AT407705B

AT407705B - Virusinaktivierte faktor xa-präparation

Info

Publication number: AT407705B
Application number: AT0148894A
Authority: AT
Inventors: Peter Dr Turecek; Johann Dr Eibl; Hans-Peter Schwarz
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1994-07-27
Publication date: 2001-05-25
Also published as: CA2129155A1; EP0651054A1; ATA148894A; JPH0775572A; DE4325872C1; US5593968A

Description

Die Erfindung betrifft eine virusinaktivierte Faktor Xa-Präparation, insbesondere eine Faktor Xa-Präparation von hoher Reinheit. Es wird ein Verfahren zur Herstellung dieser virusinaktivierten, hochreinen Faktor Xa-Präparation beschrieben, wobei es dieses Verfahren auch erlaubt, insbeson- dere eine virusinaktivierte, hochreine beta-Faktor Xa-Präparation zu erhalten, die sich durch besondere Stabilität auszeichnet.

Der Blutgerinnungsfaktor X stellt ein plasmatisches Glykoprotein dar, welches sowohl in der intrinsischen als auch extrinsischen Blutgerinnungskaskade involviert ist. Während der Blutgerin- nung wird Faktor X zu Faktor Xa aktiviert. Letzterer stellt eine Serinprotease dar, die die Umwand- lung von Prothrombin zu Thrombin katalysiert.

Faktor X besteht aus zwei Untereinheiten, nämlich einer schweren Ketten mit einer Molmasse von 49 kD und einer leichten Kette mit einer Molmasse von 17 kD, welche über eine Disulfidbrücke verbunden sind. Bei der enzymkatalysierten Aktivierung des Zymogens zu Faktor Xa wird ein aminoterminales Peptid der schweren Kette mit einer Molmasse von 11kD abgespalten. Dabei ensteht alpha-Faktor Xa mit einer Molmasse von etwa 55 kD, welcher den proteolytisch aktiven Faktor Xa darstellt (J.C Giddings, Molecular Genetics and Immunoanalysis in Blood Coagulation, Weinheim, Cambridge, New York, Basel, Verlag Chemie 1988, S. 47 ff).

Durch weitere Abspaltung eines 4,5 kD-Peptides vom carboxyterminalen Ende der schweren Kette des alpha-Faktor Xa entsteht beta-Faktor Xa. Aus der Literatur (J. Biol.Chem., 2504497-4504 (1975) und 2495614-5622 (1972)) geht hervor, dass es sich hierbei um eine autokatalytische Umwandlung des alpha-Faktor Xa in beta-Faktor Xa handelt (siehe auch Proc.

Nat Acad. Sci, USA, 72:3359-3363 (1975)). Daher enthalten kommerziell erhältliche Faktor Xa- Präparationen Mischungen aus alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa. Die kommerziell erhältlichen Faktor Xa-Praparationen werden vornehmlich durch Aktivierung von Faktor X mittels Russell's Viper Venom hergestellt. Aus J Biol.Chem., 250 :4497-4504 (1975) ist bekannt, dass diese enzy- matische Aktivierung nur zu alpha-Faktor Xa führt. Daran schliesst sich dann eine nachfolgende unkontrollierte autokatalytische weitere Umwandlung zu beta-Faktor Xa an, wobei Mischungen der beiden Formen von Faktor Xa entstehen.

Aus der Literatur ist bekannt, dass alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa die gleichen enzyma- tischen Aktivitäten besitzen. Fur eine pharmazeutische Präparation ist es aber von wesentlicher Bedeutung, dass ein Faktor Xa-Produkt mit molekularer Integrität des Wirkstoffes vorliegt, welche auch bei einer langerfnstigen Lagerung gewahrt bleibt und ausgeschlossen ist, dass keine weiteren Umwandlungen von Faktor Xa auftreten.

Aus Thrombosis Research 22 :213-220 (1981)ist ein Verfahren bekannt, welches den Erhalt einer möglichst stabilen beta-Faktor Xa-Präparation erlaubt. Nach diesem Verfahren wird beta- Faktor Xa in 50% Glycerin bei pH 7,2 in 0,03 M Imidazolpuffer gekühlt gelagert. Jedoch tritt auch bei diesem Verfahren selbst bei einer Lagerung von beta-Faktor Xa in dem genannten Puffer bei 4 C eine weitere Umwandlung zu inaktiven Fragmenten auf In ähnlicher Weise wir auch in J. Biol.

