DE2742529C2

DE2742529C2 - Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2742529C2
Application number: DE2742529A
Authority: DE
Inventors: Kenneth C. Chicago Ill. Robbins; Louis Villa Park Ill. Summaria
Original assignee: MICHAEL REESE RESEARCH FOUNDATION CHICAGO ILL US
Current assignee: MICHAEL REESE RESEARCH FOUNDATION CHICAGO ILL US
Priority date: 1976-09-24
Filing date: 1977-09-21
Publication date: 1984-01-05
Also published as: SE8301795L; DE2742529A1; CH637991A5; CA1094449A; US4082612A; FR2365583A1; JPS5352606A; CH637992A5; SE8301795D0; SE454047B; SE7710653L; FR2365583B1; GB1533205A; DK421577A; SE454048B; SE8301794D0; SE442304B; NL7710451A

Description

Es Ist bekannt, daß unter der Einwirkung einer als Fibrin bekannten Plasmakomponente.Blutgerinnsel entstehen. Es ist auch bekannt, daß Substanzen, welche Fl- ^ brin lösen (flbrlnolytlsche Substanzen) schädliche Blutgerinnsel Im Kreislaufsystem vermindern oder eliminieren können.

Das menschliche Blut enthält Plasminogen, bei dem es sich nicht um ein Enzym, sondern um einen Enzymvorläufer handelt. Bestimmte Aktivatoren wandeln das Plasminogen In Plasmin um, das In der Lage Ist, Fibrin zu lösen und Blutgerinnsel aufzubrechen. Plasmin Ist ein proteolytlsches Enzym mit einem aktiven Serlnprotease-Zentrum, und es hat die Fähigkeit, Protein und auch sich selbst aufzulösen. Plasmin und viele seiner Komplexe sind deshalb bei der Lagerung In gelöster Form ohne Zugabe von stabilisierenden Substanzen, wie Leupeptln, instabil. Die proteolytische Aktivität von Plasmin und seinen Komplexen kann zu nachteiligen Sekundäreffekten führen, wenn diese Substanzen In den Blutstrom eingeführt werden, da durch die proteolytische Aktivität Serumproteine, wie z. B. Gerinnungs- und Komplementkomponer.ien, zerstört werden können.

Bei der Streptokinase, die von Streptococcus-Kulturen stammt, handelt es sich um einen Aktivator, der In der Lage ist, Humanplasminogen in Humanplasmin umzuwandeln. Er ist auch In der Lage, Katzen-Plasminogen in Katzen-PIasmln umzuwandeln; er ist jedoch verhältnismäßig Inaktiv in bezug auf die l'mwandlung von anderen Säugetier-Plasmlnogenen.

Wenn Streptokinase Humanplasminogen zugesetzt wird, verbindet sie sich zunächst mit einem Teil des Plasminogens In stöchiometrischen Mengen unter Bildung eines Komplexes. Der Streptokinase-Plasminogen-Komplex wirkt dann als Katalysator für dit Umwandlung des restlichen Plasminogens in Plasmin. Streptokinase verbindet sich auch stöchlometrlsch mit Plasmin unter Bildung eines Komplexes, der einen Katalysator für die Umwandlung von Plasminogen darstellt.

So ist z. B. aus der DE-OS 21 48 865 ein Fibrinolyse-Aktlvator bekannt, der durch einen Gehalt an Streptokinase und Plasminogen gekennzeichnet Ist. Die Streptokinase ist jedoch nicht mit einer bestimmten Plasminfraktion verbunden.

Streptokinase ist, wie oben angegeben, verhältnismäßig inaktiv in bezug auf die Umwandlung von anderen Säugetier-Plasmlnogenen als Human- und Katzen-Plasminogenen und wandelt deshalb Rinder-Plasminogen nicht In Rinder-Plasmln um. Andererseits sind der Streptoklnase-Humanplasminogen-Kompiex und der Streptokinase-Humanplasmin-Komplex aktiv bei der Umwandlung von Rlnder-PIasmlnogen in Rlnder-Plasmin.

Es ist bekannt, daß Plasmin durch Spaltung der Plasmlnmoleküle an Ihren Disulfid-Blndungen zwischen den Ketten (einer oder zwei Disulfidbindungen pro Molekül) In eine schwere (A) Kettenfraktion und eine leichte (B) Kettenfraktion aufgespalten werden kann, welche voneinander getrennt werden können. Rickli und Otavasky j geben In »Eur. J. Blochem.«, 59, 441 bis 447 (1975) an, daß die Fraktionen durch Adsorption der schweren (A) Kettenfraktion an einen L-Lysln-substitulerten Polyacrylamld-Adsorbens und EIuleren der leichten (B) Kettenfraktion voneinander getrennt werden können. Die leichte (B) Kettenfraktion hatte keinerlei proteolytische Aktivität. Durchgeführte Tests haben ferner gezeigt, daß die bei diesem Verfahren gebildete leichte (B) Kettenfraktion mit Streptokinase In einen Komplex Oberführt werden kann, der in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen In Plasmin praktisch inaktiv ist. Die schwere (A) Kettenfiaktlon kann keinen Streptoklnasekomplex bilden.

