NL8500601A - Uit biologisch materiaal isoleerbaar, de bloedstolling remmend eiwitmateriaal, werkwijzen voor het isoleren en zuiveren daarvan alsmede farmaceutisch preparaat. - Google Patents

Description

» N.0.33.006 1

Uit biologisch materiaal isoleerbaar, de bloedstolling remmend eiwit-materiaal, werkwijzen voor het isoleren en zuiveren daarvan alsmede farmaceutisch preparaat.

De uitvinding heeft betrekking op een uit biologisch materiaal isoleerbaar, de bloedstolling remmend eiwitmateriaal alsmede op werkwijzen voor het isoleren en zuiveren ervan alsmede op een farmaceutisch preparaat.

5 Een dergelijk eiwitmateriaal is beschreven in de Nederlandse octrooiaanvrage 84.02904. In het bijzonder is in die octrooiaanvrage de isolering van een de bloedstolling remmend eiwitmateriaal uit runder-aorta beschreven.

In de volgende beschrijving wordt de nomenclatuur van de bloed-10 stolfactoren gebruikt, die wordt aanbevolen door de "Task Force on

Nomenclature of Blood Clotting Zymogens and Zymogens Intermediates". De gebruikte afkortingen zijn: S2238: H-D-fenylalanyl-L-pipecolylarglnine-p-nitro-anilidedihydrochlo-ride.

15 TBS: 50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 7,9. HTP, menselijk hersentrombo-plastine.

EDTA: ethyleendiaminetetraacetaat.

SDS-PAGE: polyacrylamidegel-elektroforese bij aanwezigheid van natrium-dodecylsulfaat.

20 Het gebruikte enzym is trypsine (EC 3.4.2.1.4).

Het cascadegewijs verlopende stolproces, dat de laatste decennia intensief is onderzocht, wordt thans beschouwd als een zich versterkend meertrapssysteem van verscheidene, met elkaar verbonden proteolytische reacties, waarbij een enzym een zymogeen omzet in de actieve vorm daar-25 van (vergelijk Jackson, C.M. & Nemerson, Y (1980) Ann. Rev. Biochem.

49, 765-811). De snelheid van deze reacties wordt in aanzienlijke mate vergroot door de aanwezigheid van fosfolipiden en eiwit-cofactoren (factor Va, factor VIIIa). In vivo worden de procoagulansreacties geregeld door diverse inhibitie-mechanismen, die een explosief trombo-30 tisch trauma na een geringe activering van de stolcascade voorkomen.

De anti-stolmechanismen kunnen als volgt worden ingedeeld (Rosenberg, R.D. & Rosenberg, J.S. (1984) J. Clin Invest. 74, 1-6): 1. De serineproteasefactor Xa en trombine worden geïnactiveerd tengevolge van de binding ervan aan antitrombine III of doelmatiger aan 35 antitrombine/heparine-complex. Zowel de activering van protrombine als de vorming van fibrine kunnen op deze wijze worden geremd. Naast anti- 85 0 0 6 0 1 2 trombine III bestaan diverse andere plasmaprotease-inhibitoren (o^-macro-globuline, antitrypsine). Hun werking is afhankelijk van de tijd.

2. De ontdekking van proteïne C (Stenflo, J. (1976) J. BioL. Chem.

251, 355-363) heeft een ander anti-stolmechanisme aan het licht ge- 5 bracht. Wanneer proteïne C eenmaal is geactiveerd, werkt het als een anticoagulans door middel van de selectieve proteolyse van de eiwit-cofactoren factor Va en VIIIa waardoor protrombinase en het enzym, dat factor X omzet, worden geïnactiveerd.

3. Piasmine splitst fibrine 1 monomeer, een produkt van de inwerking 10 van trombine op fibrinogeen, waardoor de vorming van een onoplosbaar fibrine wordt voorkomen (Nossel, H.L. (1981) Nature (Lond.) 291, 165-167).