Chem., 248 :7729-7741 die Instabilität von Faktor Xa in Glyzerin-Wasser-Gemischen be- schrieben.

Aus J. Biol. Chem , 248:7729-7741 (1973) ist ein Verfahren zur Reinigung von Faktor X aus Rin- der-Plasma bekannt. Dieses Reinigungsverfahren umfasst die Adsorption des Faktor X an Barium- chlorid, die Elution desselben und die anschliessende fraktionierte Reinigung mit Ammoniumsulfat.

Eine weitere Reinigung erfolgt chromatographisch mit Anionenaustauschern Der gereinigte Faktor X wird dann durch Einwirkung von immobilisiertem Trypsin bzw. RW (Russel's Viper Venom) akti- viert.

Die Aktivierung von gereinigtem humanem plasmatischem Faktor X wird in J. Biochem. 185, 647-658 (1980), beschrieben Als Aktivatoren werden RW bzw. gereinigte physiologische Aktiva- toren herangezogen. Zu den letzteren gehören Faktor Vit. gemeinsam mit 'tissue factor', und
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Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Faktor X bzw. Xa dient z. B. Plasma. Ausserdem kann Faktor X bzw. Xa rekombinant hergestellt werden.

Die Verwendung von biologischen Materialien als Ausgangsmaterial bzw. zur Aktivierung von Faktor X birgt das Risiko des Vorhandenseins von infektiösen Agenzien im Präparat mit sich. Des- halb ist eine Behandlung zur Inaktivierung, insbesondere von Viren, unbedingt erforderlich. Der aktivierte Faktor Xa gilt aber als ein labiles Enzym (im Vergleich zum Zymogen), weshalb es vorge-

zogen wird, das Zymogen (Faktor X) einer Behandlung zur Virusinaktivierung zu unterziehen.

Aus Gründen der Sicherheit sowie aus Stabilitätsgründen wird daher in US-PS 4,501,731 vor- geschlagen, antstelle von Faktor Xa das Zymogen Faktor X zur Behandlung von Blutstörungen zu verabreichen.

Wie vorstehend bereits erwähnt, können Faktor X bzw. der aktivierte Faktor Xa auch rekom- binant gewonnen werden. So wird z.B. in J.BioLChem. 266,13726-13730 (1991), die Expression von Faktor X und der aktivierten Form in transformierten CHO-Zellen beschrieben. Die erhaltenen
Gerinnungsfaktoren werden durch Anionenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie gerei- nigt. Obwohl es sich hierbei um schonende Verfahren handelt, wurden geringere spezifische Aktivi- täten im Vergleich zu plasmatischem Faktor Xa gefunden. Bei den Vergleichsprodukten handelte es sich um plasmatische Gerinnungsfaktoren, wie sie kommerziell durch Hematologic Technoto- gies erhältlich sind. Im übrigen ist auch bekannt, dass rekombinant hergestellter Faktor Xa in seiner gereinigten Form einer Autoproteolyse unterliegt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat von hoher Reinheit zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe gemäss der Erfindung ist es, ein virusinaktiviertes, stabiles beta-Faktor Xa-Präparat von hoher Reinheit zu schaffen.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäss der Erfindung dadurch gelöst, dass eine virusinakti- vierte Faktor Xa-Präparation mit mindestens 100 Einheiten Gerinnungsfaktor Xa-Aktivität pro mg Protein zur Verfügung gestellt wird.

Ausserdem wird ein virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100 Einheiten Gerin- nungsfaktor beta-Xa-Aktivität pro mg Protein zur Verfügung gestellt.

Bevorzugt ist es, ein virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 500 bzw. 1000 Ein- heiten pro mg Protein zur Verfügung zu stellen bzw wird ein stabiles virusinaktiviertes beta-Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100, bevorzugt 500 bzw. 1000 Einheiten Gerinnungsfaktor Xa-Aktivität pro mg zur Verfügung zu stellen.