Aus Sicherheitsgründen können therapeutische Substanzen aus menschlichem Blut, die Plasminogen und Plasmin enthalten, nicht In den Blutstrom eines Patienten Injiziert werden, well hierdurch Vlrenverunrelnlgungen, wie z. B. Hepatitls-Vlren, In den Blutstrom des Patienten übertragen werden können. Die Food and Drug Administration der USA schreibt vor, daß jedes Material, das aus menschlichem Blut gewonnen worden Ist, 10 Stunden lang auf 60° C erhitzt werden muß, um eventuelle Hepatltls-Vlren zu Inaktivleren, bevor das Material oder Irgendein Derivat davon als Arzneimittel, das In den Blutstrom Injiziert werden soll, freigegeben wird.

Wenn man einen Streptoklnase-Plasmln-Komplex einer solchen Wärmebehandlung unterwirft, ändert sich

sein Charakter, und er wird In bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin inaktiv. Wenn man Plasminogen dieser Wärmebehandlung unterzieht, bevor man es in Plasmin umwandelt und bevor man es mit Streptokinase in einen Komplex überführt, ändert sich ebenfalls der Charakter des dabei erhaltenen Komplexes. Obgleich sein Streptoklnasekomplex noch die Aktivität in bezug auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin aufweist, wird seine Proteinkomponente durch die Wärmebehandlung so denaturiert, daß Antigen- und Pyrogen-Reaktionen auftreten können, wenn der Komplex in den Blutstrom eines Patienten Injiziert wird. Aus diesen Gründen wurden Streptoklnase-Plasmin-Komplexe in der Humantherapie bisher nicht zum Auflösen von Blutgerinnsel verwendet.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Piasminderivat mit einer vorteilhaften fibrinolytischen Aktivität und einer geringen Antlgenität und Pyrogenltät zur Verfügung zu stellen.

Die der Erfindung zagrundeliegende Aufgabe wird mit Hilfe einer leichten (B) Kettenfraktion von Plasmin gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein aktives Serinprotease-Zentrum enthält, daß sie an den Sulfhydrylgruppen, die durch Reduktion der Disulftdblndungen zu der schweren (A) Kettenfraktion entstanden sind, alkyüert ist und daß sie eine geringere proteolytische Aktivität als das Stammplasmin, bezogen auf eine äquimolare Basis, aufweist.

Gegenstand der Erfindung Ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser leichten (B) Kettenfraktion von Piasmin, bei dem man die riasminmoleküle an den Disulfidbindungen zwischen den Ketten untt- Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und dichte (B) Kettenfraktionen enthält, reduziert und anschließend 'Ie leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man (1) Plasmin mit einem reversiblen Serlnproteasezentrum-Inhlbltor mischt, (2) die Piasminmoleküle In der Mischung an den Disulfldblndungen zwischen den Ketten unter Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und leichte (B) Kettenfraktionen enthält, reduziert, (3) die während der Reduktionsreaktion gebildeten SuIfhydrylgruppsn alkyllert und (4) die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind In den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß sich das katalytlsche Serinprotease-Zentrum auf der Seite der leichten (B) Kette des Plasmlnmoleküis befindet. Bei den bisherigen Verfahren zur Aufspaltung des Plasmlnmoleküls und bei der anschließenden Trennung der leichten (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion wurde das katalytlsche Serinprotease-Zentrum an der leichten (B) Kettenfraktion Inaktiviert, so daß diese ebenso Inaktiv war wie die schwere (A) Kettenfraktion, die kein derartiges katalytisches Zentrum aufweist.

Es wurde ferner gefunden, daß bekannte reversible aktive Serlnprotease-Zentrumsinhlbltoren, wie Leupeptin, die Desaktlvlerung oder Vergiftung des katalytischer! Serinprotease-Zentrums in der leichten (B) Kettenfrak· tion hemmen bzw. verhindern und dadurch Ihre Aktivität während der Reduktlons- und Trennungsstufen schützen.

Es wurde auch gefunden, daß Streptokinase das aktive Serinprotease-Zentrum schützt und daß ein Streptoklnase-Plasmlnogen-Komplex oder ein Streptoklnase-PIasmin-Komplex einer Reduktion und Trennung unterworfen werden können, ohne daß ein reversibler aktiver

Serlnprotease-Zentrumsinhibitor vorhanden ist, wobei sich ein Streptoklnase-leichter (B) Kettenfraktion-Komplex bildet, der eine fibrlnolytische Aktivität aufweist.

