DD241691A5 - Verfahren zur herstellung blutgerinnungshemmender proteine - Google Patents

Abstract

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Proteinen, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen, ohne die sich nachteilig auf den Gerinnungsprozess auswirkenden Eigenschaften der bisher bekannten Antikoagulantien. Das erfindungsgemaesse Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass Blutgefaesswaende, stark vaskularisierte Gewebe oder Endtothelzellkulturena) homogenisiert und differential zentrifugiert werden und die obenstehende Fluessigkeit in beliebiger Reihenfolge einer oder mehrerer der folgenden Reinigungsbehandlungen ausgesetzt wird,b)Praezipitieren mit Salzc)Affinitaetschromatographied)Ionenaustauschchromatographiee)Chromatographie ueber ein Molekularsieb, wobei die nach den Stufen b), c), d) und e) erhaltenen Produkte gewuenschten falls dialysiert werden koennen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung blutgerinnungshemmender Proteine.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Blutgerinnungshemmende Proteine, die in den meisten Säugetieren vorhanden sind, können in drei Gruppen eingeteilt werden. Diese Einteilung beruht auf dem Unterschied der Protein-Wirkungsmechanismen.

1. Proteine, die mit dem Gerinnungsfaktor einen Komplex bilden und dadurch den Gerinnungsfaktor unwirksam machen. Dazu gehören die Proteine:

a) Antithrombin-Ill (Thromb. Res. 5,439-452(1974])

b) α,-Protease Inhibitor (Ann. Rev. Biochem. 52,655-709(1983])

c) a₂-Makroglubin (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 [1983])

d) Crlnhibitor (Biochemistry 20, 2738-2743 [1981])

e) Protease Nexin (J. Biol. Chem. 258,10439-10444, [1983]).

2. Proteine, die einen Gerinnungsfaktor proteolytisch zerschneiden und dadurch den Gerinnungsfaktor desaktivieren. Als einziges Protein dieser Artist bisher Protein C beschrieben (J. Biol. Chem. 251,355-363(1976]).

3. Proteine, die die negativ geladenen Phospholipide abschirmen und/oder hydrolisieren, so daß die Phospholipid-abhängigen Reaktionen des Blutgerinnungsmechanismus gehemmt werden. Bisher sind nur Phospholipasen, die aus verschiedenen Schlangengiftsorten isoliert wurden, beschrieben worden (Eu. J. Biochem. 112,25-32 [1980]).

Das stufenweise ablaufende Gerinnungssystem ist in den letzten Jahren intensiv untersucht worden. Es wird als ein sich verstärkendes Mehrstufensystem verschiedener miteinander verbundener, proteolytischer Reaktionen verstanden, bei dem ein Enzym ein Zymogen in die aktive Form umsetzt (vgl. [1980]). Die Geschwindigleit dieser Reaktion wird in entscheidender Weise durch die Anwesenheit von Phospholipiden und anderer Kofaktoren wie Faktor V_a und Faktor VIlI₃ vergrößert. In vivo werden die Prokoagulationsreaktionen durch verschiedene Inhibitionsmechanismen geregelt, die einem explosiv thrombotischen Trauma nach einer geringen Aktivierung der Gerinnungskaskade vorbeugen.

Die Antigerinnungsmechanismen können wie folgt eingeteilt werden (Rosenberg, R. D., Rosenberg, J. S., J. Clin. Invest. 74,1-6 [1984]):

1. Der Serin-Protease-Faktor X_a und Thrombin werden infolge ihrer Bindung an Antithrombin III bzw. an den Antithrombin/ Heparin-Komplex inaktiviert. Sowohl die Prothrombin-Aktiierung als auch die Bildung von Fibrin kann auf diese Weise gehemmt werden. Neben Anti-thrombin III gibt es noch verschiedene andere Plasma-Protease-Inhibitoren wie beispielsweise a₂-Makroglobulin und Antitrypsin, deren Wirkung zeitabhängig ist.

2. Die Entdeckung des Protein Cs führte zur Aufdeckung eines weiteren Antigerinnungsmechanismus. Ist das Protein C einmal aktiviert worden, wirkt es durch die selektive Proteolyse der Proteinkofaktoren Faktor V_a und VIII₃, durch die die Prothrombinase und das Enzym, das den Faktor X umsetzt, inaktiviert werden, als Antikoagulanz.

3. Plasmin spaltet monomeres Fibrin 1, ein Produkt der Einwirkung von Thrombin auf Fibrinogen, wodurch der Bildung eines unlöslichen Fibrins vorgebeugt wird (Nossel, H. L, Nature, 291,165-167 [1981]).

Von den oben genannten, in den Gerinnungsprozeß eingreifenden körpereigenen Proteinen istz.Z. nur das Antithrombin III in klinischem Einsatz. Als erheblicher Nachteil hat sich jedoch die bei der Anwendung dieses Proteins auftretende Erhöhung der Blutungsneigung herausgestellt.

Alle bisher als Antikoagulantien eingesetzten Mittel, ob körpereigener oder synthetischer Natur machen in irgendeiner Weise die Gerinnungsfaktoren unwirksam und führen dadurch zu Nebenwirkungen, die sich nachteilig auf den Gerinnungsprozeß auswirken können.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweist, jedoch ohne die sich nachteilig auf den Gerinnungsprozeß auswirkenden Eigenschaften der bisher bekannten Antikoagulantien.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise konnten nun körpereigene Proteine isoliert werden, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen, nicht jedoch die Blutungsgefahr erhöhen. Als weitere überraschende Eigenschaft verlieren diese Proteine bei größeren Blutungen ihre hemmenden Eigenschaften, so daß die üblichen Gerinnungsprozesse ungestört ablaufen können und die Gefahr eines Verblutens nicht besteht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die im folgenden VAC.(VasGular-Anti-Coaguiant) genannten blutgerinnungshemmenden Proteine, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren. Diese Proteine sind in der Lage, die durch ein vaskuläres Prokoagulanz bzw. durch den Faktor X_a induzierte Gerinnung zu hemmen, jedoch nicht die von Thrombin induzierte Gerinnung. Sie hemmen nicht die biologische und amidolytische Aktivität der Faktoren X_a und ll_a.

Gegenstand der Erfindung sind blutgerinnungshemmende Proteine, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren und:

— den modifizierten Prothrombin-Zeit-Versuch und/oder

— den modifizierten, aktivierten, partiellen Thromboplastin-Zeit-Versuch und/oder

— den nicht-modifizierten Prothrombin-Zeitversuch und/oder

— die Prothrombin-Aktivierung durch den Gerinnungsfaktor X_a in Gegenwart von negativ geladenen Phopholipiden und Ca²⁺ und/oder

— die intrinsische X-Aktivierung durch den Faktor IX_a in Gegenwart von negativ geladenen Phospholipiden und Ca²⁺ und/ oder

— die Prothrombin-Aktivierung von isolierten, stimulierten Blutplättchen und/oder

— die von der Gefäßwand induzierte Gerinnung und/oder

— die gerinnungsabhängige Plättchenaggregation hemmen.

Gegenstand der Erfindung sind auch blutgerinnungshemmende Proteine, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren und deren hemmende Wirkung von der Menge an Phospholipiden abhängt. Die erfindungsgemäßen Proteine induzieren die Protrombin-Aktivierungshemmung durch den Faktor X₃. Die Hemmung ist abhängig von der Phospholipidkonzentration und ist bei hohen Phospholipidkonzentrationen kleiner. Die Phospholipide werden von den erfindungsgemäßen Proteinen nicht hydrolisiert.

Gegenstand der Erfindung sind ferner blutgerinnungshemmende proteine, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren und die über die divalenten Kationen Ca²⁺ und/oder Mn²⁺ an negativ geladene Phospholipide, die beispielsweise in Vesikeln, Liposomen oder Etherosomen zu finden sind, und/oder über die divalenten Kationen Ca²⁺ und/oder Mn²⁺ an negativ geladene Phospholipide, die mit Spherocil gekoppelt sind, binden. Die Bindung der Proteine an die negativ geladenen Phospholipide ist reversibel und kann von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) aufgehoben werden. Die erfindungsgemäßen Proteine sind in der Lage, den Faktor X_a und die Prothrombine von einer negativ geladenen Phospholipidoberfläche zu verdrängen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere blutgerinnungshemmende Proteine, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren und Molekulargewichte von ca. 70 x 10³, 6Ox 10³,34 x 10³ oder 32 x 10³ aufweisen, von denen die Proteine mit dem Molekulargewicht 34 χ 10³ respektive 32 x 10³ aus jeweils nur einer einzigen Polypeptidkette bestehen. Gegenstand der Erfindung sind vorzugsweise blutgerinnungshemmende Proteine, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren, dadurch gekennzeichnet, daß

— sie aus Blutgefäßwänden von Säugetieren isoliert und gereinigt werden,

— sie keine Glykoproteine sind,

— sie keine Phospholipasen sind,

— sie einen isoelektrischen Punkt bei pH 4,4-4,6 besitzen,

— die Aktivität der blutgerinnungshemmenden Proteine bei 56°C thermolabil ist,

— die Aktivität der blutgerinnungshemmenden Proteine im zitrierten Plasma bei 37°C einige Stunden stabil bleibt,

— die Aktivität der blutgerinnungshemmenden Proteine von Trypsin und/oder Chymotrypsin nicht vollständig zerstört wird,

— die Aktivität der blutgerinnungshemmenden Proteine von Collagenase und/oder Elastase nicht beeinflußt wird,

— sie über die divalenten Kationen Ca²⁺ und Mn²⁺ mit negativ geladenen Phospholipiden, die in Vesikeln, Liposomen oder Etherosomen zu finden sind, binden,

— sie über die divalenten Kationen Ca²⁺ und Mn²⁺ mit negativ geladenen Phospholipiden, die mit Spherocil gekoppelt sind, binden,

— die Bindung der Proteine an die negativ geladenen Phospholipide reversibel ist und von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) aufgehoben werden kann,

— sie den Faktor X_a und die Prothrombine von einer negativ geladenen Phospholipidoberfläche verdrängen,

— sieden modifizierten Thrombin-Zeit-Versuch hemmen,

— sie den modifizierten, aktivierten, partiellen Thromboplastin-Zeit-Versuch hemmen,

— sie den nicht-modifizierten Prothrombin-Zeitversuch hemmen.