De uitvinding heeft betrekking op een eiwitmateriaal (eiwitfrac- tie), dat kan worden geïsoleerd uit bloedvaten (arteriën) van onder an- 15 dere de menselijke navelstreng, alsmede op werkwijzen voor het isoleren en zuiveren daarvan. Het eiwitmateriaal volgens de uitvinding remt de activering van protrombine door protrombinase , d.w.z. factor Xa, 2+ factor Va, fosfolipide en Ca . Deze remming leidt tot een verlenging van de protrombinetijd. Het anti-stolmechanisme met het eiwitmateriaal 20 volgens de uitvinding verschilt van de bovengenoemde drie mechanismen, hetgeen in het onderstaande nader zal worden toegelicht.

De materialen en werkwijzen, die bijvoorbeeld kunnen worden toegepast ter verkrijging van het eiwitmateriaal volgens de uitvinding, worden in het onderstaande nader beschreven. Het gebruikte, chromogene 25 substraat S2238 is verkrijgbaar bij AB Kabi Diagnostica, Stockholm,

Zweden. DEAE-Sephacel, Sephadex G-100 en G-75 zijn produkten van Pharmacia. Chemicaliën voor de analytische gel-elektroforese zijn verkrijgbaar bij Bio-Rad. Door venapunctie verzameld menselijk bloed werd verenigd met trinatriumcitraatoplossing (eindconcentratie ongeveer 13 30 mM citraat) en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 2000 x g gecentrifugeerd. Het verkregen plasma werd opnieuw gedurende 15 minuten bij 10.000 x g gecentrifugeerd, waarbij bloedplaatjes-vrij plasma (PFP) werd verkregen. Als standaard dienend PFP werd bereid door mengen van plasma van diverse gezonde donoren.

35 Menselijk navelstrengmateriaal werd als volgt gehomogeniseerd.

Menselijke navelstrengen werden 15 minuten na de geboorte verkregen. De arteriën werden onmiddellijk gespoeld met ijskoude TBS-buffer, vervolgens vrij geprepareerd van de "Jelly of Warton" en gehomogeniseerd in TBS onder toepassing van een roterende menger van het type Braun MX32.

40 Een 10-procents homogenisaat (gew./vol.) werd gefractioneerd op een 85 0 0 6 0 1 • * 3 wijze, die in het onderstaande nader wordt beschreven.

Gel-elektroforese op platen bij aanwezigheid van natriumdodecyl-sulfaat werd volgens de door Laemli (Laemli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) beschreven methode uitgevoerd onder toepassing van gel, dat 10 5 gew.% acrylamide, 0,27 gew.% Ν,Ν^-methyleenbisacrylamide en 0,1 gew.% natriumdodecylsulfaat bevatte. De gelen werden aan zilverkleurlng onderworpen volgens de methode van Merril c.s. (Merril, C.R. Goldman, D, & van Keuren, M.L. (1982) Electrophoresis 3, 17-23).

De gemodificeerde protrombine-tijdtest (MPTT) werd als volgt uit-10 gevoerd. In een cuvette van gesiliconiseerd glas werden 50 pl PFP bij een temperatuur van 37°C geroerd met 150 μΐ TBS, 25 μΐ van een standaard HTP-verdunning en 25 μΐ TBS (controle) of 25 μΐ van een fractie van het gehomogeniseerde arteriële materiaal. Na een Incubatie van 3 minuten werd de stolling op tijdstip nul gestart door toevoeging van 15 250 μΐ Ca2+-buffer (80 mM NaCl, 20 mM CaCl2 en 10 mM Tris/HCl pH 7,9).

De fibrine-vorming werd optisch geregistreerd met behulp van een “Payton Dual Aggregation Module" (Homstra, G. (1981) Phil Trans R.

Soc. Lond B 294, 355-371). Wanneer voor het op gang brengen van de stolling in het MPTT factor Xg werd gebruikt, werd HTP weggelaten en 20 werden 25 μΐ gezuiverde factor Xa tezamen met de hoeveelheid van 250 μΐ 2+

Ca -buffer aan het verdunde PFP toegevoegd.