Es wurde ferner gefunden, daß eine aktive leichte (B) Kettenfraktion aus einem Plasminogen-Ausgangsmaterial hergestellt werden kann, das 10 Stunden lang bei 60° C wärmebehandelt worden ist, und daß die so hergestellte Fraktion mit Streptokinase unter Bildung elres flbrinolytlsch aktiven Komplexes verbunden werden kann, der eine wesentlich geringere antigene oder pyrogene Reaktion hervorrufen kann, wenn er in den Blutstrom eines Patienten injiziert wird, als der Komplex aus Streptokinase und einem wärriebehandelten Plasminogen, das nicht fraktioniert worden ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise Human-Plasminogen zunächst 10 Stunden bei 60° C erhitzt, um ggf. darin enthaltene Virenverunreinigungen zu inaktivieren. Das wärmebehandelte Plasminogen wird dann zu Plasmin aktiviert und mit einem aktiven Serinprotease-Zentrumsinhlbitor, wie Leupeptin (Acetyl-L-leucin-L-leucin-L-argininal) In einer solchen Menge gemischt, daß der größte Teil der oder die gesamte Piasminaktivität gehemmt (inhibiert) wird. Die Plasmin-Leupeptin-Mischung wird dann mit einem Reduktionsmittel, wie 2-Mercaptoäthano! oder Dlthioerythrit, reduziert, um die Disulfidbindungen In den Piasminmolekülen zu spalten unter Bildung der schweren (A)-PIasmin-Kettenfraktionen und der leichten (B) Kettenfraktionen. Das Produkt wird dann mit einem Alkylierungsmittel, wie Natriumjodacetat, alkyllert, um dia gespaltenen Enden der Disulfidbindungen (Sulfhydrylgruppen) an der Rekombination zu hindern; und das alkylierte Produkt wird auf eine chromatographische Affinitäts-Kolonne aufgegeben. In welcher die schwere (A) Kettenfraktion adsorbiert und die !eichte (B) Kettenfraktion eluiert wird, die ohne Adsorption die Kolonne passiert. Die leichte (B) Kettenfraktion wird mit Ammoniumsulfat ausgefällt, zentrifugiert und dann in einem Puffermedluni wird aufgelöst. Wenn die Kettenfraktion ausgefällt wleoet, bleibt der größte Teil des Leupeptlns in der flüssigen Phase zurück. Die geringe Menge Leupeptin, die bei aer ausgefällten und wieder aufgelösten leichten (B) Kettenfraktion verbleibt, unterstützt Ihre Konservierung, wenn sie In flüssiger Phase gelagert wird, sie beeinträchtigt jedoch nicht ihre Aktivität, da sie bis zu einer vernachlässigbar geringen Konzentration verdünnt wird, wenn der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase (wie nachfolgend beschrieben) in den Bluistrom eines Patienten eingeführt wird.

Die leichte (B) Kettenfraktion wird komplex an Streptokinase gebunden, entweder In roher oder in gereinigter Form, Ihdem man die Materlallen in äqulmolarfin Mengenantellen miteinander mischt und dann die Mischung kurze Zelt Inkubiert. Ein äquimolarer Komplex aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase kann auch hergestellt werden aus einem Plasmln-Streploklnase-Komplex durch Reduzieren des Komplexes zur Aufspaltung der Disulfldblndungen In den Plasmlnmolekülen des Komplexes unter Bildung von schweren (A) Plasmin=Kettenfraktlonen und leichten (B) Plasmln-Kettenfraktlonen, die an die Streptokinase gebunden sind, und anschließende Alkylierung und Aufgeben des dabei erhaltenen Produktes auf eine chromatographische Kolonne, In welcher die schwere (Λ) Plasmln-Kettenfraktlon adsorbiert wird und aus der der Komplex aus der leichten (B) Plasniln-Kettenfraktlon und Streptokinase eluiert wird, der ohne Adsorption die Kolonne durchlauft. Im letzteren Falle Ist die Verwendung von Leupep-

tin oder anderer reversibler Serinprotease-Aktivitätszentrum-Infiibltoren nicht erforderlich, da die Streptokinase die gleiche Funktion erfüllt und den Aktivitätsverlust In der ieichten (B) Kettenfraktion während der Reduktion der Piasminstruktur und während der Trennstufen verhindert.

Die wie vorstehend angegeben hergestellte leicht (B) Plasmin-Kettenfraktlon weist eine viel geringere proteolytische Aktivität auf als das Plasmin, aus dem sie abgeleitet ist, die Im allgemeinen weniger als etwa 5%, bezogen auf die Molmenge, und weniger als etwa 15%, bezogen auf das Gewicht, beträgt. In der Regel hat die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion eine proteolytische Aktivität, gemessen auf einem Caseinsubstrat, von etwa 2 bis etwa 3 CTA-Elnhelten/mg Protein. Bei den CTA-Einheiten handelt es sich um Siandard-Aktlvitäiseinheiten, die von dem Committee on Thrombolytic Agents (National Heart and Lung Institute) und von der World Health Organization angewendet werden und in Johnson et al.. »Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica«, Band 21, Seiten 259 bis 272 (1969), beschrieben sind.

Der Komplex aus der leichten (B) Plarmin-Kjttenfraktlon und Streptokinase, der, wie vorstehend angegeben, aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, hat eine viel geringere proteolytische Aktivltat als der Plasmin-Streptokinase-Komplex, aus dem er abgeleitet Ist, die im allgemeinen weniger als etwa 20%, bezogen auf das Molverhältnis, und weniger als etwa 35%, bezogen auf das Gewicht, beträgt. In der Regel hat der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden ist, eine proteolytische Aktivität, gemessen auf einem Caseinsubstrat, von etwa 2 bis etwa 3.5 CTA-Einhelten/mg Protein. Der aus Streptokinase und einer leichten (B) Kettenfraktion, wie vorstehend angegeben, hergestellte Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hat eine proteolytische Aktivität, die etwa in der gleichen Größenordnung liegt wie diejenige des aus einem Plasmfn-StreptoHnase-Komplex hergestellten Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellten Komplexes.

