはほとんど作用し
ない。これら３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ　−ＨＭ−
５４、Ｉ”−Ｉ　−ＨＭ−１５およびＦ−ｉ−１−ＩＭ
−６４の種種の基質に対する作用活性を表−３に示した
。

Ｂ′）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲：３種の新規プロ
テアーゼＦ−Ｉ　−１４Ｍ−５４、Ｆ−１−ＨＭ−１５
およびＦ−’ｌｌ−ＨＭ−６４の至適ｐＨおよび安定ｐ
Ｈ範囲は図−５〜ＩＯＫそれぞれ示した。即ちプロテア
ーゼＦ　−■−１−ＩＭ−５４（図−５）およびＦ−Ｉ
−ＨＭ−１５（図−６）の至適ｐＨはそれぞれ８〜１０
付近にあり、プロテアーゼＦ−ｎ’−６４（図−７）の
至適ｐＨは７〜８付近にある。そしてプロテアーゼＦ−
Ｉ　−ＨＭ−５４（図−８）及びＦ−１，−１−ＩＭ−
１５（図−９）のｐＨ安定範囲はｐＨ４〜１２でほぼ安
定であり、プロテアーゼＦ−１１−ＨＭ−６４（図−１
０）のｐＨ安定範囲はｐＨ５〜１２でほぼ安定である。

Ｃ′）作用適温の範囲： ３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４，Ｆ−１−
ＨＭ−，１５およびＦ−１−ＨＭ−６４の作用適温の範
囲は図−１１〜１３にそれぞれ示した。即、ちプロテア
ーゼＦ−１−ＨＭ−５４・（図−１１）、Ｆ−Ｉ−ＨＭ
−１５（図−１２）およびＦ−Ｉ［−ＨＭ−６４（図−
１−３）の３種の酵素はいずれも作用適温が３０〜６０
℃の範囲内であり、最適温度は約５０〜６０℃である。

Ｄつ種種の温度による失活の条件： ３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４、Ｆ−ｌ　
−Ｉ−ＩＭ−１５およびＦ　−Ｉｆ　−１−ＩＭ−６４
のｐＨ７，８における各温度における失活の状況は図−
１４〜１６に示した。プロテアーゼＦ−Ｉ−Ｉ（Ｍ−５
４（図−１４）、Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５（図−１５）およ
びＦ−ＩＩ−ＨＭ−６４’（図−１６）のいずれも７０
℃で６０分間保温することによって完全に失活すること
が明らかである。

Ｅ／）分子量ニ プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４の分子量は２２．００
０±２，０００； Ｆ−１−ＨＭ−１５の分子量は２１，５００±２，００
０；Ｆ　−■−ＨＭ、：６４の分子量は２３．００’０
±２，０００である。

ｐ／）紫外線吸収スペクトル： プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４、Ｆ−Ｉ−ＨＭ　−１
５及びＦ−１１−ＨＭ−６４の吸収極大はいずれも２８
０　ｎｍ付近にあり、吸収極小はいずれも２５０ｎｍ何
近にある。

Ｇつ　等電点 プロテアーゼＦ−Ｊ−１胴−５４の等電点はｐＩ＝４０
±０１；プロテアーゼＦ’−Ｊ　−ＨＭ−１５の等電点
けｐＩ　＝　３．９±０１；プロテアーゼＦ−１＋−）
ＩＭ−６４の等電点けｐＩ−３，８±０１である。

ＩＩ′）阻害剤の影響 前記Ｆ−■−ＨＭ−２７の同項の測定法において、２８
００ｍ Ｆ　−Ｔｆｆ　、−ＨＭ　−２７の水溶液（０，００８
４／ｍｔ）の代りにプロテアーゼＦ−Ｉ　−ＨＭ−５４
水溶液（００６］Ａ２８ｏｎｍ／ｍｔ）；プロテアーゼ
Ｆ−Ｉ−ＨＭＡ　２８０　ｎ　ｍ −１５水溶液（０，０６１／ｍｌ　）　；プロテア−’
　　Ａ２ａｏｎｍ ゼＦ４−ＨＭ７０８水溶液（０，０２６７ｍｔ　）のそ
れぞれの各酵素水溶液８０μｔを用い、そのほかは同じ
ように操作してプロテアーゼＦ−１−ＨＭ−５４、Ｆ−
Ｉ−ＨＭ−１５、Ｆ−１１−ＨＭ−６４に対する各種阻
害剤の影響を測・定した。その結果を表−４に示した。

表−４より明らかなように、プロテアーゼＦ−１−ＨＭ
−５４は、リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロ
ホスフェートおよびＮ−エチルマレイミドによって完全
に阻害され、大豆トリプシンインヒビター、キモスタチ
ンオヨヒトランス−４−（アミンメチル）シクロヘキサ
ンカルボン酸には若干阻害されるが、ＥＤＴＡ　、卵白
トリプシンインヒビター、ペプスタチン、アンチパイン
、トラジロールおよびイプシロン−アミノカプロン酸に
は阻害されなかった。

プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５はリマ豆トリプシンイ
ンヒビター、ジフルオロホスフェートおよびＮ−エチル
マレイミド−によって完全に阻害され、　ＥＤＴＡ　、
卵白トリプシ、ンインヒビター。

ヘフスタチン、アンチパイン、キモスタチン。

トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボ
ン酸およびイプシロン−アミノカプロン酸にはある稈度
阻害されるが、トラジロールには阻害されなかった。プ
ロテアーゼＦ　−ＩＩ　、）！Ｍ−６４は、リマ豆トリ
プシンインヒビター、ジフルオロホスフェート、Ｎ−エ
チルマレイミトオよび大豆トリプシンインヒビターによ
って完全に阻害され、アンチパインにより若干阻害され
；卵白トリプシンインヒビター、ペプスタチン、キモス
タチン、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサ
ンカルボン酸、トラジロールおよびイプシロン−アミノ
カプロン酸によってかなりの程度阻害されるが、ＥＤＴ
Ａにより阻害されなかった。

本発明の新規なプロテアーゼＦ−１［−ＨＭ−２７Ｆ−
Ｉ−ＨＭ−５４Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５およびＦ−［’−Ｉ
−ＩＭ’−６４の４種の酵素は前記したようにいずれも
優ぐれたフィブリン塊のフィブリン分解活性を有し、ま
たプラスミノーゲン活性化活性を有する。即ち、本発明
の４種の新規プロテアーゼはミミズから抽出して得た安
全な新規酵素であり、優ぐれた線溶活性を有する効果を
通して次に示す臨床効果が期待される。

一般に酵素により線維素原から転化された線維素は、血
栓症および塞栓症発症の重要な原因の一つである。本発
明の４種の新規プロテアーゼは、前記の活性作用により
末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、冠動脈閉塞症、心筋硬塞
症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症、硝子体出血、前
房出血等の予防ならびに治療効果が期待される。

更に制癌剤との併用により癌に対する併用効果も期待で
きると共に、輸血の、際の抗凝固剤として、又血管手術
における縫合線の塞栓形成防止、または血液透析におけ
る動静脈シャントの長期機能維持にも効果が期待される
。

次に本発明の各種新規プロテアーゼの製法。

分離法、精製法は実施例にて詳細に説明する。

実施例１゜ （１）　　ミミズ凍結乾燥粉末Ｉ　Ｋｇに１０ｔの０．
１％安　。

息香酸ナトリウムを含む０９％塩化ナトリウム水溶液を
添加し、３０℃で７２時間攪拌抽出したのち、ｆ過し、
残渣を３ｔの０．１％安息香酸ナトリウム、を含む０．
９％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、抽出液と洗浄液と
を合した清澄抽出液（フィブリン塊に対するフィブリン
分解活性は１０倍希釈−で４５０−／ｍｌ　）、　１３
ｔを得た。この抽出液を限外濃縮して液量を０７１ｔと
し、これにエタノール０７１ｔを加えて沈澱分別後のｒ
液に終濃度でエタノール濃度が８０％になるようにエタ
ノールを添加し、得られた沈澱をさらにエタノールで洗
浄後、真空乾燥し、乾燥粉末４２グを得た（このものの
フィブリン塊に対するフィブリン分解活性は１３２２７
１１１Ｈ／ｍｇであった。）。該粉末を精製水］、　Ｏ
ＯＯｍＡに溶解し、これをＤＥＡＲ−セルロファイン（
チッソ株式会社製品）カラムクロマトグラフィーにて処
理し図−１７に示す様に新規なプロテアーゼを含むＦ−
１−］。

］Ｆ−Ｉ−２、Ｆ−１１、Ｆ−Ｉｆｆの４分画を得た。

（２）それぞれの画分を硫安０．６飽和塩析後、得られ
た沈澱を少量の１０　ｍＭ　ＩＪリン酸緩衝液ＰＨ８０
）に溶解し、セファクリルＳ　−２００によるゲルｆ過
処理、ウルトラフィルトレージョンによる脱塩濃縮処理
した後、凍結乾燥することによって、Ｆ−Ｉ−１分画０
．２０９ｆ、Ｆ−■−２分画０．４２０Ｓ’、Ｆ　−Ｉ
Ｉ分画０．８７９ｆ、Ｆ−７１）分画１，０７０Ｓ’の
精製プロテアーゼを得た。これら各分画のフィブリン塊
に対するフィブリン分解活性はＦ−Ｉ−１が１５２００
ｍＡ／ｍＶ　、　Ｆ　−１−２が１２４００　ｍＡ／”
？　、　Ｆ　−Ｉｌが９２９０ｍａ／■、Ｆ−１［が１
７６２０−／■であった。

実施例２ 実施例１−（１）と同一の方法によりＦ−１−１分画、
ｐ−１−ｚ分画、Ｆ−，１１分画及びＦ−１１Ｉ分画を
得たのち、Ｆ−Ｉ−１分画及びＦ−Ｉ−２分画のそれぞ
れを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，ｏ　）で平衡化し
たヘキシル−セファロースカラムに通液し、活性区分を
吸着せしめた後、同緩衝液で１０繭から２００ｒｎＭの
濃度勾配にて活性区分の溶出を行い得られた活性区分を
集め、更にセファデックスＧ−７５のゲルｒ過を行うこ
とによりポリアクリルアミドゲル電流泳動として単一な
精製品のＦ−Ｉ−ＨＭ−５４及びＦ−Ｔ−ＨＭ−１５を
得た。Ｆ−ＩＩ分画は硫安０３飽和濃度にて平衡化した
トヨバールＨＷ−５５（東洋ソーダ製品）カラムに通適
し、活性画分を吸、着せしめ、硫安０３〜０１飽和の濃
度勾配で溶出を行ない、活性区分を集め脱塩し、このも
のを１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化し
たヘキシル−セファロースカラムに通液し、活性区分を
吸着せしめた後、同緩衝液で１０ｍＭから２００ｍＭの
濃度勾配にて活性区分の溶出を行ない、活性区分を集め
、セファデックスＧ−７５でゲルｒ過を行いディスク電
気泳動において単一な精製品のＦ−Ｉ［−ＨＭ−６４を
得た。Ｆ−■分画は１０　ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨｓ、ｏ　）にて平衡化した卵白トリプシンインヒビ
ター（シグマ社製品）セファロースアフィニティ担体カ
ラムに通液し、活性画分を吸着せしめた後、１Ｍ食塩を
含む同緩衝液及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（１）Ｈ５，０）
で洗浄を行なった後、０．２Ｍアルギニンを含む０．１
Ｍ、）リス塩酸緩衝液（ｐ）（ｌ　ｏ、ｏ　）にて活性
画分を溶出することによりポリアクリルゲル電気泳動に
おいて単一な精製品Ｆ−１［−ＨＭ−２７を得た。

