JPH03505531A - 活性型プロテインｃの調製方法及びそれによって得られた活性型プロテインｃ溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ”活性型プロティンＣの調製方法及びそれによって得られた活性型プロティンＣ 溶ン夜” 本発明は活性型プロティンＣ（ＡＰＣ）の調整方法に関する。

プロティンＣは、その活性型がセリンプロテアーゼである血漿糖タンパク買であ る（１．２）。

ヒトのプロティンＣは、ジスルフィド結合でつながれた二つの、＆ＲＣ活性部位 を有する分子量４１．０００のＨ！ｊｌと分子量２１．０００のＬ鏡）からなる 分子量６２，０００のタンパク質である（２）、その血漿濃度は３−５ｍｇ／ｌ である。

他のタンパク質特に血漿タンパク質と同様に、このタンパク質はビタミンに依存 性因子である。それは前駆体の形で肝臓によって合成される。ＬＭの最初の１１ 個のグルタミン酸は、補因子としてビタミンＫを有する肝カルボキシラーゼによ って、γ位炭素にカルボキシル基を付加される（３）。これらのγ−カルボキシ グルタミン酸残基は、カルシウムイオンとの相互作用に関与している（４）。

リン脂質は負に荷電しているので、カルシウムは、これらの化合物とビタミンに 依存性因子の適切な部分との間にイオン結合を生じさせる。し顧は、更に、これ もまたＣａ”との相互作用に関与していると思えるβ−ヒドロキシアスパラギン 酸残基を持っている。

ＨｌｊｌのＮ末端部分のドデカペプチドの開裂によって、このプロ酵素は活性型 プロティンｃ　（ＡＰＣ）に変換される（２）、微小循環内で起こるこの反応は 、カルシウムの存在下で、トロンビンと内皮細胞の表面に位置するタンパク質で あるトロンボモジュリンとの間で形成される化学量論的に１対１の複合体によっ て活性化される（５）。

活性型は、凝血カスケード補因子Ｖ及び■を限定加水分解して、不活性化するこ とによって、抗凝血作用を有する（６）、この活性型酵素は、組織プラスミノゲ ン活性化因子阻害物質を活性化することによってフィブリン溶解を増強するとも 思える。

ＡＰＣは、補因子、プロティンＳ、リン脂質、及びカルシウムの存在下でのみ充 分にその活性を発揮する。プロティンＳもまたビタミンに依存性血漿糖タンパク 貿であるいプロティンＳは分子ｚ７５．ｏｃｏのａａタンパク質てあり、その血 漿濃度は２５ｍｇ／ｎである。プロティンＳは、その５０％が遊離した形でそし てその５０％が補体系のタンパク質であるｒＣ４結合タンパク質Ｊ　　（Ｃ４Ｂ Ｐ）との非共有結合性複合体の形で循環する（７）、プロティンＳがＣ４ＢＰと 結合している場合には、プロティンＳは補因子として働くことができない（７） 。

他のビタミンに依存性酵素とは対照的に、プロティンＣは抗凝血性である。

先天性と後天性のプロティンＣ欠乏症が知られている。この場合には、ＡＴＩＩ ！（アンチトロンビンＩＩ＋　＞欠乏症の場合と同じように、血栓性偶発症候が 繰り返される傾向が観察される。

酵素とプロ酵素を治療に用いるのが有利である。この様にプロティンＣ欠乏症の 治療に、特に激症紫斑病のホモ結合性新生児でプロティンＣを使ってもよい。

このしばしば致命的な病気は、プロティンＣに冨む血漿濃縮物での治療を必要と するかなりの血栓症の随伴を特徴とする。ホモ接合状態は軽度乃至は重度の血栓 症エピソードに至ることがあり、或いは全く無症候性である場合もあるやプロテ ィンＣと活性型プロティンＣのいずれも、静脈血栓症と動脈性血栓症、肺蟇栓症 と大脳塞栓症と心臓塞栓症、ＣＩＶＤおよび敗血症性ショックの予防と治療に用 いてもよい。

活性型プロティンＣは、動脈または静脈の血栓症や手術や静脈炎でそして心筋後 塵の再閉塞の場合に、それらの副作用を引き起こすことないので、伝統的な抗凝 血剤（特にヘパリン）の代りに、用いてもよい。

ある種のビタミンに依存性因子の間には、特に第■因子と第Ｘ因子と第Ｘ因子と プロティンＣの間には注目すべき構造的な相同が存在する。更に、それらは、非 常に似た分子量（各々、５６，０００と５７．０００と５９．０００と６２，０ ００）を持っている。