Der Komplex aus der Ieichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, der wie vorstehend angegeben aus dem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden t?t, hat in der Regel eine C.inder-Plasminogen-Aktlvatoraktlvität, die etwa 1,6 bis etwa 1,8 Mal so groß Ist, bezogen auf das Gewicht, wie diejenige des Plasmln-Streptokinase-Komplexes. aus dem er hergestellt ist. Die Rinder-PIasmlnogei; Aktivität des Komplexes aus der 3» leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase, bezogen auf d« Molverhältnis, ist etwa 0,8 bis etwa 1.0 mal so grcß wie diejenige des Plasmln-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. In der Regel betragen die Werte für die Rlnder-Plasmlnogen-AktivatQraktivität der >> Komplexe aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase, die aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellt worden sind, gemessen auf einem Caseinsubstrat, etwa 3 bis etwa 4 CTA-Elnhelten/ng Protein. ho

Die Rlnder-Piasminogen-Aktivatoraktivität des aus Streptokinase und einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon wie vorstehend angegeben hergestellten Komplexes aus der leichten (B) Plasmin Kettenfraktlon und Streptokinase betrag! etwa 0.70 bis etwa 0.75 der Aktivität des ^hl aus einem Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus eine leichte·¹'. (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase.

Die Humanplasmlnogen-Aktivatoraktivität des aus dem wie vorstehend angegebenen Plasmin-Streptokinase-Komplex hergestellten Komplexes aus einer leichien (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase beträgt im allgemeinen etwa das 1,8- bis etwa 2,2fache der Aktivität, bezogen auf das Gewicht, des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Die Humap-plasminogen-Aktivatoraktivität des aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellten Komplexes beträgt, bezogen auf das Molverhältnis, etwa das 1,0- bis etwa l,2fache der Aktivität des Plasmin-Streptokinase-Komplexes, aus dem er hergestellt ist. Typische Werte für die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, gemessen auf einem Caseinsubstrat, betragen etwa 8 bis etwa 12 CTA-Einheiten/^g Protein. Die Humanplasminogen-Aktlvatoraktivitätswerte für aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase hergestellte Komplexe aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase betragen etwa das 0,9- bis etw<i l,0fache der Werte des aus einem Plasmin-Streptoklnase-ivomplex hergestellten Komplexes aus einer leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase. Die wesentlich höhere Humanplasminogen-Aktlvatoraktivität des Komplexes aus der leichten (ü) Plasmin-Kettenfraktion und Streptokinase, bezogen auf das Gewicht, im Vergleich zu der Aktivität des Plasmin-Streptoklnase-Komplexes ermöglicht die Anwendung von niedrigeren Intravenäsen Dosen des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase zur Erzielung einer gewünschten flbrlnolytischen Wirkung Im Vergleich zu dem Plasmin-Streptokinase-Komplex.

In vltro-Tests haben außerdem gezeigt, daß der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase wesentlich wirksamer ist als der Plasmin-Streptokinase-Komplex in bezug auf die Verminderung oder Auflösung von Blutgerinnsel selbst bei Dosen, die im Hinblick auf die Humanplasmlnogen-Akxlvatoraklivltat miteinander vergleichbar sind. Ohne an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß diese verbesserte Wirksamkeit auf die geringe MoIekülgröße des Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase im Vergleich zu dem Plasmin-Streptokinase-Komplex und demzufolge auf das bessere Eindringvermögen der kleineren Moleküle In und die bessere Wirkung auf das Innere einer Blutgerinnselstruktur zurückzuführen Ist.

Wenn es erwünscht Ist. sicherzustellen, daß In der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktion gemäß einem Aspekt der Ε,-flndung oder In dem Komplex aus der leichten (B) Plasrnln-Kettenfraktlon und Streploklnase keine Virenverunreinigungen enthalten sind, wird das Flasminogen-Ausgangsmaterlal vor der Umwandlung In Plasmin oder vor der Komplexbildung mit Streptokinase wärmebehandelt, um Irgendwelche Virenverunreinigungen zu Inaktivleren. Eine Standard-Wärmebehandlung, die von der Food and Drug Administration, wie oben erläutert, gefedert wird, besteht darin, das Plasminogen mindestens 10 Stunden lang bei einer Temperatur von mindestens 60' C zu halten. Es wurde gefunden, daß die leichte (B) Plasmin-Kettenfraktlon g'jma'ß einem Aspekt der Erfindung und der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase Ihre jeweiligen Aktivitäten au.-h dann im wesentlichen vollständig behalten, wenn die jeweiligen Produkte aus wärmebehandeltem Plasminogen als Ausgangsmaterial hergestellt werden

