DE69009668T2 - Verfahren zur herstellung von aktiviertem protein c. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von aktiviertem protein c.Info
- Publication number
- DE69009668T2 DE69009668T2 DE69009668T DE69009668T DE69009668T2 DE 69009668 T2 DE69009668 T2 DE 69009668T2 DE 69009668 T DE69009668 T DE 69009668T DE 69009668 T DE69009668 T DE 69009668T DE 69009668 T2 DE69009668 T2 DE 69009668T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- activated protein
- aprotinin
- apc
- process according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims abstract description 51
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 11
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 claims abstract 15
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 13
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 8
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 8
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 101710111620 Protein C activator Proteins 0.000 claims 1
- 108010007387 therin Proteins 0.000 claims 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 36
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 5
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 5
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 3
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- YYLQUHNPNCGKJQ-NHYDCYSISA-N (3R)-3-hydroxy-L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](O)C(O)=O YYLQUHNPNCGKJQ-NHYDCYSISA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271510 Agkistrodon contortrix Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000271032 Daboia russelii Species 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000010261 blood fractionation Methods 0.000 description 1
- 150000001669 calcium Chemical class 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 201000005380 purpura fulminans Diseases 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein C (APC).
- Das Protein C ist ein Plasma-Glycoprotein, dessen aktive Form eine Serinprotease ist (1,2).
- Das Human-Protein C ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 62 000, das aus zwei Ketten besteht, einer schweren Kette mit einem Molekulargewicht von 41 000, die das aktive Zentrum trägt, und einer leichten Kette mit einem Molekulargewicht von 21 000, die durch eine Disulfid- Brücke miteinander verbunden sind (2). Seine Plasma-Konzentration beträgt 3 bis 5 mg/l.
- Wie die anderen Proteine, insbesondere die Plasma- Proteine, ist dieses Protein ein Vitamin K-abhängiger Faktor. Es wird von der Leber synthetisiert in Form eines Vorläufers. Die elf ersten Glutaminsäuren der leichten Kette sind in Gamma-Position carboxyliert durch eine Leber-Carboxylase, die ein Vitamin A als Cofaktor enthält (3). Diese Gamma-Carboxyglutaminsäure-Reste sind beteiligt an der Wechselwirkung mit dem Calciumion (4). Da die Phospholipide negativ geladen sind, bildet das Calcium eine Ionenbrücke zwischen diesen und dem geeigneten Abschnitt der Vitamin K-abhängigen Faktoren. Die leichte Kette weist darüber hinaus einen β-Hydroxyasparaginsäurerest auf, der ebenfalls an der Wechselwirkung mit dem Ca&spplus;&spplus; beteiligt ist.
- Das Proenzym wird in das aktivierte Protein C (APC) überführt durch Abtrennung (Abschneiden) eines Dodecapeptids in dem N-terminalen Abschnitt der schweren Kette (2). Diese Reaktion, die in dem Mikrokreislauf abläuft, wird in Gegenwart von Calcium katalysiert durch einen stöchiometrischen 1:1-Komplex, der zwischen dem Thrombin und einem an der Oberfläche der Endothelzellen angeordneten Protein, dein Thrombomodulin, gebildet wird (5).
- Die aktive Form hat eine antikoagulierende Wirkung, wobei sie die Cofaktoren der Koagulationskaskade V und VIII durch eine begrenzte Proteolyse inaktiviert (6). Das aktive Enzym verstärkt auch die Fibrinolyse durch Inaktivierung des Inhibitors des Gewebeaktivators des Plasminogens.
- Das APC entwickelt seine volle Aktivität nur in Gegenwart eines Cofaktors, des Proteins S, von Phospholipiden und von Calcium aus. Das Protein S ist ebenfalls ein Vitamin K-abhängiges Plasma-Glycoprotein. Es ist monokatenar (einkettig) mit einem Molekulargewicht von 75 000, seine Plasma-Konzentration beträgt 25 mg/l. Es zirkuliert zu 50 % in freier Form und zu 50 % in Form eines nicht-kovalenten Komplexes mit einem Protein des Komplement-Sy stems des "C4-Bindungs-Protein" (C4BP) (7). Wenn das Protein S mit C4BP verbunden ist, kann es nicht als Cofaktor dienen (7).