De gemodificeerde trombine-tijdtest (MTT) werd op dezelfde wijze uitgevoerd als de hierboven beschreven test, waarbij de stolling op gang werd gebracht met Xa, met als uitzondering, dat het Xa-preparaat 25 werd vervangen door 25 μΐ gezuiverd trombine.

Protease type I en trypsine waren verkrijgbaar bij Sigma. HTP werd bereid uit menselijke hersenen volgens de door van Dam-Mieras c.s. beschreven methoden (vergelijk van Dam-Mieras, M.C.E., Muller, A.D., van Dieijen, G. & Hemker, H.C. (1984) Methods of Enzymatic Analysis, vol.

30 5, blz. 352-365, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, F.R.G.). Factor Xa, protrombine en trombine werden verkregen door zuivering van met citraat behandeld runderbloed (Rosing, J., Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P.,

Zwaai, R.F.A. & Hemker, H.C. (1980) J.Blol. Chem. 255, 274-283). Factor V werd door zuivering verkregen uit runderbloed volgens de methode die 35 is beschreven door Lindhout, T., Govers-Riemslag, J.G., van de Waart, P., Hemker, H.C., and Rosing, F. (1982) Biochemistry 21, 4594-5502.

Volgens dezelfde literatuurplaats werd factor Va verkregen 'door Incu- beren van factor V met trombine. De protrombineconcentraties werden be-

1Z

rekend uit Mr=72.000 en A^gQ^SjS (Owen, W.G., Esmon, C.T., and 40 Jackson, C.M. (1974) J. Biol. Chem. 249, 594-605) en de factor V con- 8500601 1% . « 4 centratie werd berekend uit 11,.=330.000 en A ^*9,6 (Nesheim, E.M., Myrmel, K.H., Hibbard, L., and Mann, K.G. (1979) J. Biol. Chem. 254, 508-517). De factor Xa- en trombine-concentraties werden berekend volgens de titratiemethode van de actieve plaatsen (Rosing, J., 5 Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P., Zwaai, R.F.A. & Hemker, H.C. (1980) J.Biol. Chem. 255, 275-283). De andere proteïne-concentraties werden bepaald zoals beschreven door Lowry, O.H., Rosebrough, N.V., Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265.

Bereiding van fosfolipide en fosfolipide-membranen 10 l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (PC) en 1,2-dioleoyl-sn- glycero-fosfoserine (PS) werden bereid volgens de methode van Rosing, J., Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P., Zwaai, R.F.A. & Hemker, H.C. (1980) J.Biol. Chem. 255, 275-283. Volgens dezelfde literatuur-plaats werden door toepassing van geluidsgolven uit twee lagen bestaan-15 de fosfolipide-membranen, bestaande uit PS/PC (molverhouding 20:80) bereid. De fosfolipideconcentraties werden bepaald door fosfaat-analyse volgens Böttcher, C.J.F., van Gent, C.M. and Pries, C. (1961) Anal. Chim. Acta 24, 203-207.

Meting van de protrombine-activering 20 Het tijdsverloop van de protrombine-activering werd bij verschil lende concentraties van het anti-stolmiddel onderzocht. Mengsels van (Xa, Ca^+), (Xa, fosfolipide, Ca^+) of (Xa, Va, fosfolipide, Ca^+) werden met verschillende hoeveelheden van het anti-stolmiddel bij 37eC geroerd in 50 mM Tris/HCl, 175 mM NaCl, 0,5 mg/ml menselijk serumalbu-25 mine met een pH van 7,9. Na 3 minuten werd de reactie gestart door toevoeging van protrombine. Monsters van 25 μΐ werden met tussenpozen in een (met behulp van een thermostaat op 37°C gehouden) cuvette gebracht, die TBS, 2 mM EDTA en 0,23 mM S2238 bevatte (het uiteindelijke volume was 1 ml). Hit de verandering van de absorptie bij 405 nm, gemeten met 30 een Kontron Spectrophotometer Uvikon 810, en een referentiekromme, opgesteld aan de hand van bekende hoeveelheden gezuiverd trombine, werd de hoeveelheid gevormd trombine bij verschillende concentraties van het anti-stolmiddel berekend. Het fosfolipide werd toegevoegd als membranen, bestaande uit PS en PC in een molverhouding van 20:80.