【図面の簡単な説明】

図−１〜図−４は、フィブリン塊に対するフィブリン分
解活性でみた新規プロテアーゼＦ−１１［−ＨＭ−２７
の至適ｐＨ，ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性をそ
れぞれ示した。なお至適ｐＨ及び作用適温の場合は相対
活性（％）でｐＩ−１安定性は３７℃で６０分放置した
後のプロテアーゼＦ−Ｎ−ＨＭ−２ｖの残存活性（％）
で示し、湿度安定性の場合は、各温度で６０分間保温−
した後のプロテアーゼＦ−Ｉ［−ＨＭ−２７の残存活性
（％）でそれぞれ表示した。 図−５、図−８、図−１１及び図−１４は、フィブリン
塊に対するブイプリン分解活性でみた新規プロテアーゼ
Ｆ−１−ＨＭ−５４の至適ｐＨ５ｐＨ安定性、作用適温
及び温度安定性をそれぞれ示した。図−６、図−９、図
−１２及び図−１５は、フィブリン塊に対するフィブリ
ン分解活性でみた新規プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５
の至適ｐＨ、ｐＨ安定性、作用適湿および温度安定性を
それぞれ示した。図−７、図−１０、図−１３及び図−
１６は、フイブリ−ン塊に対するフィブリン分解活性で
みた新規プロテアーゼＦ　−ＩＩ　−ＨＭ−６４の至適
ｐＨ、ｐＨ安定性、作用適温および温度安定性をそｈぞ
れ示した。そして図−１及び図−５〜図−７中○印はリ
ン酸緩衝液を・印はトリス−グリシン緩衝液を表わし、
図−２及び図−８〜図−１０中の○印は酢酸緩衝液を、
・印はリン酸緩衝液を、Δ印はトリス−グリシン緩衝液
をそれぞれ表わす。 図−１７はミミズ抽出液をアルコール沈降処理した後、
ＤＥＡＢ−セルロファインクロマトグラフイー処理して
得られるフィブリン塊に対するフィブリン分解活性でみ
た本発明の新規プロテアーゼの分画パターンを表わすも
のである。 特許出願人　　天軒製薬株式会社 同　　　　　　　美　　　原　　　　　恒図　−１ ５７８９１０ 図　−２ ４６８１０１２ 図−３ ３０４０５０６０７０ 図　−４ ３０４０５０６０７０ 図−５ ６７８９１０ 図−６ ６，７８９１０ 図−７ ６７８９１０ 図−８ ４６８１０１２ 図−９ ４６８１０１２ 図−１０ ４６８１０１２ 図　−１１ 温度（０Ｃ） 図−１２ ３０４０５０６０７０ 温度（０Ｃ） 図　−１３ 温度（０Ｃ） 図−１４ ３０４０５０６０７０ 温度（０ｃ） 図−１５ ３０４０５０６０７０ 温度（０Ｃ） 図　−１６ ３０４０５０６０７０ 温度（０Ｃ） 手続補正書 １事件の表示 昭和５７年特許願第１７’　３６６９号２発明の名称 新規なプロテアーゼ ３　補正をする者 事ｆ′１伏の関係　特許出願人 （３・　　所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号４
代　理　人 〒１０４東京都中央区銀座６丁目４番４．ｔ３土屋ビル
５階７袖正０対龜明細書全文及び図面 （１）明細書全文を別紙のとおシ訂正します。 （２）図面全別紙のとおシ訂正します。 全文補正明細書 １、発明の名称　　新規なプロテアーゼ２、特許請求の
範囲 Ｅ　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状プロ
テアーゼｌ−ＩＩＩ　−１−１１，’、４−２７゜Ａ）
活性及び基質特異性 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−トルエンスルホニル
−Ｌ−フルギニンメチルエステル塩酸塩、Ｎ−α−ｐ−
）ンルーＬ−リジンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−ピログ
ルタミル有しない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 フィブリン塊を基質として使用したときのフィブリン分
解作用の至適］〕Ｈ約８付近、ｐＨ安定範囲５〜１２゜ Ｃ）作用適温範囲゛ ｐ、Ｈ７，＋３のフィブリン塊に対してのフィブリ／分
解反応における作用適温３０〜６０℃、最適温度約５０
’Ｃ６ Ｄ）失活条件 ７０℃に６０分間保持すると完全て失活する。 Ｅ）分子量 ３２．４００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル。 ２８０ｎｍ付近に吸収極太、２５Ｏｎｍ　　付近に吸収
極小を示す。 Ｇ）等電点 ｐ工＝３．６±０．１ Ｈ）阻害剤の影響 フ′イブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆
トリプ７ンインヒビター、ジフルオロホスフエート、大
豆トリプシンインヒビター、アンチパイン、ロイペプチ
ン及ヒｌ−ラジロールにより完全に阻害され、卵白トリ
プシンインヒビター及びトランス−４−（アミノメチル
）シクロヘキサンカルボン酸によりかなり阻害され、ε
−アミノカプロン酸、キモスタチン及ヒ。ペプスタチン
によりある程度阻害されるが、エチレＣ４８，６１チ、
Ｈ６，５８係、Ｎ１４．７５％。 ８　２．０３係。 ２　以下の理化学的性質を有する白色無定形物１」し°
ロチアーゼＦ−氾−ＨＭ−豆。 Ａ）活性λ互基質特異性 フィブリン塊に対するフィブリン分解組、プラスミノー
ゲン活性化作用、カゼイン、ｐ　−トルエンスルホニル
−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−チロシ１工Ｎ−ベンゾイルーＬ−アラニンメ
チルエステル及びＮ−α−ｐ　−）　’／ルーＬ−リジ
ンメチルエステル塩酸塩に対してはほとんど作用を示さ
ない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 フィブリン塊を基質として使用したときのフイブリン分
解作用の至適ｐＨ約８〜１０　、　ｐＨ安定範囲４〜１
２ Ｃ）作用適温範囲゛ ｐＨ７，８のフィブリン塊に対してのフィブリン分解反
応に訃ける作用適温３０〜６０℃、最適温度約５０〜６
０℃。 Ｄ）失活条件 ７０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 Ｅ）分子量 ２４’、５００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル ２８０　ｎｍ伺近に吸収極大、２５０ｎｍ　　付近に吸
収極小を示す。 Ｇ）等電点 ｐＩ　　＝　　４．１±０．１ Ｈ）阻害剤の影響 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプ７ンインヒビター、ジフル第１ｊホス７エー１　、
太ｕｌ−ＩＪ７’シンインヒビター、アンチパイン、キ
モスタチン、ロイペプチン及びトラジロールにより完全
に阻害され、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘ
キサンカルボン酸及びε−アミノカプロン酸によってが
なり阻害され、ペプスタチン、Ｎ−エチルマレイミド及
び卵白トリプシンインヒビターによりあるＪ）元素分析
値 ８２．０７チ。 ３　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状グロ
テアーゼＦ−１”−ＨＭ−５４゜Ａ）活性及び基質特異
性。 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用、７°ラスミ
ノ一ゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−トルエンスルホニ
ル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ−ベン
ゾイル−Ｌ−チロノンエチルエステルに対する強い作用
を有するが、Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ　−ＩＪ　シンメ
チルエステアラニンメチルエステル及びＨ−Ｄ−バリル
−Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲。 フィブリン塊を基質として使用したときのフ定範囲４〜
１２゜ Ｃ）作用適温範囲 ｐＨ７，８のフィブリン塊に対してのフィブリン分解反
応における作用適温３０〜６０℃、最適温度約５０〜６
０℃。 Ｄ）失活条件 ７０℃３６０分間貫丼すると完全に失活する。 Ｅ）分子量 ２７　、５００±２．Ｏ’００゜ Ｆ）紫外線吸収スペクトル ２８０　ｒａｎ付近に吸収極大、２５０　ｎｍ　　付近
に吸収極小を示す。 Ｇ）等電点 ｐＩ　　＝　　４．０±０．１゜ Ｈ）阻害剤の影響８ フィブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプ７ンインヒビター、ジフルオロホスフェート及びＮ
−エチルマレイミドによってシンインヒビターによって
がな　Ｊ１宙　れ、キモスタチン、トランス−４−（ア
ミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸及び卵白トリプ
ンンインヒビターによっである程度阻害されるが、エチ
レンジアミン四酢酸ジナトリウム、ペプスタチン、アン
チパイン、トランジオール及びε−アミノカプロン酸で
は阻害されない。 Ｊ）元素分析値。 Ｓｌ、３４％。 ４　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状グロ
テアーゼＦ−１−ＨＭ−１５゜−二一一− Ａ）活性及び基質特異性゛ フィブリノ塊に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化り礼　カゼイン、ｐ−トルエンスルホニル
−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−ｆロンンエチルエステルρ汀ナエ鬼公作用を
有するが、Ｎ−α−ｐ　−）　フルーＬＩＪ−ジンメチ
ルエステＢ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 フィブリン塊を基質として使用したフィブリン分解作用
の至適ｐＨ約８〜１０　、　ｐＨ安定範囲４〜１２゜ Ｃ）作用適温範囲。 ｐＨ７，８のフィブリン塊に対しての作用適温３０〜６
０℃、最適温度約５０〜６０℃。 Ｄ）失活条件 ７０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 Ｅ）分子量 ２７．０００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル。 ２８０　ｎｍ付近に吸収極太、２５０　ｎｍイ」近に吸
収極小を示す。 Ｇ）等電点 ｐＩ　　＝　　３．９±０．１ Ｈ）阻害剤の影響。 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェート及びＮ
−エチルマレイミドによって完全に阻害され、卵白トリ
ズシンインヒビターチパイン、大豆トリグシンインヒビ
ター、ペプスタチン、ε−アミノカプロン酸、キモスタ
チン、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム及びトラン
ス−４−アミノメチルシクロヘキサン力Ｊ）元素分析値
： ８２．０５％。 Ｚイブリン塊を基質として使用したときのるＯ Ｅ）分子量 Ｇ）等電点 オロホスフエート、Ｎ−エチルマレイミド及害されない
。 Ｊ）元素分析値 Ｃ４８，２３％、　　Ｈ６，５３係、　　Ｎ　１５．９
３係。 用しない。 イブリン分解作用の至適ｐＨ約８付近、■）１１安定Ｅ
）分子量 Ｇ）等電点 Ｊ）元素分析値。 ３、発明の詳細な説明 本発明は、ミミズ例えばルムブリカス・ルベラス（Ｌｕ
ｍｂｒｉｃｕｓ　ｒｕ’ｂｅ１℃ｕｓ　）から油出され
る新規なタンパク分解酵素に関するものである。さらに
詳しくいえば、本発明は、ミミズの抽出′吻を精製する
ことにより得られ、線岬素溶屏活゛性（以下線溶活性と
略す）を示すことで特徴づけられる６種の白色無定形粉
末の新規なグロテアーゼ、すなわちグロテアーゼＦ−Ｉ
ＩＩ−１−１（Ｍ−２７、Ｆ−０−ＨＭ−４５、Ｆ−Ｔ
１−ＨＭ−５４、Ｆ　−１−ＨＭ　−１５、ｌ−１１１
