NL8402904A - De bloedstolling remmend eiwitmateriaal, werkwijze voor het isoleren daarvan alsmede farmaceutisch preparaat. - Google Patents

Description

N032367 1

De bloedstolling remmend eiwitmateriaal, werkwijze voor het isoleren daarvan alsmede farmaceutisch preparaat._

De uitvinding heeft betrekking op een de bloedstolling remmend eiwitmateriaal.

Eiwitten, die de bloedstolling remmen en in de meeste zoogdieren voorkomen, kunnen in drie groepen onderverdeeld worden. Deze indeling 5 is gebaseerd op het verschil in werkingsmechanisme van de eiwitten.

1. Eiwitten, die een complex met een stolfactor vormen, waardoor de stolfactor inactief wordt.

Dit zijn de eiwitten: a) antitrombine-III (Thromb.Res. _5, blz. 439-452 (1974)) 10 b) a^-protease remmer (Ann.Rev.Biochem. 52, blz. 655-709 (1983)).

c) a2~macroglobuline (Ann.Rev.Biochem.52, blz. 655-709 (1983)) d) Ci-inhibitor (Biochemistry 20, blz. 2738-2743 (1981)).

e) Protease Nexin (J.Biol.Chem. 258, blz. 10439-10444 (1983)).

15 2. Eiwitten, die een stolfactor proteolytisch knippen, waardoor de stolfactor inactief wordt. Tot nu toe is Protein C beschreven (J.Biol. Chem. 251, blz. 355-363 (1976)).

3. Eiwitten, die de negatief geladen fosfolipiden afschermen en/of hydrolyseren, zodat de van fosfolipide afhankelijke reacties in het 20 bloedstolproces geremd worden. Tot nu toe zijn alleen fosfolipasen beschreven, die geïsoleerd zijn uit verschillende soorten slangegif (Eur.J.Biochem. 112, blz. 25-32 (1980)).

Van de bovengenoemde eiwitten wordt alleen antitrombine-III klinisch toegepast. Het verhoogt echter de bloedingsneiging.

25 Gevonden werd nu een eiwitmateriaal, dat het risico van bloedingen niet verhoogt en bij grote bloedingen zijn werking verliest zodat het gewone stollingsproces verloopt.

Het eiwitmateriaal volgens de uitvinding, dat verder zal worden aangeduid als VAC (vasculair anticoagulans), kan als volgt worden geka-30 rakteriseerd.

- Uit de runder-aorta geïsoleerd VAC bevat in elk geval een uit één polypeptideketen bestaand eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 34.10^ en een uit één polypeptideketen bestaand eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 32.10^. Ook werd reeds enkele malen een 35 eiwit met de karakteristieken van VAC met een molecuulgewicht van ongeveer 60.10^ volgens dezelfde zuiveringsmethode geïsoleerd. De genoemde molecuulgewichten zijn bepaald door middel van polyacryl- 8402904 2 amidegel-electroforese in natriumdodecylsulfaat. Verondersteld wordt, dat er een relatie bestaat tussen VAC en het eiwit met een molecuulgewicht van 60.10^.

- VAC is geen glycoproteine.

5 - VAC is geen fosfolipase.

- VAC heeft een isoelectrisch punt bij een pH van 4,4-4,6.

- VAC bindt via de divalente kationen Ca"*"*" en Mn*'*' aan negatief geladen fosfolipiden, die gerangschikt zijn in vesicles, liposomen of etherosomen. De bereidingen van deze drie fosfolipide-structuren zijn 10 beschreven in de literatuur.

VAC bindt via deze ionen ook aan negatief geladen fosfolipiden, die gekoppeld zijn aan Sphérocil. Deze koppeling van fosfolipiden aan Sphérocil is niet beschreven in de literatuur (zie voorbeeld II).

- De binding van VAC aan negatief geladen fosfolipiden via divalente 15 kationen is reversibel en wordt verbroken door ethyleendiaminetetra- acetaat (EDTA).

- VAC remt de gemodificeerde protrombinetijd-test (zie voorbeeld I).

- VAC remt de gemodificeerde geactiveerde partiële tromboplastinetijd-test (zie voorbeeld III).

20 - VAC remt de niet gemodificeerde protrombinetijd-test (vergelijk "Hemostasis" van Boehringer Ingelheim, blz. 122 (1979)).

- VAC remt de niet gemodificeerde geactiveerde partiële tromboplastine-tijd-test (vergelijk "Hemostasis” van Boehringer Ingelheim, blz. 124 (1979)).

25 - VAC remt de protrombine-activering door stolfactor Xa bij aanwezigheid van negatief geladen fosfolipiden en Ca^*" in het in vitro systeem (vergelijk J.Biol.Chem. 255, blz. 274-283 (1980) en voorbeeld I).

- De hierbovengenoemde, door VAC geïnduceerde remming van protrombine-30 activering door factor Xa is afhankelijk van de fosfolipide-concen- tratie en is kleiner bij hoge fosfolipide-concentraties.

- VAC remt niet de biologische en de amidolytische activiteit van factor Xa en factor IIa.

- VAC verdringt factor Xa en protrombine van een negatief geladen 35 fosfolipide-oppervlak.

- VAC remt de intrinsieke X-activering door factor IXa bij aanwezigheid van negatief geladen fosfolipiden en Ca-*^· in het in vitro systeem zoals beschreven in J.Biol.Chem. 256, blz. 3433-3442 (1981).

- VAC remt de protrombine-activering door geïsoleerde, gestimuleerde 40 bloedplaatjes, in het in vitro systeem zoals beschreven in Eur. J.

8402904 3

Biochem. 122, biz. 429-436 (1982).

- VAC remt de door vaatwand geïnduceerde stolling, gemeten in het in vitro systeem zoals beschreven in Haemostasis jJ, blz. 211-226 (1979).