Dies wird erreicht durch ein neues Verfahren, bei welchem ein Faktor X-enthaltendes Aus- gangsmaterial nach Aktivierung auf mindestens 100 Einheiten Faktor Xa-Aktivität pro mg Protein gereinigt und anschliessend einer Behandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, insbe- sondere von Viren, unterzogen wird.

Die vorstehend genannte Virusinaktivierung erfolgt vorzugsweise durch eine Hitzebehandlung.

Besonders bevorzugt ist es, die Hitzebehandlung gemäss dem Verfahren von EP-159,311 durch- zuführen, wobei die zu inaktivierende Präparation in festem Zustand, wie z. B. in lyophilisierter Form, auf einen Gehalt an Wasser, Methanol oder Ethanol von mehr als 0,05 (entsprechend 5 Gew.-%) und weniger als 0,70 (70 Gew.-%) eingestellt und in einem geschlossenen Behälter bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 121 C unter Erhöhung des Partial dampfdruckes des Was- sers, Methanols oder Ethanols behandelt wird.

Vorzugsweise erfolgt die Hitzebehandlung zur Virus-Inaktivierung bei einem Wassergehalt von 0,06 bis 0,30 (Gew.-%). Bevorzugte Temperaturen zur Hitzebehandlung liegen im Bereich von 50 bis 90 C.

Überraschenderweise hat sich erfindungsgemäss herausgestellt, dass im Gegensatz zur bisher bekannten Meinung der Fachwelt der aktivierte Faktor X (Faktor Xa) in hochreiner Form ausrei- chend stabil ist, so das er sowohl hitzebehandelt als auch über langere Zeit gelagert werden kann, ohne dass wesentliche Verluste der biologischen Aktivität in Kauf genommen werden müssen.

Dieser Effekt war unerwartet, da im allgemeinen Proteine umso stabiler sind, wenn sie zusammen mit Begleitproteinen, insbesondere Trägerproteinen, vorliegen. So ist es dem Fachmann bekannt, dass z.B. Albumin als ein solches Trägerprotein agiert, welches eine Stabilisierung von u.a. Blut- faktoren bewirkt
Es ist bekannt, dass hochgereinigter Faktor X (Zymogen) gegenüber Hitzebehandlung wesent- lich labiler ist als eine Faktor X-Präparation, die in Form des Prothrombin-Komplexes, also einer Fraktion, welche aus mehreren Proteinen besteht, vorliegt. Somit konnte nicht erwartet werden, dass aktivierter Faktor X in hochgereinigter Form ausreichend stabil ist, um ihn zur Virusinaktivie- rung einer Wärmedenaturierung zu unterziehen.

Wie nachfolgend in den Beispielen gezeigt wird, kann das erfindungsgemässe Präparat durch chromatographische Reinigung eines geeigneten Ausgangsmaterials, welches Faktor Xa enthält, durch Aktivierung und anschliessende Hitzebehandlung, vorzugsweise in festem Zustand, herge-

stellt werden. Die Hitzebehandlung kann gemäss EP-159 311während 10 Stunden bei 60 C und 1 Stunde bei 80 C erfolgen. Ausserdem ist es möglich, die Hitzebehandlung des Proteins in wäss- riger Lösung, gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren, durchzuführen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform gemäss der Erfindung wird Faktor X aus einer Fak- tor X-haltigen Fraktion gereinigt, gegebenenfalls zur Inaktivierung lipidumhüllter Viren mit einem Tensid behandelt und der gereinigte Faktor X durch Einwirkung eines Enzyms zum Faktor Xa akti- viert ; daran schliesst sich eine weitere Reinigung von Faktor Xa sowie eine Hitzebehandlung des- selben. Als Ausgangsmaterial dient dabei entweder eine Plasmafraktion, insbesondere ein Pro- thrombin-Komplex oder ein Zellkulturüberstand, welcher den rekombinanten Faktor X enthält. Um bezüglich der Übertragung infektiöser Agenzien eine maximale Sicherheit zu gewährleisten, ist es vorteilhaft, bereits das Ausgangsmaterial vor der Gewinnung des Faktor X zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, insbesondere Viren, zu behandeln.

Auf diese Weise umfasst das Herstel- lungsverfahren mindestens zwei Massnahmen zur Inaktivierung von Viren.