— sie die Prothrombin-Aktivierung durch den Gerinnungsfaktor X_a in Gegenwart von negativ geladenen Phospholipiden und Ca²⁺in vitro hemmen,

— sie nicht die biologische und amidolytische Aktivität der Faktoren X_a und ll_a hemmen,

— sie die intrinsische X-Aktivierung durch den Faktor IX_a in Gegenwart von negativ geladenen Phospholipiden und Ca² hemmen,

— sie die Prothrombin-Aktivierung von isolierten, stimulierten Blutplättchen in vitro hemmen,

— sie die von der Gefäßwand induzierte Gerinnung in vitro hemmen und

— die durch die Proteine induzierte Prothrombin-Aktivierungshemmung durch den Faktor X_a von der Phospholipidkonzentration abhängig ist und bei hohen Phospholipidkonzentrationen kleiner ist.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere VAC-Proteine, im wesentlichen frei von jedwedem tierischen Gewebe, vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form.

Geeignete Ausgangsmaterialien für die Isolierung der VAC-Proteine sind die Blutgefäßwände sowie stark vaskularisiertes Gewebe verschiedener Säugetiere beispielsweise von Rindern, Ratten, Pferden und Menschen sowie Endothelzellkulturen dieser Säugetiere. Insbesondere sind die Arterienwände von Rindern, Ratten, Pferdeffund Menschen wie auch humane Nebelschnurvenen und -artieren geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins mittels an sich bekannter Isolierungs- und Reinigungstechniken. Insbesondere geeignet ist folgendes Verfahrensschema:

Das homogenisierte Ausgangsmaterial wird zunächst einer Differentialzentrifugation ausgesetzt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit kann dann nacheinander in beliebiger Reihenfolge folgendermaßen weiterbehandelt werden. Mit Ammoniumsulfat können unerwünschte Beimengungen präzipitiert werden. Der Überstand wird dann mittels Affinitätschromatographie, beispielsweise über Hydroxyapatit, lonenaustauschchromatographie, z. B. über DEAE-Sephacel, Chromatographie über ein Molekularsieb, wie Sephadex G-100 und Immunadsorptionschromatographie, beispielsweise mit polyklonalen oder auch monoklonalen Antikörpern weiter gereinigt. Je nach der Qualität des Ausgangsmaterials kann dieses Reinigungsschema abgewandelt oder auch andere Reinigungsverfahren angewendet werden, beispielsweise die Reinigung mit Hilfe von Phospholipid-Vesikeln.

Neben der klassischen Antithrombosebehandlung, der oralen Antigerinnung, wird neuerdings für den Fall einer manifesten ; Thrombose biosynthetischer Gewebe-Plasminogenaktivator intravaskulär verabreicht (N. Engl. J. Med. 310,609-613 [1984]). Die erfindungsgemäßen Proteine sind hervorragend geeignet, insbesondere durch die blutgerinnungshemmenden Eigenschaften gleichzeitig mit der Hemmung der gerinnungsabhängigen Plättchenaggregation einer Thrombose, beispielsweise bei Operationen vorzubeugen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine als antithrombotisches Mittel

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Präparate, die zumindest ein erfindungsgemäßes Protein enthalten. ·

Die Ergebnisse der VAC-Isolierung und-Reinigung aus Rinderaorten sind in der Tabelle A aufgeführt. Die Bestimmung der Menge an VAC-Aktivität im Überstand der 100000 xg Zentrifugation war wegen der Gegenwart einer Prokoagulanzaktivität irrelevant. Die für diese Aktivität verantwortlichen Bestandteile konnten mit Ammoniumsulfat bei einem Sättigungsgrad von 35% präzipitiert werden.

Festgestellt werden konnte, daß die obenstehende Lösung nach dem Präzipitieren mit 35% Ammoniumsulfat 100% VAC-Aktivität enthielt. Zur Konzentrierung wurde die Lösung bis zu einer Sättigung von 90% mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Präzipitat, die VAC-Proteine enthaltend, wurde in Gegenwart von TBS an eine Hydroxyapatit-Säule gebunden. Nach dem Waschen wurden die VAC-Proteine aus dieser Säule mit einem steigenden Phosphatgradienten eluiert. Bei einer niedrigen lonenstärke wurden die VAC-Proteine an eine DEAE-Sephacel-Säule gebunden. Die Elution der VAC-Proteine von dieser Säule erfolgte mit einem zunehmenden NaCI-Konzentrationsgradienten. Bei der Endreinigung wurden die Proteine auf Grund ihres Molekulargewichtes durch die Gelfiltration über Sephadex G100 getrennt. Das Eluenz war ein hochsalziger Puffer zum Minimalhalten der Interaktion von VAC mit dem Sephadex-Material. VAC eluierte aus dieser Säule in einem Volumen von etwa 1,6mal des leeren Säulevolumens (siehe Figur 1). Die Gesamtausbeute der VAC-Aktivität nach dieser Endreinigung betrug 35%. Gemäß der SDS-PAGE enthalten alle G-100 Fraktionen, die VAC-Aktivität zeigten, zwei Polypeptide (Molekulargewicht 34000 bzw. 32000). In einigen Fällen zeigte auch eine Fraktion mit dem Molekulargewicht 60000 VAC-Aktivität. Gemäß SDS-PAGE sind nur die Spitzenfraktionen 138-140 homogen in bezug auf die beiden Polypeptide. In derTabelle A wurden die Reinigungsdaten aus den Rinderaorten zusammengefaßt. Die G-100 Fraktionen, die in bezug auf die beiden Polypeptide homogen sind, wurden für alle weiteren Experimente dieser Beschreibung verwendet, mit Ausnahme der Experimente zur Charakterisierung der Bindung von VAC an Phospholipid-Liposome.

In der G-100 Fraktion 139 wurden 3,4% der VAC-Aktivität mit einer spezifischen Aktivität von 1480 Einheiten/mg Protein ermittelt, wie mit dem Einstufenkoagulationsversuch festgestellt werden konnte. Diese Fraktion enthielt keine nachweisbare Menge an Phospholipid und aus der Absorption bei 280 nm und dem Proteingehalt wurde für dieses gereinigte VAC-Präparat ein Extinktionskoeffizient von

i ° = 8,5 berechnet.

i cm

Charakterisierung des VAC

Wie aus Fig.2 hervorgeht, sind die zwei Polypeptide mit dem Molekulargewicht von 34000 und 32000, die in dem gereinigten Proteinmaterial vorhanden sind und denen die VAC-Aktivität zugeschrieben werden. Proteine mit einer einzigen Kette. Wie mit dem Schiff'schen Reagenz mit basischem Fuchsin festgestellt wurde, enthalten beide Proteine wenig Kohlehydratgruppen. Außerdem konnten in beiden Proteinen keine Gla-Gruppen festgestellt werden. Aus der isoelektrischen Fokussierung geht hervor, daß beide Proteine in einem einzigen Band wandern, was einem isoelektrischen Punkt von 4,4 bis 4,6 entspricht (vgl. Fig.3).

Die VAC-Aktivität wurde aus der PAG-Platte durch die Elution dieses Bandes aus dem Gel gewonnen. Eine Analyse dieses Eluates mit SDS-PAGE zeigte wiederum die Gegenwart der beiden Proteine. Damit konnte bestätigt werden, daß beide Proteine in einem einzigen Band in dem pH-Gradienten der PAG-Platte wandern. Zur Überprüfung der Methode wurde humanes Hämoblobin (Hb) ebenfalls mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung untersucht. Der festgestellte Wert von 6,8 stimmt mit den Angaben in der Literatur überein (vgl. Fig. 3).

Aus Bindungsversuchen ging hervor, daß sich die VAC-Aktivität an negativ geladenen Phospholipid-Membranen binden kann. Diese Bindung erfolgt in Gegenwart von Ca²⁺ und Mn²⁺, aber nicht in Gegenwart von Mg²⁺ und in Abwesenheit von divalenten Metallionen (vgl. Tabelle D). Diese Bindung der VAC-Aktivität an den Liposomen ist umkehrbar und kann durch das Reagenz EDTA aufgehoben werden.

An Hand der SDS-PAGE konnte gezeigt werden, daß beide Proteine in Gegenwart von Ca²⁺ an Liposomen binden können und daß diese Bindung bei Hinzufügen von EDTA wieder dissoziiert (vgl. Figur 4); ein erneuter Hinweis darauf, daß die VAC-Aktivität diesen zwei Proteinen zuzuschreiben ist.

Beim Aufbewahren in TBS, das 10% Glycerol enthält, ist die VAC-Aktivität wenigstens 3 Monate bei -70°C stabil, bei o°C wenigstens 12 Stunden und bei 37°C wenigstens eine halbe Stunde. Bei 56⁰C ist die Aktivität innerhalb von 2 Minuten verschwunden. ,-,..* „ . . .. -

Wirkung von VAC

VAC verlängert die Gerinnungszeit nach dem Einstufenkoagulationsversuch, wobei die Koagulation mit BTP ausgelöst wird. Der Ersatz von BTP durch das gereinigte Rinderthrombin oder den gereinigten Rinderfaktor X_a in diesem Versuch zeigt, daß VAC die Gerinnungszeit nur verlängert, wenn der Faktor X_a zur Auslösung der Koagulation verwendet wird und daß die von Thrombin induzierte Gerinnung nicht durch VAC beeinflußt wird. Dies deutet darauf hin, daß VAC die Faktor X_a-Aktivität direkt hemmt oder daß eine Interaktion mit dem Prothrombinase-Komplex auftritt. Zur weiteren Prüfung wurde der amidolytische Thrombin-Bildungsversuch mit dem gereinigten RinderfaktorX_a und Prothrombin benutzt. Fig. 5 zeigt, daß wenn Prothrombin in Gegenwart von Ca²⁺ und Phospholipid durch Faktor X_a zu Thrombin aktiviert wird, VAC die Prothrombin-Aktivierung hemmt und daß der Inhibitionsgrad von der VAC Konzentration abhängig ist. Außerdem ist der hemmende Effekt von VAC stärker bei einer niedrigen Phospholipidkonzentration.