5 - VAC remt de door vaatwand geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes, gemeten in het in vitro systeem zoals beschreven in Haemostasis jJ, blz. 211-226 (1979).

- De activiteit van VAC is thermolabiel bij 56°C.

- De activiteit van VAC in gecitreerd plasma bij 37°C blijft gedurende 10 enkele uren behouden.

- De activiteit van VAC wordt niet geheel vernietigd door de proteoly-tische enzymen trypsine en chymotrypsine.

- De activiteit van VAC wordt niet beïnvloed door de proteolytische enzymen collagenase en elastase.

15 Op grond van de gevonden eigenschapen van VAC wordt verondersteld dat het mechanisme van de remming van de bloedstolling onder invloed van VAC als volgt kan worden weergegeven.

VAC bindt via Ca^-ionen aan negatief geladen fosfolipiden, die beschikbaar zijn gekomen door beschadiging van weefsel en/of gesti-20 muleerde bloedplaatjes en vermindert hierdoor de binding van bepaalde stolfactoren (de van vitamine K afhankelijke stolfactoren) aan het negatief geladen fosfolipide-oppervlak, dat voor deze stolfactoren als een katalytisch oppervlak werkt (Biochim.Biophys.Acta 515, blz. 163-205 (1978)), met als gevolg, dat de van fosfolipide afhankelijke reacties 25 van het bloedstolproces door VAC geremd worden. Op grond van het werkingsmechanisme kan VAC ingedeeld worden in de bij de bespreking van de ^ stand van de techniek genoemde eiwitgroep 3. Echter met dit verschil dat VAC de fosfolipiden niet hydrolyseert en daardoor geen essentiële membraanstructuren kan afbreken. Naast dit voordeel kent VAC als anti-30 stolmiddel nog andere voordelen.

1) Het anti-stol effect van VAC is afhankelijk van de hoeveelheid fosfolipiden, die in het stolproces participeren. Het stolproces, veroorzaakt door geringe beschadiging van de vaatwand en geringe activatie van de bloedplaatjes, als gevolg van bijvoorbeeld een trombotisch pro-35 ces, kan door VAC geremd worden. Echter wanneer een vaatwand drastisch beschadigd wordt, zodat er veel fosfolipiden beschikbaar komen, zal ter plekke VAC niet in staat zijn het stolproces volledig te remmen, zodat de kans op bloedingen gering wordt. Dit in tegenstelling tot de bekende anticoagulantia, die één of meer stolfactoren inactiveren en daardoor 40 het risico van bloedingen verhogen.

8402904 4 2) VAC inactiveert de stolfactoren niet, zodat de stolfactoren andere activiteiten, waarvan er steeds meer bekend worden, kunnen blijven uitoefenen. Een belangrijke niet-hemostatische activiteit van sommige actieve stolfactoren is de chemotaxis voor inflammatoire cellen. Deze 5 cellen dragen bij aan het heelproces van een beschadigde vaatwand.

VAC is o.a. aangetoond in: 1) runder-aorta 2) ratte-aorta 3) humane navelstrengvenen en -arteriën 10 4) humane endotheelcelkweken 5) runderendotheelcelkweken.

Behalve op het de bloedstolling remmende eiwitmateriaal, waarvan de eigenschappen hierboven zijn beschreven, heeft de uitvinding ook betrekking op een werkwijze ter bereiding van dit materiaal, waarbij men 15 het bedoelde eiwitmateriaal met behulp van op zichzelf bekende isole-rings- en zuiveringstechnieken bereidt. Goede resultaten zijn bereikt met de in voorbeeld I van deze beschrijving vermelde methoden, waarbij uitgegaan wordt van runder-aorta*s. Een andere belangrijke zuiveringstechniek is de immunoadsorptie-chromatografie met behulp van polyclona-20 le of monoclonale antilichamen tegen VAC.

Bij voorkeur bereidt men VAC door a) differentiële centrifugatie van gehomogeniseerd vaatwand-materiaal, en in willekeurige volgorde onderwerpen van de bovenstaande vloeistof aan één of meer der volgende zuive- 25 ringsbewerkingen: b) precipitatie met zout (ammoniumsulfaat), c) affiniteitschromatografie (hydroxylapatiet), d) ionenwisselingschromatografie (DEAE-Sephacel), e) chromatografie met een moleculaire zeef (Sephadex G-100), 30 f) immunoadsorptie-chromatografie.

Eventueel kunnen ook andere technieken worden toegepast.

Momenteel is er een tendens, dat de klassieke antitrombosebehandeling (orale antistolling) vervangen wordt door intravasculaire toediening van biosynthetische weefsel-plasminogeenactivator (N. Engl. J. Med.

35 310, blz. 609-613 (1984)). Dit is een therapeutische benadering in een situatie, waarin trombose reeds is opgetreden. De toepassing van VAC is erop gericht om trombose te voorkomen. Doordat VAC, behalve de stolling ook de stollingsafhankelijke plaatjesaggregatie remt, lijkt het een efficiënter antitrombotisch middel dan weefsel-plasminogeenactivator.

40 Derhalve heeft de uitvinding tevens betrekking op een farmaceu tisch preparaat, dat een gehalte aan VAC bevat.

8402904 5

De in de voorbeelden gebruikte afkortingen hebben de volgende betekenis: VAC, vasculair anticoagulans; PFP, bloedplaatjes-vrij plasma; TBS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH 7,5; TBSE, TBS met 2 mM EDTA, pH 7,5; EDTA, ethyleendiaminetetraacetaat; BTP, tromboplastine uit run-5 derhersens; TBSA, TBS met 0,5 mg/ml menselijk serumalbumine, pH 7,9; SDS-PAGE, polyacrylamidegel-electroforese in natriumdodecylsulfaat; S2337, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-piperidyl-glycyl-L-arginine-p-nitro-anilide-hydrochloride; S2238, H-D-fenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginine-p-nitro-anilide-dihydrochloride; HPLC, hoge-druk-vloeistof-10 chromatografie; AT-III, menselijk antitrombine III; S.A., specifieke activiteit; Gla.,$-carboxy-glutaminezuur.