35 Resultaten Isolering

De fractionering van het supernatans van een met 10.000 x g gecentrifugeerd gehomogeniseerd materiaal van navelstreng-arteriën onder toepassing van Sephadex G-100 resulteerde in een reproduceerbaar speci-40 fiek elutie-profiel (vergelijk fig. 1). De fracties die het stolsysteem 8500601 5 -¾ • -φ beïnvloeden volgens de meting met MPTT (vergelijk de voorafgaande beschrijving van de materialen en werkwijzen) zijn weergegeven in fig. 1.

Een procoagulans-activiteit elueerde met de voorloop. Deze activiteit kan alleen in de MPTT worden vastgesteld bij de aanwezigheid van fac-5 tor VII zoals blijkt uit proeven waarbij menselijk congenitaal factor VII-deficiënt plasma werd gebruikt. Derhalve moet dit procoagulans worden beschouwd als weefsel-tromboplastine.

Bepaalde fracties bezaten een duidelijke anti-stolactiviteit. Deze fracties werden verenigd en verder gezuiverd met DEAE-Sephacel chroma-10 tografie. Het anti-stolmiddel bleek aan het DEAE-Sephacel te binden bij een zoutconcentratie van 50 mM NaCl en 50 mM Tris/HCl pH 7,9. Elutie van de activiteit met een lineaire gradiënt van NaCL van pH 7,9 werd uitgevoerd met 150-160 mM NaCl. De DEAE-fracties, die de anticoagulane-activiteit bevatten, werden verenigd en onderworpen aan gelfitratie 15 met Sephadex G-75. De kolom (1,5 x 50 cm) werd geëquilibreerd met TBS.

De activiteit trad op in de fracties, die overeenkomen met een molecuul-gewicht van 30.000-60.000 dalton. Volgens deze zuivering werden ongeveer 2 mg eiwit met een anti-stolwerking uit 10 g nat weefsel verkregen.

20 Karakterisering

Diverse fracties van de G-75 chromatografie werden onderzocht met MPTT en geanalyseerd met SDS-PAGE. De resultaten (vergelijk fig. 2) geven aan, dat het anti-stolmiddel een molecuulgewicht van ongeveer 32.000 bezit. De G-75 fracties, die de hoogste anti-stolactiviteiten 25 bezaten, werden verenigd en gebruikt voor verdere karakterisering van het anti-stolmiddel. Incubatie van het anti-stolmiddel bij 56°C geeft een snelle verlaging van de activiteit daarvan tot na 2 minuten geen activiteit meer kan worden gemeten (vergelijk fig. 3). Het anti-stolmiddel verliest zijn activiteit in verloop van 2 uren na incubatie bij 30 37°C met protease Type I, terwijl trypsine het anti-stolmiddel na een incubatieperiode van 3 uren nauwelijks inactiveert (vergelijk fig. 4).

De bij deze experimenten gebruikte concentratie aan protease Type I en trypsine inactiveren 2,5 nM trombine volledig binnen 15 minuten. De hoeveelheden protease Type I en trypsine, die werden overgebracht van 35 de reactiemengsels naar de MPTT, hebben geen invloed op de stoltijd van de controle.

Een soortgelijk materiaal kan worden verkregen uit aorta's van mensen, runderen, konijnen en ratten en uit een sterk gevasculariseerd weefsel, zoals longweefsel. Het materiaal kan niet worden verkegen uit 40 weefsel, dat matig gevasculariseerd is, zoals menselijk diafragma.

8500601 6

Werking van het eiwitmateriaal volgens de uitvinding

De MPTT wordt zowel bij aanwezigheid van het anti-stolmiddel (vergelijk fig. 5) als bij activering met HTP en bij het op gang brengen met factor Xa verlengd. Een door trombine geïnduceerde stolling wordt 5 echter niet geremd.