Fig. 6 stellt die Phospholipidabhängigkeit der von VAC induzierten Inhibition der Prothrombin-Aktivität dar. Bemerkenswert ist, daß bei einer Phospholipidkonzentration von Null die Thrombin-Aktivierung durch Faktor X_a nicht von VAC gehemmt wird. Bei Kontrollversuchen zeigte sich, daß VAC selbst das Meßsystem nicht beinflußt.

Die Inkubation von 5μΜ Phospholipid (PS/PC; 1:4 Mol/Mol) mit 107 pg/ml VAC (spez. Akt. 1300 Einheiten/mg) und 10 mM Ca²⁺ ergab innerhalb von 3 Minuten bei 37°C eine Verringerung der Prokoagulanz-Aktivität. Dies zeigte, daß VAC keine Phospholipase-Aktivität besitzt.

Im Gegensatz zu AT-III hat VAC keinen Einfluß auf die amidolytische Aktivität des gereinigten Th rombins und keinen nachhaltigen Einfluß auf die Faktor X_a-Aktivität, wie mit den chromatogenen Substraten S 2238 beziehungsweise S2237 gemessen wurde (vgl. Tabelle C). In dieser Tabelle wird auch gezeigt, daß die Inaktivierung von Faktor X_a und Thrombin/AT-Ill nicht durch VAC verstärkt wird; Heparin dagegen erhöht die AT-III Aktivität besitzt.

Die Isolierung eines neuen menschlichen blutgerinnungshemmenden Proteins konnte durch ein prinzipiell gleiches Verfahren aus dem Homogenat von menschlichen Nabelschurarterien erreicht werden.

Aufgefunden wurde das Antikoagulant durch seine Fähigkeit, die Gerinnungszeit in einem Prothrombinzeitversuch zu verlängern. Diese Fähigkeit wurde nach einer Sephadex G100 Fraktionierung eines Arterien-Homogenates meßbar. Auf Grund weiterer Isolierungsstufen kann angenommen werden, daß die Aktivität auf eine oder mehrere wasserlösliche Substanzen zurückgeführt werden kann, die insgesamt eine negative Ladung bei einem pH von 7,9 tragen.

Die Analyse einer Sephadex G75 Fraktion (der letzte bisher durchgeführte Reinigungsschritt) mit Hilfe der Gel-Elektrophorese zeigt eine Korrelation zwischen der Intensität der Molekulargewichtsbande bei 32000 und der Verlängerung der Gerinnungszeit gemessen in dem MPTT (Fig. 15). Die Beziehung zwischen der 32 K-Bande und der Antigerinnungsaktivität ist zweifelsfrei, da nur aus diesem 32K-Band des Polyacrylamidgelseine blutgerinnungshemmende Aktivität eluiert werden kann. In Verbindung mit den Ergebnissen, daß das Antikoagulant seine Aktivität bei der Inkubation bei 56°C schnell verliert und daß Proteasen seine Aktivität zerstören kann, muß angenommen werden, daß die Antigerinnungsaktivität durch ein einzelnes Protein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 32000 Dalton hervorgerufen wird.

Trypsin, im Gegensatz zu Protease Typ 1 ist ein schlechter Inaktivator des Antikoagulantes. Dies deutet darauf hin, daß das Antikoagulant nur wenige Lysin-und Arginin-Reste enthält, die für Trypsin zugänglich sind.

Die Art der blutgerinnungshemmenden Aktivität wurde untersucht, indem die Gerinnung auf verschiedene Weise ausgelöst wurde. Die entweder durch das vaskuläre Prokoagulanz HTP oder durch den Faktor X_a ausgelöste Gerinnung wird durch das Antikoagulant gehemmt, die durch Thrombin induzierte Gerinnung jedoch nicht. Hieraus kann geschlossen werden, daß das Antikagulant bei der Thrombinbildung nicht jedoch bei der Wirkung des Thrombins eine Rolle spielt.

Zur weiteren Aufklärung des Antigerinnungsmechanismus des erfindungsgemäßen Proteins wurde Prothrombinase verwendet (2). Unter den experimentellen Bedingungen kann das Antikoagulant die Aktivierung von Prothrombin durch die vollständige Prothrombinase 6Faktor X_a, Faktor V_a, Phospholipid, Ca²⁺) und durch den Phospholipid-gebundenen Faktor X_a (Faktor X_a, Phospholipid, Ca²⁺) hemmen, nicht aber den freien Faktor X₃ (Faktor X_a, Ca²⁺).

Der Zeitverlauf der Prothrombinaktivierung in Gegenwart des Antigerinnungsmittels weist auf die sofortige Inhibition der Prothrombinaktivierung hin, die zeitlich konstant bleibt. Es kann daher festgestellt werden, daß das Antikoagulant weder durch eine Phospholipase noch durch eine proteolytische Aktivität wirkt. Die Tatsache, daß die Aktivierung von Prothrombin durch Faktor X_a und Ca²⁺ gar nicht von dem Antikoagulant beeinflußt wird, ist ein starker Hinweis darauf, daß der Antigerinnungsmechanismus des vaskulären Proteins von dem der allgemein bekannten Plasmaprotease-Inhibitoren, wie Antithrombin III verschieden ist. Wie von Walker et al (8) gezeigt wurde, hemmt das aktivierte Protein C die Prothrombin-Aktivierung durch Faktor X₁, Ca²⁺ und Phospholipid nicht; demzufolge ist das erfindungsgemäße Protein auch nicht mit Protein C identisch.

Erste Bindungsversuche deuten darauf hin, daß das vaskuläre Antigerinnungsmittel mit der Lipidbindung des Faktors X_a und/oder Prothrombins möglicherweise interferiert. Ob die Fähigkeit des Antikoagulantes, die Prothrombin-Aktivierung zu hemmen, vollständig für den Verlängerungseffekt im Prothrombin-Zeit-Versuch verantwortlich ist, muß noch ermittelt werden.

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Die Tatsache, daß das erfindungsgemäße Material aus verschiedenen Arten von Arterien zu erhalten ist und nicht aus mäßig vaskularisiertem Gewebe, könnte darauf hinweisen, daß das erfindungsgemäße Protein ein physiologischer Modulator der Hämostase und Thrombose ist, aktiv auf dem vaskulären Niveau.

Auf Grund der ermittelten Eigenschaften und Wirkungen des VAC kann der Blutgerinnungsmechanismus unter VAC Einfluß folgendermaßen interpretiert werden:

VAC bindet über Ca²⁺-lonen mit negativ geladenen Phospholipiden, die durch die Beschädigung von Gewebe und/oder die stimulierten Blutplättchen auftreten und verringert dadurch die Bindung bestimmter Gerinnungsfaktoren (Vitamin K abhängige Gerinnungsfaktoren) mit der negativ geladenen Phospholipidoberf lache, die für diese Gerinnungsfaktoren wie eine katalytische Oberfläche wirkt (Biochem. Biophys. Acta, 515,163-205 [1978]), mit der Folge, daß die Phospholipid-abhängigen Blutgerinnungsreaktionen von VAC gehemmt werden. Auf Grund des Wirkungsmechanismus kann VAC in die Proteingruppe 3 eingeordnet werden (s. oben).

Von entscheidender Bedeutung ist jedoch der zu den Proteinen dieser Gruppe bestehende Unterschied, daß VAC die Phospholipide nicht hydrolisiert und dadurch keine wesentlichen Membranstrukturen zersetzen kann!

Weiterhin sind besonders bedeutsam und vorteilhaft die bisher bei keinem der bekannten Antikoagulanzien beschriebener).;^.* Eigenschaften des VAC:

— Der Antigerinnungseffekt von VAC ist von der Menge Phospholipide abhängig, die an dem Gerinnungsprozeß teilnehmen. Diese Abhängigkeit bewirkt, daß der Gerinnungsprozeß, der beispielsweise durch eine geringe Gefäßwandbeschädigung und/oder eine geringe Blutplättchenaktivierung ausgelöst wurde, z. B. durch einen thrombotischen Prozeß, überraschenderweise durch VAC gehemmt werden kann! Andererseits wird jedoch der Gerinnungsprozeß, der durch eine drastische Gefäßwandbeschädigung ausgelöst wurde, bei der Phospholipide in hoher Konzentration auftreten, durch eben diese hohen Phospholipidkonzentrationen durch VAC nicht gehemmt! Die Gefahr eine Blutung bei der Verwendung von VAC ist daher überraschenderweise äußerst gering.

Diese überlegenen Eigenschaften bietet VAC im Gegensatz zu allen bisher bekannten Antikoagulanzien, die einen oder mehrere Gerinnungsfaktoren unwirksam machen und dadurch die Gefahr einer Blutung erhöhen!

— VAC inaktiviert überraschenderweise nicht die Gerinnungsfaktoren selbst! Hierdurch ist es den Gerinnungsfaktoren auch weiterhin möglich, ihre anderen Aufgaben, von denen immer mehr aufgedeckt werden, zu erfüllen. Manche aktiven Gerinnungsfaktoren haben beispielweise die wichtige nichthämostatische Aufgabe der Chemotxis für die Inffammatorzelle. Diese Zelle trägt zur Heilung einer beschädigten Gefäßwand bei!

Durch VAC wird dieser Prozeß überraschenderweise nicht beeinträchtigt!

Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmals eine neuartige Klasse von blutgerinnungshemmenden Proteinen, die die Gerinnungsfaktoren nicht inaktivieren.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Die zur Erläuterung dienenden Beispiele sowie die aufgeführten Eigenschaften sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken. Dem Fachmann ist es ohne erfinderische Leistung möglich, anhand des beschriebenen Verfahrens weitere Proteine, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen, ohne die Gerinnungsfaktoren zu inaktivieren zu erhalten. Auch diese Proteine gehören zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

VAC: vaskuläresAntikoagulenz

PFP: Blutplättchenfreies Plasma

TBS: 10OmM NaCI, 50 mM Tris/HCI, pH 7,5

EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure

TBSE: TBS mit 2 mM EDTA

BTP: Thromboplastin aus Rindergehimen

HTP: Thromboplastin aus humanen Gehirnen

TBSA: TBS mit 0,5 mg/ml humanes Serum-Albumin, pH 7,9

S 2337: N-Benzol-L-lsoleucyl-L-Glutamyl-L-Pipecolyl-Glycyl-L-Arginin-p-Nitroanilid-Dihydrochlorid

S 2238: H-D-Phenylalanyl-L-Pipecolyl-L-Arginin-p-Nitroanilid-Dihydrochlorid

AT-III: humanes Antithrombin III

S.A.: spezifische Aktivität

Ole₂Gro-P-Cho: i^-Dioleoyl-sn-glycero-S-phosphocholin

0Ie₂GrO-P-SeT: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosposerin

GIa: γ-Carboxy-gIutaminsäure

Für die Nomenklatur der Blut-Koagulationsfaktoren ist die von Task Force on Nomenclature of Blood Clotting Zymogens and Zymogens intermediates empfohlene verwendet worden.

Materialien

Die Chemikalien für die analytische SDS-PAGE und Hydroxyapatit HTP stammten von Bio-Rad, Sephadex G-100 und G-75, DEAE-Sephacel und der „Low Molecular Weight Calibration Kit" von Pharmacia, die chromogenen Substrate S2337 und S 2238 von Kabi Vitrum und die Diaflo PM-10 Ultrafiltrationsmembran von Amicon.

Beispiel 1

Isolierung und Reinigung des VAC

Innerhalb einer halben Stunde nach dem Schlachten wurden den Rindern die Aorten entnommen. Das Rinderblut wurde in Trinatriumzitrat (Endkonzentration 0,38Gew.-%) gesammelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur und 2000xg zentrifugiert. Das wenige Blutplättchen enthaltende Plasma wurde anschließend erneut zentrifugiert (15 Minuten bei lOOOOxg). Auf diese Weise erhielt man blutplättchenfreies Plasma (PFP).

Die Aorten der Tiere wurden unmittelbar nach ihrer Entnahme gründlich mit T.BS gespült. Die Intima wurden von den Aorten gelöst und unter Anwendung eines hochtourigen Homogenisators, beispielsweise mit dem Braun MX 32, in TBSE, das Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (16mg/l) und Benzamidin (1,57g/l) enthielt, homogenisiert.

Das aus 8 Aorten homogenisierte Material, das 20% (Gewicht/Volumen) Feststoff enthielt, wurde 60 Minuten bei lOOOOOxg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit festem Ammoniumsulfat bis zu 30% gesättigt. 30 Minuten gerührt und anschließend 20 Minuten bei 12 OOOxg zentrifugiert. Die resultierende Flüssigkeit wurde mit festem Ammoniumsulfat bis zu 90% gesättigt, 30 Minuten gerührt und anschließend 20 Minuten bei 12000xg zentrifugiert.

Der Feststoff wurde in einem kleinen Volumen TBS suspendiert und gegen Benzamidin (1,57 g/l) enthaltendes TBS dialysiert. Die dialysierte Fraktion wurde auf eine Hydroxyapatit-Säule (1 χ 20cm) aufgetragen, die mit TBS äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 4 Bettvolumina TBS gewaschen. Die VAC-Proteine wurden mit 200 ml Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Lineargradienten von 0-50OmM aus der Säule eluiert. Die VAC enthaltenden Fraktionen wurde vereinigt und gegen 5OmM NaCI, 2OmM Tris/HCI, pH7,5 dialysiert.

Der gleiche Puffer wurde auch zur Äquilibrierung einer DEAE-Sephacel-Säule (3 χ 5cm) verwendet, auf der das dialysierte VAC-Material chromatographiert wurde. Die Säule wurde mit 4 Bettvolumina des Äquilibrationspuffers gewaschen, bevor das VAC mit 200 ml NaCI-Lösung in 2OmM Tris/Hcl, pH7,5 mit einem Lineargradienten von 50-30OmM von der Säule eluiert wurde.

Die VAC enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, gegen 50OmM NaCI, 2OmM Tris/HCI, pH 7,5 dialysiert und danach in einer Amicon-Konzentrationszelle unter Verwendung einer PM-10 Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Das Konzentrat mit einem Volumen von 2 ml wurde auf eine SephadexG-100 Säule (3 χ 80cm), die mit 50OmM NaCI und 2OmM Tris/HCI, pH 7,5 äquilibriert worden war, aufgetragen.

Das Eluat wurde in Fraktinen zu je 2 ml gesammelt, die aktiven Fraktionen gesondert gegen 10Vol.-% Glycerol enthaltendes TBS dialysiert und bei —70°C aufbewahrt. Die ganze Reinigung wurde bei 0-4°C durchgeführt.

Bestimmung der VAC-Aktivität

Zur Bestimmung der VAC-Aktivität wurden zwei verschiedene Methoden verwendet:

a) derEinstufenkoagulationsversuch (modifizierter Prothrombinzeitversuch)

b) einThrombinbildungsversuch

Der Einstufenkoagulationsversuch wurde folgendermaßen ausgeführt:

In einer Küvette aus silikonisiertem Glas wurden 175μΙ der zu prüfenden Fraktion oder 175 μΙ TBS als Kontrolle mit 50 μΙ PFP und 25μΙ verdünntem BTP gerührt (900 Umdrehungen/Min).

Nach einer Inkubationszeit von 3 Minuten bei 37°C wurde die Koagulation durch das Hinzufügen von 250 μΙ Puffer, der 8OmM NaCI, 2OmM CaCI₂ und 1OmM Tris/HCI, pH7,5 enthielt, ausgelöst. Die Fibrin-Bildung wurde optisch unter Verwendung einer „Payton Dual Aggregation Module" (Hornstra, G., Phil. Trans. R. Soc. London B. 294,355-371 [1981] registriert. Die Gerinnungszeit der Kontrollprobe betrug 65 Sekunden. Dieser Versuch wurde während der Reinigung zur Prüfung der verschiedenen Fraktionen auf das Vorhandensein der VAC-Aktivität angewandt. Zur Bestimmung der VAC-Ausbeute während der Reinigung wurde eine Einheit der VAC-Aktivität definiert als jene Menge VAC, die die Gerinnungszeit in dem obenerwähnten Versuch bis zu 100 Sekunden verlängerte.

In einigen Fällen wurde BTP durch gereinigtes Rinderthrombin oder den gereinigten Rinderfaktor X_a ersetzt. In diesem halbgereinigten Gerinnungssystem wurden die Mengen Thrombin oder Faktor X_a derart gewählt, daß die Gerinnungszeit der Kontrollprobe ebenfalls 65 Sekunden betrug.

DerThrombinbildungsversuch wurde folgendermaßen ausgeführt:

20μΙ gereinigter Rinderfaktor X_a(15OmM), 30μΙ CaCI₂ (10OmM), 30μΙ verdünnter VAC und 30μΙ PS/PC-Phospholipid-Membrane (die Endkonzentrationen sind in der Legende zu den Abbildungen angegeben) wurden in eine Kunststoff küvette, die 181 μΙ TBSA enthielt, gebracht.

Das Gemisch wurde 3 Minuten bei 37⁰C mit einem Teflonrührer gerührt. Die Thrombinbildung wurde durch Hinzufügung von 9μΙ gereinigtem Rinderfaktor Il (33,33μΜ) ausgelöst. Nach verschiedenen Zeiten wurden dem Reaktionsgemisch Proben von 50 μΙ entnommen, die dem Inhalt einer Kunststoff küvette von 1 ml, die mittels eines Thermostaten auf 37 ⁰C temperiert wurde und 900 μΙ TBSE und 50 μΙ des chromogenen Substrats S 2238 (5 mM) enthielt, hinzugeführt wurden. Aus der Extinktionsänderung bei 405 nm, mit einem Kontron Spektrometer Unikon 810 gemessen, wurde die Menge Thrombin in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung einer Eichkurve, die aus den bekannten Mengen gereinigten Rinderthrombins erstellt worden war, berechnet. Der Prozentsatz der von VAC verursachten Inhibition wurde folgendermaßen definiert:

% Inhibition = (1- |) x 1OO %,

worin „a" die Geschwindigkeit derThrombinbildung in Abwesenheit von VAC in nM Il_a/Min. und „b" die Geschwindigkeit der Thrombinbildung in Abwesenheit von VAC in nM Il_a/Min. ist.

Proteine

Die von Vitamin K abhängigen Faktoren Prothrombin und Faktor X_a wurden durch die Reinigung des zitrierten Rinderplasmas erhalten (vgl. Stenflo J.; J. Biol. Chem. 251.355-363 [1976]). Nach der Bariumzitrat-Adsorption und Elution, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und DEAE-Sephades-Chromatographie gab es zwei Proteinfraktionen, die eine Prothrombin/Faktor IX Mischung, beziehungsweise Faktor X enthielten. Faktor X wurde nach der Methode von Fujikawa et al.. Biochemistry, 11, 4882-4981 (1972) erhalten und unter Anwendung von RVV-X (Fujikawa et al., Biochemistry, 11,4892-4899 [1972]) aktiviert.

Prothrombin wurde von Faktor IX durch eine Heparin-Agarose-Affinitätschromatographie (Fujikawa et al.. Biochemistry, 12, 4938-4945) abgetrennt. Die Prothrombin enthaltenden Fraktionen aus der Heparin-Agarose-Säule wurden vereinigt und weiter nach der Methode von Owens et al., J. Biol.Chem. 249, 594-604(1974]) gereinigt. Die Konzentrationen von Prothrombin und Faktor X_a wurden nach der Methode von Rosing et al., J. Biol. Chem. 255,274-283 (1980) bestimmt. BTP wurde nach einer Normalmethode hergestellt, die von Van Dam-Mieres et al. in „Blood coagulation enzymes. Methods of Enzymatic Analysis" Verlag Chemie GmbH, Weinheim beschrieben ist. Die Proteinkonzentrationen wurden nach Lwry et al., J. Biol. Chem. 193, (1951) bestimmt.