これらの分子的特徴の類似は、従って、これらの異なる因子を単離することを難 しくする。

本発明の目的は、具体的に言うと、この障害を克服し様々な程度にプロティンＣ に冨む血液画分から迅速に活性型プロティンＣを得ることを可能にする方法を提 案することである。

動物から得られる５８個のアミノ酸から成るポリペプチドであるアプロチニンが 、ＡＰＣを阻害することが、発明者によって事実上証明された。この相互作用は 可逆的であるので、不溶化されたアプロチニンを使ってＡＰＣを精製することが できた。

更に具体的に述べると、本発明は、活性型プロティンＣを不溶化されたアプロチ ニンに吸着させた後に、緩衝化された食塩液でＡＰＣ／アプロチニン複合体を洗 浄し、酸性水溶液またはカオトロピック剤の溶液を使っての溶離によって、活性 型プロティンＣを採取することを特徴とする、該活性プロティンを含有する出発 材料から該活性型プロティンＣを調製する方法に関する。

様々な採取源から得られるものをプロティンＣ含有出発材料として使用すること ができる。血液分画技術によって得られる様々な画分をこれらの出発材料として 使用することができ、例えば、いわゆるＰＰ５Ｂ画分、即ちＰＰ５Ｂ前溶出液（ ＰＰＳＢ　　ｐｒｅ−ｅｌｕａｔｅ）等の画分、エタノール分画時に得られる画 分や、前精製または例えばヨーロッパ特許番号１３８，２２２に記載されている 免疫精製によって得られる両分や、例えばブリティッシュ・ジャーナル・オヴ・ ヒーモトロオジ仁１９８８．７０．４３６−４４０（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１９８８．７０゜４３６−４４０）に 記載されているプロティンＣに富む画分を出発材料として使用することができる 。

本発明の特別な実施例によると、出発材料はプロトロンビン複合体を含有する濃 縮物である。この濃縮物中に存在するプロティンＣは、カルシウムを添加するこ とによって該出発材料中に生じるトロンビンによって濃縮物中で活性化され、こ のカルシウムは、濃縮物中で生じるトロンビンによるプロティンＣの活性化を容 認するために、その後除去される。この場合には、カルシウムは、１０ｍＭから １００ｍＭの濃度で出発材料に添加され、その後に透析または透析ろ過によって 出発材料から除去される。

ＡＰＣの結合は７と９の間のｐＨで、一般的に８乃至８．４の至適ｐＨで、０． ４ＭＮａＣ１を越えない適当なイオン強度で、より好ましくは０．２５Ｍ　Ｎ　 ａ　Ｃ１よりも小さいイオン強度で行われるのが好ましい。

それによってアプロチニンとＡＰＣとの間に形成される複合体は、食塩水での前 溶離にかけてもＡＰＣが分離されないに充分なだけ安定である。

ＡＰＣを溶離するためには、複合体を解離させる溶離条件、特にｐＨの極値、特 に１と３の間のｐＨ値が採用されるへきである。ＫＳＣＮやＮａ５ＣＮ等のカオ トロピック剤を含有する溶液を使っての溶離によって、活性型プロティンＣを採 取してもよい。カオトロピック剤はその後に透析によりて除去されることになる 。

この複合体生成反応は非常に特異的であり、溶離された生成物は、第１■因子。

第■因子、第■因子及び第Ｘ因子を含まないが、これは出発材料がＰＰ５Ｂ画分 である場合のことであり、収率は非常に満足のゆくものである。

上述した通り、処理された画分は活性型プロティンＣを含んでいなければならず 、トロンビンを使ったり、ヘビ毒から抽出されたプロティンＣに特異的な賦活物 質を使ったり、あるいはヘビ毒の代りにトロンビンとトロンボモジュリンとから 成る天然賦活物質を使ったりして、様々な方法でこの活性化を行ってもよい。

活性型プロティンＣをすでに含有する画分も有り、その場合には、活性化は明ら かに不必要だろう。

下記の実施例は、本発明の他の利点と特徴を明示するためのものである。

嶌施優工： この実施例に使用される出発材料は免疫精製によって得られるプロティンＣであ る。

プロティンＣ免疫精製： 臭化シアンで活性化されたセファロース４Ｂ（ファルマシア）上で不溶化された 抗プロティンＣ単りローン性抗体の詰められたカラムに、プロティンＣに冨む血 漿小画分を吸着させる。用いられる単クローン性抗体はプロティンＣを認識する がＡＰＣを認識しない。

