NO164991B - Fremgangsmaate for fremstilling av blodkoaguleringshemmende proteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte forfremstilling av proteiner som hemmer blodkoagulasjonen.

Blodkoagulasjonshemmende proteiner, som forekommer hos de fleste pattedyr, kan inndeles i tre grupper. Inndelingen er basert på forskjeller i protein-virkningsmekanismen. 1. Proteiner som danner et kompleks med koagulasjonsfaktoren og dermed gjør den uvirksom. Til denne gruppe hører følgende proteiner:

a) Antitrombin-III (Thromb. Res., 5, 439-452 (1974))

b) -Protease-inhibitor (Ann. Rev. Biochem., 52,

655-709 (1983))

c) a^-Makroglobulin (Ann. Rev. Biochem., 5_2, 655-709

(1983))

d) C1-Inhibitor (Biochemistry, 20, 2738-2743 (1981))

e) Protease Nexin (J. Biol. Chem., 258, 10439-10444

(1983)) . 2. Proteiner som splitter koaguleringsfaktoren proteolytisk og derved desaktiverer faktoren. Det eneste protein som hittil er beskrevet av denne type er protein C (J. Biol. Chem., 251, 355-363 (1976)). 3. Proteiner som skjermer og/eller hydrolyserer de negativt ladede fosfolipider slik at fosfolipid-avhengige reaksjoner i blodkoagulasjonsmekanismen hemmes. Hittil er det kun beskrevet fosfolipaser som er isolert fra forskjellige sorter av slangegift (Eu. J. Biochem., V\ 2, 25-32 (1980)).

Det trinnvis forløpende koagulasjonssystem er grundig undersøkt de siste år. Det oppfattes som et flertrinns-system hvor forskjellige sammenkoblede proteolytiske reaksjoner for-sterker hverandre og hvor et enzym overfører et zymogen i den aktive form (sml. Jackson, C. M., Nemerson, Y., Ann. Rev. Biochem. 49, 765-811 (1980)). Hastigheten av denne reaksjon økes i avgjørende grad ved nærvær av fosfolipider og andre kofaktorer som faktor V a og faktor VIII a. In vivo reguleres prokoagulasjons-reaksjonene gjennom forskjellige inhiberingsmekanismer, som forhindrer et eksplosivt trombotisk trauma etter en svak aktivering av koagulasjonskaskaden.

Antikoagulasjonsmekanismene kan inndeles på følgende måte: (Rosenberg, R. D., Rosenberg, J. S., J. Clin. Invest. 74, 1~6

(1984)): 1. Serin-protease-faktor X aog trombin inaktiveres på grunn av deres binding til antitrombiner III resp. til antitrombin/heparin-komplekset. Både protrombin-aktiveringen og fibrindannelsen kan hemmes på denne måte. Ved siden av antitrombin III finnes dessuten forskjellige andre plasma-proteåse-inhibitorer som for eksempel c^-makroglobulin og antitrypsin, med tidsavhengig virkning. 2. Oppdagelsen av protein C avdekket ytterligere en anti-koaguleringsmekanisme. Dersom protein C først er aktivert, virker det som antikoagulant ved gen selektive proteolyse av protein-kofaktorene faktor V a og VIII a ■som inaktiverer

protrombinase og det enzym som omsetter faktor X.

3. Plasmin spalter monomert fibriri 1.som er et produkt av trombinets innvirkning på fibrinogen, hvorved dannelsen av et uløselig fibrin forebygges (Nossel, H. L., Nature, 291, 165-1 67 (1981 )) .

Av de nevnte av kroppens egne proteiner som griper inn i koagulasjonsprosessen har for tiden bare antitrombin III klinisk anvendelse. Det har imidlertid vist seg at bruk av dette'protein har den vesentlige ulempe at det øker blødningstendensen.

Alle hittil anvendte antikoagulanter, enten de er kroppsegne eller av syntetisk natur, gjør på en eller annen måte koagulasjonsfaktorene uvirksomme og fører således til bivirkninger som kan være uheldige for koagulasjonsprosessen.

Foreliggende oppfinnelse har hatt som mål å fremstille

et middel som kunne oppvise koaguleringshemmende egenskaper uten de tidligere kjente antikoagulasjonsmidlers ugunstige virkning på koagulasjonsprosessen.

Det har nå lykkes å isolere kroppsegné proteiner som har koagulasjonshemmende egenskaper, men som ikke øker blødnings-faren. Som en ytterligere overraskende egenskap, mister disse proteiner ved større blødninger sine hemmende egenskaper slik at de vanlige koagulasjonsprosesser kan forløpe uforstyrret og dermed hindre jfaren for forblødning.

Foreliggende oppfinnelse -angår fremgangsmåte for fremstilling av ^lofakoaguleringshemmende proteiner,

fortrinnsvis fra mennesker, storfe, gnagere eller hestedyr, og særlig fra arterier,som

- ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene,

- ikke hydrolyserer fosfolipider,

- bindes via de divalente kationer Ca<2+>og/ellerMn<2+>reversibelt til negativt ladede fosfolipider,

- er i stand til å fortrenge faktor Xa og protrombinene

fra en negativt ladet fosfolipidoverflate, og

- ikke hemmer den biologiske amidolytiske aktivitet av

faktorene Xa og Ila,

Særlig foretrekkes proteiner som er i stand til å hemme koagulering indusert av en vaskulær prokoagulant, resp., av faktor Xa, men derimot ikke koagulasjonen indusert av trombin.

De hemmer ikke de biologiske og amidolytiske virkninger av faktorene Xaog IIa.

Foretrukne blodkoaguleringshemmende proteiner er de som hemmer:

- det modifiserte protrombin-tidsforsøk og/eller

- det modifiserte, aktiverte, partielle tromboplastin-tidsforsøk og/eller - det umodifiserte protrombin-tidsforsøk og/eller

- protrombin-aktiveringen gjennom koagulasjonsfaktor X i

nærvær av negativt ladede fosfolipider og Ca og/eller

- indre X-aktivering gjennom faktorene IX i nærvær av

negativt ladede fosfolipider og Ca og/eller

- protrombin-aktiveringen av isolerte, stimulerte blod-

plater og/eller

- koaguleringen indusert av karveggen og/eller

- den koagulasjonsavhengige blodplateaggregasjon.

Det foretrekkes proteiner som ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene, men hvor den hemmende virkning avhenger av fosfolipidmengden. Proteinene fremstillet i henhold til oppfinnelsen induserer protrombinaktiveringshemmingen via faktor Xa. Hemmingen avhenger av fosfolipidkonsentrasjonen og er mindre

ved høyere fosfolipidkonsentrasjoner. Fosfolipidene hydrolyseres ikke av proteinene fremstillet i henhold til oppfinnelsen.

Spesielle blodkoagulasjonshemmende proteiner er de som

ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene og bindes via de divalente kationene Ca<2+>og/eller Mn2<+>til negativt

ladede fosfolipider, som f.eks. finnes i vesikler, liposomer eller eterosomer, og/eller via de divalente kationene Ca<2+>ogMn<2+>bindes til negativt ladede fosfolipider som er koblet til "Spherocil". Bindingen av proteinene til negativt ladede fosfolipider er reversibel og kan oppheves av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Proteinene; i henhold til oppfinnelsen er i stand til å fortrenge faktor X=og protrombinene fra en negativt ladet fosfolipidoverflate.

Særlig isoleres blodkoagulasjonshemmende proteiner som ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene og har molvekter på ca.

70x10<3>, ca.60xIO<3>, ca. 34 x 10<3>eller ca.32x10<3>, hvorav

proteiner med molvekten 34 x 10<3>, resp. 32 x IO<3>, kun består av en eneste polypeptidkjede.

Oppfinnelsen angår fortrinnsvis fremstilling av blodkoagu-las j onshemmende proteiner som ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene ved at

- de isoleres og renses fra blodkarvegger fra pattedyr,

- de ikke er glykoproteiher,

- de ikke er fosfolipaser,

- de har et isoelektrisk punkt ved pH 4,4-4,6

- aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene er termolabil ved 56°C,

- aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene

har noen timers stabilitet ved 37°C i citratholdig plasma,

- aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene

ikke ødelegges fullstendig av trypsin og/eller kymotrypsin,

- aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene

ikke påvirkes av kollagénase og/eller elastase,

- de bindes via de divalente kationene Ca<2+>og Mn<2+>til negativt ladede fosfolipider som finnes i vesikler, liposomer eller eterosomer, - de bindes via de divalente kationene Ca<2+>og Mn<2+>til negativt ladede fosfolipider som er koblet til "Spherocil" - bindingen av proteinene til de negativt ladede fosfolipider er reversibel og kan oppheves av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), - de fortrenger faktor X og protrombinene fra en negativt ladet fosfolipid-overflate,

- de hemmer det modifiserte protrombin-tidsforsøk,

- de hemmer det modifiserte, aktiverte, partielle tromboplastin-tidsforsøk,

- de hemmer det ikke-modifiserte protrombin-tidsforsøk,

- de hemmer protrombin-aktiveringen in vitro via koagulasjonsfaktor X= i nærvær av negativt ladede fosfolipider og Ca ,

- de ikke hemmer den biologiske og amidolytiske aktivitet

av faktor X og II ,

cl cl

- de hemmer den innebyggede X-aktivering in vitro via

faktor IX i nærvær av negativt ladede fosfolipider og Ca2\<3>- de hemmer protrombinaktiveringen av isolerte, stimulerte blodplater in vitro,

- de in vitro hemmer koagulasjon indusert av karveggene og

- den proteininduserte protrombin-aktiveringshemming via

faktor X aer avhengig av fosfolipidkonsentrasjonen og er mindre ved høyere fosfolipidkonsentrasjoner.