Herstellung von Phospholipid, Phosphoiipid-Vesikel und Phospholipid-Liposom

i^-Dioleoyl-sn-Glycero-S-Phosphocholin (18:1_cis/18:1_Cis-PC) und i^-Dioleoyl-sn-Glycero-S-Phosphoserin (18:1_cis/18:1_cis-PS) wurden wie bei Rosing et al., J. Biol. Chem. 255,274-283 (1980) beschrieben hergestellt. Gesonderte, aus zwei Schichten bestehende Phosphoiipid-Vesikel aus PC und PS wurden unter Anwendung von Ultraschall hergestellt, wie es bei Rosing et al., J. Biol. Chem. 225,274-283 (1980) beschrieben ist. Eine Vorratslösung aus Phospholipid-Liposomen wurde durch Lösen der erforderlichen Menge an Phospholipid in Chloroform hergestellt. Das Chloroform wurde mittels Stickstoff verdampft. Das zurückbleibende Phospholipid wurde in 5% Glycerol enthaltendem TBS suspendiert, 3 Minuten vor^chtig mit einigen Glaskügelchen gemischt und danach 10 Minuten bei 10OOOxg zentrifugiert. Die obenstehende Lösung wurde verworfen und der Rückstand vorsichtig erneut in 5% Glycerol enthaltendem TBS suspendiert; auf diese Weise erhielt man die Phospholipid-Liposomen-Vorratslösung. Diese Liposomen wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Phospholipid-Konzentrationen wurden durch die Phosphatanalyse nach Böttcher et al., Anal. Chim. Acta, 24,203-207 (1961) bestimmt.

SDS-PAGE

Die Gel-Elektrophorese auf Platten in Gegenwart von SDS wurde nach der von Laemmli, Nature, 227,680-685 (1970) beschriebenen Methode unter Verwendung eines Gels ausgeführt, das 10Gew.-% Acrylamid, 0,27 Gew.-% N/N³-Methylenbisacrylamid und 0,1 Gew.-% SDS enthielt. 5Gew.-% ß-Mercaptoethanol war in Gelproben mit reduzierten Disulfidbrücken vorhanden. Die Gele wurden folgendermaßen gefärbt:

1. mit 0,25Gew.-% Coomassie Bl';e P-250 in 50Gew.-% Ethanol und 15Gew.-% Essigsäure und entfärbt in 10Gew.-% Ethanol und 10Gew.-% Essigsäure

2. mit Schiffschem Reagenz, hergestellt aus dem basischen Fuchsin nach der Methode von Segrest et al., beschrieben in „Methods in Enzymology", vol.28,54-63 (1972) hergestellt oder

3. mit Silber wie von Merril et al. in Electrophorisis, 3,17-23 (1982) beschrieben.

Elektrofokussierung

Die isoelektrischen pH-Bestimmungen von Proteinen wurden mit den fertigen Dünnschicht-Polyacrylamidgelen, die Amfolin Träger-Ampholyte enthalten (PAG-Platten, LKB) bei einem pH in dem Bereich von 3,5-9,5 nach Anleitung des Herstellers ausgeführt. Der pH-Gradient in dem Gel wurde sofort nach der Elektrofokussierung durch Abschneiden eines Streifens von dem Gel entlang einer Linie zwischen der Anode und der Kathode bestimmt. Die Elektrolyten wurden aus jedem Streifen mit destilliertem Wasser eluiert und der pH-Wert des Wassers mit einer kombinierten Glaselektrode gemessen.

Glutaminsäurebestimmung

Die Gla-Bestimmung wurde mit Hilfe der HPLC an einer „Nucleosil 5SB"-Säule (CHROMPACK) nach der Methode von Kuwada et al.,Anal.Biochem. 131,173-179 (1983) ausgeführt.

Beispiel Il Die Kupplung von Phospholipiden an Spherocil

Die erforderlichen Phospholipide wurden in Chloroform gelöst und dem Säulenmaterial Spherocil in einem Verhältnis von 5 mg Phospholipid pro Gramm Spherocil hinzugefügt. Das Chloroform wurde mit N₂-GaS verdampft und das trockene Spherocilphospholipid anschließend mit dem Puffer gewaschen, worin VAC suspendiert worden war. VAC bindet an Spherocil-Phospholipid in Gegenwart von Ca⁺⁺ und/oder Mn⁺⁺, wenn ein Teil der Phospholipide negativ geladen ist.

Beispiel Ml

Es wurde 50 μΙ zitriertes/Plättchen-freies Plasma gemischt mit 200 μΙ Puffer (25 mM Tris/HCI pH 7,5,10OmM NaCI), in dem Kaolin (artifizielle Oberfläche, die die wesentliche Gerinnung katalysiert, in diesem Falle gemahlenes Glas), Inositin (Phospholipid-Quelle) und VAC vorhanden waren. Dieses Gemisch wurde 3 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach 250μΙ Ca⁺⁺ Puffer (20OmM Tris/HCI pH7,5,8OmM NaCI, 2OmM CaCI₂) hinzugefügt wurden. Die Gerinnungszeit wurde wie in Beispiel 1 gemessen.

Tabelle A

Zusammenfassung der Reinigung von VAC aus Intima der Rinderaorten

Reinigungsstufe	Protein8	VACb	Spezifische	Ausbeute	Reini
	mg	Einheiten	Aktivitäten	%	gungs-
			Einheiten/mg		grad
Obenstehende Flüssigkeit
mit 35% (NH4J2SO4	630	19 500	31,0	100	1,0
Präzipitätmit
90% (NH4J2SO4	470	19 000	40,4	97	1,3
Hydroxy-apati-Fraktion	206	17300	84,0	89	2,7
DEAE-Fraktion	35,8	13 900	388	71	12,5
SephadexG-100	0,45	666	1480	3,4	47,7

a) Die Menge Protein wurde nach der Methode von Lowry et al. bestimmt (Lowry, O. H., Rosebrough, N. V., Farr, A. L., and Randall, R. J., J. Biol. Chem. 193 [1951] 265).

b) Die VAC-Einheiten wurden bestimmt nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Einstufenkoagulationsversuch an einer Reihe Probeverdünnungen. Jene Verdünnung, welche die Gerinnungszeit der Kontrollprobe (65Sek.) zu 100 Sek. verlängert, enthält nach der Definition eine VAC-Einheit.

Tabelle B

Die metallabhängige Bindung von VAC an negativ geladene Phospholipid-Liposomen

Kation (1OmM)	tcSekundenal	EDTAC)
	obenstehende Flüssigkeit
Kontroll (keine Liposome)	180	N.D.d)
Kontroll (kein Kation)	174	64,8
CaC^	64,2	- · 134
MgCI2	165	N. D.
MnCI2	65,1	N. D.

a) die Gerinnungszeiten t_c wurden nach dem in Beispiel I beschriebenen Einstufenkoagulationsversuch bestimmt.

b) 50 μΙ der Vorratslösung von Phospholipid-Liposom (PS/PC; 50/50 mol/mp:1 mM), 50 μΙ VAC (250μg/ml,

S.A. = 700 Einheiten/mg) und 100μΙ TBS, das 5% Glycerol und das aufgegebene Kation enthielt, pH7,5, wurden bei Zimmertemperatur vermischt und 15 Minuten bei 15000xg zentrifugiert, 25 μΙ der obenstehenden, erhaltenen Flüssigkeit wurden mit TBS bis 175μΙ verdünnt und dann nach dem Einstufenkoagulationsversuch geprüft. Die Restmenge der obenstehenden Flüssigkeit wurde mit SDS-PAGE analysiert (Fig. 4).

c) Das erhaltene Liposom-Präzipitat wurde aufs neue suspendiert in 150μΙ 5% Glycerol enthaltendes TBS und 1OmM EDTA, pH7,5. Die Suspension wurde während 15 Minuten bei 15000xg zentrifugiert. Die VAC-Aktivität der obenstehenden Flüssigkeit wurde wie unter b) beschrieben, analysiert.

d) N. D. = nicht bestimmt.

Tabelle C

Der Effekt von VAC auf die amidolytische Aktivität von Faktor X₃ und Faktor ll_a.

Αίοδ/Μϊη. 10³a VAC

X₃₁AT-III X_a, Heparin X_a, Heparin, AT-III Ha

ll_a,AT-lll ll_a, Heparin ll_a. Heparin, AT-III

a) die amidolytische Aktivität wurde wie folgt gemessen: Faktor X₃ oder Faktor ll_a wurde mit den erwähnten Mitteln in TBSA verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem mit Teflon überzogenen Rührer in einer Kunststoffküvette, die mit Hilfe eines Thermostaten auf 37 °C temperiert wurde, gerührt. Nach 10 Minuten wurde eine Probe von 100 μΙ (Χ₃)οαβΓ50μΙ (M₃) aus der Küvette genommen. Die Probe wurde in eine andere, mit Hilfe eines Thermostaten auf 37 "C temperierte Kunststoffküvette gebracht, welche 800μΙ TBSE und 100μΙ32337 (2mM) beziehungsweise 900μΙ S2338 (5mM) enthielt. Die Absorptionsänderung bei 405 nM wurde mit einem Kontron Spectrophotometer Uvikon 810 gemessen, das mit Hilfe eines Thermostaten auf 37^CC temperiert wurde.

Die Endkonzentrationen der verschiedenen Mittel in den Reaktionsgemischen waren wie folgt: 18,7nM Faktor X₃; 1,5nM Faktor M₃; 18,7nM AT-III; 1 Einheit/ml Heparin und 10^g/ml VAC (S.A. 1300 Einheiten/mg).

b) N. D. = nicht bestimmt.

Beispiel IV

Das durch Venenpunktion gesammelte menschliche Blut wurde in einer Trinatriumzitratlösung (Endkonzentration etwa 13 mM Zitrat) gesammelt und 10 Minuten bei2000xg und Raumtemperatur zentrifugiert. Das so erhaltene Plasma wurde erneut 15 Minuten bei lOOOOxg zentrifugiert, um blutplättchenfreies Plasma (PFP) zu erhalten. Als Standard dienendes PFP wurde durch Mischen von Plasma verschiedener gesunder Spender bereitet.