５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）と０．５ＭＮａＣ１を使って前？８１１ｉ を行う、溶離は、３Ｍチオシアン酸カリウム溶液を使って実施される。得られた 溶出液を、濃縮し、ｐＨ８に緩衝化された７５ｍＭＮａＣ＋を使って透析する。

その結果プロティンＣの溶液が得られ、他に対する抗原の濃度比とＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ電気泳動の両方が、高度の精製が行われたことを示す。

既知の賦活物質、即ちトロンビン／トロンボモジュリン、トロンビン、まむし毒 およびラッセルのクサリヘビ毒、のうちの一つを使ってプロ酵素を活性化する。

これらの賦活物質は、溶液として画分に添加することもでき、あるいはまたはマ ド・リックスキで不溶化させることもできる。後者の場合には、活性化はバッチ 毎に実施されるかまたはカラム上で実施される。

５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）と７５ｍＭＮａＣ１で平衡化されたアプロ チニン−セファロース４Ｂ（ファルマシア）（１ｍｌのゲル当り５ｍｇのアプロ チニン）の詰められたカラム（ＩＸ５）上に、２ｍｌの活性化されて免疫精製さ れたプロティンＣを置く。

５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）と０．５ＭＮａＣ１を使って前溶離を実施 する。

０、ＩＮ塩酸緩ｆｆｉ液でｐＨを下げることによってＡＰＣを溶離させてから、 直ちにｐＨを８にもどす。

アミド分解活性と凝血活性の分析およびローレル抗プロティンＣ−次元免疫電気 泳動は、活性型プロティンＣが塩酸溶出液中にのみ見出されることを示す。

嶌施倒ス： この二番目の実施例に使用される出発物質はプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ） を含有する濃縮物である。このプレバレージョン中に含まれているプロティンＣ を、叉施信工と同じように賦活物質で活性化させる。

５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）と０．１５ＭＮａＣ１で平衡化されたアプ ロチニン−セファロース４Ｂ（ファルマシア）（１ｍｌのゲル当たり５ｍｇのア プロチニン）の詰められたカラム（ＩＸ５）上に、１００ｍ１の出発材料を置く 。

５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）と０．５ＭＮａＣ１を使って前溶離を行う 。

保持されなかった画分中または０．５ＭＮａＣｌ前ａｌＪｆ中には、活性型プロ ティンＣ活性は検出されない。

０、ＩＮ塩酸溶液でｐＨを下げることによって、マトリックス上に特異的に保持 されているＡＰＣを溶離する。ｐＨを直ちに８にもどす。

生物学的活性および電気泳動での反応と抗原性の両方の観点から、溶離された画 分はＡＰＣの特性を有する。使用されるテクニックは抗凝血活性とアミド分解活 性の分析、免疫学的同定、および還元剤を使用する又は使用しない５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ電気泳動である。

叉施伍互・ プロトロンビン複合体を含有する濃縮物のいわゆるＰＰ５Ｂ画分にカルシウム（ 最終濃度２５ｍＭ）を添加する。３０分乃至４時間おだやかに攪拌した後に、例 えば５０ｍＭトリス塩酸と０．１５ＭＮａＣｌを含有するｐＨ７，４の緩衝液に 対する透析または透析ろ過によってカルシウムを除去する。

引き続いて、室温または４℃で８乃至２４時間おだやかに攪拌してプロティンＣ の活性化を行う。

このようにして得られる両分を、活性型プロティンＣを生成するためにアプロチ ニン−セファロース上に置く。

活性型プロティンＣのこの生成は上記の方法に従って実施する。

多項文献 １）ステンフロ　Ｊ３．（１９７６）、ジャーナル　オン　バイオロジカル　ケ ミストリー　２５１　、　３５５−３６３　（Ｓｔｅｎｆｌｏ　Ｊ、、（１９７ ６）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５１．３２）ギジール　Ｗ、、（１９７９ ）、ジャーナル　オン　クリニカル　インベスティゲーション　６４．　７６１ −７６９　（Ｘｉｓｊｅｌ　Ｗ、、　（１９７９）　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、６４゜３）フェルランド　Ｐ、及びステンフロ　Ｊ、、（１９８２）、ジ ャーナル　オン　バイオロジカル　ケミストリー　２５７．　１２１７０−１２ １７９　（Ｆｅｒｌｕｎｄ　　Ｐ、　　ａｎｄ　　５ｔｅｎｆｌｏ　　Ｊ、、（ １９８２）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７．１２１７０−１２１７９）４） ネルセスツエン　Ｇ、　　Ｌ、　　キジール　Ｗ、及びディスキビオ　Ｒ，Ｇ、 　。