−１ｌ−Ｈ及びＦ−１１１−２−ＨＭ　−８９に関する
ものである０ 本発明の酵素は、例えばミミズに水性溶媒を加えて適当
な時間、適当な温度に保持して抽出を行い、抽出液をそ
のまま又は適当な時間、適当な温度に保持したのち濃縮
又は乾燥したのち吸着剤、極性有機溶媒、塩析、限外濾
過、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水的クロマト
グラフィーのいずれか又はそれらの組合せで処理するこ
とにより得ることができる。すなわち、これらの６種の
新規な酵素（ｄミミズ由来のグロテアーセであり、いず
れも線溶活性を有する。これらの酵素は、それぞれ分離
に際し第１７図に示すように別々のフラクンヨ／中に分
配されており、そのフラク／ヨンによって区別されてい
る。 本発明の酵素例えばグロテアーゼＦ−１１１−１−ＨＭ
−２７は以下に示す理化学的、性質を測定することによ
り、同定される。 Ａ）活性と基質特異性 Ｆ−Ｉｌｌ−１−ＨＶＩ−２７は、フィブリ／塊に対し
てフィブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化
活性を有し、カゼイン＋ｐ−トルエ：／スルホニル− （以下ＴＡＭｅと称する。）、Ｎ−α−　ｐ−トノルー
Ｌーリジンメチルエステル塩酸塩（以下ＴＬＭｅと称す
る。）、Ｌ−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（、通常．テストチーム
Ｓ−２　４　４　＝１発色基質といいｄ＜−化学薬品工
業社製品である。以下単にＳ−’２４４４と称する。）
及びＨ−Ｄ−バリル−１．＋ーロインル〜　Ｌ−リジン
−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（］ｆｌＪ常、テストチー
ムＳ−２２５１発色基質といい第一化学薬品工業社製品
である。以下単にＳ−２２５１と称する。）に作用する
。しかし、Ｎ−ベンゾイル−　Ｌ−アラニンメチルエス
テル（以下Ｂ　Ａ　Ｍ　ｅと称スル。）及びＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−チロンンエチルエステル（以下ＢＴＢｅと称
する。）に（はほとんど作用しなかった。 このフィブリン分解活性は、アストラノプ（Ｔ。 Ａｓｔｒｕｐ　）の方法［　ＡｒＣｈ．　Ｂｉｏｐｈｙ
．、　４０，　３４６（　１９５２　）　］と類似の方
法で測定した。すなわち、凝固可能性タンパクが０．１
５％になるようにフィブリノーゲンを０．０１Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０　、　１　７ＭＭホウ酸緩衝液　ｐＨ
　７−８　）に溶解後１０ｒｎｌを直径８０朋の殺菌ノ
ヤーレに流し込み、トロンビン溶液（　２　０　ｕ／ｍ
ｌ　）を０．５蛇加え混和し、蓋をして室温にて１時間
放置する（標準フィブリン平板）。 適当に希釈した被検酵素ｉ’ｆｆｌ　（粉末酵素の場合
は１ｍｙ／ｌｎｌｌの溶液を１凋製したのち、適当に希
釈し７た酵素水溶液）　０．０３ゴを、標準ノイブリン
平板上に垂直に滴下し、ｐ紙を蓋の間に挾み、１ｏ分間
放置後３７℃の恒温器に入れて１８時間反応させる。 このフィブリン塊のフィブリン分解活性（線溶活性）は
、標準ノイブリン平板上にできた溶解部分の長条と短径
とを測り、その積（　ｍＡ　）と希釈倍数を乗じて表示
しだ（水溶液の場合はｍｌ，７　ｍｌ　、粉末の場合は
ｙｉｆｆｌ　／　ｒｎｇで活性単位を表示した）。 また、プラスミノーゲン活性化活性は、プラスミノーゲ
ン（シグマ社製）　５　ｕ　／　ｍｌのもの１０μｌ、
被検酵素水溶液２ｏμｔ、０．０１　Ｍ塩化ナトリウム
を含む０．１７　Ｍホウ酸緩衝液（　ｐＨ　７．８　）
　３０μｔを混和し３７℃．１０分間放置し７たのち、
この反応顯のｏ．ｏ３７＝グラスミノーゲンフリーのフ
ィブリン（マイルズ社製品）平板に垂直にＭｉ　Ｆ　Ｌ
、３７℃，１８時間反応させ、溶解部分の面積を測定し
た値（−でもって表示する）　ｆ：（Ｘ）と１７、同じ
ように反応系中のフリスミノーゲンの代ゎシにｏ、、ｚ
７Ｍホウ酸緩衝ｉ１０μｔを用いたもので同じように測
定して得られた値を（Ｙ）とし、グラスミノーゲン活性
化活性は（Ｘ）　−（Ｙｌで表示した。 次に、カゼイノの加水分解活性ｔよ、クニック（Ｍ、　
Ｋｕｎｉｔｚ　）の方法［Ｊ、　Ｇｅｎ’、　ｐｈｙｅ
ｉｏｌ、。 陳２９１　（１９４７）　〕　　と類似の方法で測定１
−だ。すなわち１．！５％ミルクカゼイ／（メルク社製
、）のり／酸緩ｒ＋ｉｊ／Ｉｆ　（０，１Ｍ　、　ｐ、
Ｈ８，０）溶ｇ　Ｌ　ｍｅに被検酵素水溶ＲＥ　１　ｍ
ｌを加え、３７℃で３（）分間反応させ、０．４ＭトＩ
Ｊクロル酢酸水溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止させ
たのち、１５分間インキュベー１・し、４０００ｒｐｍ
、１５分間で遠心分離し、その上清層にとり波長２８０
　ｎｍにおける吸光度を測定（〜た。カゼイン溶ｌ夜、
トリクロル酢酸水溶液、被検酵素水溶液の順に加えて同
様に操作したものを対照とし、活性単位をクニック単位
で表わした。 次Ｑこ、ＴＡＭｅの加水分解ｌ古注（′↓　［メノソド
・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏ−１０ｇ３’　）　ｊ第１９巻、第４１ペー
ジ（１９７０）に記塩酸緩衝７’ｉｉ（ｐＨ８，０）　
５０ｍｌに１９．７　ｍｇのＴＡＭｅを溶解させ、この
ＴＡＭｅ溶液３．０ｍｌと被検酵素水溶／ｆＬＯ０１５
ＴＬｌを２５℃で反応させ、１分間経過後の波長２４７
　ｎｍにおける吸光度を測定（７た。なお同測定系にお
いて酵素水溶液の代わりに精製水を用いたものを対照と
した。活性単位は１分間に１μモルのＴＡＭｅを加水分
解するときの酵素量を１単位とした。 さらに、ＴＬＭｅの加水分解后［生は前記■Ｔ　Ａ　ｌ
ｔｌ！　８の代わりにＴＬＭｅを用い、測定波長２５０
　ｎｍを使用する以外はすべてＴＡＭｅの活性測定法と
同じ操作法により測定した。そして活性単位は１分間に
Ｊ、０のΔΔ２５０　ｎ＋ｎ　　を生ずるときの酵素量
を１単位とした。 さらに、ＢＴＥｅの加水分解活性は、「メツノドイン・
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｑｚｙ−
ｍＯｌｏｇｙ　）　Ｊ第１９巻、第３１ページ（１９７
りに記載の方法によシ測定した。すなわち、メタノール
３０ｍ１にＢＴＥｅ　１５．７ｍｆを溶解させ、これに
ｉｓ水を加えて５０ｒｎｅとし、さらに帆ＩＭＦリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）　４６．７ｍを加えて調製した
ＢＴＥｅ溶液３．０ｍｌと酵素水溶液０．１５ｍ１を２
５℃で反応させ、１分間経過後の波長２５６ｎｍの吸光
度を測定（−た。なお同調１１定系において酵素水溶液
の代わシに精製水を用いたものを対照とした。活性単位
は１分間に１μモルのＢＴＥｅを加水分解するときの酵
素量を１単位とした。 また、Ｂ　Ａ　Ｍ　ｅの力ロ水分解活性ｒｔ、Ｉ−，−
ＢＡＭｅ　ｔ（１，７ｍ７を０１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）　５０ｍｌに溶解した溶液を用い、測定波
長２５５ｎｍ全１吏用する以外は、前記ＢＴＥｅの活性
測定法と同じ操作法により測定１．た。活性単位は１分
間に１．０のΔＡ　２５５　ｎｍ　　を生ずるときの酵
素量を１単位とした。 Ｓ　−２４４４の加水分解活性は、「ザジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリ−（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｊ、５ｔｒｙ　
）　Ｊ第２６５巻、第２００５ページ（１９８０）に記
載の方法により測定した。 ｓ　−２４４４を０．１　Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ）リ
ス塩酸緩行液（ｐＨ７，４）に０−５ｍＭの濃度になる
ように溶解し、この基質溶ｏ、１ｒｒＬｅに酵素水溶液
１０μｔを混合し、２５℃で反応させ１分間経過後の波
長４０５　ｎｍの吸光度の増加を測定１．た。酵素単位
は、１分間に１μモルのＳ　−２４４４を加水分解する
ときの酵素量を１単位とした。 次に、Ｓ−２２５１の加水分解活性は、前記のＳ−２４
４４の代わりＫＳ−２２５１を用い、基質濃度を０．１
’ｍＭとする以外は、すべてＳ−２４４４の活性測定法
と同じ操作法により測定ｊ−だ。活性単位は、１分間に
１μモルのＳ〜２２５１を加水分解するときの酵素量を
１単位とした。 第１表は本発明の酵素グロテアーゼＦ−用−１〜ＨＭ−
２７を用い種種の基質に対して得られた結果を要約して
示したものである。 第　　　　１　　　　表 ただし表中のＮ、Ｄ、はＮｏｔ　Ｄｅｔ：ｅｃ：　Ｌｅ
ｄ　　の略でほとんど検出されないことを意味する（以
下、同じ意味である。） Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲： フィブリン環を基質として使用したプロテアーゼＦ−１
１１−１−ＨＭ−２７のフィブリン分解拝用の至適ｐＨ
は第１図に示したように約８付近であった。また、フィ
ブリン環を基質としてのｐＨ安定範囲は第２図に示した
ようにｐＨ５〜１２でほぼどゲ定であった。ｐＨ安定性
は３７℃で６０分間放置した後のプロテアーゼＦ−［１
〜１−ＨＭ−２７の残存活性を１ｌｌｌｌ定することに
よって決定した。 Ｃ）作用適温の範囲 ｐＨ７，８のフィブリン環を用い、種々の温度で２時間
反応させたときのグロテアーゼＰ゛−用−Ｉ−ＨＭ−２
７のフィブリン分解作用の変化を第３図に示した。作用
適温は３０〜６０℃の範囲内であり、最適温度は５０℃
付近でめった。 Ｄ）種々の温度による失活の条件 プｏ７７−セＦ−ｍ　−１−ＨＭ−２７をｐＨ７，８゜
各種の温度で６０分間保温１．た後のフィブリン環のフ
ィブリン分解作用の残存活性を第４図に示した。これよ
りプロテアーゼＦ−ｍ　−１７ＨＭ　−，２７ば７０℃
で６０分間保温することによって完全に失活することが
分る。 Ｅ）分子量 ３２．４００±２．０００　（ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳Ｊ助法によって測定した。）；牛血清アル
ブミ／（分子量：　６７．０００　）　、オブアルブミ
ン（分子量：　４３．０００　）およびキモトリプシノ
ーゲンＡ（分子量　２５，０００　）’ｉプロテアーゼ
Ｆ　　ｉｌｌ　　１−　ＨＭ　−２７の分子量決定の標
準物質として使用した。 Ｆ）紫外線吸収スペクトル 吸収極大け２８０ｎｍ伺近に、吸収極小は２５０　ｎｍ
付近に存在する。 Ｇ）等電点 ｐＩ　＝　３．６±０．１ Ｈ）阻害剤の影響。 プロテアーゼＦ’−１１１−１−ＨＭ−２７のフィブリ
ン環のフィブリン分解活性に幻する種（Ｉｎの祥素阻害
削の影響を検討した。すなわち各種の阻害剤水溶液（４
ｍグ／ｒｎｌ）２０μｔをプロテアーゼＦ−ｍ−１−Ｈ
Ｍ−２’７水溶（ｉ　（２，５μ？／ｌｎｌ　）　８０
１’Ｌと混合し、３７℃で１０分間保畠１．た後、反応
液３゜μｔ２とりフィブリン環のフィブリン分解活性を
測定した。その結果を第２表に示した。 第　　　　２　　　　表 この表よシ明らかなようにグロテアーゼＦ−用＝１−　
ＨＭ−２７は、セリン試薬のジフルオロホスフェート、
グロテアーゼ阻害剤のリマ豆トリプ／ンインヒビター、
大豆トリブ／ンインヒビター、アンチハ・イノ、ロイペ
プチン及びトラジロール（商品名バイエル社製品以下同
じ）によって完全に阻害され、卵白トリプ７ンインヒビ
ター及びトランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサ
ンカルボン酸によってかなり阻害きれるが、イグンロン
ーアミノ力プロン酸、キモスタチン及びペプスタチンに
よりある程度阻害される結果を示した。 しかしながら、二価陽イオンキレート化剤であるエチレ
ンジアミン四酢酸ジナトリウ・ム（以下ＥＤＴＡと略称