Menschliche Nabelschnüre wurden 15 Minuten nach der Geburt erhalten. Die Arterien wurden sofort mit eiskaltem TBS-Puffer gespült, danach von dem „Jelly von Warton" (Wartonsche Gel) freipräpariert und in TBS unter Verwendung eines Homogenisators des Typs Braun MX32 homogenisiert. Ein 10% Homogenisat (w/v) wurde anschließend fraktioniert.

Die Fraktionierung des Überstandes des bei lOOOOxg zentrifugierten Homogenates mit Sephadex G100 ergab ein reproduzierbares spezifisches Elutionsprofil (siehe Fig.7).

110,5	110,5
80,0	81,5
110,5	109,0
47,5	N.D.b
7,5	7,5
5,4	5,6
7,5	7,1
0,56	N. D.

Die Fraktionen, die das Gerinnungssystem bei der Messung in dem MPTT beeinflussen, sind in Fig.7 dargestellt. Eine Prokoagulansaktivität eluierte mit dem Vorlauf. Diese Aktivität kann im MPTT nur in Gegenwart des Faktors VII nachgewiesen werden durch Versuche, bei denen menschliches Kongenitalfaktor-VII-defizientes Plasma verwendet wurde. Demzufolge muß dieser Prokuagulant als Gewebe-Thromboplastin betrachtet werden.

Bestimmte Fraktionen hatten eine ausgeprägte Antigerinnungsaktivität. Diese Fraktionen wurden vereinigt und durch DEAE-Sephacel-Chromatographie weiter gereinigt (Figur 8 A). Das Antikoagulant hatte sich an dem DEAE-Sephacel bei einer Salzkonzentration von 5OmM NaCI und50mMTris/HCI pH 7,9 gebunden. DieElution der Aktivität mit einem linearen NaCI-Gradient bei pH7,9 wurde mit 150-16OmM NaCI durchgeführt. Die DEAE-Fraktionen, die die Antikoagulansaktivität enthielten, wurde vereinigt und eine Gelfiltration mit Sephadex G-75 unterzogen. Die Säule (1,5 x 50cm) wurde mit TBS äquilibriert. Die Aktivitättrat in den Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 30 000-60 000 Dalton auf. Der MPT wurde als quantitativer Assay zur Bestimmung der Menge an Antikoagulant-Aktivität verwendet (Fig.9). Eine Einheit Antikoagulant-Aktivität wurde definiert als die Menge, die die Gerinnungszeit im MPTT, bei Verwendung von HTP als Auslöser der Gerinnung (Endkonzentration 95μg Protein/ml) von dem Kontrollwert von 65s auf 100s verlängert. Mit Hilfe dieses Assays wurde errechnet, daß aus 10g nassem, arteriellem Gewebe etwa 2 mg Protein mit annähernd 1200 Einheiten Antikoagulant-Aktivität erhalten wurde.

Modifizierter Prothromfein-Zeit-Versuch (MPTT)

Der modifizierte Prothrombin-Zeit-Versuch (MPTT) wurde folgendermaßen durchgeführt. In einer Küvette aus silikonisiertem Glas wurden 50 μΙ PFP bei einerTemperatur von 37 °C mit 150μΙ TBS, 25 μΙ einer Norm HTP-Verdünnung und 25μΙ TBS (Kontrolle) oder mit 25 μΙ einer Fraktion des homogenisierten Arterienmaterials gerührt. Nach einer Inkubation von 3 Minuten wurde die Gerinnung durch Hinzufügung von 250μΙ Ca²⁺-Puffer (8OmM NaCI, 2OmM CaCI₂ und 1OmM Tris/HCI pH7,9) ausgelöst. Die Fibrinbildung wurde mittels einer ,Payton Dual Aggregation Module' (13) registriert. Wurde in dem MPTT zur Auslösung der Gerinnung der Faktor X_a benutzt, wurde HTP weggelassen und 25 μΙ gereinigter Faktor zusammen mit der Menge von 250 μΙ Ca²⁺⁺-Puffer zum verdünnten PFP gegeben.

Modifizierter Thrombin-Zeit-Versuch (MTT)

Der modifizierte Thrombin-Zeit-Versuch (MTT) wurde auf die gleiche Weise ausgeführt wie oben beschrieben, mit dem Unterschied, daß das X_a-Präparat durch 25μΙ gereinigtes Thrombin ersetzt wurde.

Proteine

Protease Typ I und Trypsin (EC 3.4.2.1.4.) stammten von Sigma. HTP wurde nach der von Van Dam-Mierasetal. (14) beschriebenen Methode aus Menschengehirnen hergestellt. Faktor X₃, Prothrombin und Thrombin wurden aus zitriertem Rinderblut wie bei Rosing et al. (2) beschrieben, gereinigt. Faktor V wurde nach der bei Lindhoutetal. (13) beschriebenen Methode aus Rinderblut erhalten. Faktor V₃ erhielt man durch Inkubation des Faktors V mit Thrombin (15). Die Prothrombin-Konzentration wurde berechnet aus M_r = 72000 und Alto = 9,6 (17). Faktor X₃- und Thrombin-Konzentrationen wurden durch Titration der aktiven Stellen (2) bestimmt. Die übrigen Proteinkonzentrationen wurden bestimmt, wie bei Lowryetal. (18) beschrieben.

Herstellung von Phospholipiden und Phospholipid-Vesikel

Ole₂Gro-P-Cho und Ole₂-P-Ser wurden nach der Methode von Rosingetal. (2) hergestellt. Durch Ultraschall wurden einzelne Doppelschicht-Vesikel aus 0Ie₂Gro-P-Ser/Ole₂Gro-P-Cho (Molverhältnis 20:80) hergestellt (2).

Die Phospholipidkonzentrationen wurden durch Phosphat-Analyse nach Böttcher et al. (19) bestimmt.

Messung der Prothrombin-Aktivierung

Der Zeitverlauf der Prothrombin-Aktivierung wurde mit verschiedenen Konzentrationen des Antigerinnungsmittels untersucht.

Die Gemische von (X₃, Ca²⁺), (X₃, Phospholipid, Ca²⁺) oder (X₃, V₃, Phospholipid, Ca²⁺) wurden mit verschiedenen Mengen des Antigerinnungsmittels bei 37°C in 5OmM Tris/HCI, 175mM NaCI, 0,5mg/ml Human-Serum-Albumin bei einem pH-Wert von 7,9 gerührt. Nach 3 Minuten wurde die Reaktion durch Hinzufügen von Prothrombin ausgelöst. Proben von 25 μΙ wurden in verschiedenen zeitlichen Abständen in eine Küvette eingebracht (auf 37°Cthermostatisiert), die TBS, 2 mM EDTA und 0,23 mM S2238 enthielt (das Gesamtvolumen betrug schließlich 1 ml). Aus der Absorptionsänderung bei 405 nm, gemessen mit einem Kontron Spektrophotometer Uvikon 810, und einer Meßkurve, die anhand bekannter Mengen gereinigtem Thrombins erstellt worden war, wurde die Menge des gebildeten Thrombins bei verschiedenen Antigerinnungsmittelkonzentrationen berechnet.

Das Phospholipid wurde als Vesikel aus Ole₂Gro-P-Ser und 0Ie₂GrO-P-ChO mit einem Molverhältnis von 20:80 hinzugefügt.

Charakterisierung

Verschiedene Fraktionen der Chromatographie über G-75 wurden im MPTT geprüft und mit SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse (siehe Fig. 10) deuten an, daß das Antigerinnungsmittel ein Molekulargewicht von etwa 32000 besitzt. Die Beziehung zwischen der Antikoagulanzaktivität und der 32 K-Bande wurden bestätigt, indem das Polyacrylamidgel geschnitten wurde und die Proteine anschließend aus dem Streifen mit TBS, das 0,5 mg/ml Rinderserum-Albumin enthielt, eluiert wurden. Eine Antikoagulant-Aktivität ist nur in dem Streifen vorhanden, der der 32 K-Bande zuzuordnen ist. Außerdem ergab sich, daß diese Aktivität bei 56⁰C thermolabil ist und eine ähnliche Dosis-Wirkung mit MPTT aufweist, wie das Ausgangsmaterial. Die G 75 Fraktionen, die die höchsten Antigerinnungsaktivitäten zeigten, wurden vereinigt und für die weitere Kennzeichnung des Antigerinnungsmittels verwendet. Die Inkubation des Antigerinnungsmittels bei 56°C ergibt eine rasche Erniedrigung der Aktivität, bis nach 2 Minuten keine Aktivität mehr gemessen werden kann (siehe Fig. 16). Das Antigerinnungsmittel verliert seine Aktivität vollständig innerhalb von 2 Stunden bei der Inkubation bei 37°C mit Protease Typ I, während Trypsin das Antigerinnungsmittel innerhalb einer Inkubationsperiode von 3 Stunden kaum inaktiviert (siehe Fig. 11). Die bei diesen Versuchen benutzte Konzentration an Protease Typ I und Trypsin inaktiviert 2,5 nM Thrombin innerhalb von 15 Minuten. Die Mengen an Protease Typ I und Trypsin, die von den Reaktionsgemischen in dem MPTT übertragen wurde, zeigten keinen Einfluß auf die Kontrollgerinnungszeit.

Der MPPT wird sowohl in Gegenwart des Antigerinnungsmittels (siehe Fig. 12) als auch bei der Aktivierung mit HTP und bei Auslösung mit dem Faktor X₃ verlängert. Eine von Thrombin induzierte Gerinnung wird jedoch nicht gehemmt.

Auf Grund dieser Erfahrungen wurde der Effekt des Antigerinnungsmittels auf die Umsetzung von Prothrombin in Thrombin durch Faktor X₃, Faktor V₃, Phospholipid und Ca²⁺ untersucht. Unter den genannten experimentellen Bedingungen wird die Thrombinbildung auf eine dosisabhängige Weise durch das Antigerinnungsmittel (siehe Fig. 13 A) gehemmt. Die Aktivierung des Prothrombins durch Faktor X_a, Phospholipid und Ca²⁺ in Abwesenheit des Faktors V_a kann gleichfalls durch das Antigerinnungsmittel gehemmt werden (siehe Fig. 13 B). Diese Inhibition wird jedoch nicht beobachtet, wenn die Aktivierung in Abwesenheit von Phospholipid erfolgt (siehe Fig. 13C).