Als aktivierendes Enzym kann Schlangengift, insbesondere RW, in immobilisierter Form oder als lösliches Enzym, verwendet werden. Ausserdem kann auch Trypsin oder eine Protease mit 'Trypsin-ähnlicher Aktivität' oder ein physiologischer Aktivator der intrinsischen oder extrinsischen Gerinnung verwendet werden. Als letzterer dient z.B. ein aktivierter Gerinnungsfaktor, gegebenen- falls mit einem Co-Faktor, wie Faktor Vlla und'tissue factor'.

Es wird angenommen, dass Faktor Xa-Präparate therapeutisch dann besonders wertvoll zur Behandlung von Haemophilie sind, wenn sie gemeinsam mit Phospholipid-Präparaten verabreicht werden (siehe hierzu EP-129 998). Es ist aber bekannt, dass die autokatalytische Umwandlung von alpha-Faktor Xa zu beta-Faktor Xa durch Lipide verstärkt wird. Eine hohe Stabilität von Faktor Xa-Präparationen ist daher vor allem wünschenswert, wenn diese gemeinsam mit Phospholipid- Präparaten verabreicht werden
Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemässen virusinaktivierten, hochreinen Präparate her- vorragend geeignet sind zur Behandlung von Haemophilie A-Inhibitor-Patienten, vor allem wenn sie in Kombination mit Phospholipidpräparaten verabreicht werden. Dies ist insbesondere auf das Vorliegen der stabilen beta-Form zurückzuführen.

Neben der therapeutischen Anwendung der erfindungsgemässen hochreinen Faktor Xa-Präpa- rate finden diese auch eine vorteilhafte Anwendung in der Diagnostik.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1:
Herstellung von Faktor X aus einer virusinaktivierten Plasmafraktion mittels lonenaus- tauschchromatographie
Als Ausgangsmaterial wurde ein Lyophilisat einer Prothrombin-Komplexfaktoren-Präparation, welche die Faktoren 11, IX, X sowie Protein C und Protein S enthielt, verwendet. Dieses Ausgangs- material wurde nach der Methode von H.G.J. Brummelhuis (Preparation of the prothrombin complex; in Curling, J. M., Methods of Plasma Protein Fractionation, S. 117-128 (Acad. Press, New York, 1980)) hergestellt und zur Virusinaktivierung nach EP-159,311 hitzebehandelt.

Entsprechend wurde das Lyophilisat (1000 E FX/g) in destilliertem Wasser gelöst, so dass dieses 50 000 E FX/1 enthielt, und auf pH 7,0 eingestellt Nach Zusatz von 12% (VN) Tween 80 wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde mit destilliertem Wasser auf das 5-fache Volumen verdünnt (entsprechend 10 000 E FX.1), mit Trinatrium-Citrat-Dihydrat (7 g.1)
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wurden die Proteine des Prothrombin-Komplexes copräzipitiert Das Präzipitat wurde durch Zentn- fugation (10 min, 4 C) sedimentiert und dreimal mit 1 I pro 10 000 E FX Waschpuffer durch Resus- pendieren und erneute Zentifugation gewaschen.

(Waschpuffer: hierzu wurde eine Lösung von
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nen-Trypsininhibitor, pH 6,0, mit 80 ml 1M BaCI2-Losung pro Liter versetzt und das entsprechende Präzipitat abgetrennt)
Das gewaschene Präzipitat wurde mit 200 ml/10 000 E eingesetztem FX einer 25%igen (G.V) Ammoniumsulfat-Lösung, welche 50 mM Benzamidin-HCI enthielt, bei 4 C 30 Minuten unter Rüh- ren resuspendiert und anschliessend zentrifugiert. Der Überstand wurde abgetrennt und das Pellet

nochmals mit Ammoniumsulfat-Lösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugations- überstände wurden vereinigt und mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und bei 4 C 15 h lang gerührt. Das dabei entstandene Prazipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen.