する。）及びＳＨ試薬のＮ−エチルマレイミドは活性を
阻害しなかった。 工）アミノ酸組成。 第　　　　３　　　　表 グロテアーセＦ−［［１−Ｌ−ＨＭ−２７の帆２ｍｇ相
当を内部標準のノルロイシンとともにｔ）　、　５　ｍ
ｇに希釈し６Ｎ塩酸を加え、１１０℃で２４時間加水分
解した後、アミノ酸自動分析装置で分析した。 Ｊ）元素分析値゛ Ｃ４８，６１％、Ｉ−Ｔ６．５８％、　　Ｎ　１４．７
５％。 ８　２．０３　　係 次に、白色無定形粉末で新規なグロテアーセＦ−０−Ｈ
Ｍ−４５，Ｆ−Ｉ　　ＢＭ−５４，Ｆ−１−ＨＭ−１５
、Ｆ−ＩＩ−ＨＭ〜６４及びＦ−ＩＩＩ−２−ａＭ−８
９のそれぞすＬの理化学的性質については、グロテアー
ゼ１４゛−ＩＩＩ　−１−ＨＭ−２７の項に記載した測
定法と同一の方法により測定した。以下にこれらの５種
のグロテア〜ゼの理化学的性質を列記する。 Ａ′）活性と基質特異性 ５種の新規プロテアーゼＦ　−０−ｎＭ−ｓ　ｓ　、　
Ｆ−１〜ＨＭ〜５４．Ｆ−１〜ＨＭ−１５、Ｆ　−ＩＩ
−ＨＭ−６４およびＦ−１−２−ＨＭ−８９のイ重々の
基質に対する作用活性を第４表に示した。 Ｆ−Ｑ−ＨＭ−４５は、フィブリン塊に対してフィブリ
ン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し
、カゼイン、ＴＡＭｅ及びＢ　Ｔ　Ｋ　ｅに作用する。 またＳ−２４４４及びＥｌ−２２５１にはごくわずかに
作用するが、ＢＡＭｅ及びＴ　ＬＭｅにはほとんど作用
しない。 Ｆ−１−ＨＭ−５４は、フィブリン分解活性を有し、プ
ラスミノーゲン活性化活性を有し、カゼイン、ＴＡＭｅ
及びＢＴＥｅに作用する。ＴＬＭｅ及びＳ−２４４４に
はわずかに作用するが、ＢＡＭｅ及びＥｌ　−２２５１
にはほとんど作用しない。 Ｆ−１−ＨＭ−１４）は、フィブリン塊に対してフィブ
リン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有
し、カゼイン、ＴＡＭｅ及び１３ＴＥθに作用する。 ＴＬＭｅ及びＳ−２４４’４にはわずかに作用するが、
ＢＡＭｅ及び５−２ｚｓｔにはほとんど作用しなし・。 Ｆ−Ｂ−ＨＭ−６４は、フィブリン塊に対してフィブリ
ン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し
、カゼインに作用し、ＴＡＭｅにはやや作用する。ＴＬ
Ｍｅ及びＳ−２４４４にはわずかに作用し、Ｓ−２２５
１にはごくわずかに作用するが、ＢＡＭｅ及びＢＴＥｅ
にはほとんど作用しない。 Ｆ−１−２−ＨＭ−３９は、フィブリン塊に対してフィ
ブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を
有し、カゼイン、ＴＡＭｅ、ＴＬＭｅ、　Ｓ−２４４４
及びＥｌ−２２５１には作用するが、ＢＡＭｅ及びＢＴ
　’Ｅ、ｅにはほとんど作用しない。 前記に示すとおり、これら５種の新規プロテアーゼＦ−
０−ＨＭ−４５、Ｆ−１−ＨＭ−５４、Ｆ−１−ＨＭ−
１５、Ｆ−１１−ＨＭ−６４及びＦ−Ｉｎ−２−ＨＭ−
８９の基質特異性は若干その活性作用を異にする。前記
の各５種の新規プロテアーゼの各基質に対する加水分解
作用活性の強弱の表現用語は、その酵素単位（＋１／ｆ
ｎｙ　）が１以上のとき作用する。同じく０．１以上１
未満の範囲のときはやや作用する。 同じ（０，０１以上０．１未満の範囲のときはわずかに
作用する。 同じ（０，００１以上帆０１未満の範囲のときはごくわ
ずかに作用する。 同じ（０，００１未満のほとんど検出されないときは第
１表及び第４表中にＮ、Ｄ、と示し、はとんど作用しな
いと表現して使い分けた。 このような基質特異性の活性表現は第１表においても同
じ意味である。 Ｂ／）　　至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：５種の新規プロ
テアーゼＦ−Ｑ−ＨＭ−４５、Ｆ−１−ＨＭ−５４、Ｆ
−１−ＨＭ−，１５、Ｆ−１１−ＨＭ−５４及びＦ−Ｍ
−２−ＨＭ−３９の至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲は＠５図
から第１４図までにそれぞれ示した。すなわち、プロテ
アーゼＦ−０−］：ＪＭ−４５（第５図）、Ｆ−１−Ｈ
Ｍ−５４（第６図）、及びＦ−１−ＨＭ−１５（第７図
）の至適ｐＨはそれぞれ８〜１ｏ付近にあり、プロテア
ーゼＦ−■−ＨＭ−６４（第８図）の至適ｐＨは７〜８
付近にあり、プロテアーゼＦ−１−２＝ＨＭ、８９　（
第９図）の至適ｐＨは８付近にあった。 そシテプロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４ｓ　（第１０図〕
、Ｆ−１＝ＨＭ−５４（第１１図）、Ｆ−ｊ−ＨＭ−１
５（第１２図）及びＦ−１−２−ＨＭ−１３９（第１４
図）のｐＨ安定範囲はｐＨ４〜１２でほぼ安定であり、
プロテアーゼＦ−ト４（Ｍ〜６４（第１３図）のｐＨ安
定範囲はｐＨ５〜１２でほぼ安定であった。 Ｃ／）作用適温の範囲： ５種の新規プロテアーゼＦ−Ｑ−ＨＭ−４５、Ｆ−１−
ＨＭ−５４、Ｆ−１−ＨＭ−１５、Ｆ−１１−ＨＭ−６
４及びＦ−ｍ−２−ＨＭ−８９の作用適温の範囲は第１
５図から第１９図までにそれぞれ示した。すなわちプロ
テアーゼＦ−Ｑ−ＨＭ−４５（第１５図）　１．Ｆ−［
−ＨＭ−５４（第１６図）、Ｆ−１−ＨＭ−１５（第１
７図）、Ｆ−１にＨＭ−６４（第１８図）及びＦ−１１
１−２−ＨＭ−Ｂｇ　（第１９図〕の５種の酵素は、い
ずれも作用適温が３０〜６０℃の範囲であり、最適温度
は約５０〜６０℃であった。 Ｄ／）種々の温度にょろ失活の条件： ５種の新規プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５、Ｆ−１−
ＨＭ−５４゜Ｆ−ｊ−ＨＭ−３５、Ｆ−１１−ＨＭ−５
４及びＦｍ２−ＨＭ−ＢｇのｐＨ７，８における各種温
度で６０分間保温した後のフィブリン塊のフィブリン分
解作用め残存活性第２０図から第２４図までに示した。 プロテアーゼＦ−０−ＨＭ＝４５（第２０図）、Ｆ−１
−ＨＭ−５４（第２１図）、Ｆ−１−Ｈ１φ−１５（第
２２図〕、Ｆ−［−ＨＭ−６４（第２３図）及びＦ−１
−２−ＨＭ−８９（第２４図）　ノイずれも７０　”Ｃ
で６０分間保温することによって完全に失活することが
分る。なお、第１図及び第５図ないし第９図の白丸はリ
ン酸緩衝液、黒丸ばトリス−グリシン緩衝液を表わし、
第２図及び第１０図ないし第１４図の白丸は酢酸緩衝液
、黒山６’ｉ’　　ＩＩ　　ｙ耐Ｉ駆熔・席　　＝々ｉ
φ　Ｌ　　ＩＩ　−ｈ＋　　・・　、・−一一−−を示
す。 Ｅ’）　分子量： 分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より測定した。結果は次のとおりであった。 Ｆ−０−ＨＭ−４５２４，５００±２，０００Ｆ−１−
ＨＭ−５４２７，５００±２．０００Ｆ−１−ＨＭ−１
５２７，０００±２，００ｑＦ−１−ＨＭ−６４２７，
８００±２，０００Ｆ−１−２−ＨＭ−８９：３２，８
００±２．（１００Ｆ／）紫外線吸収スペクトル： プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５、Ｆ−１−ＨＭ−５４
、Ｆ−１−ＨＭ−１５、Ｆ−１１−ＨＭ−６４及びＦ−
１−２−ＨＭ−８９の吸収極太はいずれも２８０ｎｍ付
近にあり、吸収極小はいずれも２５０ｎｍ付近にあった
。 Ｇ’）等電点ニ プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５の等電点はｐ工＝４．
１十〇、、１；プロテアーゼＦ−１−ＨＭ−５４の等電
点はｐＩ’＝４．Ｑ±０．にプロテアーゼＦ−１−ＨＭ
−１５の等電点はｐ工＝３．９±０．１；プロテアーゼ
Ｆ−１−ＨＭ−６４の等電点はｐ工＝３．８上帆１；プ
ロテアーゼＦ−１ｔ−２−ＨＭ−８９の等電点はｐニー
３．５上帆１であった。 Ｈ’）阻害剤の影響： 前記Ｆ−Ｉｆ−１−ＨＭ−２７の場合の測定法において
、Ｆ−１−１−ＨＭ−２７の水浴液（２，５μｇ肩）の
代わりにプロテアーゼＦ−Ｑ−ＨＭ−４５水溶液（２５
μ！ｊ／ｌｄ）　ニブロチアーゼＦｉｌ−ＨＭ−５４水
＠散（１２，５μｇ／ｒｒｄ！、）　；プロテアーゼＦ
−１−ＨＭ−１５水浴＊　（ｉ　２　、５μｇ／／ｒｎ
ｌ）；プロテアーゼＦ−［−ＨＭ−５４水溶液（２５μ
ｂ毎）；プロテアーゼＦ−ｍ２−ＨＭ−８９水溶Ｗ　（
２、５μ、９Ａｎｌ）のそれぞれの各酵素水浴液８０μ
ｅを用い、そのほかは同じように操作してプロテアーゼ
Ｆ−０−ＨＭ−４５、Ｆ−１−ＨＭ−５４、Ｆ−１−Ｈ
Ｍ−１５、Ｆ−［１−ＨＭ−６４及びＦ−１−２−ＨＭ
−８９に対する各種阻害剤の影響を測定した。 その結果を第５表に示した。これより明らかのようにプ
ロテアーゼＦ−’Ｏ−ＨＭ−４５は、リマ豆トリプシン
インヒビター、ジフルオロホスフェート、大豆トリズシ
ンインヒビター、アンチパイン、キモスタチン、ロイペ
プチン及びトラジロールによって完全に阻害され、イプ
シロン−アミノカプロン酸及びｔ−ＡＭＯＨＡによって
かなり阻害され、ペプスタチン、Ｎ−エチルマレイミド
及び卵白トリプシンインヒビターによっである程度阻害
されろか、ＥＤＴＡには全（阻害されなかった。プロテ
アーゼＦ−１−ＨＭ−５４は、リマ豆トリプシンインヒ
ビター、ジフルオロホスフェート及びＮ−エチルマレイ
ミドによって完全に阻害され、ロイペプチン及び大豆ト
リプシンインヒビターによってかなり阻害され、キモス
タチン、ｔ−ＡＭＯＨＡ及び卵白トリプシンインヒビタ
ーによっである程度阻害されろが、ＫＤＴＡ１ペプスタ
チン、アンチパイン、トラシロ豆トリプシンインヒビタ
ー、ジフルオロホスフェート及びＮ−エチルマレイミド
によって完全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター
及びロイペプチンによってかなり阻害され、アンチパイ
ン、大豆トリプシンインヒビター、ペプスタチン、イプ
シロン−アミノカプロン酸、キモスタチン、ＥＤＴＡ及
びｔ−ＡＭＣＨＡによっである程度阻害されるかトラジ
ロールには全（阻害されなかった。プロテアーゼＦ−［
−ＨＭ−５４は、リマ豆トリプシンインヒビター、ジフ
ルオロホスフェート、Ｎ−エチルマレイミド及び大豆ト
リプシンインヒビターによって完全に阻害され、卵白ト
リプシンインヒビター、トラジロール、ペプスタチン、
ｔ−ＡＭＯＨＡ及びキモスタチンによってかなり阻害さ
れ、アンチパイン及びイプシロン−アミノカプロン酸に
よっである程度阻害されるが、ＥＤＴ　Ａ及びロイペプ
チンには全く阻害されなかった。Ｆ−１−２−ＨＭ−８
９はリマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホスフ
ェート、大豆トリプシンインヒビター、アンチパイン、
ロイペプチン及びトラジロールによって完全に阻害され
、ｔ−ＡＭＣＩＡによってかなり阻害され、ペプスタチ
ン、キモスタチン、イプシロン−アミノカプロン酸及び
卵白トリプンンインヒビターによっである程度阻害され
ろか、Ｎ−エチルマレイミド及びＥＤＴＡには全く阻害
されなかった。なお、完全に阻害されろとは、第５表中
の相対活性値か０の場合であり、がなり阻害されろとは
相対活性値が５０係未満であり、ある程度阻害されろと
は相対活性値が５０係以上であり、全く阻害されないと
は相対値が１００の場合と表現を使い分けた。この表現
は前記第２表の場合も同じ意味である。 ／ Ｉ／）　　アミノ酸組成： 第６表　プロテアーゼＦ−Ｑ−ＨＭ−４５のアミノ酸組
成第８表　プロテアーゼＦ−１−ＨＭ−１５のアミノ酸
組成第９表　プロテアーゼＦ−１−ＨＭ−５４のアミノ
酸咀成第１０表　プロテアーゼＦ−［１−２−１−２−
Ｈのアミノ酸組成Ｊ７）元素分析値： １）プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５の元素分析値；０
　４８．３０係 Ｈ６，８４係 Ｎ　　１５．８８係 ８　　２．０７係 ２〕　プロテアーゼＦ−１−ＨＭ−５４の元素分析値；
Ｃ４８，９３係 Ｈ６，６５係 Ｎ’　　１５．９５　　係 ８　　　１．３４　　係 ３）プロテアーゼＦ−１−ＨＭ−１５の元素分析値；Ｃ