Oppfinnelsen angår spesielt fremstilling avVAC-

proteiner som i det vesentlige er fri fra dyrisk vev, fortrinnsvis i det vesentlige foreligger i ren form.

Egnede utgangsmaterialer for isolering av VAC-proteiner utgjøres av blodkarvegger samt sterkt vaskularisert vev fra forskjellige pattedyr, som f.eks. storfe, rotte, hest og mennesker eller fra endotelcellekulturer av disse pattedyr. Spesielt er arterieveggene fra storfe, rotter, hest og mennesker, så vel som humane navlestrengs-vener og -arterier egnet.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles de blodkoagulasjonshemmende proteiner ved at blodkarvegger, sterkt vaskularisert vev eller endotelcellekulturer

a) homogeniseres og differensialsentrifugeres, hvorpå den ovenstående væske i vilkårlig rekkefølge underkastes ett

eller flere av de følgende opprensningstrinn:

b) bunnfelling med salt,

c) affinitetskromatografi,

d) ionevekslerkromatografi,

e) kromatografi på molekylarsikt, idet de efter trinnene b), c), d) og e) oppnådde fraksjoner undersøkes med hensyn til

tilstedeværelse av antikoagulerende proteiner, ved hjelp

av et ett-trinns koaguleringsforsøk, og de oppnådde produkter fra b), c), d) og e) kan eventuelt dialyseres, og eventuelt foretas en ytterligere opprensning ved hjelp av immuno-adsorpsjonskromatografi, og eventuelt renses proteinene ved hjelp av fosfolipid-vesikler.

Spesielt foretas fremgangsmåten ved at det for bunnfellingen i trinn b) benyttes ammoniumsulfat, for kromatograferingen i trinn c) benyttes hydroksyapatitt, for kromatograferingen i trinn d) benyttes DEAE-Sephacel og for kromatograferingen i trinn e) benyttes Sephadex G-100, resp. G-75.

Ved siden av den klassiske antitrombosebehandling, peroral antikoagulasjon, er det i senere tid ved manifeste tromboser gitt biosyntetisk vev-plasminogenaktivator intravaskulært (N. Engl. J. Med. 3J_0, 609-613 (1984)).

Proteinene fremstillet i henhold til oppfinnelsen er meget velegnet, spesielt siden de blodkoagulasjonshemmende egenskaper samtidig med hemmingen av den koagulasjonshemmende blodplateaggregasjon, forebygger tromboser, for eksempel ved operasjoner.

Proteinene fremstillet i henhold til oppfinnelsen kan således også benyttes som antitrombotisk middel.

Resultatet avVAC-isolering og rensing av hovedpulsårer fra storfe er angitt i Tabell A. Bestemmelsen av mengden av VAC-aktivitet i den overstående væske ved 100.000 x g sentrifugering var i dette tilfelle irrelevant på grunn av en viss prokoagulant aktivitet. Komponentene som forårsaket denne aktivitet kunne utfelles med ammoniumsulfat ved en metningsgrad på 35 %. Etter utfellingen med 35 % ammoniumsulfat kunne det fastslås at den overliggende oppløsning oppviste 100 % VAC-aktivitet. Oppløsningen ble konsentrert ved tilsetning av ammoniumsulfat til en metningsgrad på 90 %. Det VAC-protein-holdige bunnfall ble i nærvær av TBS bundet til en hydroksyapatitt-søyle. Etter vaskingen ble VAC-proteinene eluert fra søylen ved hjelp av en økende fosfatgradient. Ved lavere ione-styrke ble VAC-proteinene bundet til en DEAE-Sephacel-søyle. Elueringen av VAC-proteinene fra denne søyle ble foretatt med en økende NaCl-konsentrasjonsgradient. Ved den avsluttende opprensing ble proteinene adskilt på basis av deres molvekter ved gelfiltrering på Sephadex G-100. For å holde interaksjonen av VAC med Sephadex-materialet på et minimum utgjorde eluerings-midlet en buffer med høyt saltinnhold. Fra denne søyle ble VAC eluert i et volum som utgjorde ca. 1,6 ganger det tomme søylevolum (se Figur 1). Totalutbyttet av VAC-aktivitet etter denne avsluttende opprensing utgjorde 35 %. Ifølge SDS-PAGE inneholder alle G-100 fraksjoner som oppviser VAC-aktivitet,

to polypeptider (molvekt 34.000 resp. 32.000). I noen tilfelle viste også en fraksjon med molvekt 60.000 VAC-aktivitet. Ifølge SDS-PAGE er bare frontfraksjonene 138-140 homogene med henblikk på de to polypeptider.

I Tabell A er opprensningsdataene for storfe-aorta sammen-stillet. G-100 fraksjonene som var homogene med hensyn til de to polypeptidene, ble benyttet i de øvrige eksperimenter i denne beskrivelse, bortsett fra forsøkene for å karakterisere bindingen av VAC til fosfolipid-liposomer.

I G-100 fraksjon 139, ble det fastslått 3,4 % VAC-aktivitet med en spesifikk aktivitet på 1480 enheter/mg protein ved hjelp av ett-trinns-koagulasjonsforsøk. Denne fraksjon inneholdt ingen påvisbare fosfolipidmengder, og ut fra absorbsjonen ved 280 nm og proteininnholdet ble det for dette rensede VAC-preparat beregnet en ekstingsjonskoeffisient på

Karakterisering av VAC

Som det fremgår av Figur 2, utgjør de to polypeptidene med molvekter på 34.000 og 32.000 som foreligger i det rensede proteinmateriale og som VAC-aktiviteten tilskrives, proteiner med en enkelt kjede. Ved hjelp av Schiffs reagens med basisk fuksin er det fastslått at begge proteiner inneholder få karbohydratgrupper. I begge proteiner kunne det dessuten registreres Gla-grupper. Av den isoelektriske fokusering fremgår det at begge proteiner vandrer i form av et enkelt bånd, noe som tilsvarer et isoelektrisk punkt på 4,4 til 4,6 (sml. Figur 3).

VAC-aktiviteten ble utvunnet fra PAG-platen ved å eluere dette bånd ut fra gelet. En analyse av eluatet med SDS-PAGE viste igjen at begge proteiner var tilstede. Det kunne dermed bekreftes at begge proteinene vandrer som et enkelt bånd under PAG-platens pH-gradient. Som kontroll av metodikken ble humant hemoglobin (Hb) likeledes undersøkt ved hjelp av isoelektrisk fokusering. Den fastslått verdi på 6,8 stemmer overens med litteraturangivelsene (sml. Figur 3).

Av bindingsforsøk fremgikk det at VAC-aktiviteten kan bindes til negativt ladede fosfolipidmembraner. Denne binding skjer i nærvær av Ca og Mn , men ikke i nærvær av Mg og når divalente metallioner (sml. Tabell D) mangler. Bindingen av VAC-aktiviteten til liposomer er reversibel og kan oppheves med reagenset EDTA.

Ved hjelp av SDS-PAGE kunne det vises at begge proteiner

kan bindes til liposomer i nærvær av Ca<2+>og at bindingen ved

tilsetning av EDTA dissosierer igjen (sml. Figur 4); en ny indikasjon på at VAC-aktiviteten kan tilskrives disse to proteiner.

Ved oppbevaring i TBS som inneholder 10 % glycerol, er VAC-aktiviteten stabil i minst tre måneder ved -70°C, minst 12 timer ved 0°C og minst i time ved 37°C. Ved 56°C forsvinner aktiviteten i løpet av 2 minutter.