- Im Gegensatz zu anderen Vitamin K-abhängigen Enzymen wirkt das Protein C antikoagulierend.
- Es sind angeborene und erworbene Defizite an Protein C bekannt. In diesem Falle beobachtet man wie bei den Defiziten an AT III eine Neigung zu wiederholten Thrombosevorfällen.
- Die therapeutische Verwendung des Enzyms und des Proenzyms ist vorteilhaft. Das Protein C kann auch für die Behandlung von Defiziten an Protein C und insbesondere bei homozygoten Neugeborenen, bei denen sich eine Purpura Fulminans entwickelt, verwendet werden.
- Diese Erkrankung, die häufig tödlich verläuft, ist charakterisiert durch beträchtliche Thrombose-Schädigungen, die eine Therapie mittels Plasma-Konzentraten, die an Protein C angereichert sind, erfordern. Die heterozygote Form kann leichte bis schwere Thrombosen mit sich bringen oder asymptomatisch (untypisch) vollständig ohne Symptome verlaufen.
- Das Protein C sowie das aktivierte Protein C können für die Prophylaxe und für die Behandlung von Venen- und Arterienthrombosen, von Lungen, Cerebral- und Herzembolien, CIVD und Septischen Schockzuständen verwendet werden.
- Das aktivierte Protein C kann auch als Ersatz für die klassischen Antikoagulantien, insbesondere das Heparin, verwendet werden, ohne daß deren Nebenwirkungen bei Arterien- oder Venenthrombosen, chirurgischen Eingriffen, Veflenentzündungen und im Falle von Myocard-Reinfarkten auftreten.
- Es existiert eine große Strukturhomologie zwischen bestimmten Vitamin K-abhängigen Faktoren und insbesondere zwischen den Faktoren VII, IX, X und Protein C. Sie haben darüber hinaus ein sehr ähnliches Molekulargewicht (56 000, 57 000, 59 000 bzw. 62 000).
- Die Ähnlichkeit dieser molekularen Charakteristiken bringt daher Schwierigkeiten bei der Isolierung dieser verschiedenen Faktoren mit sich.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, diesen Nachteil zu überwinden und ein Verfahren vorzuschlagen, das die schnelle Herstellung des aktivierten Proteins C aus einer Blutfraktion, die an Protein C mehr oder minder angereichert ist, erlaubt.
- Die Erfinder haben nämlich gezeigt, daß das Aprotinin, bei dem es sich um ein Polypeptid tierischen Ursprungs mit 58 Aminosäuren handelt, das APC inhibiert. Da die Wechselwirkung reversibel ist, war es möglich, das APC auf insolubilisiertem Aprotinin zu reinigen.
- Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein C aus einem Ausgangsmaterial, welches das genannte aktivierte Protein C enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das aktivierte Protein C an insolubilisiertem Aprotinin adsorbiert, daß man nach dem Waschen des genannten APC-Aprotinin-Komplexes mit einer gepufferten Salzlösung das genannte aktivierte Protein C durch Elution mit einer sauren wäßrigen Lösung oder mit einer Lösung eines chaotropen Agens gewinnt (abtrennt).
- Das Ausgangsmaterial, welches das Protein C enthält, kann verschiedenen Ursprungs sein. Es kann sich dabei handeln um verschiedene Fraktionen, die bei Blutfraktionieungsverfahren erhalten werden, beispielsweise kann es sich handeln um die sogenannte PPSB-Fraktion oder auch um Fraktionen, wie das PPSB-Voreluat, um Fraktionen, die beim Fraktionieren mit Ethanol erhalten werden, oder auch um Fraktionen, die durch vorherige Reinigung erhalten werden, entweder durch Immunreinigung, wie dies beispielsweise in dem Europäischen Patent 138 222 beschrieben ist, oder auch in Fraktionen, die an Protein C angereichert sind, z.B solchen, wie sie beispielsweise im "British Journal of Haematology", 1988, 70, 436-440, beschrieben sind.
- Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Ausgangsmaterial um ein Konzentrat des Prothrombin-Komplexes. Das in diesem Konzentrat vorhandene Protein C wird durch das Thrombin aktiviert, das in dem Ausgangsmaterial erzeugt wird durch Zugabe von Calcium, wobei dieses Calcium anschließend in der Weise eliminiert wird, daß eine Aktivierung des Proteins C durch das in situ erzeugte Thrombin möglich ist. In diesem Falle wird das Calcium dem Ausgangsmaterial in einer Konzentration zwischen 10 und 100 mM zugesetzt, dann wird es durch Dialyse oder Diafiltration eliminiert.
- Die Fixierung (Bindung) des APC erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 7 und 9 und im allgemeinen bei einem optimalen pH-Wert von 8 bis 8,4 bei einer geeigneten Ionenkonzentration, die jedoch 0,4 M NaCl nicht übersteigt und vorzugsweise unterhalb 0,25 M NaCl liegt.
- Der so gebildete Komplex zwischen dem Aprotinin und dem APC ist ausreichend stabil, um einer Vorelution mit Salzlösungen unterworfen zu werden, ohne daß das APC eluiert (abgetrennt) wird.
- Um das APC zu eluieren, ist es zweckmäßig, Eluierungsbedingungen anzuwenden, bei denen der Komplex dissoziiert, insbesondere extreme pH-Werte, speziell pH-Werte zwischen 1 und 3. Das aktivierte Protein C kann auch durch Elution mit einer Lösung gewonnen (abgetrennt) werden, die ein chaotropes Mittel, wie z.B KSCN oder NaSCN, enthält. Das chaotrope Mittel wird anschließend durch Dialyse eliminiert.
- Die Komplexbildungsreaktion ist sehr spezifisch und das eluierte Produkt ist frei von dem Faktor II, von dem Faktor VII, dem Faktor IX und dem Faktor X, wenn man von der PPSB-Fraktion ausgeht, und es wird eine sehr zufriedenstellende Ausbeute erzielt.
- Wie bereits weiter oben angegeben, muß die behandelte Fraktion das Protein C in aktivierter Form enthalten, wobei diese Aktivierung auf verschiedene Weise erzielt werden kann, entweder durch Verwendung von Thrombin oder auch durch Verwendung eines für das Protein C spezifischen Aktivators, der aus Schlangengift extrahiert wird, oder auch eines natürlichen Aktivators, der aus Thrombin und Thrombomodulin besteht.
- Bestimmte Fraktionen können das Protein in bereits aktivierter Form enthalten, wobei in diesem Falle eine Aktivierung offensichtlich nicht erforderlich ist.
- Die nachstehenden Beispiele sollen weitere Vorteile und Charakteristiken der vorliegenden Erfindung zeigen.
- Das für dieses Beispiel verwendete Ausgangsmaterial ist ein durch Immunreinigung erhaltenes Protein C.
- Eine an Protein C angereicherte Plasma-Unterfraktion wird an einer Säule von monoklonalen Antiprotein C-Antikörpern, die auf mit Bromcyanid (Pharmacia) aktivierter Sepharose 4-B insolubilisiert worden sind, adsorbiert. Der verwendete monoklonale Antikörper erkennt das Protein C und erkennt APC nicht.
- Eine Vorelution wird mit einem 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 M NaCl-Puffer durchgeführt. Die Elution wird mit einer 3 M Kaliumthiocyanatlösung durchgeführt. Das erhaltene Eluat wird eingeengt und dialysiert bis auf 75 mM NaCl, abgepuffert auf pH 8.
- Man erhält so eine Protein C-Lösung und auch das Verhältnis zwischen dem Antigen und der Proteinkonzentration, das bei der SDS PAGE-Elektrophorese erhalten wird, zeigt einen hohen Reinigungsgrad an.
- Das Proenzym wird mit einem der bekannten Aktivatoren aktiviert: Thrombin-Thrombomodulin, Thrombin, Extrakten des Giftes von Agkistrodon Contortrix oder der Russell-Viper. Diese Aktivatoren können der gelösten Fraktion oder der auf einer Matrix insolubilisierten Fraktion zugesetzt werden. Im letzteren Falle erfolgt die Aktivierung absatzweise (diskontinuierlich) oder an einer Säule.