４６，１５ｑｂ Ｈ’６．６４係 Ｎ　　　１６．０２　　係 ６　　　２．０５　　係 ４）プロテアーゼＦ−ｎ　−ＨＭ−６’　４０元素分析
値；０　４８．２３係 Ｈ６，５３係 Ｎ　　１５．９３係 Ｓ　　１４３係 ５）プロテアーゼＦ−１−２−ＨＭ−８９の元素分析値
；０　４７．５３係 Ｈ６５５φ Ｎ　　１４．５９チ Ｓ２゜０６係 不発明の新規なプロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ−２７、
ｐ−Ｏ−ＨＭ−４５、Ｆ−１−ＨＭ−５４、Ｆ−１−Ｈ
Ｍ−１５、Ｆ−１１−ＨＭ−６４及びＦ−１１１−２−
ＨＭ−８９の６種の酵素は、前記したようにいずれも優
れたフィブリン塊のフィブリン分解活性を有し、またプ
ラスεノーゲン活性化活性を有することがわかった。す
なわち、本発明の６種の新規プロテアーゼは、不発明者
等がはじめてミミズから抽出、単離して得た安定な新規
酵素であり、優れたｍ溶油性を有する効果を通して次に
示す臨床効果が期待される。 一般に酵素により線維素原から転化された線維素ば、血
栓症及び塞栓症発症の重要な原因の一つである。不発明
の６種の新規プロテアーゼは、前記の活性作用により末
梢動静脈血栓症、肺塞栓症、冠動脈閉塞症、心筋硬塞症
、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症、硝子体出血、前房
出血等の予防ならびに治療効果が期待される。 更に制癌剤との併用により癌に対ずろ併用効果も期待で
きろと共に、輸血の際の抗凝固剤として、又血管手術に
おける縫合線の塞栓形成防止、又は血液透析における動
静脈シャントの長期機能維持にも効果が期待されろ。 次に本発明の各種新規プロテアーゼの製法、分離法、精
製法は実施例にて詳細に説明する。 実施例１ （１）ミミズ凍結乾燥粉末Ｉ　Ｋ９に１０１の０．１　
％安息香酸ナトリウムを含む０．９チ塩化ナトリウム水
溶液を添加し、３０℃で７２時間がきまぜて抽出したの
ち、濾過し、残留分を３４の０．１　％安息香酸ナトリ
ウムを含む０．９　％塩化ナトリウム水ＭＷで洗浄し、
抽出液と洗浄液とを合した清澄抽出ｉ（フィブリン塊に
対ずろフィブリン分解活性は１０倍希釈で４５０ｍＡｌ
　ｍ１２　）　１３１Ｊを得た。この抽出液を限外濃縮
して液量な帆７１４とし、これにエタノール９．７１ｄ
を加えて沈殿分別後のＰ液に終濃度でエタノール濃度が
８０係になるようにエタノールを添加し、得られた沈殿
をさらにエタノールで洗浄後、真空乾燥し、乾燥粉末４
２Ｊを得た（このもののフィブリン塊に対するフィブリ
ン分解活性は１３２２ｙｊ／ｍｙであった。）。該粉末
を精製水１０００−に溶解し、これにＤＥＡＥ−セルロ
ファイン（チッソ株式会社製品）カラムクロマトグラフ
ィーにて処理し第２５図に示すように新規なプロテアー
ゼを含むＦ−０，Ｆ−１−１、Ｆ”−１−２、Ｆ−１１
及びＦ−１の５分画を得た。 （２）それぞれの画分を硫安０．６飽和塩析後、得られ
た沈殿を少量の１０ｍＭリン酸緩衝ｉ　（ｐＨ８，０）
に溶解し、七フアクリルＳ　−２００によろゲル濾過処
理、ウルトラフィルトレージョンによる脱塩譲縮処理し
た後、凍結乾燥することによってＦ−Ｑ分画、ｏ、、ｏ
７ｉ、　Ｆ＝＋−ｉ分画０．２０’ｌ、Ｆ−１−２分画
０．４２０＆、　Ｆ−１１分画０．８７９．１７．　Ｆ
−ｄｌ１分画１．０７０．！９の精製プロテアーゼを得
た。これら各分画のフィブリン塊に対するフィブリン分
解活性はＦ−０が８　、８１６　ｍｓＲ／ｍｇ、Ｆ−１
−１が１５，２００ｍＡ　／　”ｇ、Ｆ−１−２が１２
，０００　ｍＡ／　ｍｇ、Ｆ−１１が９　、２９０　ｍ
Ａ／　ｍｇ及び’Ｆ−１［がｌ　７　＋　６２０　ｍＡ
／　’グであった。 実施例２ 実施例１−１１１と同一の方法によりＦ−０分画、Ｆ−
１−１分画、Ｆ＝ｌ−２分画、Ｆ−１１分画及びＦ−１
分画を得たのち、Ｆ−０分画、Ｆ−１−１分画及び’Ｆ
−１−２分画のそれぞれを１０ｍＭ　リン酸緩衝’ｇ（
ｐｕｓ、ｏ）テ平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインカ
ラムに通液し、活性区分を吸着せしめた後、同緩衝液で
食塩Ｏ〜１００ｍＭの濃度勾配にて活性区分の溶出を行
い得られた活性区分を集め、さらにセファデックス−Ｇ
−７５のゲル濾過を行うことによりポリアクリルアミド
ゲル電気泳動として単一な精製品のびＦ−１−ＨＭ−１
５は０．０６．９を得た。Ｆ−１１分画は硫安０．３飽
和濃度にて平衡化したトヨバールＨＷ−５５（東洋ソー
ダ製品）カラムに通し、活性画分を吸着せしめ、硫安０
．３〜０．１飽和の濃度勾配で溶出を行い、活性区分を
集め脱塩し、このものを１０ｍＭ−’Ｊン酸緩衝ｇ（ｐ
Ｈ６，ｏ）で平衡化したヘキシル−セファロースカラム
に通液し、活性区分を吸着せしめた後、同緩衝液で食塩
の０〜１５０ｍＭの濃度勾配にて活性区分の溶出を行い
、活性区分を集め、セファデックスＧ−７５でゲル濾過
を行いポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一な
精製品のＦ−１１−ＨＭ−６４はｏ、１ｏｊを得た。Ｆ
−１分画は２０ｍＭ　’］ン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）に
て平衡化した卵白トリプシンインヒビター（シグマ社製
品）セファロースアフイニテイ担体カラムに通赦し、活
性画分を吸着せしめた後、１Ｍ食塩を含む同緩衝液及び
０．１Ｍ酢酸緩衝１（ｐＨｓ、０）で洗浄を行った後、
０．５Ｍアルギニン及び１Ｍ食塩を含む酢酸緩衝液（ｐ
Ｈｓ、ｏ）にて活性画分を溶出しＦｉｌ１画分を得た。 該Ｆ−１画分をさらに硫安０．３飽和溶液にて平衡化し
たトヨバールＨＷ−５５カラムに通液し活性画分を吸着
せしめ、硫安０．３飽和〜０．１飽和の濃度勾配で溶出
を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて単一な精製品Ｆ−１−１−ＨＭ−２７（第２６図）
。 ４、図面の簡単な説明 第１図ないし第４図は、フィブリン塊に対するフィブリ
ン分解活性でみたプロテアーゼＦ−Ｍ−１−ＨＭ−２７
の至適ｐＨ，ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性をそ
れぞれ示すグラフ、第５図、第１０図、第１５図及び第
２０図は、フィブリン塊に対するフィブリン分解活性で
みた新規プロテアーゼＦ−０−ＨＭ−４５の至適ｐＨ，
ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示すグ
ラフ、第６図、第１１図、第１６図及び第２１図は、フ
ィブリン塊に対するフィブリン分解活性でみた新規プロ
テアーゼＦ−１−ＨＭ−５４の至適ｐＨ，ｐＨ安定性、
作用適温及び温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第７図
、第１２図、第１７図及び第２２図は、フィブリン塊に
対するフィブリン分解活性でみた新規プロテアーゼＦ−
１−ＨＭ−１５の至適ｐＨ，ｐＨ安定性、作用適温及び
温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第８図、第１３図、
第１８図及び第２３図はフィブリン塊に対するフィブリ
ン分解活性でみた新規プロテアーゼＦ−１１−ＨＭ−６
４の至適ｐＨ，ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性を
それぞれ示すグラフ、第９図、第１４図、第１９図及び
第２４図はフィブリン塊に対ずろフィブリン分解活性で
みた新規プロテアーゼＦ−１−２−ＨＭ−８９の至適ｐ
Ｈ、ｐＨ安定性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示
すグラフ、第２５図はミミズ抽出液を”　ルコール沈降
処理した後、ＤＥＡＫ−セルロファインクロマトグラフ
イー処理して得られろフィブリン塊に対するフィブリン
分解活性でみた不発明の新規プロテアーゼの分画パター
ンを表わすグラス、第２６図は、ミミズ抽出液をアルコ
ール沈降処理した後、ＤＥ、ＡＥ−セルロファインクロ
マトグランイー処理して得られるＦ−１分画について、
さらにトヨバールＨＷｉ−４５５カラムクロマトグラフ
イー処理して得られろフィブリン塊に対ずろフィブリン
分解活性、Ｓ−２４４４分解活性及びＳ−２２５１分解
活性でみた不発明の新規プロテアーゼＦ−１−１−ＨＭ
−２７及びＦ−１１１−２−ＨＭ−８９の分画パターン
を表わすグラフである。 特許出願人　天野製薬株式会社 ほか１名 代り人　阿　形　　明 第１図 Ｈ 第２図 ｅ　　　　　ａ　　　　　ｔｏ　　　　／２ｆ−１ 第３図　　　　第４図 第５図　　　　第６図 第７図 Ｈ 第８図 第９図 ｐＨ 第ｔｏ図 ４　　　　６　　　　８　　　　１０　　　１２Ｈ 第１７図 瀘崖（１Ｃ） 第゛１８　図 ｆＸ）ＬじＣ） 第２１図 第２２図 温　１じＣ） 第２３図 渫Ａ（’（’） 第２４図 ｉ＆（”（：＞ 手続補正書 １事件の表示 昭和！５７年特許願第１７３６６９号 ２、発明の名称 新規なプロテアーゼ ３補正をする者 事件との関係特許出願人 住　所愛知県名占屋市中区錦−下目２番７号天野製薬株
式会社（ほか１名 氏７名 代表者　天　　野　　源　　博 ４代　理　人 〒１０５東京都港区新橋２丁目２番２号川志満・邦信ビ
ル８階５、補正命令の日付　自　発 ８、補正の内容 （１）全文明細書第２０ページ第７行目の「第１７図」
を、「第２５図及び第２６図」に訂正します。 （２）同第２０ページ第１６〜１７行目の［トルエ５４
、Ｆ、Ｉ−ＨＭ−１５Ｊを、　「Ｆ−Ｉ−１−）ＩＭ−
５４゜Ｆ　−Ｉ　−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 （４）同第３３ページ第９〜１０行目の［Ｆ−Ｉ−ＨＭ
−５４、Ｆ−Ｉ−［（Ｍ−１５Ｊを、「Ｆ　　Ｉ−Ｉ　
　ＨＭ−５４、Ｆ　−ｌ−２−［（Ｍ−１ｓＪに訂正し
ます。 （５）同第３４ページ第４表中の「Ｆ−Ｉ−ＨＭ−５４
Ｊ）を、ｇＦ−Ｉ−１−ＨＭ−５４Ｊに訂正し捷す。 （６）同第３４ページ第４表中の［Ｆ　−Ｉ　−ＨＭ−
１５Ｊを、ｌＢｒ　、Ｉ−２−Ｈｌ−２−Ｈに訂正しま
す。 （７）同第３５ページ第６行目の（−Ｆ−Ｉ−［（Ｍ−
５４Ｊを、「Ｆ−Ｉ−１−ＨＭ−５４」に訂正します。 （８）同第３５ページ第１１行目の「Ｆ−Ｉ−［（Ｍ−
１５ｊを、「Ｆ−Ｉ　−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します
。 （９）同第３６ページ第７行目の「Ｆ−Ｉ−ＨＭ−５４
゜Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５Ｊを、　［Ｆ−Ｉ−１−ＨＭ−５
４、Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５］に訂正します。 ０１　同第３７ページ第３〜４行目の［’Ｆ−Ｉ−ＨＭ
−５４、Ｆ−Ｉ−［（Ｍ−１５４を、［Ｆ−Ｉ−ｔ−［
（Ｍ−５４，Ｆ−１−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 （ロ）同第３７ページ第７行目の「Ｆ−Ｘ−’［（Ｍ−
５４（第６図）、及びＦ−Ｉ−ＨＭ−１５Ｊを、［Ｆ−
Ｉ−１−ＨＭ−５４（第６図）、及びＦ−Ｉ−，２−Ｈ
Ｍ−１５ｊに訂正します。 α力　同第３７ページ第１２〜１３行目のｌ”Ｆ−Ｉ−
［（Ｍ−５４（第１１図）、Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５Ｊを、
１Ｆ−Ｉ−１−ＨＭ−５４（第１１図）、ｐ−ｒ、−ｚ
−ＨＭ−ｘｓｊに訂正します。 ０１　同第３７ページ第１８〜１９行目の［Ｆ−Ｉ−Ｈ
Ｍ−５４，Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５Ｊ　を、　１Ｆ−Ｉ−１
−ＨＭ−５４、Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します