Virkning av VAC

Ifølge ett-trinns koagulasjonsforsøket forlenger VACKoagulasjonstiden, hvorunder koaguleringen utløses med BTP. Erstatning av BTP med renset storfetrombin eller den rensede storfefaktor X^ i dette forsøk, viser at VAC bare forlenger koaguleringstiden når faktor X3.benyttes for å utløse koagulasjonen og at den trombininduserte koagulasjon ikke påvirkes av VAC. Dette tyder på at VAC hemmer faktor X cl-aktiviteten direkte eller at en interaksjon med protrombinasekomplekset inntrer. For videre undersøkelse ble forsøk med amidolytisk trombin-dannelse gjennomført med den rensede storfefaktor X Si og protrombin. Figur 5 viser at når protrombin aktiveres av faktor X ai nærvær av Ca<2+>og fosfolipid, til trombin, hemmer VAC protrombinaktiveringen og at inhiberingsgraden avhenger av VAC-konsentrasjonen. En hemmende effekt av VAC er dessuten sterkere ved en lavere fosfolipidkonsentrasjon.

Figur 6 fremstiller fosfolipidavhengigheten av den VAC-induserte inhibering av protrombinaktiveringen. Det er bemerkelsesverdig at trombinaktiveringen av faktor Xa=ikke hemmes av VAC ved en fosfolipidkonsentrasjon på 0. Ved kontroll-forsøk har det vist seg at målesystemet ikke påvirkes av VAC selv.

Inkubering av 5 aiM fosfolipid (PS/PC; 1:4 mol/mol) med 107 ug/ml VAC (spez. Akt. 1.300 enheter/mg) og 10 mM Ca 2 +førte i løpet av 3 minutter ved 37°C til en svekkelse av prokoagul-eringsaktiviteten. Dette viste at VAC ikke har noen fosfolipase-aktivitet.

I motsetning til AT-III har VAC ingen innvirkning på den amidolytiske aktivitet av det rensede trombin og ingen ved-varende innvirkning på faktor X -aktiviteten slik som man har sett med de kromogene substrater S 2231, resp. S 2237 (sml. Tabell C) . Tabellen viser dessuten at inaktiveringen av faktor Xaog trombin/AT-III ikke forsterkes av VAC. Heparin fører derimot til en avgjørende økning av AT-III-aktiviteten. Dette viser at VAC hverken har noen heparinlignende eller AT-III-lignende aktivitet.

Isoleringen av et nytt humant antikoaguleringsmiddel kan prinsipielt oppnås ved samme isoleringsmetode fra et homogenat av humane navlestrengsarterier.Oppdagelsen av antikoagulanten skyldes dens evne til å forlenge koagulasgonstiden i et protrombin-tidsforsøk. Denne evne ble målbar etter Sephadex G-100-fraksjonering av arteriehomogenatet. Ut fra ytterligere iso-leringer antas at aktiviteten har sammenheng med en eller flere vannløselige substanser som har en negativ, total-ladning ved pH 7,9.

Analyse av Sephadex G-75-fraksjonene (det siste hittil foretatte rensetrinn) ved gel-elektroforese, viser en positiv korrelasjon mellom intensiteten av Mr=32.000-båndet og for-lengelsen av koagulasjonstiden målt i MPTT. Sammenhengen mellom 32K-båndet og antikoaguleringsaktiviteten fremgår utvetydig av at antikoaguleringsaktiviteten bare kan elueres fra 32K-båndet av polyakrylamidgelet. Ved å sammenholde dette med de observa-sjoner at antikoaguleringsmidlet hurtig taper aktiviteten ved inkubering ved 56°C, og at proteolytiske enzymer ødelegger aktiviteten, må det antas at antikoaguleringsaktiviteten skyldes et enkelt protein med én tilsynelatende molvekt på 32.000 Dalton.

Trypsin, i motsetning til protease type I, er en dårlig inaktivator av antikoagulasjonsmidlet. Dette tyder på at antikoagulasjonsmidlet har et lite antall lysin- og arginin-rester som er tilgjengelige for trypsin.

Arten av den antikoagulerende aktivitet ble undersøkt ved

å utløse koagulasjonen på forskjellige måter. Koagulasjon indusert enten med den vaskulære prokoagulant, HTP, eller med faktor X cl, inhiberes av antikoagulanten, mens derimot trombin-indusert koagulasjon ikke inhiberes. Herav kan det sluttes at antikoagulanten interfererer med trombindannelsen, ikke med trombinvirkningen.

For ytterligere å undersøke antikoagulasjonsmekanismen av forbindelsen, ble det benyttet protrombinase, rekonstituert fra rensede faktorer og protrombin (2) .

Under de nevnte eksperimentelle betingelsene kan antikoagulanten inhibere aktiveringen av protrombin via den komplette protrombinase (faktor X Cl , faktor V cl , fosfolipid, Ca<2+>) og « via fosfolipidbundet faktor X (faktor X , fosfolipid, Ca +), men ikke via den fri faktor X (faktor X , Ca ).

a a

Tidsforløpet av protrombin-aktiveringen i nærvær av antikoagulant tyder på enøyeblikkelig inhibering av protrombin-aktiveringen som holder seg konstant. Det kan derfor trekkes

den slutning at antikoagulanten hverken virker gjennom en fosfolipase- eller gjennom en proteolytisk aktivitet. Det faktum at protrombin-aktiveringen av faktor Xclog Ca2 + ikke påvirkes av antikoagulanten i det hele tatt, gir en sterk indikasjon på at antikoagulasjonsmekanismen av den vaskulære forbindelse er forskjellig fra mekanismen for velkjente plasma-protease inhibitorer, så som antitrombin III. Siden Walker et al., (8) har vist at aktivert protein C ikke inhiberer protrombin-aktiveringen gjennom faktor X a. Ca<2+>og fosfolipid, kan forbindelsen i henhold til oppfinnelsen heller ikke være protein C.

Foreløpige bindingsundersøkelser tyder på at den vaskulære antikoagulant sannsynligvis interfererer med lipidbindingen til faktor Xaog/eller protrombin. Om antikoagulasjonsmidlets evne til å inhibere protrombin-aktiveringen helt forklarer dens for-lengende virkning på protrombintiden, gjenstår å fastslå.

At denne inhibitor kan finnes i forskjellige arterietyper men ikke i et svakere vaskularisert vev, kan tyde på at det er funnet en fysiologisk modolator av hemostase og trombose som er aktiv på det vaskulære nivå.

På basis av de fastslåtte egenskaper og virkninger av

VAC, kan blodkoagulasjonsmekanismen under VAC-påvirkning tydes

på følgende måte:

VAC bindes via Ca<2+->ioner til negativt ladede fosfolipider, som opptrer ved skade av vev og/eller ved stimulerte blodplater, og nedsetter derved bindingen av bestemte koagulasjonsfaktorer (vitamin K-avhengige koagulasjonsfaktorer) til den negativt ladede fosfolipidoverflate som virker som en katalytisk overflate for disse koagulasjonsfaktorene (Biochem. Biophys. Acta., 515, 163-205 (1978) med den følge at de fosfolipid-avhengige blodkoagulasjonsreaksjonene hemmes av VAC. På basis av virkningsmekanismen kan VAC innordnes i proteingruppe 3

(se ovenfor).

Det er imidlertid av avgjørende betydning at VAC skiller seg fra proteinene innen denne gruppe ved at de ikke hydrolyserer fosfolipidene og således ikke kan ødelegge vesentlige menbranstrukturer!

Følgende egenskaper ved VAC som hittil ikke er beskrevet hos kjente antikoagulasjonsmidler, er spesielt betydelige og fordelaktige: - Antikoagulasjonseffekten av VAC er avhengig av den fosfolipidmengde som deltar i koagulasjonsprosessen. Denne avhengighet bevirker at koagulasjonsprosessen, som for eksempel er utløst av en liten skade i en karvegg og/eller en svak blodplate-aktivering, f.eks. gjennom en trombotisk prosess, overraskende kan hemmes av VAC! Derimot hemmes ikke koagulasjonsprosesser utløst av en drastisk karveggs-skade hvor fosfolipidene opptrer i høy konsentrasjon, nettopp på grunn av disse høye fosfolipid-konsentrasjonene! Faren for blødning ved brukKav VAC er derfor forbausende liten.

I motsetning til alle hittil kjente antikoagulasjonsmidler som gjør en eller flere koagulasjonsfaktorer uvirksomme og derved øker faren for blødning, har VAC overlegne; egenskaper. - VAC inaktiverer ikke selve koagulasjonsfaktorene. Koagulasjonsfaktorene har derfor mulighet for.å oppfylle sine øvrige oppgaver, hvorav stadig flere avdekkes.. Mange aktive koagulasjonsfaktorer har for eksempel den viktige ikke-hemostatiske kjemotaksis-oppgave for inflammator-cellen. Denne celle bidrar til tilheling av en skadet karvegg.

Denne prosess påvirkes ikke av VAC!