Natrluniphosphaipufler oluicri I)Ie Elution wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit μ>π 60 ml/Sliiiule durchgeführt und Volumenfraktionen von 3 ml wurden getrennt gesammelt. Die leichte (U) Kettenfraktlon passierte die Kolonne ohne Adsorption und sie wurde durch Exlinktionsmessungen bei 2SO nm nachgewiesen. Wenn der Extinktionswert auf 0 zurückkehrte, wurden die leichte (B) Kettenfraktlon enthaltenden Fraktionen miteinander vereinigt und zur Ausfüllung der leichten (B) Kettenfraktlon wurden 3.1 g Ammoniumsulfat/IO ml bei " 0 C zugegeben, wobei das nicht ausgefüllte Leupeplln In der flüssigen Phase zurückblieb. Die miteinander vereinigten Ammonlumsulfat enthallenden Fraktionen wurden über Nacht bei 4 C stehen gelassen, um eine vollstandige Ausfüllung der leichten (B) Kettenfraktlon /u¹'¹ gewahrleisten, und der Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugleren bei 6000 IJpM für einen Zeltraum von 1 Stunde bei 2 C entfernt. Der Niederschlag aus der Wenn ein Plasmln-Streptoklnase-Komplex aus einem wärmebehandelten Plasminogen-Ausgangsmater la I hergestellt wird, behült er ebenfalls Im wesentlichen seine gesamte Aktivität. Unter der F.lnwlrkung der Wilrme auf ilai Plasmlnogenniulekül verändert sich jedoch seine Struktur oder es wird denaturiert In einer Reihe von Zentren und das verhältnismäßig grolle PlasmlnmolekUl. das davon abgeleitet Ist. wird ebenfalls im wesentlichen denaturiert, wodurch es selbst und seine Komplexe antigen und pyrogen gemacht werden, wenn es In den Blutstrom eines Patienten eingeführt wird.

Wenn das aus warmebehandeltem Plasminogen hergestellte Plasmin reduziert und In eine schwere (A) Kettenfraktion und In eine leichte (B) Kettenfraktlon aufgespalten wird, wird die schwere (A) Kettenfraktlon verworfen, wobei viele der denaturierten Zentren, die sich In der schweren (A) Kettenfraktion befinden, ebenfalls verworfen werden, so daß eine native leichte (B) Kettenfraktlon

von 10 mg/ml (f:|'_in, = 16) In einem wäßrigen Puffernie- ■'" dium gelöst ähnlich demjenigen, wie es anfänglich zum Auflösen des Plasmlns verwendet worden war. Die leichte (B) Kettenfraktlon wurde bei Istündigem Zentrifugieren bei 2 C mit 3000 ΓρΜ klar und sie wurde bei -20 C aufbewahrt.

Beispiel 2

Herstellung eines Komplexes aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase aus der leichten

(B) Kettenfraklion

Ein äquimolarer Komplex aus der leichten (B) Plasmln-Kettenfrakllon und Streptokinase wuriie hergestellt durch Zugabe von 0.5 m! StreptoHnase (32 mg/ml) zu t" 0.9 ml der in Bespiel ; tiergestellten leichten (B) Kettenfraktion. Der äquimolare Komplex wurde 10 Minuten lang bei 25 C inkubiert und dann bei -20 C aufbewahrt. In der Regel hatte der so hergestellte äquimolare Komplex eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsub- *<* strat von 2.3 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytlschen Aktivität von 11.6 CTA-Einheiten/mg Protein des aus dem Ausgangsplasmin hergestellten äquimolaren Slreptoklnasekomplexes.

Typische Rinder-Plasmlnogen-Aktivatoraktivitätswerte -"> für den äquimolaren Komplex des Beispiels 2 auf einem Caseinsubstrat waren 2.6 CTA-Einhelten/ug Protein im Vergleich zu 2.1 CTA-Einheiten/ug Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin. Typische Werte für die Humanplasmino- v> gen-Aktivatoraktivität des äquimolaren Komplexes des Beispiels 2 auf einem Caseinsubstrat waren 9.3 CTA-Elnheiten/|ig Protein im Vergleich zu 4.9 CTA-Einhelten/ug Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

Der äquimolare Komplex des Beispiels 2 kann in der

In der Regel hatte die so erhaltene leichte (B) Plasmin-Kettenfrakiion eine proteolytische Aktivität auf einem Caseinsubstrat von 2.6 CTA-Einheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von '■' 27.2 CTA-Einheiten/mg Protein für das Plasmin, aus dem die leichte (B) Kettenfraktion stammte.

In der Regel kann die auf diese Weise erhaltene leichte (B) Plasmin-Kettenfraktion 0.09 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein einarbeiten im -⁵ Vergleich zu dem Ausgangs-Plasmin. das 0.95 Moi pro Mo! Protein einarbeiten kann.

pyrogen sein kann als das gesamte denaturierte Plasmin. In entsprechender Welse können Komplexe mit einer solchen leichten (B) Plasmln-Kettenfraktlon, wie z. B. Streptoklnase-Komplexe, wesentlich weniger antigen und weniger pyrogen sein als ähnliche Komplexe aus dem gesamten denaturierten Plasmin.

Fs hat sich als nicht notwendig erwiesen, stark gereinigte Streptokinase zu verwenden, da auch rohe Streptoklnasefrakti; .,-un zur Herstellung der Komplexe verwendet werden können.