- 2 ml immungereinigtes aktiviertes Protein C werden auf eine Aprotinin-Sepharose 4B (Pharmacia)-säule (1 x 5) (5 mg Aprotinin pro ml Gel) aufgegeben (abgeschieden), die mit einem 50 mM Tris-HCl, pH 8, 75 mM NaCl-Puffer äquilibriert ist.
- Es wird eine Vorelution mit einem 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 M NaCl-Puffer durchgeführt.
- Das APC wird eluiert unter Herabsetzung des pH-Wertes mit einer 0,1 N HCl-Lösung und der pH-Wert steigt sofort wieder auf 8 an.
- Die Bestimmung der amidolytischen und koagulierenden Aktivität sowie die eindimensionale Laurell-Antiprotein C- Immunelektrophorese zeigen, daß das aktivierte Protein C nur in dem HCl-Eluat zu finden ist.
- Das für dieses zweite Beispiel verwendete Ausgangsmaterial ist ein Konzentrat des Prothrombin-Komplexes (PPSB). Das in diesem Präparat enthaltene Protein C wird mit einem Aktivator wie in Beispiel 1 aktiviert.
- 100 ml Ausgangsmaterial werden an einer Aprotinin-Sepharose 4-B (Pharmacia)-Säule (1 x 5) abgeschieden (5 mg Aprotinin pro ml Gel), die mit einem 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,15 M Nacl-Puffer äquilibriert worden ist.
- Es wird eine Vorelution mit einem 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,5 M Nacl-Puffer durchgeführt.
- In der nicht-zurückgehaltenen Fraktion und in der 0,5 M Nacl-Vorelution ist keine Aktivität des aktivierten Protein C nachweisbar.
- Das spezifisch an der Matrix zurückgehaltene APC wird eluiert unter Herabsetzung des pH-Wertes mit einer 0,1 N HCl-Lösung. Der pH-Wert steigt sofort wieder auf 8 an.
- Die eluierte Fraktion weist die Charakteristiken des APC auf, sowohl in bezug auf die biologische Aktivität als auch in bezug auf das elektrophoretische Verhalten und die Antigenität. Die angewendeten Verfahren sind jeweils die Bestimmungen der antikoagulierenden und amidolytischen Aktivitäten, die immunologische Identifizierung und die SDS PAGE-Elektrophorese mit und ohne Reduktionsmittel.
- Calcium (Gesamtmenge 25 mM) wird der PPSB-Fraktion eines Konzentrats des Prothrombin-Komplexes zugesetzt. Nach langsamem Rühren für 30 min bis 4 h wird das Calcium durch Dialyse oder Diafiltration gegen einen Puffer eliminiert, der beispielsweise 50 mM Tris-HCl; 0,15 M NaCl, pH 7,4, enthält.
- Danach erfolgt die Aktivierung des Proteins C unter langsamem Rühren bei Umgebungstemperatur oder bei 4ºC während 8 bis 24 h.
- Dies so erhaltene Fraktion wird auf Aprotinin-Sepha rose abgeschieden (angelagert), um das aktivierte Protein C zu reinigen.
- Diese Reinigung des aktivierten Proteins C erfolgt nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren.