Das Pellet wurde in Puffer (25 mM Trinatrium-Citrat-Dihydrat, 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidin-HCI, pH 6,0) in einer Konzentration von 50 000 E FX/1 gelöst und gegen denselben Puffer über eine Sepha- dexRG25-Säule chromatographiert und die Fraktionen gesammelt. Dabei wurde im Eluatstrom die UV-Absorption bei 280 nm und die elektrische Leitfähigkeit gemessen Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf 40 000 E FX/1 eingestellt.
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thrombin-Komplexfaktoren getrennt. Dazu wurden auf einer Säule (Innendurchmesser: Gelbett- höhe = 1:8,3), mit gequollenem, gewaschenem DEAE-Sepharose-Gel, 10 E FXlml Gel bei einer
Flussrate von 2 ml/min adsorbiert.

Danach wurde die Säule mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/min mit dem 1,7-fachen Gelvolumen an 100 mm NaCI in 25 mM Trinatrium-Citrat-Dihydrat, pH 6,0, und anschliessend mit dem 2,6-fachen Gelvolumen an 250 mM NaCI in 25 mM Citrat-Puffer, pH 6,0, gespült. Die Elution von FX erfolgte mit dem 5,2-fachen Gelvolumen an 280 mM NaCI in Citrat-Puffer, pH 6,0. (Noch am Gel gebundenes Protein wurde mit 1 M NaCI in Puffer und durch Waschen mit Lauge entfernt.)
Bei der Elution wurden Fraktionen gesammelt, die auf den Gehalt an FX, Protein C, FIX und F/1 analysiert wurden. Die FX-enthaltenden Fraktionen, die frei von Fll und arm an FIX und Protein C waren, wurden vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und 15 h bei 4 C gerührt.

Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt und in 20 mM Tris- HCI-Puffer, pH 7,4, welcher 50 mM NaCI und 2 mM CaCI2 (TBSC-Puffer), enthielt gelöst, durch Chromatographie über eine Säule gefüllt mit SephadexRG25 gegen 20 mM TBSC-Puffer umge- puffert, und auf 3 E FX/ml eingestellt.

Bezüglich der Verfahrensbedingungen zur Hitzebehandlung wird auf den Gesamtinhalt von EP-159 311 verwiesen. Diese europäische Patentschrift soll damit Bestandteil der vorliegenden Beschreibung sein.

Beispiel 2 :
Alternatives Verfahren zur Herstellung von Faktor X
Das Lyophilisat einer Prothrombin-Komplexfaktoren-Präparation wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gelöst und mit Tween 80 behandelt. Nach Verdünnen auf 10 000 E FX//1 wurde mit 30 g/1 Ca3(PO4)2 versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die feste Phase durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit je 25 ml/g Calciumphosphat eines Puffers von 20 mM Tris-HCI, pH 7,0, enthaltend 10% Ammoniumsulfat, durch Resuspendieren gewaschen und jeweils neuerlich abzentrifugiert. Danach wurde eine dritte Waschung mit 25 ml/g Calciumphosphat eines Puffers von 20 mM Tris-HCI, pH 7,0, enthaltend 150 mM NaCI, durch neuerliches Resuspen- dieren und anschliessendes Abzentrifugieren durchgeführt.

Zur Elution des adsorbierten Faktor X wurde das Pellet mit 1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 (25 ml Elutionslösung/g eingesetztem Calciumphosphat) 1 h bei Raumtemperatur gerührt.

Danach wurde die feste Phase durch Zentrifugation abgetrennt und der Faktor X-enthaltende Überstand mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und 15 h bei 4 C gerührt.

Das dabei entstehende Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Pellet wurde, wie in Beispiel 1, Absatz 4 beschrieben, über Sephadex G25 umgepuffert und anschliessend zur Chro- matographie über DEAE-Sepharose-Fast-Flow gebracht.

Beispiel 3 :
Herstellung von Faktor X aus einer virusinaktivierten Plasmafraktion mittels tonenaus- tausch- und Affinitätschromatographie
Die nach Beispiel 1 oder 2 hergestellte, Faktor X-enthaltende Lösung wurde nach der Methode von J.P. Miletich et al (Analytical Biochemistry, 105,304-310 (1980)) über ein Dextransulfatgel weiter gereinigt. Die so erhaltene FX-enthaltende Fraktion wurde mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und 15 h bei 4 C gerührt.

Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentri-

fugation abgetrennt und in 20 mM Tris-HCI-Puffer, enthaltend 150 mM NaCI und 2 mM CaCI2, pH 7,4 (TBSC-Puffer), gelöst, durch Chromatographie über eine mit SephadexR G25 gefüllte Säule gegen 20 mM TBSC-Puffer umgepuffert und auf 3 E FXlml eingestellt.

Beispiel 4 :
Quantitative Bestimmung von Faktor Xa
Testprinzip :
Das chromogene Peptidsubstrat CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA wird durch Faktor Xa hydroly-
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von Paranitroanilin wird spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen. Die Zunahme der optischen Dichte (o D. ) ist proportional dem Gehalt an Faktor Xa in der zu quantifizierenden Probe.

Reagenzien
Verdünnungspuffer:
3,7 g/1 Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
2,1 g/1lmidazol
18,0 g/1 NaCI
1,0 g/1 Humanalbumin pH 8,4
Substratlösung:
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in Verdünnungspuffer
Methode :
50 1 einer Faktor Xa enthaltenden Probe werden mit 50 1 Verdünnungspuffer versetzt und 90 Sekunden bei 37 C inkubiert. Dann werden 100 1 der Substratlösung zugesetzt und die Zunahme der o D. pro Minute bei 37 C bei 405 nm bestimmt. Die Zunahme der O.D. muss über den Messzeitraum konstant linear bleiben.

Zur Erstellung einer Bezugskurve wird die Standardpräparation von bovinem Faktor Xa "NIBSC-Reagent 75/595" verwendet, wobei eine Ampulle nach Rekonstitution mit 1 ml A. dest.

1 E FXa enthält.

(s. Datasheet, National Institute for Biological Standards and Controls).

Beispiel 5 :
Herstellung von beta-Faktor Xa aus Faktor X
Die nach den Beispielen 1,2 oder 3 hergestellte FX-Lösung wurde mit 0,14 mg RW (FX-akti- vierende Protease aus Vipera russellii) pro 100 E FX versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt.

Danach wurde das Inkubationsgemisch an Benzamidin-SepharoseR(gewaschen und gequollen), gepackt in eine Säule (innerer Querschnitt. Gelbetthöhe = 1:3) entsprechend 5 E FXlml Gel bei einer Flussrate von 3 ml/min adsorbiert. Zur Entfernung inerter Proteine wurde mit dem 3,5-fachen Gelvolumen bei gleicher Flussrate mit TBSC-Puffer gewaschen- Faktor Xa wurde mit 30 mM Benza- midin-HCI in TBSC-Puffer eluiert und in Fraktionen gesammelt. Die alpha- und beta-FXa enthal- tenden Fraktionen wurden vereinigt, mit Ammoniumsulfat (80% Sättigung) versetzt und 15 h bei 4 C gerührt. Das entstandene Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 4 C vom Uberstand abge- trennt und in 20 mM Tris-HCI-Puffer,enthaltend 150 mM NaCI, pH 7,4 (TBS) gelöst.

Zur quantitativen Umwandlung des FXa in reinen beta-Fxa wurde die vorstehend erhaltene Lösung 3 h bei 37 C inkubiert. Daraufhin wurde über SephadexR-G25 gegen TBS umgepuffert, steril filtriert (0,22 m-Fitter) und anschliessend auf 200 E beta-FXalml eingestellt (die Präparation lag somit in TBS vor).

Eine nach diesem Verfahren hergestellte beta-FXa-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 2. 550 E FXa/mg Protein auf.

Variante A
Eine nach Beispiel 5 hergestellte beta-FXa-Lösung wurde mit Saccharose versetzt, so dass die endgültige Präparation 5 g/1 00 ml enthielt.

Die spezifische Aktivität war wie vorstehend beschrieben.

Variante B
Eine nach Variante A hergestellte beta-FXa-Lösung wurde mit 1 g/100 ml Humanalbumin (Humanalbumin 20% Haemodenvate hitzeinaktiviert) versetzt.

Eine nach diesem Verfahren hergestellte beta-FXa-Präparation wies eine spezifische Aktivität von mindestens 20 E FXalmg Protein auf (vor Albumin-Zugabe betrug die spezifische Aktivität 2550 E/mg Protein).

Beispiel 6 :
Lyophilisierung von Faktor Xa
Ein nach Beispiel 5 hergestellte beta-FXa-Präparation wurde schockgefroren und lyophilisiert.