Foreliggende oppfinnelse beskriver for første gang en ny klasse av blodkoagulasjonshemmende proteiner som ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene. De etterfølgende illustrerende eksempler og de angitte egenskaper skal ikke begrense oppfinnelsen på,noen måte. Ved hjelp av de beskrevne fremgangsmåter vil det være mulig for fagmannen å frembringe andre proteiner med blodkoagulasjonshemmende egenskaper som ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene. Også disse proteiner om-fattes av foreliggende oppfinnelse. Forkortelser benyttet i denne beskrivelse, har følgende betydninger:

VAC : vaskulær antikoagulant

PFP :.blodplatefritt plasma

TBS : 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH 7,5

EDTA : etylendiamintetraeddiksyre

TBSE : TBS med 2 mM EDTA

BTP : tromboplastin fra storfehjerner

HTP : tromboplastin fra menneskehjerner

TBSA : TBS med 0,5 mg/ml humant serumalbumin, pH 7,9 S 2337 : N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-pipecolyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydroklorid

S 2238 : H-D-fenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydroklorid

AT-III : humant antitrombin III

S.A. : spesifikk aktivitet

01e2Gro-P-Cho: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin 01e2Gro-P-Ser: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoserin Gla : gamma-karboksy-glutaminsyre

Når det gjelder blodkoagulasjonsfaktorene, er nomen-klaturen anbefalt av "Task Force on Nomenclature of Blood Clotting Zymogens and Zymogens intermediates" benyttet. Materialer;

Kjemikaliene for den analytiske SDS-PAGE og hydroksyapatitt HTP var fra Bio-Rad, Sephadex G-100 og G-75, DEAE-Sephacel og "Low Molecular Weight Calibration Kit" fra Pharmacia, det kromogene substrat S 2337 og S 2238 fraKabi Vitrum og Diaflo PM-10 ultrafiltreringsmembraner fra Amicon.

Eksempel I

Isolering og rensing av VAC

I løpet av i time etter slakting ble storfeets pulsårer tatt ut. Blodet ble samlet i trinatriumcitrat (sluttkonsentrasjon 0,38 vektprosent) og sentrifugert i 10 minutter ved romtemperatur under 2000 x g. Plasmaet som inneholdt små mengder blodplater ble deretter sentrifugert igjen (15 min. ved 10.000 x g). På denne måte ble det oppnådd blodplatefritt plasma (PFP).

Umiddelbart etter uttaket ble dyrenes pulsårer spylt grundig med TBS. Intima ble løst fra pulsåren-;ved homogeni-sering i en hurtiggående homogenisator, f.eks..Braun MX 32, i TBSE som inneholdt soyabønne-trypsin-inhibitor.- (16 mg/liter) og benzamidin (1,57 g/liter).

Det homogeniserte materialet fra 8 pulsårer, som inneholdt 20 % (vekt/volum) faststoff, ble sentrifugert 60 minutter ved 100.000 x g. Den overstående væske ble tilsatt fast ammonium-sulf at til 30 % metning, omrørt i 30 minutter og deretter sentrifugert i 20 minutter ved 12.000 x g. Den resulterende væske ble tilsatt ammoniumsulfat til 90 % metning, omrørt i 30 minutter og deretter sentrifugert i 20 minutter ved 12.000

x g. Faststoffet ble suspendert i et lite volum TBS og dialysert mot benzamidinholdig (1,57 g/liter) TBS. Den dialyserte fraksjon ble påsatt på en hydroksyapatitt-søyle (1 x 20 cm) som var stabilisert med TBS. Søylen ble vasket med 4 ganger sjiktvolumet TBS. VAC-proteinene ble.: eluert med 200 ml natriumfosfatbuffer (pH 7,5) med en lineær gradient på 0-500 mM. De oppnådde VAC-fraksjoner ble slått sammen og dialysert mot

50 mM NaCl, 20 mM tris/HCl, pH 7,5.

Den samme bufferoppløsning ble benyttet til stabilisering av en DEAE-Sephacel-søyle (3x5 cm) som ble benyttet til kromatografering av det dialyserte VAC-materialet. Søylen ble vasket med 4 ganger sjiktvolumet av stabiliseringsbufferen før VAC ble eluert med 200 ml NaCl-oppløsning i 20 mM tris/HCl,

pH 7,5, med en lineær gradient på 50-300 mM. De VAC-holdige fraksjonene ble samlet opp, dialysert mot 500 mM NaCl, 20 mM tris/HCl, pH 7,5, og deretter konsentrert i en Amicon-konsentra-sjons-celle ved bruk av en PM-10 ultrafiltreringsmembran. Konsentratet som hadde et volum på 2 ml, ble anbrakt på en Sephadex G-100 søyle (3 x 80 cm) som på forhånd var stabilisert med 500 mM NaCl og 20 mM tris/HCl, pH 7,5.

Eluatet ble samlet opp i 2 ml fraksjoner og de virksomme fraksjonene separat dialysert mot 10 volumprosent glycerolholdig TBS og oppbevart ved -70°c. Hele renseprosessen ble foretatt ved 0-4°C.

Bestemmelse av VAC- aktiviteten

For å bestemme VAC-aktiviteten ble det benyttet to forskjellige metoder: a) ett-trinns-koagulasjonsforsøket (modifisert protrombin-tidsforsøk) b) et trombindannelsesforsøk

Ett-trinn-koagulasjonsforsøket ble utført på følgende

måte:

I en silikonisert glasskyvette ble 175^,ul av test-fraksjonen eller 175^,ul TBS som kontroll, omrørt med 50^,ul PFP og 25^ul fortynnet BTP (9 00 omdreininger/minutt). Etter 3 minutters inkubering ved 37°C, ble koagulasjonen utløst ved tilsetning av 250^ul buffer som inneholdt 80 mM NaCl, 20 mM CaCl2 og 10 mM tris/HCl, pH 7,5. Fibrindannelsen ble registrert optisk ved hjelp av en "Payton Dual Aggregation Module", (Hornstra, G., Phil. Trans. R. Soc. London B., 294, 355-371

(1981). Koagulasjonstiden for kontrollprøven utgjorde 65 sek. Dette forsøk ble benyttet under opprensingen for å teste de forskjellige fraksjoner på VAC-aktivitet. Ved bestemmelsen av VAC-utbyttet under opprensingen ble en enhet for VAC-aktiviteten definert som den VAC-mengde som forlenget koaguleringstiden opp til 100 sekunder i dette forsøk.

Enkelte ganger ble BTP erstattet med renset storfetrombin eller renset storfefaktor Xcl. I dette halvrensede koagulasjonssystem ble mengden av trombin eller faktorXa, valgt slik at kontrollprøvens koagulasjonstid likeledes utgjorde 65 sekunder.

Trombindannelsesforsøket ble utført på følgende måte:

20^ul opprenset storfefaktor Xfl(150 nM), 30^ul CaCl2

(100 mM) , 30^,ul fortynnet VAC og 30^ul PS/PC-fosfolipid-membran (sluttkonsentrasjonene er angitt i figurtekstene), ble brakt over i en piastkyvette som inneholdt 181^ul TBSA.

Blandingen ble omrørt i 3 minutter ved 37 C med en teflon-rører. Trombindannelsen ble utløst ved tilsetning av 9^,ul renset storfefaktor II (33,33^,uM). Til forskjellige tidspunkter ble det fra reaksjonsblandingen tatt ut prøver på 50^,ul som ble tilsatt til innholdet i en plastkyvette på 1 ml og som ved hjelp av termostat, ble holdt på 37°C og inneholdt 900^,ul TBSE og 50^ul av det kromogene substrat S 2238 (5 mM). Fra ekstingsforandringen ved 405 nm som ble målt .med et Kontron spektrometer Uvikon 810, ble trombinmengden iireaksjons-blandingen beregnet ved å benytte en kalibrerihgskurve som var fremstillet på basis av kjente mengder opprenset storfe-trombin. Den prosentuelle inhibering forårsaket av VACCble definert som følger:

hvor "a" står for hastigheten av trombindannelsen i nærvær av VAC, uttrykt i nM II a/min. og "b" for hastigheten av trombindannelsen uten VAC, uttryket i nM IIa/min.

Proteiner

De vitamin K avhengige faktorene protrombin og faktor X2ble oppnådd ved rensing av citratholdig storfeplasma (sml. Stenflo J., J. Biol. Chem., 251, 355-363 (1976)). Etter barium-citratadsorbsjon og eluering, fraksjonering med ammoniumsulfat og DEAE-Sepahdex-kromatografi, forelå to proteinfraksjoner som inneholdt en protrombin/faktor IX-blanding, henholdsvis faktor X. Faktor X ble oppnådd etter Fujikawa et al., Biochemistry, 11, 4882-4891 (1972), og aktivert ved bruk av RW-X (Fujikawa et al.,Biochemistry, 11, 4892-4899 (1972)). Protrombin ble skilt fra faktor IX ved heparin-agarose affinitetskromatografi (Fujikawa et al.,Biochemistry, 12, 4938-4945)). De protrombinholdige fraksjonene fra heparin-agarose søylen ble slått sammen og videre opprenset etter Owens et al., J. Biol. Chem., 249, 594-605 (1974)). Konsentrasjonen av protrombin og faktor XcLble bestemt etter Rosing et al., J. Biol. Chem., 255, 274-283

(1980).BTP ble fremstillet etter en normalmetode beskrevet av van Dam-Mieras et al., i "Blood coagulation enzymes, Methods of Enzymatic Analysis" Verlag Chemie GmbH, Weinheim Vest-Tyskland. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt etter Lowry et al., J.

Biol. Chem., 1_9_3, 265 (1951).

Fremstilling av fosfolipid, fosfolipid- membran og fosfolipid-liposom

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (18:1/18:1. -PC)

CXS Cio

og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoserin (18:1./18:1. -PS)

ble fremstillet som beskrevet av Rosing et al., J. Biol. Chem., 255, 274-283 (1980). Enkelte fosfolipidmembraner av PC og PS som besto av to sjikt, ble fremstillet ved bruk av ultralyd slik som beskrevet avRosing et al., J. Biol. Chem., 225, 274-283 (1980). En stamoppløsning av fosfolipid-liposomer ble fremstillet ved oppløsning av den nødvendige fosfolipidmengde i kloroform. Kloroformen ble fordampet med nitrogen. Det gjen-værende fosfolipid ble suspendert i 5 % glycerolholdig TBS, blandet forsiktig i 3 minutter med noen små glasskuler og deretter sentrifugert i 10 minutter ved 10.000 x g. Den overstående væske ble kassert og residuet forsiktig suspendert igjen i 5 % glycerolholdig TBS. På denne måte ble fosfolipid-liposom-stamoppløsningen oppnådd. Den ble oppbevart ved romtemperatur. Fosfolipidkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av fosfatanalysemetoden etter Bottcher et al., Anal. Chim. Acta, 24, 203-207 (1961).

SDS- PAGE

Gel-elektroforese på plater i nærvær av SDS ble utført etter metoden beskrevet av Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970) under anvendelse av et gel som inneholdt 10 vektprosent akryla amid, 0,27 vektprosent N/N 3-metylen-bisakrylamid og 0,1 vektprosent SDS. I gelprøver med reduserte disulfidbroer forelå

5 vektprosent Ø-merkaptoetanol. Gelprøvene ble farvet på følgende måte: 1) med 0,25 vektprosent Coomassie Blue R-250 i 50 vektprosent etanol og 15 vektprosent eddiksyre og avfarvet i 10 vektprosent etanol og 10 vektprosent eddiksyre, 2) med Schiffs reagens, fremstillet av basisk fuchsin (Merck) etter Segrest et al., beskrevet i "Methods inEnzymology", Vol. 28, 54-63 (1972) eller 3) med sølv som beskrevet av Merril et al., i Electrophoresis, 3, 17-23 (1982).

Elektrofokusering

De isoelektriske pH-bestemmelsene av proteiner ble utført med ferdige tynnskikt-polyakrylamidgel som inneholdt amfolin-bærer-amfolytter (PAC-plater, LKB) ved en pH i området 3,5-9,5 etter produsentens anvisning. Gelets pH-gradient ble omgående bestemt etter elektrofokuseringen ved å skjære av en strimmel av gelet langs en linje mellom anoden og katoden. Elektro-lyttene ble eluert ut fra hver strimmel med destillert vann og pH-verdien av vannet målt med en kombinasjons-glasselektrode.

Glutaminsyrebestemmelse

Gla-bestemmelsen ble utført ved HPLC på en "Nucleosil 5SP"-kolonne (CHROMPAK) etter Kuwada et al., Anal. Biochem., 131, 173-179 (1963).

Eksempel II

Tilkobling av fosfolipider til Spherocil

De nødvendige fosfolipider ble løst opp i kloroform og tilsatt til søylematerialet Spherocil (firma Rhone-Poulenc ) i et forhold på 5 mg fosfolipid pr. g Spherocil. Kloroformen ble fordampet med N2~gass og det tørre Spherocil-fosfolipid deretter vasket med buffer inneholdende VAC som en suspensjon. VAC bindes til Spherocil-fosfolipid i nærvær av Ca<2+>og/eller Mn + når en del av fosfolipidene er negativt ladet.

Eksempel III

50yUl citratholdig blodplatefritt plasma ble blandet med 200^1 buffer (25 mM tris/HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) som inneholdt kaolin (kunstig overflate, som katalyserer den vesentlige koagulasjon, i dette tilfelle oppmalt glass), inositin (fosfo-lipidkilde) og VAC. Denne blanding ble inkubert 3 minutter ved 37°C, hvorpå 250^ul Ca<2+->buffer (200 mM tris/HCl, pH 7,5,

80 mM NaCl, 20 mM CaCl2)#ble tilsatt. Koagulasjonstiden ble målt som i Eksempel I.

Eksempel IV

Humanblod uttatt ved venepunksjon og oppsamlet4 i trinatriumcitrat (sluttkonsentrasjon ca. 13 mM citrafe):.; ble sentrifugert ved romtemperatur i 10 minutter ved 2000\xxg.. Det resulterende plasma ble sentrifugert om igjen i^15 minutter ved 10.000 x g for å oppnå blodplatefritt plasma (PFP)''<1>. Et standard forråd avPFPble fremstillet ved å blåndeeplasma fra flere friske blodgivere.

Humane navlestrenger ble tatt ut innen 15 minutter etter fødsel. Arteriene ble straks gjennomspylt med iskald TBS-buffer, deretter befridd fraWarton's gel (Jelly of Warton):,og homogen-isert i TBS med en Braun MX32 homogenisator. Et 10% (vekt/- volum) homogenat ble deretter fraksjonert.

Fraksjoneringen av den overstående væske etter, sentrifugering ved 10.000 x g av homogenatet på Sephadex, G-100, resulterte i en reproduserbar spesifikk elueringsprofil (Fig. 7). De fraksjoner som påvirket koaguleringssystemet i henhold til målingen med MPTT, eir angitt i Fig. 7. En prokoagulant-aktivitet eluerte med 0-retensjonsvolumet. Denne aktivitet kan bare på-vises i nærvær av faktor VII i MPTT ifølge forsøk hvor human kongenital faktor-VII-deficient: plasma ble benyttet. Denne prokoagulant må derfor antas å være vevs-tromboplastin.

Noen fraksjoner oppviste en klar antikoagulånt-aktivitet. Disse fraksjonene ble slått sammen og renset videre-_ved DEAE-Sephacel kromatografi (Fig. 8A). Antikoagulanten syntes å binde seg til DEAE-Sephacel ved en sluttkonsentrasjon på 50 mM NaCl og 50 mM tris/HCl, pH 7,9. Elueringen av aktiviteten^ble oppnådd ved 150-160 mM NaCl ved bruk av en lineær gradient'av NaCl med pH 7,9. De DEAE-fraksjoner som hadde antikoagulånt-aktivitet ble slått sammen og underkastet Sephadex G-75 gelfiltrering (Fig. 8B) Søylen (1,5 x 50 cm) ble stabilisert med TBS. Aktiviteten viste seg i fraksjoner med molvekt på 30.000-60.000 Dalton.

MPTT ble benyttet som kvantitativ test for bestemmelse av mengden av antikoagulånt-aktivitet (Fig. 9). En enhet av antikoagulånt-aktivitet ble definert som den mengde som forlenget koagulasjonstiden i MPTT når HTP (sluttkonsentrasjon 95^ug protein/ml) ble.benyttet som koagulasjons-initiator, fra kontroll-verdien på 65 sekunder til 100 sekunder. Med denne metode ble det beregnet at det fra 10 g fuktig arterielt vev kunne isoleres 2 mg protein med ca. 1200 enheter antikoagulånt-aktivitet.

Modifisert protrombin- tidstest ( MPTT)

Den modifiserte protrombin-tidstest (MPTT) ble utført som følger: i en silikonisert glasskyvette ble 50^ul PFP omrørt ved 37°C med 150^ul TBS, 25^ul av en standard HTP-fortynning og 25yUl TBS (kontroll) eller 25^ul av en fraksjon av arteriehomogenatet. Etter inkubering i 3 minutter ble koagulasjonen utløst ved tidspunktet 0 ved tilsetning av 250^ul Ca +-buffer (80 mM NaCl, 20 mMCaCl2og 10 mM tris/HCl, pH 7,9). Fibrindannelsen ble registrert optisk med en "Payton Dual Aggregation Module" (13). Når det for å utløse koagulasjonen i MPTT ble benyttet faktor X , bleHTP utelatt og 25,ul renset faktor X

a 2+ ' a tilsatt sammen med de 250^,ul Ca -buffer til det fortynnede PFP.

Modifisert trombin- tidstest ( MTT)

Denne undersøkelse ble utført på samme måte som den ovenfor beskrevneXa~initierte MPTT, med den eneste forskjell at X a -preparatet ble erstattet med 25/,ul renset trombin.

Proteiner

Protease type I og trypsin (EC 3.4.2.1.4) ble levert av Sigma. HTP ble fremstillet av menneskehjerner som beskrevet av van Dam-Mieras et al., (14). Faktor Xa.protrombin og trombin ble renset fra citrert storfeblod som beskrevet av Rosing et al., (2). Faktor V ble renset fra storfeblod som beskrevet av Lindhout et al., (15). Faktor V able oppnådd ved å inkubere faktor V med trombin (15). Protrombinkonsentrasjonene ble beregnet fra M r =72.000 og Aooru i = 15,5 (16) „og faktor V konsentrasjonen ble beregnet fra Mr=330.000 og A2g0=9,6 (17). Faktor Xfl-og trombin-konsentrasjonene ble bestemt ved titrering (2) av aktive seter. Andre proteinkonsentrasjoner ble bestemt etter Lowry et al., (18).

Fremstilling av fosfolipid og fosfolipid- vesikler

01e2Gro-P-Cho og 01e2Gro-P-Ser ble fremstillet som beskrevet av Rosing et al., (2).

Enkle dobbeltlags vesikler bestående av Ole2Gro-P-Ser/01e2~Gro-P-Cho (molforhold 20:80), ble produsert ved ultralyd-behandling (2).Fosfolipidkonsentrasjonene ble bestemt ved

fosf at-analyse etter metoden til Bottcher et': al., (19).

Måling av protrombin- aktiveringen

Tidsforløpet av protrombin-aktiveringen ble undersøkt ved forskjellige konsentrasjoner av antikoagulantv.Blandinger av (X a . Ca2 + ) , (X a , fosfolipid, Ca2 + ) eller (X a ,-Va,, fosfolipid,

Ca<2+>), ble omrørt med forskjellige mengder avvantikoagulantet ved 3 7°C i 50 mM tris/HCl, 175 mM NaCl, 0,5 mg/ml humant serumalbumin ved pH 7,9. Etter 3 minutter ble protrombin-aktiveringen startet ved tilsetning av protrombin. Til forskjellige tidspunkter ble prøver på 25 ,ul overført fra reaksjpnsblandingen til en kyvette (termostatert til 37 oC) som inneholdt TBS, 2 mM EDTA og 0,23 mM S 2238 (sluttvolumet var 1 ml) >. Fra absorbsjons-forandringen ved 4 05 nm, målt med et Kontron spektrofotometer Uvikon 810, og en kalibreringskurve tatt opp med kjente mengder renset trombin, ble mengden av det dannede trombin-beregnet ved forskjellige antikoagulant-konsentrasjoner.

Fosfolipidet ble tilsatt som vesikler av 01e2Gro-P-Ser og 01e2Gro-P-Cho i et molforhold på 20:80.

Karakterisering

Flere fraksjoner fra G-75 kromatograferingen ble undersøkt ved MPTT og analysert med SDS-PAGE. Resultatene (Fig. 10)

tyder på at antikoagulanten hadde en molvekt påa.ca. 32.000 Dalton. Sammenhengen mellom antikoagulånt-aktivitet og 32K-båndet ble bekreftet ved å snitte opp polyakrylamidgelet og deretter eluere proteinene fra strimlene med TBS inneholdende 0,5 mg/ml storfe-serumalbumin. Det ble funnet antikoagulånt-aktivitet bare i eluatet fra strimler som stemte overens med 32K-båndet. Det viste seg dessuten at aktiviteten er termolabil ved 56°C og at den oppviser et tilsvarende dose/virknings-forhold i MPTT som utgangsmaterialet.

G-75 fraksjonene som inneholdt hoved-antikoagulant-aktiviteten, ble slått sammen og benyttet for ytterligere karakterisering av antikoagulanten. Inkubering av antikoagulanten ved 56°C reduserte aktiviteten hurtig inntil det etter 2 min. ikke kunne måles noen aktivitet lenger. Antikoagulanten taper aktiviteten fullstendig i løpet av 2 timer etter inkubering ved 3 7°C med protease type I, mens trypsin knapt inaktiverer anti koagulanten etter 3 timers inkubering (Fig. 11). Protease type-I- og trypsin-konsentrasjonen benyttet i disse eksperimenter, inaktiverte fullstendig 2,5 nM trombin i løpet av 15 minutter. Mengden av protease type I og trypsin som ble overført til

MPTT med reaksjonsblandingene, hadde ingen effekt på kontroll-prøvens koagulasjonstid.

Virkningsmåte

MPTT forlenges i nærvær av antikoagulanten (Fig. 12) både ved aktivering med HTP og ved utløsning med faktor X3.. Den trombin-induserte koagulering inhiberes imidlertid ikke.

På grunn av disse funn ble også effekten av antikoagulant på omdannelse av protrombin til trombin av faktor X , faktor

2 +

V a, fosfolipid og Ca , undersøkt. Under de omtalte forsøks-betingelsene, ble trombindannelsen inhibert av antikoagulanten på en doseavhengig måte (Fig. 13A). Aktiveringen av protrombin av faktor X a . fosfolipid og Ca<2+>uten faktor V a, kan inhiberes også av antikoagulanten (Fig. 13B). Denne inhibering ses imidlertid ikke dersom aktiveringen skjer uten fosfolipid

(Fig. 13C).

Eksempel V

Polyklonale antistoffer mot VAC

Polyklonale antistoffer mot storfe-VAC ble utviklet i kanin. Storfe-VAC, renset etter den beskrevne fremgangsmåte, ble blandet med samme volum av fullstendig Freund's adjuvans. Blandingen ble injisert subkutant i kaninen. Etter 4 uker fikk kaninen en "booster" -injeksjon av renset storfe-VAC. "Booster"-injeksjonen ble gjentatt to ganger med to ukers mellomrom. 10 dager etter den siste "booster"-injeksjon ble det tatt ut en prøve blod som fikk koagulere for å oppnå serum. Immunoglobuliner (lg) isoleres fra serumet etter følgende metode.

a) Serumet ble oppvarmet i 30 min. til 56°C.

b) Serumet avsettes deretter på DEAE-Sephacel som stabiliseres med 50 mM tris, 100 mM NaCl, pH 8,2. c) Ikke-bundet protein utfelles med (NH4)2S04ved en metningsgrad på 50 %. d) De utfelte proteiner pelleteres ved sentrifugering og pelletmassen resuspenderes i 50 mM tris,,100 mM NaCl,

pH 7,9 og dialyseres omhyggelig mot den." samme buffer.

e) Den oppnådde proteinblanding inneholder.: Ig.

Ved å benytte den beskrevne metode ble det isolert

proteinfraksjoner med VAC-aktivitet fra aorta og lunger fra storfe, fra aorta fra rotte og hest og fra humane navlestrengarterier.

Proteinene ble separert på et polyakrylamidgel ved elektroforese i nærvær av dodekylsulfat under ikke-reduserende betingelser. Etter endt elektroforese ble proteinene overført fra gelet til nitrocellulose-strimler som beskrevet'av Towbin et al., (21) .

Strimlene ble inkubert med anti-VAC lg, hvorpå, de etter grundig vasking ble inkubert med geite-anti-kanin-Ig som var koblet med pepperrot-peroksydase. Sistnevnte ble fremkalt med diamin-benzidin-tetrahydroklorid som er et substrat for per-oksydasen. Et brunt bånd på nitrocellulose-strimmelen indikerte herunder nærvær av geite-kanin-Ig. Flekken inneholdt dessuten anti-VAC-Ig og proteiner som anti-VAC-Ig bindes til.

Immunoblots av proteinene med VAC-aktivitet, isolert fra storfe-aorta, storfe-lunge, rotte- og heste-aorta og humane navlestrengarterier er vist i Figur 14.

Av resultatene kan det trekkes følgende konklusjoner:

Ved bruk av den beskrevne isolasjonsmetode kan det oppnås en proteinfraksjon med VAC-aktivitet fra storfe-aorta, storfe-lunge, rotte- og heste-aorta og humane navlestrengsarterier.

De isolerte proteinfaksjoner med VAC-aktivitet inneholder proteiner med Mr på ± 32.000,<±>34.000 og<1>70.000 som reagerer med anti-VAC-Ig som ble utviklet i kanin mot renset storfe-VAC.

Eksempel VI

Rensetrinn for VAC ved bruk av fosfolipid-vesikler med stort volum.

Fosfolipid-vesikler med stort volum (LW) sammensatt av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoserin (PS) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (PC), ble fremstillet som beskrevet av

P. van de Waart et ai., (20) .

Til rensetrinnet ble det benyttet LW-holdig PS/PC (molforhold 20:80). Andre molforhold kan også benyttes, men negativt ladede fosfolipider må imidlertid være tilstede. Kjede-lengden av fettsyrene i fosfolipidet kan også varieres.