Die Kiipplupgsreak'ion der Streptokinase mit der leichten ι B) Plasmin-Kettenfraktlon oder mit dem Ci-; .:mtplasmln dient dazu, die Strepioklnase von den In ihrer rohen Form damit verbundenen Verunreinigungen zu trennen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
Herstellung der leichten (B) Kettenfraktlon

150 mg Leupeptln wurden zu 10 ml Humanplasmln (25 bis 30 CTA-Elnhelten/mg Protein), gelöst In einem wäßrigen Puffermedium aus 25% Glycerin, 0,04 Mol/l trls-(Hydroxymethyl)-amlnomethan (nachfolgend abgekürzt mit »Trls«), 0,02 Mol/l Lysin und 0,08 Mol Liter Natriumchlorid bei pH 9 und bei einer Konzentration von 5 mg/ml Protein zugegeben. Das Plasmin war aus wärmebehandeltem Humanplasmlnogen, wie nachfolgend angegeben, hergestellt worden. Während der Zugabe des Leupeptins wurde die Piasminlösung In einem Eisbad von 0" C gehalten und die Endkonzentration des Leuptptins in der Lösung betrug 0,04 Mol/l.

Zu dieser Plasmin-Leupeptin-Mischung wurden 0.072 ml konzentriertes 2-Mercaptoäthanol (Endkonzentration 0.1 M) zugegeben und die Plasmin-Leupeptin-Mischung wurde 20 Minuten lang reduziert, während sie in einem Wasserbad von 20⁼ C gehalten wurde. Das reduzierte Plasmin wurde dann in ein Eisbad von 0° C gebracht und es wurden 0,29 ml 4-M-Natrlumjodacetat zugegeben, um die beim Aufbrechen der Dlsulfldbindungen in den Plasmlnmolekülen während der Reduktionsreaktion gebildeten Sulfhydrylgruppen zu alkylieren. Die Alkylierungsreaktion wurde 30 Minuten lang bei 0° C ablaufen gelassen. Das reduzierte und alkyllerte Plasmin wurde dann über eine L-Lysin-substltuierte Sepharose-Koionne il χ 20 cm) laufen gelassen, äquillbrleit und bei einem üH-Wert von ~A und bei 2° C mit einem 0.1 M

Regel 0,50 Mol irlllictes Diisopropvlphosphorfhioridat pro Mol Protein einarbeiten Im Vergleich /u einem von 0.90 Mol pro Mol Protein für einen ilqulmolaren Komplex aus Slreploklnase und dem Ausgangsplasmln.

Beispiel 3

Herstellung eines Komplexes aus einer leichten (B) Plasmln-Kettenfraktlon und Streptokinase aus dem Plasmln-

Streptoklnase-Konnilcx '"

Wärmebehandelles llumanplasminogen (25 bis 30 C'TA-Elnhellen/mg Protein) wurde in einem wäßrigen Puffcrmdium gelöst, das 0.05 Mol pro Liter Iris. 0,02 Mol pro Liter Lysin und 0,1 Mol pro Liter Natrlumchlo- , rid enthielt und einen pH-Wert von 9 aufwies, bis /u einer Konzentration von 22 mg Proteln/ml. Zu 3 ml der obengenannten PlasmlnogenliVsung wurden In einem

..tr» Λ /" I

ι) Ct .-.-.»tnl* Ir*..*·»

K)

Beispiel 4

Wärmebehandlung von Plasminogen

In Beispiel I wurde das Ausgangsplasniin als »aus einem wärmebehandelten llumanplasminogen hergestellt'! bezeichnet und In Beispiel 3 wurde das Atisgangsplasnilnogen als »warmebehandelt« bezeichnet.

In jedem !'alle wurde llumanplasminogen bei einer Konzentration von 20 mg/ml In einem 0,05 M Tris-0.02 M Lysin- 0,1 M NaCI-Puffer bei einem pH-Wert von 9.0 mit 1 η IICI bei 0 C auf pH 3.0 eingestellt, dann bei einem pH-Wert von 3,0 gegen einen 0,15 M (Jlycln-0,001 M HCI-Pufter gründlich dlalysierl. Nach der Dialyse wurde die Proteinlösung mit dem 0,15 M Glyein-0.001 M HCI-Puffer bis auf eine Endkonzentration von 1 mg Protein pro ml verdünnt und in einem mit einem Stopfen verschlossenen Kolben 10 Stunden lang in einem Wasserbad von 60 C erhitzt. Das Plasminogen wurde /j...»r> ir» £jn£m [^uK:*it i>b"ek'jhU und durch Zü"übe von

ten/nig Protein) In einer Konzentration von 32 mg Pro- ,,, tein/ml in einem 0,067 M Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 zugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang in einem Wasserbad von 25 C Inkubiert, um den Komplex sich In einem Plasmin-Streptoklnase-Komplex umwandeln zu lassen. Der Komplex ,-wurde dann in einem Eisbad von 0' C gekühlt und durch Zugabe von 8 ml der In Beispiel I beschriebenen 25%igen ülycerln-Pufferlösung auf 12 ml verdünnt.