Nach Rekonstituierung des Lyophilisates im Originalvolumen konnten in allen Fällen mehr als 50% der Ausgangsaktivität an FXa nachgewiesen werden.

Beispiel 7 :
Hitzebehandlung von tyophitisiertem beta-Faktor Xa
Zur Inaktivierung eventuell enthaltener Krankheitserreger wurden die lyophilisierten beta-FXa- Präparationen aus Beipiel 6 nach dem im Patent EP-159 311 beschriebenen Verfahren unter Erhöhung des partiellen Wasserdampfdruckes erhitzt bzw. im Anschluss an die Behandlung bei 60 C noch 1 h bei 80 C ebenso behandelt. Die Ausbeute an FXa betrug in jedem Fall mehr als 90%.

Beispiel 8 :
Thermostabilität von Faktor X aus einem Prothrombinkomplex-Präparat im Vergleich zu hochgereinigtem Faktor X
Die folgenden Versuche geben einen Vergleich der Stabilität im Hinblick auf die Hitzedenatu- rierung von Faktor X bei unterschiedlich reinen Präparaten. Während dem Fachmann bekannt war, dass das Zymogen von Faktor X wesentlich stabiler ist als der aktivierte Faktor Xa, hat sich erfin- dungsgemäss überraschenderweise gezeigt, dass dieser aktivierte Faktor Xa dennoch einer Hitze- behandlung unterworfen werden kann, ohne eine nennenswerte Einbusse der biologischen Aktivität.

Dies war für den Fachmann nicht vorhersehbar.

Für einen Stabilitätsvergleich unterschiedlich reiner Faktor X-Präparate wurden folgende Ver- suche durchgeführt: Eine Prothrombinkomplexfaktoren-Präparation wurde nach der Methode von H. G.J. Brummelhuis (Preparation of the prothrombin complex; in Curling, J. M., Methods of Plasma Protein Fractionation, S. 117-128 (Acad. Press, New York, 1980)) hergestellt und zur Virusinakti- vierung nach dem Verfahren gemäss EP-159 311 hitzebehandelt Die spezifische Aktivität von Faktor X in dieser Präparation betrug 1,36 E/mg Protein. Daneben lagen Faktor 11 mit einer spezi- fischen Aktivität von 101,33 Elmg Protein und Faktor IX mit einer spezifischen Aktivität von 1,12 E/mg Protein vor.

In einem weiteren Versuch wurde Faktor X wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch nach erfolgter Ammoniumsulfatfällung gegen einen Puffer, bestehend aus 6 g/1 Trinatrium-Citrat und 7 g/1 NaCI, pH 7,35, durch Chromatographie über Sephadex G25 umgepuffert. Die spezifische Aktivität dieser Faktor X-Präparation betrug 45 E/mg Protein.

Die beiden Faktor X-Präparationen wurden in dem vorstehend genannten Puffer auf 7 E FX/ml verdünnt und lyophilisiert. Anschliessend wurde auf 7,5% Wasser befeuchtet und jeweils entweder 1 h bei 95 C, 2 h bei 95 C oder 10 h bei 60 C erhitzt. Danach wurde der Faktor X-Gehalt der

Proben bestimmt und die Aktivitätsabnahme gegen nicht erhitzten Faktor X, jeweils hochrein und aus Prothrombin-Komplex ermittelt (siehe Tabelle 1). Dabei zeigte sich, dass der hochgereinigte Faktor X durch die Thermobehandlung eine Aktivitätsabnahme von durchschnittlich 20% aufwies, wahrend die Aktivität von Faktor X im Prothrombin-Komplex weitgehend unverändert blieb.

Tabelle 1
FX % Restaktivität
FX rein FX in PPK
Behandlung nicht erhitzt 100 100
1 h/95 C 81 99,6
2 h/95 C 78,5 94,5
10h/60 C 82 100
Während also das hochgereinigte Zymogen von Faktor X bei einer Hitzebehandlung weniger stabil ist als die vorstehend eingesetzte Vergleichssubstanz, musste der Fachmann erwarten, dass bei einer gleichen Behandlung von hochreinem aktivierten Faktor Xa ein wesentlich höherer Ver- lust der biologischen Aktivität auftritt. Überraschenderweise ist dies aber bei dem erfindungsge- mässen Verfahren nicht der Fall.