Metode:

LW, - 1 mM fosfolipider i 50 mM tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 7,9, ole blandet med samme volum av en proteinfraksjon med VAC-aktivitet. Proteinene forelå i 50 mM tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,9.Blandingen fikk stå i 5 minutter ved romtemperatur og ble deretter sentrifugert i 30 minutter ved 20.000 x g. Pelleten ble resuspendert i 50 mM tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2/pH 7,9 og sentrifugert om igjen. Den resulterende pellet ble suspendert igjen i 50 mM tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM etylendiamintetraedd-iksyre (EDTA), pH 7,9 og sentrifugert igjen. Den resulterende overstående væske inneholdt VAC-aktiviteten. Denne metode utgjør et effektivt rensetrinn i fremgangsmåten for å oppnå renset VAC.

Figurbeskrivelse

Figur 1 Gelfiltrering av VAC på Sephadex G-100.

Søylen (3 x 80 cm) ble fremstillet med en trykkhøyde på

60 cm og stabilisert med 500 mM NaCl og 20 mM tris/HCl, pH 7,5. Den VAC-holdige fraksjon oppnådd etter DEAE-kromatografi, ble konsentrert til 2 ml og deretter anbrakt på Sephadex G-100. Trykkhøyden på 60 cm ble opprettholdt. Tomvolumet var 24 5 ml (fraksjon 70). Etter disse ble det samlet opp 2 ml fraksjoner. Fraksjonene ble dialysert mot 10 % glycerolholdig TBS, og deretter testet i ett-trinns koagulasjonsforsøket beskrevet i Eksempel I, på VAC-aktivitet. Koagulasjonstidene ble oppnådd ved å fortynne G-100 fraksjonene med TBS i forholdet 1:10. Koagulasjonstiden uten VAC var 65 sekunder.

Figur 2 Analytisk SDS-PAGE av VAC

SDS-PAGE med gel som inneholdt 10 vektprosent akrylamid, 0,27 vektprosent N,N 3-metylenbisakrylamid og 0,1 % SDS, ble utført etter Laemli (Laemli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685).

Tallene på X-aksen har følgende betydning:

1) Materialer med normal molvekt hvor disulfidbindingene er redusert,

2) 25^ug redusert VAC,

3) 25^ug ikke-redusert VAC.

Gelet ble farvet med Coomassie Blue og avfarvet som beskrevet i Eksempel I.

Figur 3 Bestemmelse av isoelektrisk pH for VAC

Elektrofokuseringen ble utført på PAG-plater i pH-området 3,5-9,5 (sammenlign Eksempel I). 200^ug human Hb<1>og 20^ug VAC ble anbrakt på gelet etter at pH-gradienten i gelet var dannet. Human Hb tjente som referanse med det kjente isoelektriske punkt ved pH 6,8. Før farvingen med Coomassie Blue, ble gelet fiksert i 30 minutter med 0,7M trikloreddiksyre.

Figur 4 Analyse av bindingen av VAC til negativt ladede fosfolipid-liposomer med SDS-PAGE

SDS-PAGE ble utført etter Laemli (Laemli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) på samme plater som beskrevet under Figur 2. De analyserte prøvene ble oppnådd fra bindingsforsøkene som nevnt i forbindelse med Tabell B. Tallene langs X-aksen har følgende betydning: 1) Materialer med norm-molvekt hvor disulfidbindingene er redusert, 2) overstående væske oppnådd etter sentrifugering av et VAC-preparat uten nærvær av liposomer, 3) overstående væske oppnådd etter sentrifugering av VAC i nærvær av liposomer, 4) overstående væske oppnådd etter sentrifugering av VACi nærvær av liposomer og Ca2+ og 5) overstående væske oppnådd etter sentrifugering av liposom-bunnfallet fra 4), som var suspendert på nytt i TBS inneholdende 10 mM EDTA.

Figur 5 Effekten av VAC-konsentrasjonen på inhiberingen (%) av trombindannelsen

De angitte VAC-konsentrasjonene er de foreliggende slutt-konsentras joner i forsøkene. Trombindannelsen ble målt med en mikromol protrombin,10nM faktor Xc, l og 0,5M (a-*) eller 5M (•-o) fosfolipid-membran (PC/PS; 4:1, mol/mol) i 10 mM CaCl2~holdig TBSA. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 minutter ved 37 C med de angitte mengderVAC(S.A. 1300 enheter/mg). Ved tilsetning av protrombin til blandingen som i Eksempel I, ble trombindannelsen utløst og hastigheten målt. Hastigheten av trombindannelsen utenVAC utgjorde 3,3 nM II cL/min. (A-A), henholdsvis 10,9 nM II a/min. (•-•).

Figur 6 Fosfolipidkonsentrasjonens effekt på VAC-inhiberingen

(%) av trombindannelsen.

Trombindannelsen ble målt med en mikromol protrombin, 10 nM faktor X a , 10,7/.ug/mlVAC(S.A. 1300 enheter/mg) og forskjellige konsentrasjoner av fosfolipid-membran (PC/PS; 4:1, mol/mol) i TBSA. Faktor X 3., VAC og fosfolipid ble omrørt i TBSA

i 3 minutter ved 37°C. Trombindannelsen ble utløst ved tilsetning av protrombin til reaksjonsblandingen. Hastigheten av trombindannelsen ble målt som beskrevet i Eksempel I. Den prosentuelle inhibering av trombindannelsen (• - •) ble målt for hver fosfolipidkonsentrasjon med den tilsvarende hastighet av trombindannelsen uten VAC (A-A) tilstede.

Figur 7 Gelfiltrering på Sephadex G-100 av den overstående væske etter sentrifugering ved 10.000 x g av et homogenat av navlestrengsarterier. 2 ml av den overstående væske etter sentrifugering ved 10.000 x g ble anbrakt på en Sephadex G-100 søyle (1,5 x 80 cm) som ble stabilisert med TBS. Søylen ble eluert med TBS. Alikvoter av de resulterende fraksjoner ble testet i MPTT.

Visse fraksjoner (SSBS) oppviser prokoagulant-aktivitet og utløser koagulering i MPTT uten tilsetning av HTP, faktor Xcoleller trombin. Andre fraksjoner (EH3 ) forlenger koagulasjonstiden i MPTT under anvendelse av HTP for å utløse koagulering. Disse fraksjonene ble slått sammen og ytterligere fraksjonert.

Figur 8 Kromatografi av antikoagulanten på DEAE-Sephacel (A) og Sephadex G-75 (B).

De samlede antikoagulant-holdige fraksjoner fra Sephadex G-100 søylen ble overført til DEAE-Sephacel. Elueringen ble foretatt med en 200 ml lineær gradient av 50 mM-300 mM NaCl

(---). Fraksjoner (4 ml) ble samlet opp og testet på A2gQ

( ) og på antikoagulånt-aktivitet i MPTT med HTP (slutt-konsentras jon 95^,ug protein/ml) som utløser av koagulas jonen ( •). Fraksjoner med antikoagulånt-aktivitet ble slått sammen, konsentrert og deretter avsatt på Sephadex G-75 (B). Fraksjoner (2 ml) tile samlet opp og testet på A 28Q ( ) og på antikoagulånt-aktivitet ( © ) . Vq representerer søylens 0-retensjons-volum.

Figur 9 Dose/virkning for antikoagulanten i MPTT.

Varierende mengder av antikoagulanten ble tilsatt til

MPTT. Koagulasjonen ble utløst med HTP (sluttkonsentrasjon

95^,ug protein/ml). Kontrollens koagulasjonstid var 65 sekunder.

Figur 10. Gel-elektroforese av forskjellige fraksjoner av

G-75 eluatet.

En bestemt mengde av forskjellige fraksjoner av G-75

eluatet ble underkastet gel-elektroforese som beskrevet tidligere. Gelene ble farvet med sølv etter Merril et al., (12).

Bane 1: reduserte lavmolekylære standarder; bane 2-6: ureduserte alikvoter av G-75 fraksjoner med nummerene 35, 39, 41, 43 og 50.

Figur 11 Effekten av proteolytiske enzymer på antikoagulant-aktiviteten.

Antikoagulanten ble inkubert ved 37°C med protease type I

(ffl , sluttkonsentrasjon 0,11 enheter/ml), trypsin ( A , slutt-konsentras jon 88 BAEE enheter/ml) og uten proteolytiske enzymer (9). Ved de angitte tidspunkter ble 5^ul inneholdende 6^ug antikoagulant protein, tatt ut fra reaksjonsblandingen og tilsatt til MPTT. Koagulasjonen ble utløst med HTP (slutt-konsentras jon 18 protein ^,ug/ml) . Kontrollens koagulas jonstid var 110 sekunder. De angitte enheter for de proteolytiske enzymene er beregnet på basis av verdier fra produsenten.

Figur 12 Effekten av den vaskulære antikoagulant på

koagulasjonstiden i M(P)TT etter induksjon med HTP, faktor X eller trombin.

a

Konsentrasjonene av koagulasjonsutløserne (HTP 18^,ug protein/ml, 1,5 nM faktor X eller 0,4 nM trombin), ble valgt slik at kontroll-koagulasjonstidene utgjorde 110 sekunder

(uskraverte stolper). Når faktor X 3. ble benyttet ble reaksjonsblandingen tilsatt fosfolipid-vesikler (sluttkonsentrasjon 10^uM) bestående av01e2Gro-P-Ser/01e2Gro-P-Cho (molforhold, 20:80). Koagulasjonstidene indusert av de angitte midler i nærvær av 3,5^ug protein antikoagulant, representeres av de skraverte stolper.

Figur 13 Effekten av antikoagulant på protrombin-aktivering med (X , V , fosfolipid, Ca<2+>), (X , fosfolipid, Ca<2+>) og

a2+ a

(Xa, Ca<Z>).

Reaksjonsblandingen inneholdt: (A), 1^uM protrombin, 0,3 nM X a , 0,6 nM V a , 0,5 / .uM fosfolipid og 10 mM CaClz 0 med 12,0 /,ug/ml antikoagulant (iS ), 4,8^ug/ml antikoagulant { A ) og uten antikoagulant ( • ). (B) 1 / ,uM protrombin, . 10 nM X a , 0,5/,uM fosfolipid og 10 mM CaCl2med 2,4^ug/ml antikoagulant ( iffl ), 0,48^ug/ml antikoagulant ( Ék ) og uten antikoagulant ( • ).

(C) 1^,uM protrombin, 75 nM Xflog 10 mM CaCl2med ^O^ug/ml antikoagulant (A ) og uten antikoagulant ( • ). Ved de angitte

tidspunkt ble det uttatt prøver og trombinbestemt som tidligere angitt.

Figur 14 Immunoblots

Disse "blots" ble oppnådd ved å følge den ovenfor angitte fremgangsmåte. Bane 1: proteinfraksjoner med VAC-aktivitet isolert fra storfe-aorta. Bane 2: proteinfraksjon med VAC-aktivitet isolert fra storfe-aorta. Bane 3: proteinfraksjon med VAC-aktivitet isolert storfe-lunge. Bane 4: proteinfraksjon med VAC-aktivitet isolert fra humane navlestrengsarterier.

Bane 5: proteinfraksjon med VAC-aktivitet isolert fra rotte-aorta. Bane 6: proteinfraksjon med VAC-aktivitet isolert fra heste-aorta.

Figur 15 Gel-elektroforese (A) og antikoagulasjonsaktivitet (B)

av de forskjellige fraksjoner av G-75 eluatet.

Bestemte mengder av de forskjellige eluatfraksjoner fra G-75 ble underkastet gel-elektroforese som tidligere beskrevet. Båndene ble farvet ved hjelp av sølv etter Merril c. R., Goldman D.,&van Keuren M. L. (1982) Electrophoresis 3, 17-23. Elektroforese-bane 1: norm-materiale med lav molvekt; elektro forese-bane 2-6: ikke-reduserte like mengder av G-75 fraksjonene med tiltagende eluatvolum. Bestemte mengder av G-75 fraksjonene som var analysert ved gel-elektroforese, ble under-søkt i MPTT (se tidligere beskrivelse) ved bruk av HTP for å utløse koagulasjonen. Kontroll-koagulasjonstiden er angitt med uskraverte.stolper.Tallene under de skraverte stolpene tilsvarer elektroforese-baneangivelsene-i Fig. 15A.

Figur 16 Varme-inaktivering av det vaskulære antikoagulasjons-middel

Antikoagulasjonmidlet ble inkubert ved 56°C og etter forskjellige inkubasjonstider ble det tatt ut prøver på 5^ul som inneholdt 3,6^ug protein. Disse ble straks avkjølt med is og deretter testet i MPTT med HPT som koagulasjonsutløser. Koagulasjonstiden for kontrollprøven var 110 sekunder.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av blodkoagulasjonshemmende proteiner, særlig fra arterier og fortrinnsvis fra mennesker, storfe, gnagere eller hestedyr, som - ikke inaktiverer koagulasjonsfaktorene, - ikke hydrolyserer fosfolipider, - bindes via de divalente kationer Ca<2+>og/eller Mn<2+>reversibelt til negativt ladede fosfolipider, - er i stand til å fortrenge faktor Xa og protrombinene fra en negativt ladet fosfolipidoverflate, og - ikke hemmer den biologiske amidolytiske aktivitet av faktorene Xa og Ila, karakterisert vedat blodkarvegger, sterkt vaskularisert vev eller endotelcellekulturer a) homogeniseres og differensialsentrifugeres, hvorpå den ovenstående væske i vilkårlig rekkefølge'underkastes ett eller flere av de følgende opprensningstrinn: b) bunnfelling med salt, c) affinitetskromatografi, d) ionevekslerkromatografi, e) kromatografi på molekylarsikt, idet de efter trinnene b), c), d) og e) oppnådde fraksjoner undersøkes med hensyn til tilstedeværelse av antikoagulerende proteiner, ved1 hjelp av et ett-trinns koaguleringsforsøk, og de oppnådde produkter fra b), c), d) og e) kan eventuelt dialyseres, og eventuelt foretas en ytterligere opprensning ved hjelp av immuno-adsorpsjonskromatografi, og eventuelt renses proteinene ved hjelp av fosfolipid-vesikler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det for bunnfellingen i trinn b) benyttes ammoniumsulfat, for kromatograferingen i trinn c) benyttes hydroksyapatitt, for kromatograferingen i trinn d) benyttes DEAE-Sephacel og for kromatograferingen i trinn e) benyttes Sephadex G-100, resp. G-75.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det isoleres blodkoagulasjonshemmende proteiner som hemmer koagulasjon indusert av en vaskulær prokoagulant, respektive av faktor Xa, men ikke koagulasjonen indusert av trombin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det isoleres blodkoagulasjonshemmende proteiner som hemmer det modifiserte protrombin-tidsforsøk og/eller det modifiserte, aktiverte, partielle tromboplastin- tidsforsøk og/eller det modifiserte protrombin-tidsforsøk og/eller protrombin-aktiveringen gjennom koagulasjonsfaktor Xai nærvær av negativt ladede fosfolipider og Ca<2+>og/eller intrinsik X-aktivering gjennom faktorene IXai nærvær av negativt ladede fosfolipider ogCa<2+>og/eller protrombin-aktiveringen av isolerte, stimulerte blod plater og/eller koagulasjonen indusert av karveggen og/eller den koagulasjons-avhengige blodplateaggregasjonen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det isoleres blodkoagulasjonshemmende proteiner hvor de blodkoagulasjonshemmende proteiners hemmende virkning avhenger av fosfolipidmengden, og den protrombin-aktiveringshemning som proteinene induserer via faktor Xa, er avhengig av fosfolipidkonsentrasjonen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det isoleres blodkoagulasjonshemmende proteiner som oppviser mol-vekter på ca. 70 x 10<3>, ca. 30 x IO<3>, ca.34xIO<3>eller ca. 32 x 10<3>.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det fra blodkarvegger fra pattedyr isoleres og renses de blodkoagulasjonshemmende proteiner, som dessuten kjennetegnes ved at de er ikke glykoproteiner, de er ikke fosfolipaser, de har et isoelektrisk punkt ved pH 4,4-4,6, aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteiner er termolabile ved 56°C, aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene har noen timers stabilitet ved 37"C i citratholdig plasma, aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene ikke ødelegges fullstendig av trypsin og/eller krymotrypsin, aktiviteten av de blodkoagulasjonshemmende proteinene ikke påvirkes av kolagenase og/eller elastase, de bindes via de divalente kationene Ca<2+>og Mn<2+>til negativt ladede fosfolipider som finnes i vesikler, liposomer eller eterosomer, de bindes via de divalente kationene Ca<2+>og Mn<2+>til negativt ladede fosfolipider som er koblet til Spherocil, bindingen, av proteinene til de negativt ladede fosfolipider er reversibel og kan oppheves av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), de fortrenger faktor Xaog protrombinene fra en negativt ladet fosfolipid-overflate, de hemmer det modifiserte protrombin-tidsforsøk, de hemmer det modifiserte,,, aktiverte, partielle trombo plastin-tidsforsøk, de hemmer det ikke-modifiserte protrombin-tidsforsøk, de hemmer protrombin-aktiveringen in vitro via koagulasjonsfaktor Xai nærvær av negativt ladede fosfolipider ogCa<2+>, de ikke hemmer den biologiske og amidolytiske aktivitet av faktor Xaog IIa, de hemmer den intrinsike X-aktivering in vitro via faktor IXai nærvær av negativt ladede fosfolipider og Ca<2+>, de hemmer protrombin-aktiveringen av isolerte, stimulerte blodplater in vitro, de in vitro hemmer koagulasjonen indusert av karveggene og at den protein-induserte protrombin-aktiveringshemning via faktor Xaer avhengig av fosfolipid-konsentrasjonen og er mindre ved høyere konsentrasjoner.