Voorbeeld I

Isoleren en zuiveren van VAC.

Uit runderen werden de aorta's binnen een half uur na het slachten 15 verwijderd. In het slachthuis werd runderbloed verzameld in trinatrium-citraat (uiteindelijke concentratie 0,38 gew.%) en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 2.000xg gecentrifugeerd. Het weinig bloedplaat jes bevattende plasma werd gedurende 15 minuten opnieuw gecentrifugeerd bij 10.000xg, wat PFP opleverde.

20 Hydroxylapatiet HTP en de chemicaliën voor de analytische SDS-PAGE

waren afkomstig van Bio-Rad. Sephadex G-100, DEAE-Sephacel en de “Low Molecular Weight Calibration Kit" werden gekocht bij Pharmacia. De chromogene substraten S2238 en S2337 waren van Kabi Vitrum. Diaflo PM-10 ultrafiltratie membranen waren afkomstig van Amicon.

25 Nadat de aorta's uit de dieren waren verwijderd, werden ze grondig met TBS gespoeld. De intima werden van de aorta's losgemaakt en onder toepassing van een snel draaiende menger (Braun MX 32) gehomogeniseerd in TBSE, dat sojaboon-trypsine-inhibitor (16 mg/1) en benzamidine (1,57 g/1) bevatte. Het uit 8 aorta's verkregen 20% (gewicht/volume) 30 vaste stof bevattende gehomogeniseerde materiaal werd gedurende 60 minuten bij 100.000xg gecentrifugeerd. Het supernatans werd met vast am-moniumsulfaat op een verzadiging van 35% gebracht, gedurende 30 minuten geroerd en gedurende 20 minuten bij 12.000xg gecentrifugeerd. Het verkregen supernatans werd tot 90% verzadigd met ammoniumsulfaat, geduren-35 de 30 minuten geroerd en gedurende 20 minuten bij 12.000xg gecentrifugeerd. Het residu werd gesuspendeerd in een klein volume TBS en gedia-lyseerd tegen benzamidine (1,57 g/1) bevattend TBS. De gedialyseerde fractie werd op een hydroxylapatiet-kolom (1x20 cm) gebracht, die met TBS was geëquilibreerd. De kolom werd gewassen met 4 bedvolumes TBS en 40 vervolgens werd VAC uit de kolom geëlueerd met 200 ml natriumfosfaat- 8402904 6 buffer (pH 7,5) met een liniaire gradient van 0-500 niM. De VAC bevattende fracties werden verenigd en gedialyseerd tegen 50 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7,5. Dezelfde buffer werd gebruikt voor het equilibreren van een DEAE-Sephacel-kolom (3x5 cm), waarop het gedialyseerde VAC ma-5 teriaal werd onderworpen aan chromatografie. De kolom werd gewassen met 4 bedvolumes van de equilibratie-buffer. VAC werd uit de kolom geëlu-eerd met 200 ml NaCl-oplossing in 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 met een lineaire gradient van 50-300 mM. De VAC bevattende fracties werden verzameld, gedialyseerd tegen 500 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, en ver-10 volgens geconcentreerd in een Amicon-concentratiecel onder toepassing van een PM-10 ultrafiltratiemembraan. Het concentraat met een volume van 2 ml werd op een Sephadex G-100 kolom (3x80 cm) gebracht, die was geëquilibreerd met 500 mM NaCl en 20 mM Tris/HCl, pH 7,5. Het eluaat werd verzameld in fracties van 2 ml en de actieve fracties werden af-15 zonderlijk gedialyseerd tegen 10 volume-% glycerol bevattend TBS en bewaard bij -70°C. De gehele zuivering werd uitgevoerd bij 0-4°C.

Bepaling van de activiteit van VAC.

Voor het vaststellen van de activiteit van VAC werden twee verschillende methoden gebruikt: een ééntraps-coagulatietest (gemodifi-20 ceerde protrombinetijdtest) en een trombinevormingstest. De ééntraps-coagulatietest werd als volgt uitgevoerd: in een cuvette van gesilico-niseerd glas werden 175 μΐ van de te onderzoeken fractie of 175 μΐ TBS (dat als blanco diende) geroerd (900 omwentelingen/min) met 50 μΐ PFP en 25 μΐ verdund BTP. Na een incubatie van 3 minuten bij 37°C werd de 25 coagulatie gestart door toevoeging van 250 μΐ buffer, die 80 mM NaCl, 20 mM CaCl2 en 10 mM Tris/HCl bevatte, pH 7,5. De fibrine-vorming werd optisch geregistreerd onder toepassing van een "Payton Dual Aggregation Module" (Hornstra, G. (1981) Phil.Trans.R.Soc.Lond.B. 294, 355-371). De stoltijd van het blanco monster was 65 seconden. Deze test 30 werd tijdens de zuivering toegepast voor het onderzoeken van de diverse fracties op de aanwezigheid van VAC-activiteit. Voor het bepalen van de opbrengst aan VAC tijdens het zuiveren werd één eenheid van de VAC-activiteit gedefinieerd als de hoeveelheid VAC, die de stoltijd in de bovenbeschreven proef tot 100 seconden verlengde.

35 In enige gevallen werd BTP vervangen door gezuiverd rundertrombine of gezuiverde runderfactor Xa. In dit half-gezuiverde stolsysteem werden de hoeveelheden trombine of factor Xa zodanig gekozen dat de stoltijd van het blanco monster eveneens 65 seconden bedroeg.