Beispiel V Polygonale Antikörper gegen VAC

Polygonale Antikörper gegen Rinder VAC wurden in Kaninchen stimuliert. Rinder VAC, nach der oben beschriebenen Methode gereinigt, wurde mit gleichen Anteilen an komplettem Freudschem Adjuvanz gemischt. Die Mischung wurde dem Kaninchen subcutan injiziert. Nach 4 Wochen erfolgte eine Auffrischung, indem dem Kaninchen erneut gereinigtes Rinder VAC s.c. injiziert wurde. Diese Booster-Injektion wurde zweimal im Abstand von 2 Wochen wiederholt. 10 Tage nach der letzten Booster-Injektion wurde dem Kaninchen Blut entnommen und das Blut zur Gerinnung gebracht, um Serum zu erhalten. Immunoglobuline (Ig) wurden aus dem Serum nach dem folgenden Schema isoliert.

a) das Serum wurde 30 Minuten auf 56°C erhitzt.

b) Anschließend wurde das Serum auf DEAE-Sephacel aufgetragen, das mit 50 mM Tris, 100 m NaCI, pH8,2 äquilibriert worden war.

c) Das nichtgebundene Protein wird mit (NH₄I₂SO₄ bei 50%iger Sättigung mit (NH₄J₂SO₄ präzipitiert.

d) Die präzipitierten Proteine wurden durch Zentrifugieren pelletiert, das Pellet wurde resuspendiert in 5OmM Tris, 10OmMNaCl pH7,9 und ausgiebig gegen den gleicher Puffer dialysiert.

e) Die erhaltene Proteinmischung enthält das Ig.

Aus Rinder-Aorta, Rinder-Lunge, Ratten- und Pferde-Aorta und menschlichen Nabelschnürarterien wurden Proteinfraktionen nach den beschriebenen Verfahren isoliert, die VAC-Aktivität zeigen. Die Proteine wurden auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Dodecylsulfat und unter nichtreduzierenden Bedingungen durch Elektrophorese wurden die Proteine von dem Gel auf Nitrozellulose-Streifen, wie bei Towbin et al. (21) beschrieben, übertragen. Die Streifen wurden mit dem Anti-VAC-Ig inkubiert und nach intensivem Waschen mit Ziegen-, Anti-Kaninchen-Ig, an dem Meerrettichperoxidase gekuppelt ist, inkubiert. Diese wird mit Diamin-benzidin-Tetrahydrochlorid, ein Substrat für die Proxidase, sichtbar gemacht. Nach Beendigung des beschriebenen Verfahrens zeigte ein braunes Band auf dem Nitrozellulosestreifen die Gegenwart eines Ziegen-Kaninchen- Ig's an. Außerdem waren Anti-VAC-Ig und Proteine, an die die Anti-VAC-Ig binden, auf diesem Fleck vorhanden. Immunoblots der Proteine mit VAC-Aktivität, isoliert aus Rinder-Aorta, Rinder-Lunge, Ratten- und Pferde-Aorta und menschlichen Nabelschnurarterien sind in Fig. 14 dargestellt.

Diese Ergebnisse zeigen folgendes: Bei Anwendung des beschriebenen Isolierungsschemas kann eine Protein-Fraktion mit VAC-Aktivität aus Rinder-Aorten, Rinder-Lungen, Ratten- und Pferde-Aorten und menschlichen Nabelschurarterien erhalten werden. Weiterhin: die isolierten Proteinfraktionen mit VAC-Aktivität enthalten Proteine mit Molekulargewichten von ±32000, ±34000 und ±70000, die mit Anti-VAC-Ig, das gegen gereinigtes Rinder-VACin Kaninchen stimuliert worden war, reagieren.

Beispiel Vi Reinigungsschritt für VAC unter Verwendung großvolumiger Phospholipid-Vesikel

GroßvolumigePhospholipid-Vesikel (LVV), zusammengesetzt aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserin (PS) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (PC) wurden wie bei P. van de Waart et al. (20) beschrieben, hergestellt. Für den Reinigungsschritt wurden LVV, enthaltend PS:PC (Molverhältnis 20:80) verwendet. Doch sind auch andere Molverhältnisse zu verwenden, mit der Einschränkung, daß negativ geladene Phospholipide vorhanden sein müssen. Ebenso kann die Kettenlänge der Fettsäuren in den Phosolipiden variiert werden

Verfahren:

LVV, ±1 mM Phospholipid in 5OmM Tris/HCI, 10OmM NaCI, pH 7,9, wurden mit einem gleichen Volumen einer Proteinfraktion, die VAC-Aktivität enthält, vermischt. Die Proteine sind in 50 mM Tris/HCI, 100 mM NaCI, 1OmM CaCI₂, pH7,9 gelöst. Die Mischung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wird die Mischung 30 Minuten bei 20000 xg zentrifugiert. Das Pellet wird resuspendiert in 5OmM Tris/HCI, 10OmM NaCI, 1OmM CaCI₂, pH7,9 und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird anschließend in 5OmM Tris/HCI, 1OmM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH7,9 resuspendiert und wieder zentrifugiert. Der erhaltene Überstand enthält die VAC-Aktivität. Die oben beschriebene Methode ist ein effizienter Reinigungsschritt bei dem Verfahren, gereinigtes VAC zu erhalten.

Figurbeschreibung

Figur 1 Gelfiltration von VAC auf Sephadex G-100.

Die Säule (3 x 80cm) wurde mit einer Druckhöhe von 60cm hergestellt und mit 50OmM NaCI und 2OmM Tris/HCI, pH7,5 äquilibriert. Die VAC enthaltende Fraktion, erhalten nach der DEAE-Chromatographie, wurde bis 2 ml konzentriert und danach auf das Sephadex G-100 geführt. Die Druckhöhe von 60 cm wurde aufrechterhalten. Das leere Volumen war 245 ml (Fraktion 70).

Hiernach wurden die Fraktionen von 2 m gesammelt. Die Fraktionen wurden dialysiert gegen 10% Glycerol enthaltendes TBS, wonach sie nach dem Einstufenkoagulationsversuch auf die VAC-Aktivität geprüft wurden, wie beschrieben in Beispiel I. Die Gerinnungszeiten wurden bei Verdünnungen von 1:10 der G-100 Fraktionen mit TBS erhalten. Die Gerinnungszeit in Abwesenheit von VAC war 65 Sekunden.

Figur 2 Analytische SDS-PAGE von VAC.

SDS-PAGE mit Gelen, welche 10 Gew.-% Acrylamid, 0,27 Gew.-% N,N³-Methylenbisacrylamid und 0,1% SDS enthalten, wurde nach Laemli ausgeführt (Laemli, U. K., [1970] Nature 227, 680-685). Die Bedeutung der Zahlen auf der x-Achse ist wie folgt:

1. Materialien mit Normmolekulargewicht, bei denen die Disulfidbindungen reduziert sind,

2. 25 μg reduzierter VAC,

3. 25 pg nicht-reduzierter VAC.

Das Gel wurde gefärbt mit Coomassie Blue und auf die in Beispiel I beschriebene Weise entfärbt.

Figur 3 Die Bestimmung des isoelektrischen pH von VAC

Die Elektrofokussierung wurde mit PAG-Platten in dem pH-Bereich von 3,5-9,5 (vergleiche Beispiel I) ausgeführt. 200μg menschliches Hb¹ und 20 μg VAC wurden auf das Gel gebracht, nachdem der pH-Gradient in dem Gel gebildet war. Menschliches H_b diente als Referenz mit dem bekannten isoelektrischen Punkt bei pH 6,8. Bevor das Gel der Färbung mit Coomassie Blue ausgesetzt wurde, wurde das Gel während 30 Minuten mit 0,7 M Trichloressigsäure fixiert.

Figur 4 Die Analyse der Bindung von VAC an negativ geladenen Phospholipid-Liposomen mit SDS-PAGE SDS-PAGE wurde an Laemli ausgeführt (Laemli, U. K., [1970] Nature 227,680-685) auf den gleichen Plättchen wie bei der Figur 2 beschrieben. Die analysierten.Proben wurden aus den Bindungsexperimenten erhalten, wie in der Erläuterung bei Tabelle B erwähnt. Die Bedeutung der Zahlen auf der x-Achse ist wie folgt:

1. Materialien mit Norm-Molekulargewicht, bei denen die Disulfidbindungen reduziert sind,

2. obenstehende Flüssigkeit, erhalten nach dem Zentrifugieren eines VAC-Präparates in Abwesenheit von Liposomen,

3. obenstehende Flüssigkeit, erhalten nach dem Zentrifugieren von VAC in Gegenwart von Liposomen,

4. obenstehende Flüssigkeit, erhalten nach dem Zentrifugieren von VAC in Gegenwart von Liposomen undCa⁺⁺ und

5. obenstehende Flüssigkeit, erhalten nach dem Zentrifugieren des Liposom-Präzipitats von 4., das aufs neue suspendiert wurde in 1OmM EDTA enthaltendem TBS.

Figur 5 Der Effekt der Konzentration von VAC auf die Inhibition (%) der Thrombin-Bildung Die erwähnten Konzentrationen von VAC sind die endgültig in den Versuchssystemen vorhandenen Konzentrationen. Die Thrombin-Bildung wurde gemessen bei 1μΜ Prothrombine, 1OnM FaktorX_aund0,5M (A — A)oder5M (· — ·) Phospholopid-Membran (PC/PS; 4:1, Mol/Mol) in 1OmM CaCI₂enthaltendem TBSA. Das Reaktionsgemisch wurde mit den erwähnten Mengen VAC(S-A. 1300 .'•inl.ieiten/mg) während 3 Minuten bei 37 ⁰C ohne Prothrombin gerührt. Durch die Hinzufügung von Prothrombin zu dem Gemisch wurde wie in Beispiel I die Thromuinbildung ausgelöst, bei der die Geschwindigkeit gemessen wurde. Die Geschwindigkeit der Thrombin-Bildung in Abwesenheit von VAC betrug 3,3 nM Il_a/Min. (A — A) beziehungsweise 10,9 nM Il_a/Min. (· — ·).

Figur 6 Der Effekt der Phospholipidkonzentration auf die Inhibition (%) der Thrombin-Bildung durch VAC DieThrombin-Bildungwurdegemessen bei 1 μΜ Prothrombine, 1OnM FaktorX₃, 10,7pg/ml VAC(S.A. 1 300 Einheiten/mg) und verschiedenen Konzentrationen Phospholipid-Membran (PC/PS; 4:1, Mol/Mol) in TBSA. Faktor X₃, VAC und Phospholipid wurden 3 Minuten bei 37⁰C in TBSA gerührt. DieThrombin-Bildung wurde ausgelöst durch die Hinzufügung von Prothrombin zu dem Reaktionsgemisch. Die Geschwindigkeit der Thrombin-Bildung wurde gemessen, wie in Beispiel I beschrieben. Der Prozentsatz der Inhibition der Thrombin-Bildung (· — ·) wurde für jede Phospholipidkonzentration mit der entsprechenden Geschwindigkeit der Thrombin-Bildung bei Abwesenheit von VAC(A — A) gemessen.

Figur 7 Die Gelfiltration eines lOOOOxg Überstandes von einem Nabelschnurarterien-Homogenat auf SephadexG100 2 ml eines lOOOOxg Überstandes wurden auf eine SephadexG-100 Säule (1,5 χ 80cm), die mit TBS pre-äquilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde mit TBS eluiert. Aliquote der erhaiicnen Fraktionen wurden im MPTT getestet. Bestimmte Fraktionen (□) zeigen eine Prokoagulant-Aktivität und lösten die Gerinnung im MPTT aus, ohne Zugabe von HTP, Faktor X_a oder Thrombin. Andere Fraktionen (□) verlängern die Gerinnungszeit im MPTT bei Verwendung von HTP als Auslöser der Gerinnung.

Diese Fraktionen wurden gesammelt und weiterfraktioniert.

Figur 8 Chromatographie des Antikoagulanten auf DEAE-Sephacel (A) und Sephadex G-75 (B) Der Pool von der Sephadex G-100 Säule, den Antikoagulant enthaltend, wurde auf DEAE-Sephacel gebracht. Elution wurde mit 200 ml eines linearen Gradienten von 50mM-30ömM NaCI (—(vorgenommen. Fraktionen (4ml) wurden gesammelt auf A₂so

( ) und Antikoagulant-Aktivität im MPTT unter Verwendung von HTP (Endkonzentration 95 pg Protein/ml) als Starter für die

Gerinnung (·) überprüft. Die Fraktionen mit Antikoagulant-Aktivität wurden gesammelt, konzentriert und anschließend auf

Sephadex G-75 (B) gebracht. 2ml Fraktionen wurden gesammelt und auf A₂so( ) und Antikoagulant-Aktivität (·) überprüft. V₀

kennzeichnet das Leervolumen der Säule

Figur 9 Dosis-Abhängigkeit des Antikoagulanten im MPTT

Variierende Mengen an Antikoagulant wurden dem MPTTzugesetzt. Koagulation wurde durch HTP ausgelöst (Endkonzentration 95μg Protein/ml). Die Kontroll-Gerinnungszeit war 65 Sekunden

Figur 10 Gel-Elektrophorese verschiedener Fraktionen des G-75-Eluates

Eine bestimmte Menge an verschiedenen Fraktionen des G-75-Eluates wurde, wie beschrieben, einer Gel-Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden wie bei Merril et al. (12) beschrieben, mit Silber angefärbt (12). Spalte 1: reduzierte niedrigmolekulare Standards; Spalten 2-6: unreduzierte Aliquote von G-75-Fraktionen mit den Nummern 35,39,41,43 und 50. Figur 11 Effekt proteolytischer Enzyme auf die Aktivität des Antikoagulanten

Das Antikoagulant wurde bei 37°C mit Protease Typ I (·, Endkonzentration 0,11 Einheiten/ml). Trypsin (A, Endkonzentration 88 BAEE Einheiten/ml) und ohne proteolytische Enzyme (·) inkubiert. Zu angegebenen Zeiten wurden 5μΙ, 6μg Antikoagulant-Protein enthaltend, aus der Reaktionsmischung entnommen und dem MPTTzugegeben. Die Gerinnung wurde mit HTP ausgelöst (Endkonzentration 18 Protein μg/ml). Kontrollgerinnungszeit betrug 110s Die angegebenen Einheiten für die proteolytischen Enzyme sind aus Angaben der Hersteller abgeleitet

Figur 12 Effekt des Vascular Antikoagulant auf die Gerinnungszeit, die im M(P)TT entweder durch HTP, Faktor X_a oder Thrombin induziert wurde

Die Konzentration der Gerinnungsstarter (HTP 18μg Protein/ml 1,5 nM Faktor X₃ oder 0,4nM Thrombin) wurden so gewählt, daß die Kontrollgerinnungszeit etwa 110s betrug (offene Balken). Bei Verwendung von Faktor X_a wurden Phospholipid Vesikel (Endkonzentration 10μΜ) zusammengesetzt aus'Ole₂Gro-P-Ser/Ole₂Gro-P-Cho (Molverhältnis 20:80) der Reaktionsmischung zugesetzt. Gerinnungszeiten, die durch die angegebenen Agentien in Gegenwart von 3,5 μg Antikoagulant-Protein ermittelt wurden, sind als schattierte Balken dargestellt

Figur 13 Effekt des Antikoagulanten auf die Prothrombinaktivierung durch (X_a, V₃, Phospholipid, Ca²⁺), (X_a, Phospholipid, Ca²⁺) und (X₃, Ca²⁺)

Die Reaktionsmischungen enthielten: (A) 1 μΜ Prothrombin, 0,3nM X₃,0,6nM V₃,0,5μΜ Phospholipid und 1OmM CaCI₂ mit 12^g/ml Antikoagulant (EJ), 4,8 μg/ml Antikoagulant (A) und kein Antikoagulant ·). (B) 1 μΜ Prothrombin, 1OnM X₃, 0,5μΜ Phospholipid und 1OmM CaCI₂ with 2^g/ml Antikoagulant (3), 0,48μg/ml Antikoagulant (A) und kein Antikoagulant (·). (C) 1 μΜ Prothrombin, 75nM X₃ und 1OmM CaCI₂ mit 120μg/ml Antikoagulant (A) und kein Antikoagulant (·). Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben entnommen und das Thrombin wie beschrieben bestimmt.

Figur 14 Immunoblots

Die Blots wurden wie oben beschrieben erhalten.

Spalte 1: Protein Fraktion mit VAC-Aktivität, isoliert aus Rinder-Aorta.

Spalte 2: Protein Fraktion mit VAC-Aktivität, isoliert aus Rinder-Aorta.

Spalte 3: Protein-Fraktion mit VAC-Aktivität, isoliert aus Rinder-Lunge.

Spalte 4: Protein Fraktion mit VAC-Aktivität, isoliert aus menschlichen Nabelschnurarterien.

Spalte 5: Protein Fraktion mit VAC-Aktivität, isoliert aus Ratten-Aorta.

Spalte 6: Protein Fraktion mit VAC-Aktivität, isoliert aus Pferde-Aorta.

Figur 15 Die Gelelektrophorese (A) und die Antigerinnungsaktivität (B) der verschiedenen Fraktionen des Eluats aus G-75 Bestimmte Mengen der verschiedenen Fraktionen des Eluats aus G-75 wurden der Gel-Elektrophorese ausgesetzt, wie in dem Vorstehenden beschrieben worden ist. Die Banden wurden durch Silber nach der Methode von Merril C. R. Goldman D., & Van Keuren M. L. (1982) Electrophoresis 3,17-23 angefärbt. Elektrophorese-Bahn 1: Normmaterial mit einem niedrigen Molekulargewicht; Elektrophorese-Bahnen 2-6: nicht-reduzierte gleiche Mengen der G-75 Fraktionen, bei wachsenden Elutionsvolumina. Bestimmte Mengen der G-75 Fraktionen, die mit der Gel-Elektrophorese analysiert worden waren, wurden in dem MPTT geprüft (siehe vorstehende Beschreibung) unter Anwendung von HTP zur Auslösung der Gerinnung. Die Kontrollgerinnungszeit ist durch den offenen Balken dargestellt. Die Zahlen unter den schraffierten Balken entsprechen den Zahlen der Elektrophoresebahnen in Fig. 15 A.

Figur 16 Die Hitze-Inaktivierung des vaskulären Antigerinnungsmittels Das Antigerinnungsmittel wurde bei 56°C inkubiert, und nach den verschiedenen Inkubationszeiten wurde je eine Probe von 5 μΙ, welche 3,6μο Protein enthielt, entnommen, sofort mit Eis abgekühlt und danach in dem MPTT unter Verwendung von HPT als Koagulationsauslöser geprüft. Die Gerinnungszeit der Kontrollprobe war 110 Sekunden.

Claims (4)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung blutgerinnungshemmender Proteine, gekennzeichnet dadurch, daß Blutgefäßwände, stark vaskularisierte Gewebe oder Endothelzellkulturen

   a) homogenisiert und differential zentrifugiert werden und die obenstehende Flüssigkeit in beliebiger Reihenfolge einer oder mehrerer der folgenden Reinigungsbehandlungen ausgesetzt wird:

   b) Präzipitieren mit Salz

   c) Affinitätschromatographie

   d) lonenaustauschchromatographie

   e) Chromatographie über ein Molekularsieb, wobei die nach den Stufen b), c), d) und e) erhaltenen Produkte gewünschtenfalls dialysiert werden können.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine weitere Reinigung mit Hilfe einer Immunoadsorptionschromatographie durchgeführt wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Proteine mit Hilfe von Phoepholipid-Vesikein gereinigt werden. -
4. 4. Verfahren nah einem der Punkte 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß für den Niederschlag der Sufeb) Ammoniumsulfat, für die Chromatographie der Stufe c) Hydroxyapatit, für die Chromatographie der Stufe d) DEAE Sephacel und für die Chromatographie der Stufe e) SephadexG-100 bzw. G-75 verwendet wird.

   Hierzu 14 Seiten Zeichnungen