。 α力　同第３８ページ第２〜３行目の［Ｆ−Ｉ−ＨＭ−
５４（第１６図）、Ｆ−Ｉ−ＦＩＭ−１ｓＪを、１−Ｆ
−Ｉ−１−［（Ｍ−５４（第１６図）、Ｆ　　Ｉ　　２
−ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 αつ　同第３８ページ第８〜９行目の「Ｆ−工−ＨＭ−
５４、Ｆ−Ｉ−［（Ｍ−１５１を、「Ｆ−Ｉ−１−［（
Ｍ−５４、Ｆ−Ｉ−２−Ｈｌ、ＩＩ−１５Ｊに訂正しま
す。 ◇Ｑ　同第３８ページ第１３〜１４行目のｌ’−Ｆ−Ｉ
−ＨＭ−５４（第２１図）、Ｆ−Ｉ−ＨＭ”１５Ｊを、
［Ｆ−Ｉ−Ｌｌ−ＨＭ−５４（第２１図）、Ｆ　−Ｉ　
−２−ＨＭ　　１５　ｊに訂正します。 α力　同第３９ページ第６行目の「Ｆ−Ｉ−ＨＭ−５４
Ｊを、［Ｆ　　Ｉ　　１−ＨＭ−５４Ｊに訂正します。 ０→　同第３９ページ第７行目の’ｉ’Ｆ　−ｒ　−Ｉ
Ｉ　Ｍ−１５Ｊを、［Ｆ−Ｉ−２−Ｈ１＋！−１５Ｊに
訂正します。 αつ　同第３９ベーン第１１〜１２行目の「Ｆ−Ｉ−Ｈ
Ｍ−５４，Ｆ−Ｉ−１８Ｍ−ｔ５Ｊ　を、　「Ｆ−Ｉ−
１−Ｈｌシー５４、Ｆ−Ｉ−２４Ｍ−１５Ｊに訂正しま
す。 （ハ）同第３９ページ第１７行目のｌ”Ｆ−Ｉ−ＨＭ−
５４Ｊを、［Ｆ−Ｉ−１−ＨＭ’−５４Ｊに訂正し捷す
。 Ｑ］）同第３９ページ第１８行目の「Ｆ　−Ｉ　−ＨＭ
−１ｓＪを、ｌ’−Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正し
ます。 （イ）同第４０ページ第６行目のｊｒ−■−Ｈｙ−ｓ　
４」を、１Ｆ−■−１−［（Ｍ−５４Ｊに訂正します。 に）同第４０ページ第７行目の１Ｆ−Ｉ−ＨＭ−，１５
Ｊを、「Ｆ−１−２−ＨＭ−１５」に訂正します。 （ハ）同第４０ページ第１１〜１２行目の［Ｆ−Ｉ−Ｈ
Ｍ−５４，Ｆ−Ｉ−Ｈ’Ｍ−１５Ｊを、［ｉＩ−１−Ｈ
Ｍ−５４、Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 に）同第４１ページ第４行目の１ｒ−１−ＨＭ−５４Ｊ
を、「Ｆ−Ｉ−１−、［（Ｍ−５４Ｊに訂正します。 ＱＱ　　同第４１ページ第１２行目のｌＦ−Ｉ−ＨＭ−
１５」を、「Ｆ−Ｉ−２＝ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 （イ）同第４２ページ第１９行目の［−〇の場合」を、
１０％の場合」に訂正します。 （ハ）同第４３ページ第２行目の１１００の場合」を、
１１００％の場合」に訂正します。 （ハ）同第４４ページ第５表中の「ｙ−ニーｍＭ−５４
ｊを、ｌ’−Ｆ−Ｉ−１−、ＨＭ−５４Ｊに訂正します
。 （ト）同第４４ページ第５表中の「Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１，
５Ｊを、Ｉ−Ｆ　　Ｉ　　２−ＨＭ−１５Ｊに訂正しま
す。 （３１）同第４５ページ第７表の［Ｆ−Ｉ−ＨＭ−５４
Ｊを、［Ｆ−Ｉ−１−［（Ｍ−５４Ｊに訂正します。 （３２）同第４６ページ第８表の［Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１５
Ｊを、ＩＦ−Ｉ−２＝ＨＭ、−１ｓ　Ｊに訂正します。 （田）同第４７ページ下から３行目の１Ｆ−Ｉ−ＨＭ−
５４」を、「Ｆ−Ｉ−１−ＨＭ−５４Ｊに訂正します。 （３４）同第４８ページ第３行目の［Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１
５ｊを、１Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 （３５）同第４８ページ下から１行目の１Ｆ−■−ＨＭ
−５４　、　Ｆ−Ｉ−［（Ｍ−１５ｊ　を、「Ｆ−Ｉ−
１−ＨＭ−５４゜Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正し捷
す。 （：’ｍ）同第５２ページ第９行目の「００２グ、Ｆ−
Ｉ−ＨＭ−５４は００７グ」を、［ｏ、ｏ２ｙ、Ｆ−Ｉ
−１−ＨＭ−５４は０．０７１ｉ’Ｊに訂正します。 （３７）同第５２ページ第１０行目の１Ｆ−Ｉ−ＨＭ−
１５は００６グ」を、「Ｆ−４−２−ＨＭ−１５は０．
０６７」に訂正します。 （３８）　同第５３ページ第１行目の「０１０グ」を、
「０１１ｉ′」に訂正します。 （３９）同第５３ページ第１４行目の「００７０グ」を
、［’ｏ、　０７　ｒＪに訂正します。 （４０）同第５３ページ第１４行目の「ｏ、ｏ６ｏグ」
を、「０．０６７」に訂正します。 （４１）同第５４ページ第６行目の［Ｆ−：ｃ−ＨＭ−
５Ｊを、「Ｆ−Ｉ−１−ＨＭ−５４ｊに訂正します。 （４２）同第５４ページ第１０行目の１ｙ−ｘ−ＨＭ−
１５」を、［Ｆ−Ｉ−２−ＨＭ−１５Ｊに訂正します。 （４３）第２５図を別紙のとおシ訂正します。 手続補正書 昭和５８年９　月２０日 昭和５７年特許願第１７３６６９号 ２発明の名称 新規なプロテアーゼ ３補■をする者 事件との関係　特許出願人 イよ　所愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号天野製薬
株式会社（ほか１名） 氏　名　　代表者　天　野　源　博 ４代　理　人 ５　補正命令の日刊　　自発 ６　補正により増加する発明の数　０ ７補正の対象　　明細確の特許請求の範囲の欄８補正の
内容　　別紙のとおり 特許請求の範囲 １　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状プロ
テアーゼＦ−１−１−ＨＭ−２７゜Ａ）活性及び基質特
異性。 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−ト／）ｖ−Ｌ−アル
ギニンメチルエステル塩酸塩、　　Ｎ　−α−ｐ−トシ
ル−Ｌ−ｌ））ンメチルエステル塩酸塩、Ｌ〜ピログル
タミル−グリツルーＬ−アルギニンーｐ−ニトロアニリ
ド塩酸塩及びＨ−Ｄ−バ１）ルｐ−口インルーＬ　　’
）　シン−ｐ−ニトロアニリド・ジ塩酸塩に対する強い
作用を有するか、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチル
エステル及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエス
テルに対する作用を有しない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 フィブリン塊を基質として使用したときのフィブリン分
解作用の至適ｐＨ約８付近、ｐＨ安定範囲５〜１２゜ Ｃ）作用適温範囲 ｐＨ７，８のフィブリン塊に対してのフィブリン分解反
応における作用適温３０〜６０℃、最適温度約５０℃。 Ｄ）失活条件。 ７０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 ′Ｆ２）分子量 ３２．４００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル ２８０　ｎｍ付近に吸収極太、２５００ｍ付近に吸収極
小を示す。 Ｇ）等電点 ｐ丁＝３．６±０．１ Ｈ）阻害剤の影響： フイブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェート、大豆
トリプシンインヒビター、アンチパイン、ロイペプチン
及びトラジロールにより完全に阻害され、卵白トリプシ
ンインヒビター及びトランス−４−（アミノメチル）シ
クロヘキサンカルボン酸によりかなり阻害され、ε−ア
ミノカプロン酸、キモスタチン及びペプスタチンによシ
ある程度阻害されるが、エチレンジアミン四酢酸ジナト
リウム塩及びＮ−エチルマレイミドでは実質的に阻害さ
れない。 ■）アミノ酸組成。 Ｊ）元素分析値。 ０４８．６１係、　Ｈ６，５８係、　Ｎ　１４．７５％
。 ８２．０３９１１０ ２　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状プロ
テアーゼｍ−ｏ−ＨＭ−４５０ Ａ）活性及び基質特異性 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−トンエと−Ｌ−アル
ギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ−ベンノイル−Ｌ−
チロシンエチルエステルニ対する強い作用を有するが、
Ｌ−ピログルタミル−クリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−
ニトロアニリド塩Ｈ塩及Ｕ　Ｈ−Ｄ　−ハ＋）ルーＬ−
ロイシル−Ｌ、　−リジン−ｐ−ニトロアニリド・ジ塩
酸塩にはわずかな作用を示すのみで、Ｎ−ベンゾイル−
Ｌ−アラニンメチルエステル及びＮ−α−ｐ　ｈシル−
Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩に対してはほとんど作
用を示さない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 フィブリン塊を基質として使用したときのフィブリン分
解作用の至適ｐＨ約８〜１０　、　ｐＨ安定範囲４〜１
２ Ｃ）作用適温範囲。 ｐＨ’７．８のフィブリン塊に対してのフィブリン分解
反応における作用適温３０〜６０℃、最適温度約５０〜
６０℃。 Ｄ）失活条件。 ７０℃に６０分間保持すると完全（・こ失活する。 Ｅ）分子量。 ２４．５００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル ２８Ｏｎｍ付近に吸収極太、２５０　ｎｍ付近に吸収極
小を示す。 Ｇ）等電点 ｐＩ　＝　４．１士０．１ Ｈ）阻害剤の影響。 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェート、大豆
トリプシンインヒビター、アンチパ・ｆン、キモスタチ
ン、ロイペプチン及びトラジロールにより完全に阻害さ
れ、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカ
ルボン酸及びε−アミノカプロン酸によってかなｊ）阻
害され、ペプスタチン、Ｎ−エチルマレイミド及び卵白
トリプシンインヒビターにょシある程度阻害されるが１
　エチレンジアミン四酢酸ジ太トリウムでは実質１的に
１阻害されない。 ■）アミノ酸組成。 Ｊ）元素分析値。 ０４８．３０％、　Ｈ６，８４％、　Ｎ　１５．８８係
。 Ｓ２．Ｏ’７％。 ３　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状グロ
テアーゼＦ−１−１−ＨＭ−５４゜Ａ）活性及び基質特
異性： フィブリン環に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン伸性化作用、カゼイン、ｐ−トン／Ｌ−−Ｌ−ア
ルギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ〜ベンゾイル−Ｌ
−チロシンエチルエステルに対する強い作用を有するが
、Ｎ−α−Ｉ）−）シル−Ｉ、、　−ＩＪレジンチルエ
ステル塩酸塩及びＬ−ピログルタミル〜Ｌ−グリシル−
Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩にはわずか
に作用し、Ｎ　−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエス
テル及ヒＨ−Ｄ−バリル−Ｌ−口イシル−Ｌ−リジン−
ｐ−ニトロアニリド・ジ塩酸塩にはほとんど作用しない
。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲。 フィブリン環を基質として使用したときのフィブリン分
解作用の至適ｐＨ約８〜１０　、　ｐＨ安定範囲４〜１
２゜ Ｃ）作用適温範囲。 ｐＨ７，８のフィブリン環に対してのフィブリン分解反
応における作用適温３０〜６０℃、最適温度約５．０〜
６０℃。 Ｄ）失活条件゛ ７０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 ＦＪ）分子量 ２７．５００±２，０００゜ Ｆ）紫外線吸収スペクトル： ２８Ｏｎｍ付近に吸収極太、２５０　ｎｍ付近に吸収極