De trombinevormingstest werd als volgt uitgevoerd: 20 μΐ gezuiver-40 de runderfactor Xa (150 nM), 30 μΐ CaC12 (100 mM), 30 μΐ verdunde 8402904 7 VAC en 30 μΐ PS/PC-fosfolipide-membranen (de uiteindelijke concentraties zijn aangegeven in de toelichting bij de figuren) werden in een kunststof cuvette gebracht, die 181 μΐ TBSA bevatte. Het mengsel werd gedurende 3 minuten bij 37°C geroerd met een met teflon beklede roerder. De 5 trombinevorming begon bij de toevoeging van 9 μΐ gezuiverde runderfactor II (33,33 μΜ). Na verschillende tijden werden monsters van 50 μΐ uit het reactiemengsel genomen en toegevoegd aan de inhoud van een kunststof cuvette van 1 ml, die met behulp van een thermostaat bij 37°C werd gehouden en 900 μΐ TBSE en 50 μΐ van het chromogene substraat S2238 10 (5 mM) bevatte. Uit de absorptieverandering bij 405 nm, geregistreerd met een Kontron Spectrofotometer Uvikon 810, werd de hoeveelheid trombine in het reactiemengsel berekend onder toepassing van een ijkkromme, verkregen met bekende hoeveelheden gezuiverd rundertrombine. Het percentage van de door VAC veroorzaakte inhibitie werd als volgt gedefinieerd: 15 % inhibitie « (1- |)xl00%, waarin a = snelheid van de trombinevorming bij aanwezigheid van VAC 20 in nM IIa/min en b = snelheid van de trombinevorming bij afwezigheid van VAC in nM IIa/min.

Proteïnen

De van vitamine K afhankelijke factoren protrombine en factor X2 25 werden verkregen door zuivering van met citraat behandeld runderplasma (vergelijk Stenflo, J. (1976) J.Biol.Chem. 251,355-363). Na bariumci-traat-adsorptie en elutie, fractionering met ammoniumsulfaat en chroma-tografie met DEAE-Sephadex werden twee proteïnefracties verkregen, die een protrombine-factor IX mengsel respectievelijk factor X bevatten.

30 Factor X werd verkregen volgens de methode van Fujikawa c.s. (Fujikawa, K., Legaz, M.E. en Davie, E.W. (1972) Biochemistry 11, 4882-4891) en onder toepassing van RW-X (Fujikawa, K., Legaz, M.E. en Davie, E.W.

(1972) Biochemistry 11, 4892-4899) geactiveerd. Protrombine werd van factor IX afgescheiden door heparine-agarose-affiniteitschromatografie 35 (Fujikawa, K., Thompson, A.R., Legaz, M.E., Meyer, R.G. en Davie, E.W.

(1973) Biochemistry 12, 4938-4945). De protrombine bevattende fracties uit de heparine-agarose kolom werden verenigd en verder gezuiverd volgens de methode van Owen c.s. (Owen, W.G. Esmon, C.T. en Jackson, C.M.

(1974) J.Biol.Chem. 249, 594-60522). De concentraties van protrombine 40 en factor Xa werden bepaald volgens de methode van Rosing c.s.

(Rosing, J., Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P., Zwaai, R.F.A. en Hemker 8402904 8 H. C. (1980) J.Biol.Chem. 255, 274-283). BTP werd bereid volgens een standaardmethode, beschreven door van Dam-Mieres c.s. (Dam-Mieres, M.C.E., van, Muller, A.D., Dieijen, G., van, Hemker, H.C. Blood coagulation enzymes, Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie GmbH, 5 Weinheim). De proteïneconcentraties werden bepaald volgens Lowry c.s. (Lowry, O.H., Rosebrough, N.V., Farr, A.L. en Randall, R.J. (1951) J.Biol.Chem. 193, 265).

Bereiding van fosfolipide, fosfolipidermembranen en fosfolipiderlipor-soom 10 l,2-Di-oleoyl-snrglycero-3-fosfocholine (18:1 /18:1 -PC) en cis cis

Mg I, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoserine (18:1 /18:1 . -PS) werden bereid zoals beschreven door Rosing c.s. (Rosing, J., Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P., Zwaai, R.F.A. en Hemker H.C. (1980) J.Biol. Chem. 255, 274-283). Afzonderlijke, uit twee lagen bestaande fosfolipi- 15 de-membranen van PC en PS werden bereid door toepassing van geluidsgolven, zoals beschreven in Rosing, J., Tans, G., Govers-Riemslag, J.W.P., Zwaai, R.F.A. en Hemker H.C. (1980) J.Biol.Chem. 255, 274-283. Een voorraadoplossing van fosfolipiderliposomen werd bereid door de gewenste hoeveelheid fosfolipide op te lossen in chloroform. De chloroform 20 werd onder stikstof verdampt. Het resterende fosfolipide werd gesuspendeerd in 5% glycerol bevattend TBS, gedurende 3 minuten voorzichtig gemengd met enige glasbolletjes en vervolgens gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 10.000xg. Het supernatans werd weggedaan en het residu werd voorzichtig opnieuw gesuspendeerd in 5% glycerol bevattend TBS, 25 wat de voorraadoplossing van fosfolipide-liposomen opleverde. Deze li-posomen werden bij kamertemperatuur bewaard. De fosfolipide-concentraties werden door fosfaat-analyse volgens Böttcher c.s. (Böttcher, C.J.F., van Gent, C.M. en Pries, C. (1961) Anal.Chim.Acta 24, 203-207) bepaald.

30 SDS-PAGE

Gel-electroforese op platen bij aanwezigheid van SDS werd op de door Laemli (Laemli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) beschreven methode uitgevoerd onder toepassing van gel, dat 10 gew.% acrylamide, 0,27 gew.% N/N^-methyleenbisacrylamide en 0,1 gew.% SDS bevatte.

35 5 Gew.% β-mercaptoethanol was aanwezig in gelmonsters met gereduceer de disulfide-bruggen. De gelen werden als volgt gekleurd: 1) met 0,25 gew.% Coomassie Blue R-250 in 50 gew.% ethanol, 15 gew.% azijnzuur en ontkleurd in 10 gew.% ethanol, 10 gew.% azijnzuur, 2) met Schiff's reagens, bereid uit basisch Fuchsine (Merck) volgens 40 de methode van Segrest (Segrest, J.P. en Jackson, R.L. (1972) 8402904 9

Methods in Enzymology vol. 28, 54-63) of 3) met zilverkleuring, zoals beschreven door Merril c.s. (Merill, C.R., Goldman, D., en Keuren, M.L., van. (1982) Electrophoresis 3, 17-23. Electrofocussering 5 Isoelectrische pH-bepalingen van proteïnen werden uitgevoerd met gerede dunne-laag-polyacrylamide gelen, die Amfoline drager-amfolyten bevatten (PAG-platen, LKB) bij een pH in het gebied van 3,5-9,5 volgens de handleiding van de fabrikant. De pH gradient in de gel werd onmiddellijk na de electrofocussering bepaald door afsnijden van een strook 10 van de gel langs de lijn tussen de anode en de kathode. De electrolyten werden uit elke strook met gedestilleerd water geëlueerd en de pH van het water werd gemeten met een gecombineerde glaselectrode. jj-Carboxyglutaminezuurbepaling

De Gla-bepaling werd uitgevoerd met HPLC met een nucleosil 5SB ko-15 lom (CHROMPACK) volgens de methode van Kuwada en Katayama (Kuwada, M., en Katayama, K. (1983) Anal.Biochem. 131, 173-179).

Resultaten

Isolering en gedeeltelijke zuivering van VAC

De resultaten van het isoleren en zuiveren van VAC worden aangege-20 ven in tabel A. De bepaling van de hoeveelheid VAC-activiteit in het lOO.OOOxg supernatans was irrelevant wegens de aanwezigheid van een procoagulans-activiteit. Deze activiteit precipiteerde met ammoniumsul-faat bij een verzadiging van 35%. Gesteld werd, dat het supernatans na precipitatie met 35% ammoniumsulfaat 100% VAC-activiteit bevatte. De 25 precipitatie van de proteïnen met ammoniumsulfaat bij een verzadiging van 90% werd gebruikt als concentratietrap. VAC, dat bij aanwezigheid van TBS werd gebonden aan hydroxylapatiet, elueerde uit deze kolom met een tijdens de elutie toenemende fosfaatconcentratie. Bij een lage ion-sterkte bond VAC aan DEAE-Sephacel. Elutie van VAC uit de DEAE-kolom 30 vond plaats met een tijdens de elutie toenemende NaCl-concentratie. Bij de uiteindelijke zuiveringsstap werden de proteïnen op basis van hun molecuulgewicht door gelfiltratie met Sephadex G-100 gescheiden. De elutiebuffer was een "high salt" buffer ten einde de interactie van VAC met het Sephadex minimaal te houden. VAC elueerde uit deze kolom met 35 een elutievolume van ongeveer 1,6 maal het ledige volume van de kolom (zie figuur 1). De totale opbrengst aan VAC-activiteit na deze uiteindelijke zuiveringsstap was 35%. Volgens SDS-PAGE bevatten alle G-100 fracties, die VAC-activiteit vertoonden, twee polypeptiden (molecuulgewicht 34.000 resp. 32.000). Volgens SDS-PAGE zijn echter alleen de 40 piekfracties 138-140 homogeen met betrekking tot de twee polypeptiden.

8402904 10

In tabel A worden de gegevens van de zuivering van VAC uit de runder-aorta samengevat. De G-100 fracties, die homogeen zijn met betrekking tot de twee polypeptiden, worden gebruikt voor alle verdere experimenten in deze beschrijving behalve voor de experimenten, die zijn uitge-5 voerd voor het karakteriseren van de binding van VAC aan fosfolipide-liposomen. In G-100 fractie 139 wordt 3,4% van de VAC-activiteit gevonden met een S.A. van 1480 eenheden/mg proteïne, zoals wordt vastgesteld met de ééntraps-coagulatietest. Deze fractie bevatte geen aantoonbare hoeveelheid fosfolipide en uit de absorptie bij 280 nm en het proteïne- 1% 10 gehalte werd een extinctiecoëfficient A = 8,5 berekend voor lcm dit gezuiverde VAC-preparaat.

Karakterisering van VAC

Zoals blijkt uit figuur 2 zijn de twee polypeptiden met het mole-15 cuulgewicht van 34.000 resp. 32.000, die aanwezig zijn in het gezuiverde VAC preparaat en waaraan de VAC-activiteit wordt toegeschreven, proteïnen met êén enkele keten. Beide polypeptiden bevatten weinig koolhy-draatgroepen, zoals vastgesteld met Schiff's reagens, gebaseerd op basisch Fuchsine. Verder kunnen in beide proteïnen geen Gla-groepen wor-20 den aangetoond. Uit isoelectrische focussering blijkt, dat beide polypeptiden migreren als één enkele band die een geschat isoelectrisch punt bij een pH tussen 4,4 en 4,6 bezit (vergelijk figuur 3). De VAC-activiteit werd uit de PAG-plaat gewonnen door de band uit het gel te elueren. Een analyse van dit eluaat met SDS-PAGE toonde de aanwezigheid 25 van beide polypeptiden opnieuw aan. Dit bevestigt, dat inderdaad beide polypeptiden als één enkele band in de pH-gradient van de PAG-plaat migreren. Menselijk hemoglobine (Hb) werd ook aan isoelectrisch focusse-ren blootgesteld teneinde de methode te controleren. Voor Hb werd een pH van 6,8 vastgesteld (vergelijk figuur 3), welke waarde in overeen-30 stemming is met de literatuur.