Zu 12 ml des Plasmin-Streptoklnasekomplexes. der oben hergestellt worden war, wurden 0,07 ml konzentr.jrtes 2-Mercaptoüthanol bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben. Der Komplex wurde 20 Minuten lang in einem Wasserbad von 20" C reduziert, dann auf 0 C abgekühlt und alkyllert durch Zugabe von 0.35 ml 4 M Natriumjodacetat. Nach 30mlnütigem Stehenlassen j-, bei 0° C wurde der reduzierte und alkylierte Slreptokinase-Komplex über eine L-Lysin-substitulerte Sepharose-Kolonne (1 χ 20 cm) auf die in Beispiel I für das reduzierte und alkyllerte Plasmin beschriebene Welse laufen gelassen. Der Komplex aus der leichten (B) Kettenfraktion und Streptokinase passierte ohne Adsorption die Kolonne und er wurde nachgewiesen, gesammelt, ausgefüllt, zentrifugiert, gelöst und geklärt wie die leichte (B) Kettenfraktion in Beispiel 1.

In der Regel hatte der Komplex aus der leichten (B) Plasmin-Kettenfraktlon und Streptokinase in Beispiel 3 eine proteolytische Aktivität auf einem Caselnsubstrat von 2,9 CTA-Elnheiten/mg Protein im Vergleich zu einer proteolytischen Aktivität von 11,6 CTA-Einhelten/mg Protein für den äquimolaren Komplex aus Streptokinase und dem Ausgangsplasmin. Die typischen RInder-Plasminogenaktivatoraktivitätswerte für den Komplex des Beispiels 3 auf einem Caselnsubstrat betrugen 3,6 CTA-Einheiten/ug Protein oder 237 CTA-Einheiten/n Mol Protein im Vergleich zu 2,1 CTA-Einheiten/ng Protein oder 264 CTA-Einheiten/n Mol Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin. Typische Werte für die Humanplasminogen-Aktivatoraktivität des Komplexes des Beispiels 3 auf einem Caseinsubstrat waren 10.0 CTA-Einheiten/ug Protein im Vergleich zu 4,9 CTA-Einheiten/ug Protein für den äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

In der Regel kann der Komplex des Beispiels 3 0,70 Mol tritiiertes Diisopropylphosphorfluoridat pro Mol Protein aufnehmen im Vergleich zu einem Wert von 0,90 MoI pro MoI Protein für einen äquimolaren Komplex von Streptokinase mit dem Ausgangsplasmin.

festem Amr.ionlumsulfat (3.1g/10 ml Lösung) ausgefällt. Das wärmebehandelte Plasminogen wurde durch 1 stündiges Zentrifugleren bei 6000 LJpM abgetrennt und der Niederschlag wurde aufgelöst zur Erzielung einer Konzentration von 10 mg/ml In dem 0,05 M Trls-0,02 M l.ysln-0,10 M NaCI-Puffer bei einem pH-Wert von 9,0. Das wiirmebehandelte Plasminogenkonzentrat wurde durch Istündiges Zentrifugieren bei 3000 UpM geklitrt und das unlösliche Protein wurde entfernt und verworfen. Das Plasminogen wurde unter Verwendung einer chromatographlschen L-Lysln-substitulerten Sepharose-M'flnitiits-Kolonne weiter gereinigt und nach dem EIuieren mit /.--Aminocapronsäure wurde es unter Anwendung der Ammonlumsulfat-Ausfiillungsmetho Ie abgetrennt. Nach der Wärmebehandlung wurden eiwa 74% des Ausgangsproteins und etwa 73% der anfänglichen proteolytischen Aktivität zurückgewonnen, wobei fast keine Änderung der spezifischen Aktivität des Plasminogens auftrat.

Es braucht nicht erwähnt zu werden, daß die vorstehend beschriebenen Beispiele auch in einer für den Fachmann ohne weiteres ersichtlichen Weise abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird. So können beispielsweise anstelle von Leupeptin andere reversible Serlnprotease-Aktlvltätszentren-Inhlbltoren, wie Benzamldin und seine Derivate, verwendet werden. Der Serinprotease-Aktlvitätszentren-Inhibitor wird vorzugsweise in einer Konzentration verwendet, die ausreicht, um eine etwa 90%lge Plasmln-lnhiblerung zu erzielen. Bei Verwendung von Benzamidin als Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhlbltor sind die proteolytischen Aktivitäten der leichten (B) Kettenfraktion und ihres Streptokinase-Komplexes nicht so niedrig wie diejenigen der unter Verwendung eines Leupeptin-Inhibitors hergestellten Produkte, sie sind jedoch niedriger als diejenigen des Komplexes aus Streptokinase und dem vollständigen Plasmin. Die Plasminogenaktivatoraktivität ist auch höher für die unter Verwendung von Benzamidin als Serinprotease-Aktivitätszentren-Inhibitor hergestellten Produkte um bis zu etwa 8 CTA-Einheiten/ug Protein für die Rinder-Plasminogenaktivatoraktivität oder bis zu etwa 25 CTA-Einheiten^g Protein für die Humanplasminogenaktivatoraktivität.