小を示す。 Ｇ）等電点 ｐ工＝　４．０±０．１゜ Ｈ）阻害剤の影響。 フィブリン環に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェート及びＮ
−エチルマレイミドてよって完全に阻害され、ロイペプ
チン及び大豆トリプシンインヒビターによってかなシ阻
害され、キモスタチン、トランス−４−（アミノメチル
）シクロヘキサンカルボン酸及び卵白トリプシンインヒ
ビターによっである程度阻害されるが、エチレンジアミ
ン四酢酸ンナトリウム、ペプスタチン、アンチパイン、
トランジオール及びε−アミノカプロン酸では阻害され
な匹。 ■）アミノ酸組成。 Ｊ）元素分析１直。 ０４８．９３％、　Ｈ６，６Ｓ係＋　　Ｎ　１５．９５
係。 ８１．３４係。 ４　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状グロ
テアーゼＦ−１−２−ＨＭ−１５゜Ａ）活性及び基質特
異性。 フィブリン環に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−）フルーＬ−アルギ
ニンメチルエステル塩酸塩及ヒＮ−ベンゾイル−Ｌ−チ
ロシンエチルエステルニ対する強い作用を有するが、Ｎ
−α〜ｐ−トシルーＬ−リジンメチルエステル塩酸塩及
びＬ−ピはグルタミル−グリフルーＬ−’フルギニンー
ｐ−ニトロアニリド塩酸塩にはわずかに作用し、Ｎ−ベ
ンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル及ヒＨ−Ｄ−ハ
リルーム−ロイシル−Ｌ　　ＩＪレジンｐ−ニトロアニ
ＩＪド・ジ塩酸塩にはほとんど作用しない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲゛ フィブリン環を基質として使用したフィブリン分解作用
の至適ｐＨ約８〜１０　、　ｐＨ安定範囲４〜１２゜ Ｃ）作用適温範囲。 ｐＨ７，８のフィブリン環に対しての作用適温３０〜６
０℃、最適温度約５０〜６０℃。 Ｄ）失活条件ニ ア０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 Ｅ）分子量： ２７．００Ｑ±２．０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル： ２８０　ｎｍ付近に吸収極太、２５０ｎｍ付近に吸収極
小を示す。 Ｇ）等電点。 ｐニー３．９±０．■ Ｈ）阻害剤の影響 フィブリン環に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロポスフェート及びＮ
−エチルマレイミドによって完全に阻害され、卵白トリ
プシンインヒビター及ヒロイヘフチンによシがなシ阻害
され、アンチパイン、大豆トリプシンインヒビター、ペ
プスタチ／、ε〜ルアミノカプロン、キモスタチン、エ
チレンジアミン四酢酸ジナトリウム及びトランス−４−
アミンメチルシクロヘキサンカルボン酸によっである程
度阻害されるが、トラジロールでは阻害されない。 ■）アミノ酸組成。 Ｊ）元素分析値 Ｃ４６，１５％、　　Ｈ６，６４％、　　Ｎ１６．０２
％。 ８２．０５％。 ５　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状グロ
テアーゼＦ−１１−ＨＭ−６４゜Ａ）活性及び基質特異
性。 フィブリン環に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化作用、カゼインに対する強イ作用、ｐ　−
トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩に対する
作用を有するが、Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｊ、　　ＩＪレ
ジンチルエステル塩酸塩及びＬ−ピロクルタミルークリ
シルーＬ〜アルギニノ−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩には
わずかに作用し、Ｈ−Ｄ−バリル−し−ロインルーＬ−
リジンーｐ−ニトロアニリド・ジ塩酸塩にはごくわずか
に作用り、　Ｎ−ヘ／ソイル−Ｌ−アラニンメチルエス
テル及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル
にはほとんど作用しない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： フィブリン環を基質として使用したときのフィブリン分
解作用の至適ｐＨ約７〜８、ｐＨ安定範囲５〜１２゜ Ｃ）作用適温範囲。 ｐＨ７，８のフィブリン環に対してのフィブリン分解反
応における作用適温３０〜６０℃、最適温要約５０〜６
０℃。 Ｄ）失活条件。 ７０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 Ｅ）分子量 ２７　、８００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル。 ２８０　ｎｍ伺近に吸収極太、２５０ｎｍ付近に吸収極
小を示す。 Ｇ）等電点 ｐニー３．８±０．１ Ｈ）阻害剤の影響。 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェ−）、Ｎ−
エチルマレイミド及び大豆トリプシンインヒビターによ
り完全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター、トラ
ジロール、ペプスタチン−、キモスタチン及びトランス
−４−（アミノメチル）７クロヘキサンカルボン酸によ
ってかなり阻害され、アンチパイン及びε−アミノカプ
ロン酸によりある程度阻害されるが、エチレンジアミン
四酢酸ジナトリウム及びロイペプチンでは阻害されない
。 ■）アミノ酸組成： Ｊ）元素分析１直。 Ｃ４８，２３％、　　Ｈ６，５３％、　　Ｎ　１５．９
３％。 ８　１．４３　％。 ６　以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末状プロ
テアーゼＦ−Ｉ［１−２−ＨＭ−８９。 Ａ）活性及び基質特異性： フィブリン塊に対するフィブリン分解作用、プラスミノ
ーゲン活性化作用、カゼイン、ｌ；１１７土−Ｌ−アル
、ギニンメチルエステル塩酸塩、Ｎ　−α−ｐ−トシル
−Ｌ−ＩＪ　シンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−ピログル
タミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ド塩酸塩及びＨ−Ｄ−バリル−Ｌ−口イシル−Ｌ−ＩＪ
レジンｐ−ニトロアニリド・ジ塩酸塩に対する作用を有
するが、　　Ｎ　−ベンゾイル−し−アラニンメチルエ
ステル及ヒＮ−ペンソイル−Ｌ−チロシンエチルエステ
ルにはほとんど作用しない。 Ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： フィブリン塊を基質として使用したときのフィブリン分
解作用の至適ｐＨ約８付近、ｐＨ安定範囲４〜１２゜ Ｃ）作用適温範囲 ｐＨ７，８のフィブリン塊に対してのフィブリン分解反
応における作用適温３０〜６０℃、最適温度約５０〜６
０℃。 Ｄ）失活条件ニ ア０℃に６０分間保持すると完全に失活する。 Ｅ）分子量。 ３２　、８００±２，０００ Ｆ）紫外線吸収スペクトル： ２８０　ｎｍ付近に吸収極大、２５０ｎｍ　付近に吸収
極小を示す。 Ｇ）等電点； ｐ工；３．５±０．１ Ｈ）阻害剤の影響 フィブリン塊に対するフィブリン分解作用は、リマ豆ト
リプシンインヒビター、ジフルオロホスフェート、大豆
トリプシンインヒビター、アンチパイン、ロイペプチン
及びトラジロールにより完全に阻害され、トランス−４
−アミノメチル／−々ロヘキサンカルボン酸によりかな
９阻害され、ペプスタチン、キモスタチン、ε−アミノ
カプロン酸及び卵白トリプシンインヒビターによりある
程度阻害されるが、Ｎ−エチルマレイミド及びエチレン
ジアミン四酢酸・ジナトリウムでは阻害されない。 ■）アミノ酸組成。 Ｊ）元素分析値 Ｃ！　４７．５３％、　　Ｈ−６，５５係、　　Ｈ１４
，５９％。 ３２．０６係。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　以下の理化学的性質を有する新規プロテアーゼＦ−
   ＩＩ−ＨＭ−２７： Ａ〕　活性と基質特異性： Ｆ−■−ＨＭ−２７は、フィブリン塊に対してフィブリ
   ン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し
   、カゼイン、Ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アルギニン
   メチルエステル塩酸塩およびＮ−α−Ｐ−）シル−Ｌ　
   −ＩＪジン−メチルエステルに作用する。またＦ−Ｉ−
   ＨＭ−２７は、Ｎ−ベンゾイル〜Ｌ−アラニンメチルエ
   ステル及びＮ−べしシイルート−チロシンエチルエステ
   ルには作用しない。 Ｂ）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲： フイブリン塊を基質と、して使用したプロテアーゼＦ−
   ■−ＨＭ−２７のフィブリン分解作用の至適ｐＨは図−
   １に示したように約８付近であり、うイブリン塊を基質
   としてのｐＨ安定範囲は図−２に示したようにｐＨ４〜
   １２で安定である（　ｐＨ安定性は、３７℃で６０分間
   放置した後のプロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−２７の残存活
   性を測定することによって決定した。）。 Ｃ）作用適温の範囲： ｐＨ７，８のフィブリン塊を用い、種種の温度で２時間
   反応させたときのプロテアーゼＦ−１ｂ、−ＨＭ−２７
   のフィブリン分解作用を図−３に示した。作用適温は３
   ０〜６０℃の範囲内であり、最適温度は約５０〜６０℃
   である。 Ｄ〕　種種の湿度による失活−の条件ニブロチアーゼＦ
   −Ｉ−Ｈ，Ｍ、−２７をｐＨ７，８，各種の温度で６０
   分間保温した後のフィブリン塊のフィブリン分解作用の
   残存活性を図−４に示した。プロテアーゼＦ−１［’−
   ＨＭ−２７は７０℃で６０分間保温することによって完
   全に失活することが明らかである。 Ｅ）分子量： ２８．０００±２．０００ （分子量はセファデックスＧ−７５によるゲルｒ過法に
   よって測定した。）； 牛血清アルブミン（分子量：　４３，０００　）。 キモトリプシノーゲンＡ　（分子ｍ　：２５，０００　
   ）およびリボヌクレアーゼＡ（分子量：１３，７００）
   をプロテアーゼＦ−Ｈ−ＨＭ−２７の分子量決定の標準
   物質として使用した。 Ｆ）紫外線吸収スペクトル： 吸収極大は２８０　ｎｍ付近に、吸収極小は２５０　ｎ
   ｍ付近に存在する。 Ｇ）等電点： ｐＩ＝＝３．７±０．１ Ｈ）阻害剤の影響ニ プロテアーゼｐ−ｚ−ＨＭ−ｚ７のフィブリン塊のフィ
   ブリン分解活性に対する種種の酵素阻害剤の影響を検討
   した。各種の阻害剤水溶液（４ｍグ／ｍｔ、　）　２０
   　ｐ　ＡをプロテアーゼＩ’−Ｉ２８ｏｎｍ −ＨＭ’−２７水溶液（０，００８４７ｍｌ　）８０μ
   ｔと混合し、３７℃で１０分間保温した後。 反応液３０μｔをとりフィブリン塊のフィブリ示した。 プロテアーゼＦ−，ｌ［−ＨＭ−２７はセリン試薬のジ
   フルオロホスフェ−）　、　ＳＨ試薬のＮ−エチルマレ
   イミド、プロテアーゼ阻害剤のリマ登トリプシンインヒ
   ビター、大豆トリプシンインヒビター、ペプスタチン、
   ロイペプチンおよびトラジロール（商品名、バイエル社
   製品、以下同じ）によって完全に阻害され、卵白トリプ
   シンインヒビター　キモスタチン、トランス−４−（ア
   ミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸およびイプシロ
   ン−アミノカプロン酸において、ある程度阻害される結
   果を示した。二価陽くオンキレート化剤であるＥＤ、Ｔ
   Ａ、アンチパインは活性を阻害しなかった。 ２　以下の理化学的性質を有する新規プロテアーゼＦ−
   Ｉ−ＨＭ−５４： Ａ）活性と基質特異性： Ｆ−Ｉ−ＨＭ−５４は、フィブリン塊に対してフィブリ
   ン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し
   、カゼイン、Ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アルギニン
   メチルエステル塩酸塩およびＮ−ベンゾイル−’ｆ、、
   　−チｏ　シンエチルエステルに作用する。またＦ　−
   Ｉ　−ＨＭ−５４は、Ｎ−ベンゾ゛イルーＬ−アラニン
   メチルエステル及びＮ−α−Ｐ−）シルーＬ−リジンメ
   チルエステルには作用しない。 Ｂ）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲； フィブリン塊を基質として使用したプロテアーゼＦ−Ｉ
   −ＨＭ−５４のフィブリン分解作用の至適ｐＨは図−５
   に示したように約８〜１０付近であり、フィブリン塊を
   基質としてのｐＨ安定範囲は図−８に示したようにｐＨ
   ４〜１２て安定である（　ｐＨ安定性は、３７℃で６０
   分間放置した後のプロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４の残
   存活性を測定することによって決定したのＣ）作用適温
   の範囲： ｐＨ７，８のフィブリン塊を用い、種種の温度で２時間
   反応させたときのプロテアーゼＦ−Ｉ　−ＨＭ　−’５
   ４のフィブリン分解作用を図−１１に示した。作用適温
   は３０〜６０℃の範囲内であり、最適温度は約５０〜６
   ０℃である。 Ｄ）種種の温度による失活の条件ニ ブロチアーゼＦ−Ｉ　−ＨＭ−５４−をｐＨ７，８，各
   種ノ温度で６０分間保温した後のフィブリン塊のフィブ
   リン分解作用の残存活性を図−１４に示した。プロテア
   ーゼＦ−Ｉ−ＭＪ（−５４は７０℃で６０分間保温する
   ことによって完全に失活することが明らかである。 Ｅ）分子量： ２２．０００　　±　１，０００ （分子量はセファデックスＧ−７５によるゲルｒ過法に
   よって測定した。）； 牛血清アルブミン（分子量：　４３，０００　）。 キモトリプシノーゲンＡ（分子ｉ　：　２５，０００　
   ）およびリボヌクレアーゼＡ　（分子Ｍ　：１３，７０
   ０）をプロテアーゼＦ−Ｉ、ＨＭ−５４の分子量決定の
   標準物質として使用した。 Ｆ）紫外線吸収スペクトル： 吸収極大は２８０　ｎｍ付近に、吸収極小は２．５０　
   ｎｍ付近に存在する。 Ｇ）等電点： ｐｉ　＝　４．’Ｏ±０１ Ｈ）　　阻冨剤の影響ニ プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４のフィブリン塩のフィ
   ブリン分解活性に対する種種の酵素阻害剤の影響を検討
   した。各種の阻害剤水溶液（４ｍｆ／ｍｌ　）　２０４
   ７をプ’ｒｙ　テア　−セＦ　−Ｉ−ＨＭ−５４水溶液
   （０’、０６１　　ｎｍ／ｍｚ　）　８０μｔと混合し
   、３７℃で１０分間保温した後。 反応液３０μｔをとりフィブリン塩のフィブリン分解活
   性を測定した。その結果を表−４に示した。プロテアー
   ゼＦ−Ｉ−ＨＭ−５４はリマ豆トリプシンインヒビター
   、ジフルオロホスフェートおよびＮ−エチルマレイミド
   によって完全に阻害され、大豆トリプシンインヒビター
   、キモスタチンおよびトランス−４−（アミノメチル）
   シクロヘキサ・ンカルボン酸には若干阻害されるが、Ｅ
   ＤＴＡ　、卵白トリプシンインヒビター、ペプスタチン
   、アンチパイン、トラジロールおよびイプシロン−アミ
   ノカプロン酸には阻害されなかった。 ３　以下の理化学的性質を有する新規プロテアーゼＦ−
   Ｉ　−ＨＭ、−１５： Ａ）活性と基質特異性： ｐ−Ｉ−ＨＭ−１５は、フィブリン塩に対してフィブリ
   ン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し
   、カゼイン、Ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニン
   メチルエステルａ酸塩およびＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロ
   シンエチルエステルに作用する。またＦ−Ｉ−ＨＭ−１
   ５は、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル及
   びＮ−α−１Ｐ−）シルーＬ−リジンメチルエステルに
   は作用しない。 Ｂ）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲： フィブリン塩を基質として使用したプロテアーゼＦ−Ｉ
   −ＨＭ−１５のフィブリン分解作用の至適ｐＨは図−６
   に示したように約８〜ｌ。 付近であり、フィブリン塩を基質としてのｐＨ安定範囲
   は図−９に示したようにｐＨ４〜１２で安定である（　
   ｐＨ安定性は、室温で６０分間放置した後のプロテアー
   ゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５の残存活性を測定することによっ
   て決定しム）。 Ｃ）作用適温の範囲： ｐＨ７，８のフィブリン塩を用い、種種の温度で２時間
   反応させたときのプロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５のフ
   ィブリン分解作用を図−１２に示した。作用適温は３０
   〜６０℃の範囲内であり、最適湿度は約５０〜６０℃で
   ある。 Ｄ）種種の温度による失活の条件ニ ブロチアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５をｐＨ７，８、各種の
   温度で６０分間保温した後のフィブリン塩のノイブリン
   分解作用の残存活性を図−１５に示した。プロテアーゼ
   Ｆ−Ｉ−ＨＭ−１，５は７０℃で６０分間保温すること
   によって完全に失活することが明らかである。 Ｅ）分子量： ２１．５００±２，０００ （分子量はセファデックスＧ−７５によるゲルｒ過法に
   よって測定した。）； 牛血清アルブミン（分子量：　４３，０００　）。 キモトリプシノーゲンＡ（分子量：　２５，０（１０）
   およびリボヌクレアーゼＡ（分子量：　１３，７００　
   ）をプロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５の分子量決定の標
   準物質として使用した。 Ｆ）紫外線吸収スペクトル： 吸収極大は２８０　ｎｍ付近に、吸収極小は２５　Ｑ　
   ｎｍ付近に存在する。 Ｇ）等電点： ｐＩ＝３．９±０．１ Ｈ）阻害剤の影響ニ プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ−１５のフィブリン塩のフィ
   ブリン分解活性に対する種種の酵素阻害剤の影響を検討
   した。各種の阻害剤水溶液（４ｒｎＩＦ／ｍｔ）　２０
   　ｐｉをプロテアーゼＦ−Ｉ−Ａ　２ａｏ　ｎ　ｍ ＨＭ−１５水溶液（０，０６１／ｍＡ　）　８０μＡと
   混合し、３７℃で１０分間保温した後２反応液３０μｔ
   をとりフィブリン塩のフィブリン分解活性を測定した。 その結果を表−４に示した。プロテアーゼＦ−Ｉ−ＨＭ
   −１５はリマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホ
   スフェートおよびＮ−エチルマレイミドによって完全に
   阻害され、ＥＤＴＡ　、卵白トリプシンインヒビター、
   ペプスタチン、アンチパイン、°キモスタチン、トラン
   ス−′４−アミンメチルシクロヘキサンカルボン酸およ
   びイプシロン−アミノカプロン酸にはある程度阻害され
   るが、トラジロールには阻害されなかった。 ４　以下の理化学的性質を有する新規プロテアーゼｐ−
   ｎ−ＨＭ−６４： Ａ）活性と基質特異性： Ｆ−Ｉ［−Ｉ−ＩＭ−６４は、フィブリン塊に対してフ
   ィブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性化活性
   を有し、カゼイン、Ｐ−）ルエンスルホニルーし一アル
   ギニンメチルエステル塩酸塩およびＮ−ベンゾイル−Ｌ
   −チロシンエチルエステルに作用する。またＦ−１１−
   Ｉ（Ｍ−６４は、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチル
   エステル及びＮ−α−Ｐ−）シルーＬ−リジンメチルエ
   ステルには作用しない。 Ｂ）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲： フイブリン塊を基質として使用したプロテアーゼＦ−Ｉ
   ［−ＨＭ’−６４のフィブリン分解作用の至適ｐＨは図
   −７に示したように約７〜８付近であり、フィブリン塊
   を基質としてのｐＨ安定範囲は図−１０に示したように
   ｐＨ５〜１２で安定である（　ｐＨ安定性は、３７℃で
   ６０分間放置した後のプロテアーゼＦ−１１−ＨＭ−６
   ４の残存活性を測定することによって決定した。）。 Ｃ）作用適湿の範囲： ｐＨ７，８のフィブリン塊を用い、種種の湿度で２時間
   反応させたときのプロテアーゼＦ−１１−ＨＭ−６４の
   フィブリン分解作用を図−１３に示した。作用適温は３
   ０〜６０℃の範囲内であり、最適温度は約５０〜６０℃
   である。 Ｄ）種種の温度による失活の条件ニ ブロチアーゼＦ−ＩＩ−ＨＭ−６４をｐＨ７，８，各種
   の温度で６０分間保温した後のフィブリン塊ノフイブリ
   ン分解作用の残存活性を図−１６に示した。プロテアー
   ゼＦ−■−Ｍ）（−６４は７０℃で６０分間保温するこ
   とによって完全に失活することが明らかである。 Ｅ）分子量： ２３．０００±２，０００ （分子量はセファデックスＧ−７５によるゲル濾過法に
   よって測定した。）； 牛血清アルブミン（分子量：　４：３，０００　）　。 キモトリプシノーゲンＡ（分子ｉ：２５．ｏｏｏ、）オ
   よびリボヌクレアーゼＡ（分子！：　１３，７００　）
   をプロテアーゼＦ　−，１−ＨＭ　−６，４の分子量決
   定の標準物質として使用した。 Ｆ）紫外線吸収スペクトル： 吸収極大は２８　Ｏｎｍ付近に、吸収極小は２５　Ｏｎ
   ｒｒｉ付近に存在する。 Ｇ）等電点： ｐＩ　　＝　　３．８±０１ Ｈ）　　阻害剤の影響ニ プロテアーゼＩｉ’−１−ＨＭ−６４のフィブリン塊の
   フィブリン分解活性に対する種種の酵素阻害剤の影響を
   検討した。各種の阻害剤水溶液（４’ｆ／ｍｌ　）　２
   ０　ｔｒｉをプロテアーゼＦ−１−ＨＭ−６４水溶液（
   ０，０２６Ａ２８ｏ””７ｍｌ　）　８０μｔと混合し
   、３７℃で１．０分間保温した後、反応液３０μｔをと
   りフィブリン塊のフィブリン分解活性を測定した。その
   結果を表−４に示した。プロテアーゼＦ−■−ＨＭ−５
   ４は、リマ豆トリプシンインヒビター　ジフルオロホス
   フェート、Ｎ−エチルマレイミドオよヒ大豆トリプシン
   インヒビターによって完全に阻害され、アンチパインに
   より若干阻害され、卵白トリプシンインヒビター　、ペ
   プスタチン、キモスタチン、トランス−，４，−、（ア
   ミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、トラジロール
   およびイプシロン−アミノカプロン酸によってかなりの
   程度阻害されるが、　ＥＤＴＡにより阻害されなかった
   。