Uit bindingsproeven is gebleken, dat de VAC-activiteit aan negatief geladen fosfolipide-membranen kan binden. Deze binding treedt op bij aanwezigheid van Ca·*·* en Mn**" doch niet bij aanwezigheid van Mg** en bij afwezigheid van tweewaardige metaalionen (vergelijk 35 tabel B). Deze binding van VAC-activiteit aan de liposomen is omkeerbaar en kan worden verbroken door het chelatie-middel EDTA. Aan de hand van SDS-PAGE (vergelijk figuur 4) is aangetoond, dat beide proteïnen bij aanwezigheid van Ca** aan de liposomen binden en dat deze binding weer dissocieert bij toevoeging van EDTA, hetgeen er opnieuw op 40 wijst, dat de VAC-activiteit aan deze twee polypeptiden moet worden 84029 04 11 toegeschreven.

Bij bewaren in 10% glycerol bevattend TBS is de VAC-activiteit gedurende tenminste 3 maanden bij -70°C stabiel, gedurende tenminste 12 uren bij 0°C en gedurende tenminste een half uur bij 37°C. Bij 56°C is 5 de activiteit binnen 2 minuten volledig verdwenen.

Werking van VAC

VAC verlengt de stollingstijd volgens de êêntraps-coagulatietest, waarbij de coagulatie teweeg wordt gebracht met BTP. Vervanging van BTP door gezuiverd rundertrombine of gezuiverde runderfactor Xa in deze 10 proef toont aan, dat VAC de stollingstijd alleen verlengt indien factor Xa wordt gebruikt voor het teweegbrengen van de coagulatie en dat de door trombine geïnduceerde stolling niet door VAC wordt beïnvloed. Dit suggereert, dat VAC de factor Xa-activiteit direct remt of dat een interactie optreedt met het protrombinase-complex. Om dit verder te on-15 derzoeken werd de amidolytische trombinevormingsproef met de gezuiverde runderfactor Xa en protrombine gebruikt. Figuur 5 laat zien, dat indien protrombine bij aanwezigheid van Ca·*"*· en fosfolipide door factor Xa wordt geactiveerd tot trombine, VAC de protrombine-activatie remt en dat de mate van inhibitie afhankelijk is van de VAC-concentra-20 tie. Bovendien is het remmende effect van VAC sterker bij een lagere concentratie van fosfolipide. Figuur 6 geeft de afhankelijkheid van fosfolipide van de door VAC geïnduceerde inhibitie van de protrombine-activatie weer. Opgemerkt wordt, dat bij een fosfolipideconcentratie van nul de activatie van trombine door factor Xa niet wordt geremd 25 door VAC. Uit controleproeven is gebleken, dat VAC geen invloed heeft op het meetsysteem zelf.

Incubatie van 5 yM fosfolipide (PS/PC; 4:1 mol/mol) met 107 yg/ml VAC (S.A. 1300 eenheden/mg) en 10 mM Ca"1-^ gedurende 3 minuten bij 37°C had een vermindering van 50% van de procoagulans-activiteit van het 30 fosfolipide tot gevolg (hetgeen werd bepaald met de trombinevormingsproef). Bij verlenging van de incubatietijd tot meer dan 30 minuten werd geen verdere verandering van de procoagulans-activiteit waargenomen. Dit toont aan, dat VAC geen fosfolipase-activiteit bezit.

In tegenstelling tot AT-III heeft VAC geen invloed op de amidoly-35 tische activeit van gezuiverd trombine en heeft het geen nadelige invloed op de factor Xa-activiteit, zoals is gemeten met de chromogene substraten S2238 respectievelijk S2237 (vergelijk tabel C). In tabel C wordt ook aangetoond dat inactivatie van factor Xa en trombine AT-III niet wordt bevorderd door VAC, terwijl heparine op significante wijze 40 deze AT-III activiteit verhoogt. Dit toont aan, dat VAC noch een hepa- 8402904 12 rine-achtige noch een AT-III-achtige activiteit bezit#

Voorbeeld II

Koppeling van fosfolipiden aan Sphérocil

De benodigde fosfolipiden worden opgelost in chloroform en toege-5 voegd aan het kolommateriaal Sphérocil (firma Rhone-Poulenc), in een verhouding van 5 mg fosfolipide per gram Sphérocil. De chloroform wordt met N2~gas verdampt en vervolgens wordt het drooggedampte Sphérocil-fosfolipide gewassen met de buffer, waarin het VAC is gesuspendeerd.

VAC bindt aan Sphérocil-fosfolipide bij aanwezigheid van Ca"*-*· en/of 10 Mn*-*·, als een deel van de fosfolipiden negatief geladen is.

Voorbeeld III

50 μΐ Gecitreerd plaatjes-vrij plasma worden gemengd met 200 pl buffer (25 mM Tris/HCl pH 7,5, 100 mM NaCl), waarin zich kaolien (artificieel oppervlak, dat de intrinsieke stolling katalyseert, in dit ge-15 val gemalen glas), inositine (fosfolipide-bron) en VAC bevinden. Dit mengsel wordt 3 min. bij 37°C geïncubeerd, waarna 250 μΐ Ca^-buf-fer (200 mM Tris/HCl pH 7,5, 80 mM NaCl, 20 mM CaCl2) worden toegevoegd. De stoltijd wordt gemeten zoals in voorbeeld I).