Op grond van deze bevindingen werd het effect van het anti-stolmiddel op de omzetting van protrombine in trombine door factor Xa, 2+ factor Va, fosfolipide en Ca onderzocht. Onder de genoemde experimentele omstandigheden wordt de vorming van trombine op een 10 dosis-afhankelijke wijze geremd door het anti-stolmiddel (vergelijk fig. 6A). De activering van protrombine door factor Xa, fosfolipide 2+ en Ca bij afwezigheid van factor Va kan eveneens worden geremd door het anti-stolmiddel (vergelijk fig. 6B). Deze inhibitie wordt echter niet waargenomen wanneer de activering plaatsvindt bij afwezigheid 15 van fosfolipide (vergelijk fig. 6C).

Op grond van het bovenstaande kan worden geconcludeerd dat het anti-stolmiddel volgens de uitvinding de stoltijd bij een protrombine-tijdtest kan verlengen. De anti-stolmiddelactiviteit kon worden gemeten na fractionering met Sephadex G-100 van het gehomogeniseerde arteriële 20 materiaal. Op grond van verdere isolatietrappen kan worden aangenomen dat deze activiteit kan worden geassociëerd met een uit een of meer stoffen bestaand, in water oplosbaar materiaal, dat als geheel een negatieve lading bij pH 7,9 bezit.

Analyse van de Sephadex G-75 fracties met gel-elektroforese toont 25 een positieve correlatie tussen de intensiteit van de Mr=32.000 band en de verlenging van de stoltijd zoals gemeten met de MPTT (vergelijk fig. 2). Tussen de intensiteit van de andere zichtbare banden en de verlenging van de stoltijd kan geen relatie worden vastgesteld. In combinatie met de bevindingen, dat het anti-stolmiddel bij incubatie bij 30 56°C zijn activiteit snel verliest en proteolytische enzymen zijn activiteit kunnen vernietigen, kan worden aangenomen dat de anti-stolmiddelactiviteit mag worden toegeschreven aan een afzonderlijk eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 32.000.

In tegenstelling tot protease Type I is trypsine een slechte inac-35 tivator voor het anti-stolmiddel. Uit dit feit kan worden afgeleid, dat het anti-stolmiddel een gering aantal lysine- en arginineresten bezit, die toegankelijk zijn voor trypsine. De aard van de activiteit van het anti-stolmiddel werd door het op gang brengen van de stolling op verschillende manieren onderzocht. Door het vasculaire procoagulans HTP 40 ofwel door factor Xa geïnduceerde stolling wordt geremd door het anti- 8 5 G 0 6 0 i a ' 7 stolmiddel volgens de uitvinding terwijl door trombine geïnduceerde stolling niet wordt geremd. Uit deze bevindingen mag worden geconcludeerd dat het anti-stolmiddel een rol speelt bij de vorming van trombine en niet bij de werking daarvan.

5 Teneinde het mechanisme van de antistolling van het materiaal vol gens de uitvinding verder te onderzoeken werd protrombinase gebruikt, dat opnieuw was samengesteld uit gezuiverde factoren en protrombine (vergelijk Rosing, J., Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P., Zwaai, R.F.A.

& Hemker, H.C. (1980) J. Biol. Chem. 255, 274-283). Onder de experimen-10 tele omstandigheden kan het anti-stolmiddel de activering van protrombine door volledig protrombinase (factor Xg, factor Va, fosfolipide, 2+

Ca ) en door aan fosfolipide gebonden factor Xa (factor Xa, 2+ 2+ fosfolipide, Ca ) maar niet door de vrije factor Xa (factor Xa, Ca ) remmen.