- 1) J. Stenflo (1976), "J. Biol. Chem." 251, 355-363
- 2) W. Kisiel (1979), "J. Clin. Invest.", 64, 761-769
- 3) P. Ferlund, J. Stenflo (1982), "J. Biol. Chem." 257, 12170-12179
- 4) G.L. Nelsestuen, W. Kisiel, R.G. Di Scipio (1978), "Biochemistry" 17, 2134-2138
- 5) C.T. Esmon, W.G. Owen (1981), "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 78, 2249-2252
- 6) F.J. Walker, S.W. Sexton, C.T. Esmon (1979), "Biochim. Biophys. Acta", 571, 333-342
- 7) B. Dahlbäck (1986), "J. Biol. Chem.", 261, 12022- 12027
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein
C (APC) aus einem Ausgangsmaterial, welches das genannte
aktivierte Protein C enthält, dadurch gekennzeichnet, daß
man das APC an insolubilisiertem Aprotinin adsorbiert und
dann nach dem Waschen des genannten
APC-Aprotinin-Komplexes mit einer gepufferten Salzlösung das genannte
aktivierte Protein C durch Elution mit einer sauren wäßrigen
Lösung oder mit einer Lösung eines chaotropen Agens
gewinnt (abtrennt).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Fixierung des aktivierten Proteins C an dem
insolubilisierten Aprotinin bei einem pH-Wert zwischen 7 und 9
und vorzugsweise zwischen 8 und 8,4 durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das aktivierte Protein C durch Eluieren mit
einer sauren wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert zwischen 1
und 3 gewonnen (abgetrennt) wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das aktivierte Protein C durch Eluieren mit
einer Lösung, die ein chaotropes Agens enthält, das
vorzugsweise ausgewählt wird aus der Gruppe KSCN und NaSCN,
gewonnen (abgetrennt) wird, wobei das chaotrope Agens
anschließend durch Dialyse eliminiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß das Waschen des aktivierten
Protein C-Aprotinin-Komplexes mit einer gepufferten
Salzlösung mit einem pH-Wert in der Größenordnung von 8
durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß das Aprotinin auf einer Matrix
in Konzentrationen zwischen 0,5 und 5 mg pro ml Gel
insolubilisiert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial, welches
das APC enthält, ausgewählt wird aus der Gruppe
immungereinigtes aktiviertes Protein C und
mit einem Aktivator für das Protein C behandeltes
Konzentrat des Prothrombin-Komplexes (PPSB).
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial ein
Konzentrat des Prothrombin-Komplexes ist und daß das Protein C
darin durch das in dem Ausgangsmaterial durch Zugabe von
Calcium erzeugte Thrombin aktiviert worden ist, wobei das
Calcium anschließend so eliminiert wird, daß die
Aktivierung des Proteins C durch das genannte Thrombin möglich
ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Calcium dem Ausgangsmaterial in einer
Konzentration zwischen 10 und 100 mM zugesetzt wird.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904814A FR2645865B1 (fr) | 1989-04-12 | 1989-04-12 | Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue |
| FR909002028A FR2658517B2 (fr) | 1989-04-12 | 1990-02-20 | Preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue. |
| PCT/FR1990/000258 WO1990012028A1 (fr) | 1989-04-12 | 1990-04-10 | Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69009668D1 DE69009668D1 (de) | 1994-07-14 |
| DE69009668T2 true DE69009668T2 (de) | 1994-10-06 |
Family
ID=26227270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69009668T Expired - Fee Related DE69009668T2 (de) | 1989-04-12 | 1990-04-10 | Verfahren zur herstellung von aktiviertem protein c. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5198534A (de) |
| EP (1) | EP0424498B1 (de) |
| JP (1) | JPH03505531A (de) |
| KR (1) | KR920700220A (de) |
| AT (1) | ATE106893T1 (de) |
| CA (1) | CA2030783A1 (de) |
| DE (1) | DE69009668T2 (de) |
| DK (1) | DK0424498T3 (de) |
| ES (1) | ES2054355T3 (de) |
| FR (1) | FR2658517B2 (de) |
| MA (1) | MA21807A1 (de) |
| PL (1) | PL284757A1 (de) |
| WO (1) | WO1990012028A1 (de) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT397615B (de) * | 1991-05-14 | 1994-05-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend protein c |
| AT402262B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c |
| DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