840 29 04 13

Tabel A

Samenvatting van de zuivering van VAC uit intima van de runder-aorta 5 Zuiveringstrap Proteïnea VAC^ Specifieke Opbrengst Zuivering een- activiteiten mg heden eenheden/mg % maal 35% (NH4)2 S04 10 supernatans 630 19.500 31,0 100 1,0 90% (NH4)2S04 pellet 470 19.000 40,4 97 1,3 15 hydroxylapatiet- fractie 206 17.300 84,0 89 2,7 DEAE-fractie 35,8 13.900 388 71 12,5 20 Sephadex G-100 fractie 139 0,45 666 1480 3,4 47,7 a De hoeveelheid proteïne werd bepaald volgens de methode van Lowry 25 c.s. (Lowry, O.H., Rosebrough, N.V., Farr, A.L. en Randall, R.J.

(1951) J.Biol.Chem. 193, 265).

b De VAC-eenheden werden bepaald door onderzoek van verscheidene verdunningen van het monster volgens de in voorbeeld I beschreven één-traps-coagulatietest. De verdunning, die een verlenging van de stoltijd 30 van het blanco monster (65 seconden) tot 100 seconden oplevert, bevat per definitie één VAC-eenheid.

8402904 14

Tabel B

De van metaal afhankelijke binding van VAC aan negatief geladen fosfo-lipide-liposomen 5 tc, secondena

Kation (10 mM) supernatans EDTAC

10 controle (geen liposomen) 180 N.D.^ blanco (geen kation) 174 64,8

CaCl2 64,2 134

MgCl2 165 N.D.

MnCl2 65,1 N.D.

15 _ a De stoltijden tc werden volgens de in voorbeeld I beschreven ëén-traps-coagulatietest bepaald.

k 50 μΐ van de voorraadoplossing van fosfolipide-liposoom (PS/PC; 20 50/50, mol/mol, 1 mM), 50 μΐ VAC (250 μg/ml, S.A.=700 eenheden/mg) en 100 μΐ TBS, dat 5% glycerol en het aangegeven kation bevatte, pH 7,5, werden bij kamertemperatuur gemengd en gedurende 15 minuten bij 15.000xg gecentrifugeerd. 25 μΐ van het verkregen supernatans werd met TBS verdund tot 175 μΐ en vervolgens volgens de ééntraps-coagulatietest 25 onderzocht. Het overblijvende supernatans werd geanalyseerd met SDS-PAGE (figuur 4).

c De gevormde liposoom-pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 150 μΐ 5% glycerol bevattend TBS en 10 mM EDTA, pH 7,5. De suspensie werd gedurende 15 minuten bij 15.000xg gecentrifugeerd. De VAC-activiteit van 30 het supernatans werd bepaald zoals beschreven onder b.

^ N.D. = niet bepaald.

8402904 15

Tabel C

Effect van VAC op de amidolytische activiteit van factor Xa en factor IIa.

5 ____

M^Q^/min.lO^ a VAC

” + 10 Xa 110,5 110,5

Xa, AT-III 80,0 81,5

Xa, heparine 110,5 109,0

Xa, heparine, AT-III 47,5 N.D.b IIa 7,5 7,5 15 IIa, AT-III 5,4 5,6 IIa, heparine 7,5 7,1 IIa, heparine, AT-III 0,56 N.D.

20 a De amidolytische activiteit werd als volgt gemeten:

Factor Xa of factor IIa werd met de aangegeven middelen verdund in TBSA. Het reactiemengsel werd geroerd met een met teflon beklede roer-der in een kunststof cuvette, die met behulp van een thermostaat bij 37°C werd gehouden. Na 10 minuten werd een monster van 100 μΐ (Xa) of 25 50 μΐ (IIa) uit de cuvette genomen. Dit monster werd in een andere, met behulp van een thermostaat bij 37°C gehouden kunststof cuvette gebracht, welke 800 μΐ TBSE en 100 μΐ S2337 (2 mM) respectievelijk 900 μΐ TBSE en 50 μΐ S2338 (5 mM) bevatte. De absorptieverandering bij 405 nM werd gemeten met een Kontron Spectrofotometer Uvikon 810, die met be-30 hulp van een thermostaat bij 37°C werd gehouden. De uiteindelijke concentraties van de diverse middelen in de reactiemengsels waren als volgt: 18,7 nM factor Xa; 1,5 nM factor IIa; 18,7 nM AT-III; 1 eerr-heid/ml heparine en 10,7 pg/ml VAC (S.A. 1300 eenheden/mg). b N.D. = niet bepaald.

8402904 16

Figuurbeschrijving

Figuur 1« Gelfiltratie van VAC op Sephadex G-100.

De kolom (3x80 cm) werd bereid met een drukhoogte van 60 cm en ge-ëqullibreerd met 500 mM NaCl en 20 mM Tris/HCl, pH 7,5. De VAC bevat-5 tende fractie, verkregen na DEAE-chromatografie, werd geconcentreerd tot 2 ml en daarna op het Sephadex 6-100 aangebracht. De drukhoogte van 60 cm werd gehandhaafd. Het ledige volume bleek 245 ml te zijn (fractie 70). Hierna werden fracties van 2 ml verzameld. De fracties werden ge-dialyseerd tegen 10% glycerol bevattend TBS, waarna ze volgens de êin-10 traps-coagulatietest werden onderzocht op VAC-activiteit, zoals besche-ven in voorbeeld I. De stoltijden werden verkregen bij verdunningen van 1ï10 van de G-100 fracties met TBS. De stoltijd bij afwezigheid van VAC was 65 seconden.

Figuur 2. Analytische SDS-PAGE van VAC.

15 SDS-PAGE met gelen, die 10 gew.% acrylamide, 0,27 gew.% Ν,Ν^-me- thyleenbisacrylamide en 0,1% SDS bevatten, werd uitgevoerd volgens Laemli (Laemli, Ü.K. (1970) Nature 227, 680-685). De betekenis van de cijfers op de x-as is als volgt: 1) materialen met standaardmolecuul-gewicht, waarvan de disulfidebindingen gereduceerd zijn, 2) 25 jig geredu-20 ceerd VAC, 3) 25 jxg niet-gereduceerd VAC. De gel werd gekleurd met Coomassie Blue en op de in voorbeeld I beschreven wijze ontkleurd.

Figuur 3. Bepaling van de isoelectrische pH van VAC.

Het electrofocusseren"werd uitgevoerd met PAG-platen in het pH-ge-bied van 3,5-9,5 (vergelijk voorbeeld I). 200 yg menselijk H^1 en 25 20 yg VAC werden op de gel aangebracht nadat de pH-gradient in de gel gevormd was. Menselijk diende als referentie met het bekende isoelectrische punt bij pH 6,8. Voordat de gel werd onderworpen aan kleuring met Coomassie Blue werd de gel gedurende 30 minuten gefixeerd met 0,7 M trichloorazijnzuur.

30 Figuur 4. Analyse van de binding van VAC aan negatief geladen fosfoli-pide-liposomen met SDS-PAGE.

SDS-PAGE werd uitgevoerd volgens Laemli (Laemli, Ü.K. (1970) Nature 227, 680-685) op dezelfde plaatjes als bij figuur 2. De geanalyseerde monsters werden verkregen uit de bindingsexperimenten zoals wordt 35 aangegeven in de toelichting bij tabel B. De betekenis van de cijfers op de x-as is als volgt: 1) materialen met standaard-molecuulgewicht, waarvan de disulfide-bindingen gereduceerd zijn, 2) supernatans, verkregen na centrifugeren van een VAC-preparaat bij afwezigheid van lipo-somen, 3) supernatans, verkregen na centrifugeren van VAC bij aanwezig-40 heid van liposomen, 4) supernatans, verkregen na centrifugeren van VAC

8402904 17 bij aanwezigheid van liposomen en Ca-***" en 5) supernatans, verkregen na centrifugeren van de liposoom-pellet van 4), die opnieuw werd gesuspendeerd in 10 mM EDTA bevattend TBS.

Figuur 5. Effect van de concentratie van VAC op de inhibitie (%) van 5 de trombinevorming.

De gegeven concentraties van VAC zijn de uiteindelijk in de testsystemen aanwezige concentraties. De trombinevorming werd gemeten bij 1 pM protrombine, 10 nM factor Xa en 0,5 M (A — A ) of 5 M (#-#) fosfolipide-membranen (PC/PS; 4:1, mol/mol) in 10 mM CaCl2 bevattend 10 TBSA. Het reactiemengsel werd met de aangegeven hoeveelheden VAC (S.A. 1300 eenheden/mg) gedurende 3 minuten bij 37°C zonder protrombine geroerd. Door toevoeging van protrombine aan het mengsel begon de trombinevorming, waarvan de snelheid werd gemeten zoals in voorbeeld I. De snelheid van de trombinevorming bij afwezigheid van VAC was 3,3 nM 15 IIa/min. (A —A) resP* 10,9 nM lla/min. (φ » φ).

Figuur 6. Effect van de fosfolipide-concentratie op de inhibitie (%) van de trombinevorming door VAC.

De trombinevorming werd gemeten bij 1 pM protrombine, 10 riM factor Xa, 10,7 pg/ml VAC (S.A. 1300 eenheden/mg) en verschillende concen-20 traties fosfolipide-membranen (PC/PS; 4:1, mol/mol) in TBSA. Factor Xa, VAC en fosfolipiden werden gedurende 3 minuten bij 37°C in TBSA geroerd. De trombinevorming werd op gang gebracht door toevoeging van protrombine aan het reactiemengsel. De snelheid van de trombinevorming werd gemeten zoals beschreven in voorbeeld I. Het percentage van de in-25 hibitie van de trombinevorming (φ - φ) werd voor elke fosfolipide concentratie met de overeenkomstige snelheid van de trombinevorming bij afwezigheid van VAC (J^<*A) gemeten.

8402904

Claims (8)

1. De bloedstolling remmend eiwitmateriaal waarvan de eigenschappen in de voorgaande beschrijving zijn aangegeven*

2. Eiwitmateriaal volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit in water oplosbare» uit één keten bestaande polypeptiden bevat met een mo-lecuulgewicht van ongeveer 34.10^ respectievelijk ongeveer 32.10^ en een isoelectrisch punt van 4,4-4,6.

3. Werkwijze ter bereiding van een de bloedstolling remmend eiwit-10 materiaal, met het kenmerk, dat men uit biologisch vaatwandmateriaal met behulp van op zichzelf bekende isolerings- en zuiveringstechnieken een de bloedstolling remmend eiwitmateriaal bereidt, waarvan de eigenschappen in de voorgaande beschrijving zijn aangegeven.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men biolo-15 gisch vaatwandmateriaal a) homogeniseert en differentieel centrifugeert, en de bovenstaande vloeistof in willekeurige volgorde aan één of meer der volgende zuiveringsbewerkingen onderwerpt: b) precipitatie met zout 20 c) affiniteitschromatografie d) ionen-uitwisselingschromatografie e) chromatografie met een moleculaire zeef, waarbij men de na de stappen b), c), d) ene) verkregen produkten desgewenst dialyseert.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men een verdere zuivering met behulp van immunoadsorptie-chromatografie uitvoert .

6. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men voor de precipitatie van stap b ammoniumsulfaat, voor de chromatografie van 30 stap c hydroxylapatiet, voor de chromatografie van stap d DEAESephacel en voor de chromatografie van stap e Sephadex G-100 gebruikt.

7. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men de in de voorbeelden beschreven methode of een analoge methode toepast.

8. Farmaceutisch preparaat, gekenmerkt door een gehalte aan eiwit-35 materiaal volgens conclusie 1 of 2 resp. verkregen volgens de werkwijze van conclusies 3-7. 8402904