15 Het tijdsverloop van de protrombine-activering bij aanwezigheid van het anti-stolmiddel wijst op een ogenblikkelijke inhibitie van de protrombine-activering, die in de tijd constant blijft. Derhalve mag worden geconcludeerd dat het anti-stolmiddel noch via een fosfolipase- noch via een proteolytische activiteit werkt. Het feit, dat de active- 2+ 20 ring van protrombine door factor Xa en Ca in het geheel niet op ongunstige wijze door het anti-stolmiddel wordt beïnvloed, is een sterke aanwijzing dat het anti-stolmechanisme van het vasculaire materiaal verschilt van dat van de algemeen bekende plasmaprotease-inhibi-toren, zoals antitrombine III. Omdat volgens Walker, F.J. Sexton, P.W.

25 & Esmon, C.T. (1979) Biochim. Biophys. Acta 571, 233-342 is aangetoond, dat geactiveerd proteïne C de protrombine-activering door factor Xa, 24*

Ca en fosfolipide niet remt, kan ook worden geconcludeerd dat het materiaal volgens de uitvinding geen proteïne C is.

Voorlopige onderzoekingen van de binding duiden erop, dat het vas-30 culaire anti-stolmiddel de lipidebinding van factor Xa en/of protrombine waarschijnlijk verstoort.

Het feit, dat het materiaal volgens de uitvinding in arteriSn van diverse typen kan worden gevonden en niet in een matig gevasculariseerd weefsel, wijst erop, dat volgens de onderhavige uitvinding een fysiolo-35 gische modulator van hemostase en trombose Is gevonden, die actief is op vasculair niveau.

8500601 * fc ·% 8

Figuurbeschrijving

Fig. 1. Gelfiltratie van het 10.000 x g supernatans van een gehomogeniseerd navelstrengarterie-materiaal op Sephadex G-100.

2 ml van het 10,000 x g supernatans werden aangebracht op een ko-5 lom (1,5 x 80 cm) met Sephadex G-100, die tevoren met TBS was geëquili-breerd. De kolom werd geëlueerd met TBS. Gelijke hoeveelheden van de verkregen fracties werden onderzocht volgens de gemodificeerde protrom-bine-tijdtest (MPTT) (vergelijk de voorafgaande beschrijving). Bepaalde fracties (enkel gearceerd) geven een procoagulans-actlviteit aan en 10 brengen de stolling in de MPTT op gang zonder toevoeging van HTP, factor Xa of trombine. Andere afzonderlijke fracties (dubbel gearceerd) verlengen de stoltijd in de MPTT. Deze fracties werden verenigd en verder gefractioneerd.

15 Fig. 2. Gel-elektroforese (A) en antistolmiddel-activiteit (B) van diverse fracties van het G-75 eluens.

Een bepaalde hoeveelheid van diverse fracties van het G-75 eluens werden onderworpen aan gel-ëlektroforese, zoals in het voorafgaande is beschreven. De activiteiten werden door zilverkleuring op de gelen 20 zichtbaar gemaakt volgens de methode van Merril, C.R. Goldman, D. & van Keuren, M.L. (1982) Electrophoresis 3, 17-23. Elektroforese-baan 1: standaard materiaal met een laag molecuulgewicht; elektroforesebanen 2-6: niet-gereduceerde gelijke hoeveelheden van de G-75 fracties met toenemend elutievolume. Een vastgestelde hoeveelheid van de G-75 frac-25 ties, die met gel-elektroforese waren geanalyseerd, werden volgens de MPTT onderzocht (vergelijk de voorafgaande beschrijving) onder toepassing van HTP voor het op gang brengen van de stolling. De controle-stoltijd wordt aangegeven door de open staaf. De getallen onder de gearceerde staven komen overeen met de getallen van de elektroforesebanen 30 in fig. 2A.

Fig. 3. Inactivering door warmte van het vasculaire anti-stolmiddel.

Het anti-stolmiddel werd bij 56°C geïncubeerd en na diverse incubatietijden werd telkens een monster getrokken in een hoeveelheid van 35 5 μΐ, die 3,6 pg proteïne bevatte, onmiddellijk gekoeld met ijs en ver volgens onderzocht met de MPTT onder toepassing van HTP als coagulatie-initiator. De stoltijd van het controle-monster was 110 seconden.