（１９７８）、バイオケミストリー１７．　２１３５−２１３８　（Ｎｅｌｓｅ ｓｔｕｅｎ　Ｇ、Ｌ、、　Ｋ１５ｉｅｌ　Ｗ、　ａｎｄＤｉ　５ｃｉｐｉｏ　Ｒ ，Ｇ、、　（＋９７８）　、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７．２１３４−２１ R８　） ５）エスモン　Ｃ，Ｔ、及びオーウエン　Ｗ、Ｇ、、（１９８１）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８．２２４９−２２５２　（Ｅｓｍｏ ｎＣ，Ｔ、ａｎｄ　Ｏｗｅｎ　Ｗ、Ｇ、、　（１９８１）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８．２２４９−２２５２）６）ウォーカー　 Ｐ、Ｊ、、セフストン　ｐ、　ｗ、およびエスモン　Ｃ，Ｔ、　。

（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　　５７１．３３ ３−３４２　　（Ｗａｌｋｅｒ　　Ｐｊ、、５ｅｘｔｏｎ　　Ｐ、Ｗ、　　ａｎ ｄ　　Ｅｓｍｏｎ　　Ｃ，Ｔ、、（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ@　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、八Ｃ ｔａ　５７１，３３３−３４２） ７）ダールベック　Ｂ、、（１９８６）　　ジャーナル　オン　バイオロジカル ケミストリー、　　２６１．　１２０２２−１２０２７　（Ｄａｈｌｂａｃｋ　 Ｂ、、（１９８６）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２ｔｉＸ、１２０２２−１２０２ ７　）国際調査報告 国際調査報告 ＦＲ９０００２５８ Ｓ＾　　　３６７１３

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）を不溶化されたアプロチニンに吸着させた後 に、緩衝化された食塩水でＡＰＣ／アプロチニン複合体を洗浄し、酸性水溶液ま たはカオトロピック剤の溶液を使っての溶離によって活性型プロテインＣを採取 することを特徴とする、該活性型プロテインＣを含有する出発材料から該活性型 プロテインＣを調製する方法。
2. ２．不溶化されたアプロチニンヘの活性型プロテインＣの結合が７と９の間のｐ Ｈ、好ましくは８と８．４の間のｐＨで実施されることを特徴とする、特許請求 の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．ｐＨが１と３の間の酸性水溶液を使っての溶離によって活性型プロテインＣ を採取することを特徴とする、特許請求の範囲第１または２項に記載の方法。
4. ４．好ましくはＫＳＣＮとＮａＳＣＮのうちから選ばれるカオトロピック剤を合 有する溶液での溶離によって活性型プロテインＣが採取され、該カオトロピック 剤がその後に透析によって除去されることを特徴とする、特許請求の範囲第１ま たは２項に記載の方法。
5. ５．活性型プロテインＣ／アプロチニン複合体の洗浄が一位の数字が８のｐＨを 有する緩衝化された食塩水を使って行われことを特徴とする、特許請求の範囲第 １乃至４項のうちのいずれかに記載の方法。
6. ６．アプロチニンが１ｍ１のゲル当たり０．５ｍｇの濃度でマトリックス上で不 溶化されることを特徴とする、特許請求の範囲第１乃至５項のうちいずれかに記 載の方法。
7. ７．前記活性型プロテインＣを含有する出発材料が活性化され免疫精製されたプ ロテインＣとプロテインＣ賦活物質で処理されたＰＰＳＢのうちから選ばれるこ とを特徴とする、特許請求の範囲第１乃至６項に記載の方法。
8. ８．出発材料がプロトロンビン複合体を含有する濃縮物であり、プロテインＣが カルシウムを添加することによって該出発材料中に生じるトロンビンによってそ の濃縮物中で活性化され、該トロンビンによるプロテインＣの活性化を許すため に該カルシウムがその後に除去されることを特徴とする、特許請求の範囲第１乃 至６項に記載の方法。
9. ９．カルシウムが１０ｍＭと１００ｍＭの間の濃度で出発材料に添加されること を特徴とする、特許請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．特許請求の範囲第１乃至９項のうちのいずれかの方法によって得られたこ とを特徴とする、活性型プロテインＣ溶液。