Beispiel 9 :
Lagerstabilität von beta-Faktor Xa
Es wurde eine Präparation von beta-Faktor Xa gemäss Beispiel 5 hergestellt und in einer
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gelagert, wobei einmal pro Woche eine Probe gezogen und, wie in Beispiel 4 beschrieben, auf ihren Gehalt an Faktor Xa untersucht wurde. Über den Lagerungszeitraum ergab sich keine Verän- derung der Aktivität von beta-Faktor Xa.

PATENTANSPRÜCHE :
1 Virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100 Einheiten Gerinnungsfaktor Xa-
Aktivität pro mg Protein.

2. Virusinaktiviertes Faktor Xa-Präparat mit mindestens 100 Einheiten Gerinnungsfaktor beta-
Xa-Aktivität pro mg Protein.

Claims

3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2 mit mindestens 500 Einheiten pro mg Protein.

4. Präparat nach Anspruch 1 oder 2 mit mindestens 1.000 Einheiten pro mg Protein.

5. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das bereits hochgereinigte Präparat einer Behandlung zur Virus-inaktivierung unterzogen wur- de.

6. Präparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Virus-Inaktivierung eine Hitzebehandlung durchgeführt wurde.

7. Verfahren zur Herstellung eines virusinaktivierten Faktor Xa-Präparates gemäss einem der Ansprüche 1 und 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Faktor X-enthaltendes Aus- gangsmaterial nach Aktivierung auf mindestens 100 Einheiten Faktor Xa-Aktivität pro mg Protein gereinigt und anschliessend einer Behandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, insbesondere von Viren, unterzogen wird.

8. Verfahren zur Herstellung eines virusinaktivierten beta-Faktor Xa-Praparates gemäss einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Faktor X-enthaltendes Ausgangsmaterial nach Aktivierung auf mindestens 100 Einheiten beta-Faktor Xa-Aktivität pro mg Protein gereinigt, der vorliegende Faktor Xa bzw. das vorliegende Gemisch aus alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa in ausschliesslich beta-Faktor Xa umgewandelt und einer Behandlung zur Virus-Inaktivierung unterzogen wird. <Desc/Clms Page number 8>

9 Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der vorliegende Faktor Xa bzw. das Gemisch aus alpha-Faktor Xa und beta-Faktor Xa zunächst einer Behandlung zur Virus-Inaktivierung und dann einer Umwandlung in ausschliesslich beta-Faktor Xa unterzogen wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Aus- gangsmatenal eine Plasmafraktion, insbesondere ein Prothrombinkomplex, oder rekombi- nanter Faktor X verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung der Faktor Xa-Präparation auf mindestens 500 Einheiten pro mg Pro- tein erfolgt.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung der Faktor Xa-Präparation auf mindestens 1000 Einheiten pro mg Pro- tein erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Reini- gung von Faktor X chromatografisch erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivie- rung von Faktor X zu Faktor Xa enzymatisch erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym ein Schlangengift, insbesondere Russel's Viper Venom, in immobilisierter Form oder als lösliches Enzym, oder eine Protease mit Trypsin-ähnlicher Aktivität oder ein aktivierter Gerinnungsfaktor ge- gebenenfalls mit einem Co-Faktor, wie Faktor Vlla und 'tissue factor', verwendet werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zur Virus- Inaktivierung eine Hitzebehandlung erfolgt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 50 bis 90 C durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Hitzedenaturierung in festem Zustand bei einem Wassergehalt von 0,06 bis 0,30 (Gew.-%) erfolgt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Um- wandlung von alpha-Faktor Xa zu beta-Faktor Xa durch Inkubation von 1 bis 24 h bei 4-40 C erfolgt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine alpha-Faktor Xa-ent- haltende Lösung 2 bis 4 h bei 17 bis 37 C inkubiert wird.

21. Verwendung eines Präparates mit Gerinnungsfaktor Xa-Aktivität bzw. beta-Faktor Xa-Akti- vität nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Haemophilie-A-Inhibitor-Patienten.

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