8500501 % __ * 9

Fig. 4. Effect van proteolytische enzymen op de activiteit van het anti-stolmiddel.

Het anti-stolmiddel werd bij 37°C gelncubeerd met protease Type I ( , eindconcentratie 0,11 eenheden/ml), trypsine ( ▲ , eindconcentra-5 tie 88 BAEE eenheden/ml) en zonder proteolytische enzymen ( · ). Op de aangegeven tijdstippen werd een hoeveelheid van 5 μΐ, die 6 pg proteïne van het anti-stolmiddel bevatten, uit het reactiemengsel verwijderd en onderworpen aan de MPTT. De stolling werd op gang gebracht met HTP. De controle-stoltijd was 110 seconden. De hierbij aangegeven eenheden van 10 de proteolytische enzymen worden berekend uit de waarden, die zijn opgegeven door de fabrikant.

Fig. 5. Effect van het vasculaire anti-stolmiddel op de stoltijden, teweeggebracht bij de M(P)TT door HTP, factor Xg of trombine.

15 De concentraties van de stol-initiatoren (1,5 nM factor Xg of 0,4 nM trombine) werden zodanig gekozen dat controle-stoltijden van ongeveer 110 seconden werden verkregen (open staven). Bij toepasisng van factor Xa werden fosfolipide-membranen (eindconcentratie 10 μΜ),, bestaande uit PS/PC (molverhouding 20:80) aan het reactiemengsel toege-20 voegd. De door de aangegeven middelen bij aanwezigheid van 3,5 pg eiwit volgens de uitvinding teweeggebrachte stoltijden worden weergegeven door de gearceerde staven.

Fig. 6. Effect van het anti-stolmiddel op de protroobine-activering 25 door (Xa, Va, fosfolipide, Ca^+), (Xa, fosfolipide, 2+ 2+

Ca ) en (Xa, Ca )·

De reactiemengsels bevatten: (A) 1 pM protrombine, 0,3 nM Xa, 0,6 nM Va, 0,5 pM fosfolipide en 10 mM CaCl2 net 12,0 pg/ml anti-stolmiddel ( ), 4,8 pg/ml 30 anti-stolmiddel ( A ) en geen anti-stolmiddel ( · ).

(3) 1 pM protrombine, 10 nM Xa, 0,5 pM fosfolipide en 10 mM CaCl2 met 2,4 pg/ml anti-stolmiddel ( ), 0,48 pg/ml anti-stolmiddel ( A ) en geen anti-stolmiddel ( · ).

(C) 1 pM protrombine, 75 nM Xa en 10 mM CaCl2 net 120 pg/ml anti- 35 stolmiddel ( A ) en zonder anti-stolmiddel ( · ).

Op de aangegeven tijden werden monsters getrokken en werd trombine op de in de beschrijving aangegeven wijze bepaald.

8500601

Claims (5)

1. De bloedstolling remmend eiwitmateriaal, waarvan de eigenschappen in de voorgaande beschrijving zijn aangegeven.

2. Werkwijze ter bereiding van een de bloedstolling remmend eiwit-5 materiaal, met het kenmerk, dat men uit biologisch vaatwandmateriaal met behulp van op zichzelf bekende isolerings- en zuiveringstechnieken een de bloedstolling remmend eitwitmateriaal bereidt, waarvan de eigenschappen in de voorgaande beschrijving zijn aangegeven.

3. Werkwijze ter bereiding van een de bloedstolling remmend eiwit-10 materiaal, met het kenmerk, dat men het eiwitmateriaal volgens conclusie 1 op de in de voorgaande beschrijving aangegeven wijze bereidt.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat men als vaatwandmateriaal navelstreng-vaatwandmateriaal gebruikt.

5. Farmaceutisch preparaat, gekenmerkt door een gehalte aan eiwit-15 materiaal volgens conclusie 1, resp. verkregen volgens de werkwijze van een of meer der conclusies 2-4. ********** 8500601