Anstelle von 2-Mercaptoäthanol können auch andere Reduktionsmittel, wie Dithioerythrit oder Dlthiothreit, verwendet werden, um die Disuifidbrücken in den Plasminmolekülen aufzuspalten. Als Alkylierungsmittel kann Natriumjodacetat verwendet werden, wie in den

Beispielen 1 und 3 angegeben, es kann aber auch Jodacetamkl oder Irgendein anderes Alkylierungsmlltel verwendet werden, von dem bekannt ist, daß es eine Schutzgruppe für eine IYeIe Sullhydrylgruppe liefert.

Das Plasminogen-Ausgangsmaterlal braucht nicht rein -, /u sein. Hs können auch ruhe Präparate, die Plasmalraktionen enthalten oder sogar vollständiges Plasma enthalten, verwendet werfen, da während der weiteren Verarbeitung des Materials eine Reinigung erfolgt. Anstelle von L-Lysin-substlluierter Sepharose können In der chro- ],, matographlschen Affinitätskolonne auch andere selektive Adsorbentlen, wie /. H. L-Lysin-substiluiertes Polyacrylamid oder L-Lysin-substltuierte Agarose sowie durch L-Arglnln oder D-Lysln substituierte Sepharose, Polyacrylamid oder Agarose verwendet werden. Die chromalo- ι -, graphische Trennung kann gewünschtenfalls auch unter Anwendung eines diskontinuierlichen Verfahrens anstatt In einer Kolonne durchgeführt werden.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf den iiqulmolaren Komplex aus der leichten :v. (B) Plasmlnkettenfraktion und Streptokinase näher erläutert, es 1st jedoch für den Fachmann selbstverständlich, dall die leichte (B) Plasmln-Kettenfraktlon auch brauchbare Komplexe bildet mit allen anderen Substanzen, die äqulmolare Komplexe mit llumanplasminogen bilden, y, unter Erzeugung eines Aktivators, wie z. B. Slaphyloklnase. Solche Komplexe werden aul die vorstehend für die Komplexe mit Strepokinase beschriebene Welse hergestellt uihI sie sind ebenso wertvoll wegen Ihrer flbrlnolytischen Aktivität.

Die iiquimolaren Komplexe werden, wenn sie wegen ihrer Mbrinolyllschen Wirkung an einen Patienten verabreicht werden, am besten intravenös verabreicht. Sie können allmählich (portionsweise) über einen längeren Zeitraum in einer In einer physiologischen Glukose-Knchsal/-Lösung verdünnten F^;orm verabreicht werden oder sie können In einer konzentrlerteren Form, gelöst In einer physiologischen Glukose-Koehsalz-Lösung, verabreicht werden, entweder allein oder In Mischung mit anderen Materlallen, wie z. B. Ilumanalbumln. Die Dosen können In Abhängigkeit von dem Zustand des Patienten variieren und sie liegen Im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 1,0 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Die Komplexe können In flüssiger Form In Ampullen in tonn einer Lösung In einer physiologischen Glükosc-Kochsalzlösung oder In einer Albumin enthaltenden Kochsalzlösung abgepackt sein. Sie können auch In trokkener Form als Pulver In Mischung mit Humanalbumin, hergestellt durch Lyophillslcren einer Lösung des Komplexes mit Albumin, abgepackt sein.

Claims

. Patentansprüche:

1. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein aktives Serin- -protease-Zentrum enthält, daß sie an den Sulfhydrylgruppen, die durch Reduktion der Dlsulfldbindungen zu der schweren (A) Kettenfraktion entstanden sind, alkyliert ist und daß sie eine geringere proteolytische Aktivität als das Stammplasmln, bezogen auf eine äquimolare Basis, aufweist.

2. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Humanplasmln hergestellt worden ist.

3. Leichte (B) Kettenfraktion von Plasmin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Humanplasmln aus Plasminogen hergestellt worden ist, das man 10 Stunden lang auf 60° C erhitzt hat.

4. Verfahren zur Herstellung der leichten (B) Kettenfraktion von Plasmin nach Anspruch 1, wobei man die Piasminmoleküle an den Disulfidbindungen zwischen den Ketten unter Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und leichte (B) Kettenfraktionen enthält, reduziert und anschließend die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt, dadurch gekennzeichnet, daß man (1) das Plasmin mit einem reversiblen Serlnproteasezentrum-Inhibllor mischt, (2) die Plasmlnmoleküle in der Mischung an den Disulfidbindungen zwischen den Ketten unter Bildung eines Gemisches, das schwere (A) und leichte (B) Kettenfraktionen enthält, reduziert. (3) die während der Reduktionsreaktion gebildeten Sulfhydrylgruppen alkyliert und (4) die leichte (B) Kettenfraktion von der schweren (A) Kettenfraktion trennt.

5. Verfahren nach Anspruch 4 zur Herstellung der _3ä leichten (B) Kettenfraktion von Plasmin des Anspruchs 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Plasmin Humanplasmin einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5 zur Herstellung der leichten (B) Kettenfraktion von ■ Plasmin des Anspruchs 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Humanplasmln einsetzt, das aus Plasminogen hergestellt worden Ist, welches man 10 Stunden lang auf 60° C erhitzt hat.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumproteinasezentrum-Inhlbitor Leupeptln oder Benzamidin einsetzt.