| US6867045B1 (en) * | 1994-11-14 | 2005-03-15 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| JP3745805B2 (ja) * | 1995-10-24 | 2006-02-15 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | トロンボモジュリンの精製方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8319538D0 (en) * | 1983-07-20 | 1983-08-24 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4849403A (en) * | 1985-05-29 | 1989-07-18 | Pentapharm Ag | Protein C activator, methods of preparation and use thereof |
| EP0287028B1 (de) * | 1987-04-17 | 1993-07-21 | Teijin Limited | Verfahren zur Trennung von aktiviertem menschlichem Protein C |
-
1990
- 1990-02-20 FR FR909002028A patent/FR2658517B2/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 DK DK90907093.0T patent/DK0424498T3/da active
- 1990-04-10 US US07/613,843 patent/US5198534A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-10 EP EP90907093A patent/EP0424498B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 CA CA002030783A patent/CA2030783A1/fr not_active Abandoned
- 1990-04-10 WO PCT/FR1990/000258 patent/WO1990012028A1/fr active IP Right Grant
- 1990-04-10 DE DE69009668T patent/DE69009668T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-10 ES ES90907093T patent/ES2054355T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 JP JP2506627A patent/JPH03505531A/ja active Pending
- 1990-04-10 AT AT90907093T patent/ATE106893T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-10 KR KR1019900702600A patent/KR920700220A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-04-12 PL PL28475790A patent/PL284757A1/xx unknown
- 1990-04-12 MA MA22067A patent/MA21807A1/fr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5198534A (en) | 1993-03-30 |
| EP0424498A1 (de) | 1991-05-02 |
| WO1990012028A1 (fr) | 1990-10-18 |
| FR2658517B2 (fr) | 1992-06-19 |
| ES2054355T3 (es) | 1994-08-01 |
| ATE106893T1 (de) | 1994-06-15 |
| MA21807A1 (fr) | 1990-12-31 |
| DE69009668D1 (de) | 1994-07-14 |
| CA2030783A1 (fr) | 1990-10-13 |
| JPH03505531A (ja) | 1991-12-05 |
| EP0424498B1 (de) | 1994-06-08 |
| FR2658517A2 (fr) | 1991-08-23 |
| PL284757A1 (en) | 1991-01-14 |
| DK0424498T3 (da) | 1994-07-04 |
| KR920700220A (ko) | 1992-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0181465B1 (de) | Blutgerinnungshemmende Proteine, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung | |
| DE68915675T3 (de) | Verfahren zur Reinigung von Vitamin K-abhängigen Proteinen. | |
| DE69434332T2 (de) | Thrombin mutanten | |
| DE69213421T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Faktor VII-Konzentrates mit einer hohen Reinheit | |
| EP1012303B1 (de) | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon | |
| DE69534383T2 (de) | Verfahren zur aufreinigung des faktors viii | |
| JPH0689014B2 (ja) | トロンビン結合性物質およびその製法 | |
| DE69126049T2 (de) | Vektoren und Zusammensetzungen zur Expression von Glykosilationsmutanten des menschlichen Proteins-C | |
| AT409334B (de) | Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren | |
| AT410216B (de) | Faktor x-analogon mit verbesserter aktivierbarkeit | |
| EP0155852A2 (de) | Thrombinbindender Stoff und Verfahren zu seiner Herstellung | |
| DE3780506T2 (de) | Reinigung des einkettigen und zweikettigen gewebeplasminogenaktivators. | |
| DE69009668T2 (de) | Verfahren zur herstellung von aktiviertem protein c. | |
| EP0565511B1 (de) | Verfahren zur Spaltung von Proenzymen | |
| EP0565512B1 (de) | Verfahren zur Aktivierung von Blutgerinnungsfaktoren | |
| DE3852625T2 (de) | Vektoren und Verbindungen zur Expression von Zymogen-Formen von menschlichem Protein C. | |
| DE3034045C2 (de) | ||
| EP0776969A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch kontrollierte proteolytische spaltung von Pro-Proteinen | |
| Gasmi et al. | Purification from Vipera lebetina (desert adder) venom of a protein that depletes human complement | |
| DE60220469T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch aktiver, rekombinanter Urokinase umfassend die Verwendung von Buttersäure oder deren Salze | |
| DE69520844T2 (de) | Verfahren zur Verhinderung der Zersetzung des Proteins C | |
| DE3625090A1 (de) | Mittel zur therapie faktor viii-resistenter haemophilie a und verfahren zu seiner herstellung | |
| DE4403057C1 (de) | Thrombozytenstabilisierende Faktor IX-Fragmente, deren Herstellung sowie sie enthaltende Arzneimittel | |
| EP0418647B1 (de) | Verfahren zur Reinigung von Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 2 (PAI-2) | |
| EP0917567A1 (de) | Thrombinaktivierbarer plasminogenaktivator |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |