JPS61137822A - 血液凝固抑止性タンパク質 - Google Patents
血液凝固抑止性タンパク質Info
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- JPS61137822A JPS61137822A JP60208573A JP20857385A JPS61137822A JP S61137822 A JPS61137822 A JP S61137822A JP 60208573 A JP60208573 A JP 60208573A JP 20857385 A JP20857385 A JP 20857385A JP S61137822 A JPS61137822 A JP S61137822A
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- anticoagulant
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- A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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- Y10S530/829—Blood
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血液の凝固全抑止するタンパク質、これらのタ
ンパク質の製造方法およびそれらの使用に関する。
ンパク質の製造方法およびそれらの使用に関する。
大部分の補乳動物に存在する抗凝血性タンパク質は６１
＃に分けることができる。この分類はタンパク質の活性
メカニズムの違いにもとづいている。
＃に分けることができる。この分類はタンパク質の活性
メカニズムの違いにもとづいている。
１、 凝血因子と複合体を形成し、それによって凝血因
子を不活性にするタンパク質、これらを工人のタンパク
質全包含丁、る： ａ）抗）ロンげンＩ〔トロンボ・、リサーチ（Ｔｈｒｏ
ｍｂ、Ｒｅｇ、 ５．４５９〜４５２頁（１９７４年）
〕； ｂ）α、−プロテアーゼ抑止体〔アン、゛レビュー・。
子を不活性にするタンパク質、これらを工人のタンパク
質全包含丁、る： ａ）抗）ロンげンＩ〔トロンボ・、リサーチ（Ｔｈｒｏ
ｍｂ、Ｒｅｇ、 ５．４５９〜４５２頁（１９７４年）
〕； ｂ）α、−プロテアーゼ抑止体〔アン、゛レビュー・。
バイオケミストリイ（ムｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、） ５−２％６５５〜７０９頁（１９Ｂ５年）〕； Ｃ）α２−のマクログロブリン〔アン；レビュー。
、） ５−２％６５５〜７０９頁（１９Ｂ５年）〕； Ｃ）α２−のマクログロブリン〔アン；レビュー。
バイオケミ＝５２．６５５〜７０９頁（１９８３年）〕
； ａ） ０１−抑止体〔バイオケミストリイ（Ｂｉｏ−ａ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ’Ｉ Ｑ、２７５８〜２７４り
１頁（１９８１年）〕； ｅ）プロテアーゼ ネキシン〔ジエイ、・パイオル・ケ
ミ、 （ｙ、Ｂｌｏｌ、ｃｈｅｍ、） ２５８．１０４
３９〜１０４４４頁（１９８３年）］。
； ａ） ０１−抑止体〔バイオケミストリイ（Ｂｉｏ−ａ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ’Ｉ Ｑ、２７５８〜２７４り
１頁（１９８１年）〕； ｅ）プロテアーゼ ネキシン〔ジエイ、・パイオル・ケ
ミ、 （ｙ、Ｂｌｏｌ、ｃｈｅｍ、） ２５８．１０４
３９〜１０４４４頁（１９８３年）］。
２６ 凝血因子をタンパク質加水分解的に切断し、そ
れによって凝血因子を不活性化するタンパク質。従来文
献に記載されているこの種の由−のタンパク質はプロテ
ィンＣである〔ジエイ、パイオル、ケミ、（ｙ、Ｂｌｏ
ｌ、ａｈｅｍ、） ２５１ ％ ３５５〜゛３６６頁（
１９７６年）〕。
れによって凝血因子を不活性化するタンパク質。従来文
献に記載されているこの種の由−のタンパク質はプロテ
ィンＣである〔ジエイ、パイオル、ケミ、（ｙ、Ｂｌｏ
ｌ、ａｈｅｍ、） ２５１ ％ ３５５〜゛３６６頁（
１９７６年）〕。
工 負に帯電しｒｓ ＋）ン脂質を分別および（または
）加水分解し、かくして血液凝固メカニズムのリン脂質
依存性反応全抑止するタンパク質。従来、稽々のタイプ
のヘビ毒から単離されている由−のホスホリパーゼが開
示されている〔ヨーロン パ・ジエイ、バイオケミ、
（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１１２．２５〜６２
頁（１９８０年）〕。
）加水分解し、かくして血液凝固メカニズムのリン脂質
依存性反応全抑止するタンパク質。従来、稽々のタイプ
のヘビ毒から単離されている由−のホスホリパーゼが開
示されている〔ヨーロン パ・ジエイ、バイオケミ、
（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１１２．２５〜６２
頁（１９８０年）〕。
近年、段階的凝血系が充分に研究されており、これは酵
素が酵素原を活性形に変換する異なる内部連継タンパク
質分解反応の増大する多段階系であるものと理解されて
いる〔ジャクリンら（Ｊａｃｋｓｏｎ、 Ｃ，Ｍ、およ
びＮｅｍｅｒｓｏｎ、Ｙ ）によるアンｉしくニー、バ
イオケミ−（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、λ４
９．７６５〜８１１頁（１９８０年）〕。この反応の速
度はリン脂質および因子ｖａ７および因子１のようなそ
の他の補助因子により決定的に増 。
素が酵素原を活性形に変換する異なる内部連継タンパク
質分解反応の増大する多段階系であるものと理解されて
いる〔ジャクリンら（Ｊａｃｋｓｏｎ、 Ｃ，Ｍ、およ
びＮｅｍｅｒｓｏｎ、Ｙ ）によるアンｉしくニー、バ
イオケミ−（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、λ４
９．７６５〜８１１頁（１９８０年）〕。この反応の速
度はリン脂質および因子ｖａ７および因子１のようなそ
の他の補助因子により決定的に増 。
大される。インＣポで、凝血促進反応は凝血の僅かな活
性化が段階的に生じた後の爆発的な血栓形成性損傷全防
止する穆々の抑止機構により調節される。
性化が段階的に生じた後の爆発的な血栓形成性損傷全防
止する穆々の抑止機構により調節される。
この抗凝血メカニズムは下記のように分類できる〔ロー
ゼンペルグら（Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ、Ｒ，Ｄ、、Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ、Ｊ、８．）によるジエイ、タリン、イン
ベスト、 （Ｊ、０１１ｎ、工ｎｖｅｓ＋ｔ、） ７４
．１〜６頁（１９８４年）〕： １、 セリン−プロテアーゼ因子Ｘａ、およびトロンビ
ンはそれらが抗トロンビン這に、または抗トロンＣン／
ヘパリン複合体に結合する結果として不活性化される。
ゼンペルグら（Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ、Ｒ，Ｄ、、Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ、Ｊ、８．）によるジエイ、タリン、イン
ベスト、 （Ｊ、０１１ｎ、工ｎｖｅｓ＋ｔ、） ７４
．１〜６頁（１９８４年）〕： １、 セリン−プロテアーゼ因子Ｘａ、およびトロンビ
ンはそれらが抗トロンビン這に、または抗トロンＣン／
ヘパリン複合体に結合する結果として不活性化される。
プロトロンビン活性化およびフィブリンの形成はこの方
法°で抑止できる。
法°で抑止できる。
抗トロンビンに加えて、α２−マクログロブリンおよび
抗トリプシンのような種々のその他の血漿−プロチアー
ゼ抑止体がまた存在し、これらの活性は時間依存性であ
る。
抗トリプシンのような種々のその他の血漿−プロチアー
ゼ抑止体がまた存在し、これらの活性は時間依存性であ
る。
２、 プロティンＣの発見はもう一つの抗凝血メカニズ
ムの発見を導いた。プロティン０は一度活性化さ・れる
と、タンパク質補助因子、Ｖａ、および１の選択的タン
パク質加水分解により抗凝血体として作用し、これによ
ってプロトロンビナーゼおよび因子Ｘ？変換する＃素が
不活性化される。
ムの発見を導いた。プロティン０は一度活性化さ・れる
と、タンパク質補助因子、Ｖａ、および１の選択的タン
パク質加水分解により抗凝血体として作用し、これによ
ってプロトロンビナーゼおよび因子Ｘ？変換する＃素が
不活性化される。
五 プラスミンはトロンビンがフィブリノ−ｒンに作用
した生成物である単量体系フィブリン１を分解する。こ
れに工９、不溶性フィブリンの生成か防止される〔ノゼ
ル（Ｎｏａｓｅｌ、Ｈ，Ｌ、）によるネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ ）、２９１．１６５〜１６７貞（１９８１年
）〕。
した生成物である単量体系フィブリン１を分解する。こ
れに工９、不溶性フィブリンの生成か防止される〔ノゼ
ル（Ｎｏａｓｅｌ、Ｈ，Ｌ、）によるネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ ）、２９１．１６５〜１６７貞（１９８１年
）〕。
凝血プロセスに包含される前記の天然タンパク質の中で
、現在、唯一の抗トロンビン夏が臨床的に使用されてい
る。しかしながら、このタンパク質が血液に投与される
傾向が増大して（るに従い、重大な欠点が証明されてき
た。
、現在、唯一の抗トロンビン夏が臨床的に使用されてい
る。しかしながら、このタンパク質が血液に投与される
傾向が増大して（るに従い、重大な欠点が証明されてき
た。
従来抗凝血剤として使用されてきた全ての薬剤は、これ
が身体または全身的に天然のものであるか否かにかかわ
らず、成る方式で細面因子を無効にし、かくして凝血プ
ロセスに対して不利な効果でありうる副作用を導く。
が身体または全身的に天然のものであるか否かにかかわ
らず、成る方式で細面因子を無効にし、かくして凝血プ
ロセスに対して不利な効果でありうる副作用を導く。
本発明の目的は現在既知の抗凝血剤が付随する凝血プロ
セスに対する不利な作用をともなうことなく、血液凝固
抑止性を示す薬剤を束製造ることにあった。
セスに対する不利な作用をともなうことなく、血液凝固
抑止性を示す薬剤を束製造ることにあった。
驚くべきことに、本発明にエワ■液峡皿抑止性を有する
が、失血の危険？Ｉ−増大させない天然タンパク質を単
離できることが見い出された。また驚くべきことに、こ
れらのタンパク質は主要出血の場合にはそれらの抑止性
金失ない、か（して正常す凝血プロセスを崩壊させるこ
となく進行させることができ、出血死の危険をなくする
ことができる。
が、失血の危険？Ｉ−増大させない天然タンパク質を単
離できることが見い出された。また驚くべきことに、こ
れらのタンパク質は主要出血の場合にはそれらの抑止性
金失ない、か（して正常す凝血プロセスを崩壊させるこ
となく進行させることができ、出血死の危険をなくする
ことができる。
本発明は抗凝血性タンパク質に関し、これ全以後ＶＡＣ
Ｃ血管系抗凝血剤（ヱａｓｃｕｌａｒ Ａｎｔｉ旦ｏａ
ｇ−ｕｌａｎｔ ） ）と称することとする。ＶＡＯは
凝血因子を不活性化しない特徴を有する。これらのタン
パク質は血管系凝崩原（ｖａ日ｃｕｌａｒ ｐｒｏｃｏ
ａｇｕｌａｎｔ ）によりまたは因子“Ｘべ、により生
じる凝血を抑止できるが、トロンビンにより生じる凝血
は抑止できない。これらのタンパク質は因子Ｘａおよび
％ 。
Ｃ血管系抗凝血剤（ヱａｓｃｕｌａｒ Ａｎｔｉ旦ｏａ
ｇ−ｕｌａｎｔ ） ）と称することとする。ＶＡＯは
凝血因子を不活性化しない特徴を有する。これらのタン
パク質は血管系凝崩原（ｖａ日ｃｕｌａｒ ｐｒｏｃｏ
ａｇｕｌａｎｔ ）によりまたは因子“Ｘべ、により生
じる凝血を抑止できるが、トロンビンにより生じる凝血
は抑止できない。これらのタンパク質は因子Ｘａおよび
％ 。
の生物学的およびアミド分解的活性を抑止しない。
本発明は凝血因子全不活性化することなく、下記の抑止
を示す抗凝血性タンパク質に関する：変性プロトロンビ
ン一時間試験、および（または） 変性され、活性化された部分的トロンボプラスチン−時
間試験、および（または） 非変性プロトロンビン一時間試験、および（または） 負に帯電したリン脂質お工びｃａ”＋の存在における凝
血因子ｘａによるプロトロンビン活性イｈお工び（また
は） 負に帯電したリン脂質およびＣａ２＋の存在における因
子ＩＸａによる固有のＸ−活性化、および（または） 単離され、刺戟された血小板のプロトロンビン活性化、
および（または） 血管壁により誘発される凝血、および（または）凝血依
存形血小板凝集。
を示す抗凝血性タンパク質に関する：変性プロトロンビ
ン一時間試験、および（または） 変性され、活性化された部分的トロンボプラスチン−時
間試験、および（または） 非変性プロトロンビン一時間試験、および（または） 負に帯電したリン脂質お工びｃａ”＋の存在における凝
血因子ｘａによるプロトロンビン活性イｈお工び（また
は） 負に帯電したリン脂質およびＣａ２＋の存在における因
子ＩＸａによる固有のＸ−活性化、および（または） 単離され、刺戟された血小板のプロトロンビン活性化、
および（または） 血管壁により誘発される凝血、および（または）凝血依
存形血小板凝集。
本発明はまた、凝血因子を不活性化せず、およびその抑
止活性がリン脂質の量に依存して変わる抗凝血性タンパ
ク質に関する。本発明によるタンパク質は因子Ｘ、、に
よるプロトロン♂ンｒｌｌ＝化の抑止も誘発する。この
抑止はリン脂質一度に依存して変化し、高リン脂質濃度
で減少する。リン脂質は本発明によるタンパク質により
加水分解されない。
止活性がリン脂質の量に依存して変わる抗凝血性タンパ
ク質に関する。本発明によるタンパク質は因子Ｘ、、に
よるプロトロン♂ンｒｌｌ＝化の抑止も誘発する。この
抑止はリン脂質一度に依存して変化し、高リン脂質濃度
で減少する。リン脂質は本発明によるタンパク質により
加水分解されない。
本発明はさらにまた、凝血因子を不活性化せず、負に帯
電したリン脂質（これは、たとえば小胞、りぎシームま
たはエテロゾームに見い出すことができる）に二価カチ
オンＣａ”＋および（またハ）Ｍｎ針を経て結合し、お
よび（または〕スフエロシルに結合する負に帯電したリ
ン脂質に二価のカチオンＣａ”＋および（または） ｕ
２＋ ＠経て結合する抗凝血性タンパク質に関する。こ
のタンパク質の負に帯電したリン脂質に対する結合は可
逆性であって、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＩＤＴＡ
）により逆行させることができる。本発明によるタン
パク質は因子Ｘａ・・、およびプロトロンビンを負に帯
電したリン脂質表面から排除することができる。
電したリン脂質（これは、たとえば小胞、りぎシームま
たはエテロゾームに見い出すことができる）に二価カチ
オンＣａ”＋および（またハ）Ｍｎ針を経て結合し、お
よび（または〕スフエロシルに結合する負に帯電したリ
ン脂質に二価のカチオンＣａ”＋および（または） ｕ
２＋ ＠経て結合する抗凝血性タンパク質に関する。こ
のタンパク質の負に帯電したリン脂質に対する結合は可
逆性であって、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＩＤＴＡ
）により逆行させることができる。本発明によるタン
パク質は因子Ｘａ・・、およびプロトロンビンを負に帯
電したリン脂質表面から排除することができる。
本発明は特に、凝血因子を不活性化せず、約７０×１０
３、約６０×１０３．３４１０３または３２ Ｘ １０
３の分子ｉを有し、５４ Ｘ １０４または３２ ｘｌ
０’の分子量を有するタンパク質はそれぞれ唯一のポ
リペプチド鎖を有するものである抗凝血性タンパク質に
関する。
３、約６０×１０３．３４１０３または３２ Ｘ １０
３の分子ｉを有し、５４ Ｘ １０４または３２ ｘｌ
０’の分子量を有するタンパク質はそれぞれ唯一のポ
リペプチド鎖を有するものである抗凝血性タンパク質に
関する。
本発明は好ましくは、凝血因子を不活性化せず、下記の
特徴を有する抗凝血性タンパク質に関する：哺乳動物の
血管壁から単離され、次いで精製されるものである； グリコプロティンではない； ホスホリパーゼではない； ｐＪ（４，４〜４．６の等電点を有する；５６℃におけ
るこの抗凝血性タンパク質の活性は熱的に不安定である
； クエン酸塩処理した血漿中でこの抗凝血性タンパク質の
活性は６７℃で数時間安定で留まる；この抗凝血性タン
パク質の活性はトリプシン砧よび（または）キモトリプ
シンにより完全に破壊されない； この抗凝血性タンパク質の活性はコラゲナーゼおよび（
または）エラスターゼにより作用されない； 小胞（ＶｅａｉａｌｅＢ）、リポゾームまたはエテロデ
ームに見い出すことができる負に帯電したリン脂質に二
価カチオンＣａ”＋およびＭｎ２＋を経て結合する； スフエロシル（５ｐｅｒｏｏｉｌ ）に結合する負に帯
電したリン脂質に二価カチオンＣａ２＋およびＭｎ”を
経て結合する； このタンパク質の負に帯電したリン脂質に対する結合は
可逆性であつ【、エチレンジアミンテトラ酢ｉ！Ｉ（凡
Ｄ’ｒＡ ）により逆行できる；因子゛・ｘ、、および
プロトロンビン゛を負に帯電したリン脂質表面から排除
する； 変性トロンビン一時間試験を抑止する；変性され、活性
化された部分的トロンボプラスチン−時間試験を抑止す
る； 非変性プロトロンビン一時間試験全抑止する；インビト
ロで負に帯電したリン脂質およびＯａ２＋の存在におけ
る凝血因子Ｘａ＋によるプロトロンビン活性化を抑止す
る； 因子淘および■。・の生物学的お工びアミド分解的活性
ケ抑止しない； インビトロで負に帯電したリン脂質およびＣａ” ＋の
存在における因子ＩＸａ：＝による固有のＸ−活性化を
抑止する； インビトロで、単離され、刺戟された血小板のプロトロ
ンビン活性化を抑止する。； インビトロで、血管壁により誘発される凝血を抑止する
：および 因子ｘａ：によるゾロトロンのこのタンパク質により誘
発される抑止はリン脂質の濃度に依存して変化し、高い
リン脂質濃度で減じられる。
特徴を有する抗凝血性タンパク質に関する：哺乳動物の
血管壁から単離され、次いで精製されるものである； グリコプロティンではない； ホスホリパーゼではない； ｐＪ（４，４〜４．６の等電点を有する；５６℃におけ
るこの抗凝血性タンパク質の活性は熱的に不安定である
； クエン酸塩処理した血漿中でこの抗凝血性タンパク質の
活性は６７℃で数時間安定で留まる；この抗凝血性タン
パク質の活性はトリプシン砧よび（または）キモトリプ
シンにより完全に破壊されない； この抗凝血性タンパク質の活性はコラゲナーゼおよび（
または）エラスターゼにより作用されない； 小胞（ＶｅａｉａｌｅＢ）、リポゾームまたはエテロデ
ームに見い出すことができる負に帯電したリン脂質に二
価カチオンＣａ”＋およびＭｎ２＋を経て結合する； スフエロシル（５ｐｅｒｏｏｉｌ ）に結合する負に帯
電したリン脂質に二価カチオンＣａ２＋およびＭｎ”を
経て結合する； このタンパク質の負に帯電したリン脂質に対する結合は
可逆性であつ【、エチレンジアミンテトラ酢ｉ！Ｉ（凡
Ｄ’ｒＡ ）により逆行できる；因子゛・ｘ、、および
プロトロンビン゛を負に帯電したリン脂質表面から排除
する； 変性トロンビン一時間試験を抑止する；変性され、活性
化された部分的トロンボプラスチン−時間試験を抑止す
る； 非変性プロトロンビン一時間試験全抑止する；インビト
ロで負に帯電したリン脂質およびＯａ２＋の存在におけ
る凝血因子Ｘａ＋によるプロトロンビン活性化を抑止す
る； 因子淘および■。・の生物学的お工びアミド分解的活性
ケ抑止しない； インビトロで負に帯電したリン脂質およびＣａ” ＋の
存在における因子ＩＸａ：＝による固有のＸ−活性化を
抑止する； インビトロで、単離され、刺戟された血小板のプロトロ
ンビン活性化を抑止する。； インビトロで、血管壁により誘発される凝血を抑止する
：および 因子ｘａ：によるゾロトロンのこのタンパク質により誘
発される抑止はリン脂質の濃度に依存して変化し、高い
リン脂質濃度で減じられる。
特に、本発明はいかなる動物組織も実質的に含有しない
特に実質的に純粋な形のＶＡＣタンパク質に関する。
特に実質的に純粋な形のＶＡＣタンパク質に関する。
ＶＡＯタンパク質の単離に適当な原料材料は各種哺乳動
物、たとえば牛、ラット、ウマおよびヒトの血管壁およ
び極めて血管化した組織（ｖａａｃｕｌ−ａｒｉｓｅｃ
Ｌ ｔｉｓｓｕｅ ）、並びにこれらの哺乳動物の内皮
細胞培養物である。牛、ラット、ウマおよびヒトの動脈
壁およびヒト腑帯靜脈および動脈が特に適している。
物、たとえば牛、ラット、ウマおよびヒトの血管壁およ
び極めて血管化した組織（ｖａａｃｕｌ−ａｒｉｓｅｃ
Ｌ ｔｉｓｓｕｅ ）、並びにこれらの哺乳動物の内皮
細胞培養物である。牛、ラット、ウマおよびヒトの動脈
壁およびヒト腑帯靜脈および動脈が特に適している。
本発明はまた、本発明によるタンパク質ｔそれ自体既知
の単離および精製技法を使用して製造する方法に関する
。下記の方法が特に好適である：均質化した原料材料を
先ず差動遠心分離処理する。得られた上澄液ｖｉ−次い
で次のとおりにいずれか所望の順序でさらに処理する。
の単離および精製技法を使用して製造する方法に関する
。下記の方法が特に好適である：均質化した原料材料を
先ず差動遠心分離処理する。得られた上澄液ｖｉ−次い
で次のとおりにいずれか所望の順序でさらに処理する。
望ましくない不純物は硫酸アンモニウムで沈殿させるこ
とができる。上置液ｔＲ和クロマトグラフィにより、た
とえばヒドロキシアパタイトを使用して、またはイオン
交換クロマトグラフィにより、たとえばＤＦＸＩＣ−セ
ファセル（５ｅｐｈａｃａｌ ） ｐ使用して、または
分子筒、たとえばセファデックス（５ｅｐｈａｄｅＸ
）Ｇ−１００上でクロマトグラフィ処理することにより
、また（°工免疫吸着クロマトグラフィにより、たとえ
ばボリクａナルまたはモノクロナル抗体を使用して、さ
らに精製する。原材料の品質に応じて、この精製計画は
変更でき、あるいはその他の精製方法、たとえばリン脂
質小胞を用いる精製も使用できる。
とができる。上置液ｔＲ和クロマトグラフィにより、た
とえばヒドロキシアパタイトを使用して、またはイオン
交換クロマトグラフィにより、たとえばＤＦＸＩＣ−セ
ファセル（５ｅｐｈａｃａｌ ） ｐ使用して、または
分子筒、たとえばセファデックス（５ｅｐｈａｄｅＸ
）Ｇ−１００上でクロマトグラフィ処理することにより
、また（°工免疫吸着クロマトグラフィにより、たとえ
ばボリクａナルまたはモノクロナル抗体を使用して、さ
らに精製する。原材料の品質に応じて、この精製計画は
変更でき、あるいはその他の精製方法、たとえばリン脂
質小胞を用いる精製も使用できる。
伝統的な抗血栓形成処置、すなわち抗凝血剤の経口投与
に加えて、さらに近年、生合成組線−プラスノゲン活性
化剤が明白な血栓症の場合に血管内経路で投与されてい
る〔エングルら（Ｎ、Ｅ！ｎｇｌによるジエイ、メト
（Ｊ、Ｍｅａ、） ３１’０．６０９〜５１６頁（１９
８４年）〕。
に加えて、さらに近年、生合成組線−プラスノゲン活性
化剤が明白な血栓症の場合に血管内経路で投与されてい
る〔エングルら（Ｎ、Ｅ！ｎｇｌによるジエイ、メト
（Ｊ、Ｍｅａ、） ３１’０．６０９〜５１６頁（１９
８４年）〕。
本発明によるタンパク質は、たとえば手術中の、特にそ
れらの血液凝固、抑止性について、および同時に血小板
の凝血依存性凝集に対するそれらの抑止作用について見
て、血栓症の防止に特に適している。
れらの血液凝固、抑止性について、および同時に血小板
の凝血依存性凝集に対するそれらの抑止作用について見
て、血栓症の防止に特に適している。
従って、本発明はまた本発明によるタンパク質を抗血栓
症剤として使用することに関する。
症剤として使用することに関する。
本発明はさらにまた、本発明によるタンパク質の少な（
とも一種を医薬的に許容され５る担体および（または）
賦形剤と組合せて含有する医薬製剤に関する。
とも一種を医薬的に許容され５る担体および（または）
賦形剤と組合せて含有する医薬製剤に関する。
十人動脈からのＶＡＣ単離および精製の実施により得ら
れた結果全表Ａに示す。１００．０００ｘｇ遠心分離の
上澄液中のｖＡＣ活性レベルの測定は凝血原（ｐｒｏｃ
ｏａｇｕｌａｎｔ ）活性の存在の故に誤差が生じる。
れた結果全表Ａに示す。１００．０００ｘｇ遠心分離の
上澄液中のｖＡＣ活性レベルの測定は凝血原（ｐｒｏｃ
ｏａｇｕｌａｎｔ ）活性の存在の故に誤差が生じる。
この活性に応答できる成分は硫醒アンモニウムにより３
５チの飽和レベルで沈殿することが判った。３５チ硫酸
アンモニウムによる沈殿後に得られた上澄液は１００％
ｖｈａ活性を有することが見い出された。この活性を沈
殿させるために、この溶液’ｔ９０％飽和が達成される
まで硫酸ア７モニウムと混合する。生成するＶＡＯタン
パク質含有沈殿ｉ ＴＢ８の存在でヒドロキシアパタイ
トカラムに結合させる（ １００ ｍＭ Ｈα、５０戚
トリス／ ＨＣＡｐＨ７，５）。洗浄後に、ＶＡＣタン
パク質金このカラムからリン酸塩勾配丁すぎ液により溶
出する。低イオン強度で、ｖｉａタンパク質はＤＭＡＩ
Ｂ −セファセルカラムに結合する。このカラムからの
ｖｈａタンパク質の溶出は増加するＮａＣＪ濃度勾配を
用いて行なう。最終精製工程において、タンパク質をセ
ファデックス（）−１００上でのゲル濾過によりそれら
の分子量にもとづいて分離する。溶出液はＶＡＯとセフ
ァデックス材料との相互反応を最少にするために高度に
塩処理した緩衝剤を用いる。ＶＡＣはこのカラムからカ
ラムの空容積の約１．６倍の量で溶出させる（第１図参
照）。この最終精製後のＶＡＯの縮収率は３５％であっ
た。５Ｄ８−ＰＡＧＩＩＩにより、ＶＡＯ活性を示した
ｌＣの（）−１ｏ。
５チの飽和レベルで沈殿することが判った。３５チ硫酸
アンモニウムによる沈殿後に得られた上澄液は１００％
ｖｈａ活性を有することが見い出された。この活性を沈
殿させるために、この溶液’ｔ９０％飽和が達成される
まで硫酸ア７モニウムと混合する。生成するＶＡＯタン
パク質含有沈殿ｉ ＴＢ８の存在でヒドロキシアパタイ
トカラムに結合させる（ １００ ｍＭ Ｈα、５０戚
トリス／ ＨＣＡｐＨ７，５）。洗浄後に、ＶＡＣタン
パク質金このカラムからリン酸塩勾配丁すぎ液により溶
出する。低イオン強度で、ｖｉａタンパク質はＤＭＡＩ
Ｂ −セファセルカラムに結合する。このカラムからの
ｖｈａタンパク質の溶出は増加するＮａＣＪ濃度勾配を
用いて行なう。最終精製工程において、タンパク質をセ
ファデックス（）−１００上でのゲル濾過によりそれら
の分子量にもとづいて分離する。溶出液はＶＡＯとセフ
ァデックス材料との相互反応を最少にするために高度に
塩処理した緩衝剤を用いる。ＶＡＣはこのカラムからカ
ラムの空容積の約１．６倍の量で溶出させる（第１図参
照）。この最終精製後のＶＡＯの縮収率は３５％であっ
た。５Ｄ８−ＰＡＧＩＩＩにより、ＶＡＯ活性を示した
ｌＣの（）−１ｏ。
留分が２８１のポリペプチド（各分子量は３４０００お
よび３２．０００である）を含有することが判った。
よび３２．０００である）を含有することが判った。
成る場合には、分子量６０．０００を有するさらに別の
留分がＶＡＯ活性を示した。
留分がＶＡＯ活性を示した。
５ＤＩＩＩ−ＰＡＧＥに従い、ピーク留分１３８−１４
０だけがこれら２ｍのポリペプチドに関して均質であっ
た。これらの留分を本明細書に記載する牛ＴＡＧの研究
に係る全てのその他の実験に使用し丸但し、牛ＶＡＱの
リン脂質リポゾームに対する結合特性に係る実験には使
用しない。
０だけがこれら２ｍのポリペプチドに関して均質であっ
た。これらの留分を本明細書に記載する牛ＴＡＧの研究
に係る全てのその他の実験に使用し丸但し、牛ＶＡＱの
リン脂質リポゾームに対する結合特性に係る実験には使
用しない。
Ｇ−１００留分１６９において、３．４％のＶＡＣ活性
が一段階凝血試醗（例１参照）により見い出され、タン
パク質１叩当り比活性１４８０単位金有した（我人参照
）。この留分は検知できる量のリン脂質を含有せず、そ
して の吸光係数がこの精製ＶＡＣ試料について２８０ｎｍに
おける吸収およびタンパク質含有量から計算された。
が一段階凝血試醗（例１参照）により見い出され、タン
パク質１叩当り比活性１４８０単位金有した（我人参照
）。この留分は検知できる量のリン脂質を含有せず、そ
して の吸光係数がこの精製ＶＡＣ試料について２８０ｎｍに
おける吸収およびタンパク質含有量から計算された。
ｖｈａの特徴
第２図から明白なように、牛動脈からの精製タンパク質
材料中に存在し、ｖＡＣ活性がここに含まれる、６４０
００および３２．０００の分子量を有する２種のポリペ
プチドは一本の鎖を有するタンパク質である。塩基性ア
クシンとともにシックの試薬全使用すると、両タンパク
質が数個の炭水化物基葡有することが確認できる。さら
にまた、どちらのタンパク質にもｒ−カルボキシグルタ
メート（Ｇｌａ ）残基は見い出すことができない。−
Ｊ′ｆｊ１点（例１参照）は両タンパク質が４．４〜４
．６の等電点に相当する単−帯に移動することを示した
（第３図参照〕。
材料中に存在し、ｖＡＣ活性がここに含まれる、６４０
００および３２．０００の分子量を有する２種のポリペ
プチドは一本の鎖を有するタンパク質である。塩基性ア
クシンとともにシックの試薬全使用すると、両タンパク
質が数個の炭水化物基葡有することが確認できる。さら
にまた、どちらのタンパク質にもｒ−カルボキシグルタ
メート（Ｇｌａ ）残基は見い出すことができない。−
Ｊ′ｆｊ１点（例１参照）は両タンパク質が４．４〜４
．６の等電点に相当する単−帯に移動することを示した
（第３図参照〕。
ＶＡＯ活性はこの帯部金ゲルから溶出することにより得
られたＴＡＯ板から得られた。この溶出液金１９ＤＢ−
ＰＡ（）ｌｌｉで分析すると、２１１のタンパク質の存
在をまた示した。従って、両タンパク質がＰＡ（） 板
の一勾配における単−帯に移動する。この方法を再検す
るために、ヒトへモグロ♂ン（ａｂ）を９１１点測定に
よりまた研究した。６．８の数値は文献に示されている
数値と一致することが見い出された（第６図参照）。
られたＴＡＯ板から得られた。この溶出液金１９ＤＢ−
ＰＡ（）ｌｌｉで分析すると、２１１のタンパク質の存
在をまた示した。従って、両タンパク質がＰＡ（） 板
の一勾配における単−帯に移動する。この方法を再検す
るために、ヒトへモグロ♂ン（ａｂ）を９１１点測定に
よりまた研究した。６．８の数値は文献に示されている
数値と一致することが見い出された（第６図参照）。
結合試験はＶＡＯ活性が負に帯電したリン脂質膜に結合
できることを示した。この結合はＣａ”およびＭｎ２＋
の存在で生じるがｙｇ ２＋の存在または二価金属イオ
ンの不存在では生じない（表Ｂ参照）。
できることを示した。この結合はＣａ”およびＭｎ２＋
の存在で生じるがｙｇ ２＋の存在または二価金属イオ
ンの不存在では生じない（表Ｂ参照）。
このリポゾームに対するＶＡＣ活性の結合は可逆性であ
って、試薬ＫＤＴＡにより逆行する。
って、試薬ＫＤＴＡにより逆行する。
ＥＩＤＳ−ＰＡＧＥ ’ｉ使用すると、両タンパク質が
Ｃａ”の存在でリポゾームに結合できること、およびこ
の結合がＥＤＴＡ を加えると破廐されることを示すこ
とができた（第４図参照）。これはまたＶＡＯ活性がこ
れら２稽のタンパク質に帰因できることを示している。
Ｃａ”の存在でリポゾームに結合できること、およびこ
の結合がＥＤＴＡ を加えると破廐されることを示すこ
とができた（第４図参照）。これはまたＶＡＯ活性がこ
れら２稽のタンパク質に帰因できることを示している。
１０チグリセロール含有ＴＢＳ中で貯蔵すると、ＶＡＯ
活性ｔ”！ −７０’Ｇで少なくとも６ケ月、０°０で
少なくとも１２時間および５７’０で少なくとも牛時間
安定である。５６°０において、この活性は２分間以内
に消失する。
活性ｔ”！ −７０’Ｇで少なくとも６ケ月、０°０で
少なくとも１２時間および５７’０で少なくとも牛時間
安定である。５６°０において、この活性は２分間以内
に消失する。
ＶＡＯの活性
ＶＡＯは一段階凝血試験において凝血時間を延長する（
例１参照）、この凝血は牛の脳からのトロンボプラスチ
ン（ＢＴＦ ）で触発される。この実験でＢＴＰ ｉ精
製牛トロンビンまたは精製牛因子Ｘａで置き換えると、
ＶＡＯは因子Ｘａが凝血の開始に用いられた場合にだけ
凝血時間を延長する；トロンーンにより誘発された凝血
はＴＫＯにより作用をされない。このことはＶＡＯが因
子Ｘａ活性を直接に抑止し、またはノａトロンビナーゼ
複合体といくらか相互反応すること金示している。さら
に試験するために、梢製牛因子Ｘａ および凝血１金用
いるアミド分屏的トロンビン生成試験金行なった。
例１参照）、この凝血は牛の脳からのトロンボプラスチ
ン（ＢＴＦ ）で触発される。この実験でＢＴＰ ｉ精
製牛トロンビンまたは精製牛因子Ｘａで置き換えると、
ＶＡＯは因子Ｘａが凝血の開始に用いられた場合にだけ
凝血時間を延長する；トロンーンにより誘発された凝血
はＴＫＯにより作用をされない。このことはＶＡＯが因
子Ｘａ活性を直接に抑止し、またはノａトロンビナーゼ
複合体といくらか相互反応すること金示している。さら
に試験するために、梢製牛因子Ｘａ および凝血１金用
いるアミド分屏的トロンビン生成試験金行なった。
第５図はプロトロンビンｔｏａ”＋およびリン脂質の存
在で因子Ｘａ により活性化してトロンビンを生成させ
た場合に、ＶＡＯがこのブストロンビン活性化金抑止し
、この抑止度合がｖｈｏ濃度に依存することを示してい
る。さらにまた、ＶＡＣのこの抑止効果はリン脂質の濃
度が低いほど大きくなる。
在で因子Ｘａ により活性化してトロンビンを生成させ
た場合に、ＶＡＯがこのブストロンビン活性化金抑止し
、この抑止度合がｖｈｏ濃度に依存することを示してい
る。さらにまた、ＶＡＣのこの抑止効果はリン脂質の濃
度が低いほど大きくなる。
第６図はプロトロンビン活性化のＶＡＯ誘発抑止のリン
脂質依存性を示している。ぜ口のリン脂質濃度において
因子Ｘａ、＋、にょるプロトロンビン活性化はＴＡＯに
より抑止されないことは注目されるべきである。対照試
験はＶＡ（ｌｉそれ自体が測定系に作用しないことを示
した。
脂質依存性を示している。ぜ口のリン脂質濃度において
因子Ｘａ、＋、にょるプロトロンビン活性化はＴＡＯに
より抑止されないことは注目されるべきである。対照試
験はＶＡ（ｌｉそれ自体が測定系に作用しないことを示
した。
５ ｍｃＭリン脂質〔１，２−ジオレオイル−ａｎ−グ
リセロ−６−ホスホセリン（Ｐｓ）／１．２−ジオレオ
イル−８ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｐａ） １
： ４ モｙｖ７モｈ 〕２ｖｈａ （１ｍｙ当９の
比活性： １．３００単位ン１Ｄ７ｍｃｇ／ｊＥ／およ
び１０ＪＩＩＭａａ■とともにインキュベートすると、
凝血原活性の減少が３７℃で６分以内に生じた。これは
’７ＡＣがホスホリパーゼ活性をもたないことを示して
いる。
リセロ−６−ホスホセリン（Ｐｓ）／１．２−ジオレオ
イル−８ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｐａ） １
： ４ モｙｖ７モｈ 〕２ｖｈａ （１ｍｙ当９の
比活性： １．３００単位ン１Ｄ７ｍｃｇ／ｊＥ／およ
び１０ＪＩＩＭａａ■とともにインキュベートすると、
凝血原活性の減少が３７℃で６分以内に生じた。これは
’７ＡＣがホスホリパーゼ活性をもたないことを示して
いる。
抗トロンビンＩ（ムＴ−１）の場合と異なり、１１ＡＯ
は精製トロンビンのアミド分解的活性に対する作用をも
たず、色原性基質８２３５７Ｃｗ−ベンゾイル−Ｉをイ
ンロイシル−Ｌ−グルタミル−ｂ−ピペコリルーグリシ
ルーＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン−ジヒドロク
ロリド）または８２２３８（Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル
−Ｌ−ビペコリルーＬ−アルギニンーｐ−ニトロアニリ
ド−ジヒドロクロリド）を用いて測定して、因子Ｘａ活
性に対する持続的作用もない（表Ｃ参照）。この表はま
た因子ＸａおよびトロンぎンのＡＴ−１による不活性化
が’７ＡＧにより強化されないことを示している。他方
、ヘパリンはＡＴ−１の存在下にトロンビンおよび因子
Ｘａ の不活性化全決定的に増大させる。これはＶＡＯ
がヘパリン様活性もムＴ−１様活性も有しないことを示
している。
は精製トロンビンのアミド分解的活性に対する作用をも
たず、色原性基質８２３５７Ｃｗ−ベンゾイル−Ｉをイ
ンロイシル−Ｌ−グルタミル−ｂ−ピペコリルーグリシ
ルーＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン−ジヒドロク
ロリド）または８２２３８（Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル
−Ｌ−ビペコリルーＬ−アルギニンーｐ−ニトロアニリ
ド−ジヒドロクロリド）を用いて測定して、因子Ｘａ活
性に対する持続的作用もない（表Ｃ参照）。この表はま
た因子ＸａおよびトロンぎンのＡＴ−１による不活性化
が’７ＡＧにより強化されないことを示している。他方
、ヘパリンはＡＴ−１の存在下にトロンビンおよび因子
Ｘａ の不活性化全決定的に増大させる。これはＶＡＯ
がヘパリン様活性もムＴ−１様活性も有しないことを示
している。
新規なヒト凝血剤の単離は同一単離方法により、たとえ
ばヒト廣帯動脈の均質物から達成できる。
ばヒト廣帯動脈の均質物から達成できる。
このような均質物で、本発明による抗凝血剤はプロトロ
ンビン一時間試験において凝塊形成時間を延長する能力
を有することが見い出された。この抗凝血活性は動脈均
質物のセファデックスＧ−１００分留後に測定可能にな
る（例４参照）。さらに単離処理すると、この活性ｔ！
ｐＨ７，９で総合的に負電荷を有する水溶性物質（１種
または２種以上）全付随するものと見做される。
ンビン一時間試験において凝塊形成時間を延長する能力
を有することが見い出された。この抗凝血活性は動脈均
質物のセファデックスＧ−１００分留後に測定可能にな
る（例４参照）。さらに単離処理すると、この活性ｔ！
ｐＨ７，９で総合的に負電荷を有する水溶性物質（１種
または２種以上）全付随するものと見做される。
セファデックスＧ−７５留分Ｙｒニゲル電気泳動により
分析すると、分子量３２．０００帯の強度と凝塊形成時
間の延長との間に、変性プロトロンビン−時間試験（Ｍ
ＰＴＴ）で測定して陽性の相互関係があることが示され
た（例４参照）。３２に一帯と抗凝血活性との関係はポ
リアクリルアミドゲル上の３２に帯の部分からだけ抗凝
血活性が溶出され５ることから疑いもなく証明される。
分析すると、分子量３２．０００帯の強度と凝塊形成時
間の延長との間に、変性プロトロンビン−時間試験（Ｍ
ＰＴＴ）で測定して陽性の相互関係があることが示され
た（例４参照）。３２に一帯と抗凝血活性との関係はポ
リアクリルアミドゲル上の３２に帯の部分からだけ抗凝
血活性が溶出され５ることから疑いもなく証明される。
当抗凝血剤が５６℃でインキュベートするとその活性を
急速に失ない、およびタンパク質加水分解酵素がその活
性を破壊できるという発見と組合せて、我々は本発明に
よる抗凝血活性が３２０００ダルトンの見掛けの分子ｅ
ｔ有する単一のタンパク質により示されるものと見做す
。
急速に失ない、およびタンパク質加水分解酵素がその活
性を破壊できるという発見と組合せて、我々は本発明に
よる抗凝血活性が３２０００ダルトンの見掛けの分子ｅ
ｔ有する単一のタンパク質により示されるものと見做す
。
プロテアーゼタイプ■とは異なり、トリプシンは本発明
の抗凝血剤の貧弱な不活性化剤である。
の抗凝血剤の貧弱な不活性化剤である。
これは当該抗＃崩剤がトリプシンにとって容易に受は入
れられ５るリジンおよびアルイエン残基金少数で有する
だけであることを示唆している。本発明の抗凝血剤の活
性の性質は種々の異なる方法で凝血を抑止することによ
り研究された。血管系化合物、ＨＴＩＩ （ヒト脳トロ
ンボプラスチン）または因子も・、のどちらかにより誘
発される凝塊形成はこの抗凝血剤により抑止される；他
方トロンビン誘発凝塊形成は抑止されない。これらの発
見から、本発明の抗凝血剤がトロン♂ン生成を干渉する
が、トロンビンの作用は干渉しないものと結論できる。
れられ５るリジンおよびアルイエン残基金少数で有する
だけであることを示唆している。本発明の抗凝血剤の活
性の性質は種々の異なる方法で凝血を抑止することによ
り研究された。血管系化合物、ＨＴＩＩ （ヒト脳トロ
ンボプラスチン）または因子も・、のどちらかにより誘
発される凝塊形成はこの抗凝血剤により抑止される；他
方トロンビン誘発凝塊形成は抑止されない。これらの発
見から、本発明の抗凝血剤がトロン♂ン生成を干渉する
が、トロンビンの作用は干渉しないものと結論できる。
本発明による抗凝血メカニズム金さらに研究するだめに
、精製因子およびプロトロンビンから再構成されたプロ
トロンピナーゼを使用［、り（例４参照）。記載されて
いる実験条験下に、抗凝血剤は完全プロトロンピナーゼ
（因子Ｘａ、因子’Ｖ ａｓリン脂質 Ｃａ” ）によ
り、およびリン脂質結合した因子ｘａ（因子Ｘａ１ リ
ン脂質、Ｃａ” ）によりプロテア−ゼの活性化を抑止
できるが、遊離の因子Ｘａ（因子Ｘａ−、Ｃ＆” ）に
よっては抑止されない。
、精製因子およびプロトロンビンから再構成されたプロ
トロンピナーゼを使用［、り（例４参照）。記載されて
いる実験条験下に、抗凝血剤は完全プロトロンピナーゼ
（因子Ｘａ、因子’Ｖ ａｓリン脂質 Ｃａ” ）によ
り、およびリン脂質結合した因子ｘａ（因子Ｘａ１ リ
ン脂質、Ｃａ” ）によりプロテア−ゼの活性化を抑止
できるが、遊離の因子Ｘａ（因子Ｘａ−、Ｃ＆” ）に
よっては抑止されない。
本発明の抗凝血剤の存在下におけるｆｒ：Ｉトロンビン
活性化の時間経過はプロトロンビン活性化の即時的抑止
を示し、この抑止は一定の時間のままとどまる。従って
、本発明の抗凝血剤はホスホリパーゼによるものでも、
またタンパク質加水分解的活性によるものでもないと結
論することができる。因子ＸａおよびＣａ”＋にょるプ
ロトロンビンの活性化が本発明の抗凝血剤により全く作
用を受げないという事実は、本発明の血管系化合物の抗
凝血メカニズムが抗トロンビン■のような既知血漿プロ
テアーゼ抑止剤の場合と異なっていることを強力に示し
ている。ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）
は活性化されたプロティンＣは因子Ｘａ、Ｃａ”＋およ
びリン脂質によるプロトロンビン活性化を抑止しないこ
とを証明しているので〔バイオキマ、パイオフィス、ア
クタ、 （Ｂｉｏｃｈｉｍａ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
活性化の時間経過はプロトロンビン活性化の即時的抑止
を示し、この抑止は一定の時間のままとどまる。従って
、本発明の抗凝血剤はホスホリパーゼによるものでも、
またタンパク質加水分解的活性によるものでもないと結
論することができる。因子ＸａおよびＣａ”＋にょるプ
ロトロンビンの活性化が本発明の抗凝血剤により全く作
用を受げないという事実は、本発明の血管系化合物の抗
凝血メカニズムが抗トロンビン■のような既知血漿プロ
テアーゼ抑止剤の場合と異なっていることを強力に示し
ている。ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）
は活性化されたプロティンＣは因子Ｘａ、Ｃａ”＋およ
びリン脂質によるプロトロンビン活性化を抑止しないこ
とを証明しているので〔バイオキマ、パイオフィス、ア
クタ、 （Ｂｉｏｃｈｉｍａ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
ムｃｔａ ） ５７１．３３３〜３４２頁（１９７９年
）〕、本発明の化合物がまたプロティンＣのどちらでも
ないと結論できる。
）〕、本発明の化合物がまたプロティンＣのどちらでも
ないと結論できる。
初めの結合研究は本発明の血管系抗凝血剤が多分、因子
Ｘａおよび（または）プロトロンビンの脂質結合を干渉
することを示している。抗凝血剤のプロトロンビン活性
化抑止能力がプロトロンビン時間に対するその延長作用
に完全に相応するか否かが確立されるべきである。
Ｘａおよび（または）プロトロンビンの脂質結合を干渉
することを示している。抗凝血剤のプロトロンビン活性
化抑止能力がプロトロンビン時間に対するその延長作用
に完全に相応するか否かが確立されるべきである。
この抑止剤が程々のタイプの動脈に見い出すことができ
るが、貧弱に血管化されていない組織くは見い出されな
いという事実は血流停止および血栓の生理学的モジュレ
ータ−が血管レベルで活性であることが見い出されたこ
とを示している。
るが、貧弱に血管化されていない組織くは見い出されな
いという事実は血流停止および血栓の生理学的モジュレ
ータ−が血管レベルで活性であることが見い出されたこ
とを示している。
観察されたＶＡＣの性質および活性にもとづき、”／Ａ
Ｃの影響下における血液凝固メカニズムは下記のとおり
釦解釈することができる： ＶＡＣは組織への損傷の結果として、および（または）
血小板刺戟により生じる負Ｉｃｆ電したリン脂質にＣａ
２＋を経て結合し、それによって、特定の凝血因子（ビ
タミンに一依存凝血因子）の負に帯電したリン脂質表面
（これはこれらの凝血因子のための触媒的表面として作
用する）への結合を減じ〔バイオケミ、パイオフィス、
アクタ（Ｅｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ、ｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ ） ５１ ５、１６３〜２０５頁（１９８５年
）〕、この結果として、リン脂質依存血液凝固反応がＶ
ＡＣにより抑止される。
Ｃの影響下における血液凝固メカニズムは下記のとおり
釦解釈することができる： ＶＡＣは組織への損傷の結果として、および（または）
血小板刺戟により生じる負Ｉｃｆ電したリン脂質にＣａ
２＋を経て結合し、それによって、特定の凝血因子（ビ
タミンに一依存凝血因子）の負に帯電したリン脂質表面
（これはこれらの凝血因子のための触媒的表面として作
用する）への結合を減じ〔バイオケミ、パイオフィス、
アクタ（Ｅｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ、ｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ ） ５１ ５、１６３〜２０５頁（１９８５年
）〕、この結果として、リン脂質依存血液凝固反応がＶ
ＡＣにより抑止される。
その活性メカニズムにもとづき、ＶＡＣはタンパク質群
３（前記参照）の類に属するものとすることができる。
３（前記参照）の類に属するものとすることができる。
しかしながら、ＶＡＣとこの群のその他の既知のタンパ
ク質とは臨界的に重大な差異を有する。
ク質とは臨界的に重大な差異を有する。
’７ＡＣはリン脂質を加水分解せず、従っていづれの必
須の膜構造も分解しない。
須の膜構造も分解しない。
既知の抗凝血剤のいづれについても従来開示されていな
いＶＡＣのこの性質は重大であって、また有利である、
すなわち、 ＶＡＣの抗凝血作用は凝血プロセスにおけるリン脂質沈
殿の量に依存して変わる。この依存性は、たとえば血管
壁の僅かな損傷および（または）血小板の、たとえば血
栓症プロセスによる僅かな活性化により開始された凝血
プロセスが驚くべきことにＶＡＣＩｃより抑止できるこ
とを意味している。
いＶＡＣのこの性質は重大であって、また有利である、
すなわち、 ＶＡＣの抗凝血作用は凝血プロセスにおけるリン脂質沈
殿の量に依存して変わる。この依存性は、たとえば血管
壁の僅かな損傷および（または）血小板の、たとえば血
栓症プロセスによる僅かな活性化により開始された凝血
プロセスが驚くべきことにＶＡＣＩｃより抑止できるこ
とを意味している。
他方、血管壁に対する激しい損傷（ここではりン脂質が
高濃度で生じる）により触発される凝血プロセスはＶＡ
Ｃにより抑止されない。これは正確には、この高いリン
脂質濃度によるものであ・る。
高濃度で生じる）により触発される凝血プロセスはＶＡ
Ｃにより抑止されない。これは正確には、この高いリン
脂質濃度によるものであ・る。
ＶＡＣを使用した場合の出血の危険は従って驚くべきこ
とに極めて少ない。ＶＡＣは従来既知の全ての抗凝血剤
が一種または二種以上の凝血因子を無効にし、かくして
出血の危険を増大させる従来既知の抗凝血剤の全てと異
なり、これらの優れた性質を有する。
とに極めて少ない。ＶＡＣは従来既知の全ての抗凝血剤
が一種または二種以上の凝血因子を無効にし、かくして
出血の危険を増大させる従来既知の抗凝血剤の全てと異
なり、これらの優れた性質を有する。
ｖＡＣは驚くべきことに、凝血因子それら自体を不活性
化しない。従って、凝血因子がそれらの他の機能（その
多くは発見されている）を果たすため忙その位置にとど
まる。若干の活性凝血因子は、たとえば炎症細胞の化学
走性の重要な止血防止任務を有する。これらの細胞は損
傷した血管壁の回復に寄与する、驚くべきことに％ＶＡ
Ｃはこのプロセスを干渉しない。
化しない。従って、凝血因子がそれらの他の機能（その
多くは発見されている）を果たすため忙その位置にとど
まる。若干の活性凝血因子は、たとえば炎症細胞の化学
走性の重要な止血防止任務を有する。これらの細胞は損
傷した血管壁の回復に寄与する、驚くべきことに％ＶＡ
Ｃはこのプロセスを干渉しない。
本発明はさらに、凝血因子を不活性化しない新規な一群
の抗凝血性タンパク質を最初化開示したものである。本
発明を説明するための実施例および列証されている性質
はいづれの方法でも本発明を制限するものであるべきで
はない。当業者はいづれの発明的努力をすることなく、
ここく記載されている方法を使用して、凝血因子を不活
性化することなく、抗凝血性を示すさらに別のタンパク
質を得ることができる。これらのタンパク質はまた本発
明の保護範囲内に入る。
の抗凝血性タンパク質を最初化開示したものである。本
発明を説明するための実施例および列証されている性質
はいづれの方法でも本発明を制限するものであるべきで
はない。当業者はいづれの発明的努力をすることなく、
ここく記載されている方法を使用して、凝血因子を不活
性化することなく、抗凝血性を示すさらに別のタンパク
質を得ることができる。これらのタンパク質はまた本発
明の保護範囲内に入る。
本発明で使用した略語は下記の意味を有するものとする
： ｖｈｃ ：血管系抗凝血剤 ＰＦＰ ：血小板を含有しない血漿 ＴＢ８ ： １００ ｍＭ ＮａＣｊ、 ５０ ｍＭ
トリス／ ＨＣＩ、ｐＨ７，５ ＥＤＴＡ ：エチレンジアミンテトラ酢酸ＴＢ８１Ｃ：
ＫＤＴＡ ２ ｍＭ含有ＴＢＳＢＴＰ ：牛脳からの
トロンボプラスチン：ヒト脳からのドロンボブ２スチン ＴＢ８Ａ ：ヒト血清アルブミンＱ、５１ｖ／ｄを含有
するＴＢ８ 、 ｐＨ７，９ ８２３３７： ）Ｉ−ベンゾイル−Ｌ−インロイシルー
Ｌ−グルタミル−Ｌ−ピペコリルーグリシルーし一アル
ギニンーｐ−ニトロアニリド−ジヒドロクロリド ８２２３８ ： Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ビペ
コリルーＬ−アルギニンーｐ−ニトロアニリド−ジヒド
ロクロリド ＡＴ−［Ｉ：ヒト抗トロンビン■ Ｓ、Ａ：比活性 ｏｔｅ２Ｇｒｏ−ｐ、−ｃｈｏ ： Ｌ ２−ジオレ
オイル−５ｎ−グリセロ−６−ホスホコリン ０Ｊ１３２ＧｒＯ−Ｐ Ｓｅｒ ： １ ＊ ２−ジ
オレオイル−５ｎ−グリセロ−６−ホスホセリン 血液凝固因子の命名については、夕′スク フォース
オン ノーメンクラチャー オプ デルード クロッテ
ィング ディモーデンス アンｒゲイモーダンス イン
ターメデーツ（Ｔ（１５）ｋ Ｆｏｒｅθｏｎ Ｎｏｍ
ｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈａｔｔｉ
ｎｇ Ｚｙｍｏｇｅｎｓａｎｄ Ｚｙｍｏｇｅｎｓ工ｎ
ｔｅｒｍｅｄａｔｅａ ）により推せんされている命名
法を使用した。
： ｖｈｃ ：血管系抗凝血剤 ＰＦＰ ：血小板を含有しない血漿 ＴＢ８ ： １００ ｍＭ ＮａＣｊ、 ５０ ｍＭ
トリス／ ＨＣＩ、ｐＨ７，５ ＥＤＴＡ ：エチレンジアミンテトラ酢酸ＴＢ８１Ｃ：
ＫＤＴＡ ２ ｍＭ含有ＴＢＳＢＴＰ ：牛脳からの
トロンボプラスチン：ヒト脳からのドロンボブ２スチン ＴＢ８Ａ ：ヒト血清アルブミンＱ、５１ｖ／ｄを含有
するＴＢ８ 、 ｐＨ７，９ ８２３３７： ）Ｉ−ベンゾイル−Ｌ−インロイシルー
Ｌ−グルタミル−Ｌ−ピペコリルーグリシルーし一アル
ギニンーｐ−ニトロアニリド−ジヒドロクロリド ８２２３８ ： Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ビペ
コリルーＬ−アルギニンーｐ−ニトロアニリド−ジヒド
ロクロリド ＡＴ−［Ｉ：ヒト抗トロンビン■ Ｓ、Ａ：比活性 ｏｔｅ２Ｇｒｏ−ｐ、−ｃｈｏ ： Ｌ ２−ジオレ
オイル−５ｎ−グリセロ−６−ホスホコリン ０Ｊ１３２ＧｒＯ−Ｐ Ｓｅｒ ： １ ＊ ２−ジ
オレオイル−５ｎ−グリセロ−６−ホスホセリン 血液凝固因子の命名については、夕′スク フォース
オン ノーメンクラチャー オプ デルード クロッテ
ィング ディモーデンス アンｒゲイモーダンス イン
ターメデーツ（Ｔ（１５）ｋ Ｆｏｒｅθｏｎ Ｎｏｍ
ｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈａｔｔｉ
ｎｇ Ｚｙｍｏｇｅｎｓａｎｄ Ｚｙｍｏｇｅｎｓ工ｎ
ｔｅｒｍｅｄａｔｅａ ）により推せんされている命名
法を使用した。
材料
分析用８ＤＢ −ＰＡＧＥおよびヒドロキシアパタイト
ＥＩＴＰ用の化学物質はビオ−ラド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）
から入手した；セファデックス（）−１００およびＧ−
７５、ＤＥＡＤ−セファセルおよび「低分子量目盛キッ
ト（Ｌｏｗ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃａ
１ｉｂｒａｔｉｏｎｘ１ｔ ）はフ了−マシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ）から入手した：色原性物質８２３３７
および８２２３８はカビ ヒトラム（Ｋａｂｉ Ｖｉｔ
ｒｕｍ ）から入手した；そしてジアンＯ（Ｄｉａｆｌ
ｏ ） Ｐ Ｍ −１０限外濾過膜はアミコン（ａｍｉ
ｃｏｎ ）から入手した。
ＥＩＴＰ用の化学物質はビオ−ラド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）
から入手した；セファデックス（）−１００およびＧ−
７５、ＤＥＡＤ−セファセルおよび「低分子量目盛キッ
ト（Ｌｏｗ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃａ
１ｉｂｒａｔｉｏｎｘ１ｔ ）はフ了−マシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ）から入手した：色原性物質８２３３７
および８２２３８はカビ ヒトラム（Ｋａｂｉ Ｖｉｔ
ｒｕｍ ）から入手した；そしてジアンＯ（Ｄｉａｆｌ
ｏ ） Ｐ Ｍ −１０限外濾過膜はアミコン（ａｍｉ
ｃｏｎ ）から入手した。
例 １
ＶＡＣの単離および精製
動物を屠殺した後の半時間以内に子犬動脈を取り出す。
牛血液はクエン酸三ナトリウム（最終濃度０．６８重量
係、）中に採取し、室温および２．０ＯＯＸ、Ｓｒで１
０分間遠心分離する、若干の血小板を含有する血漿を次
いで再び遠心分離する（ １０．０００ ｘｇで１５分
間）。この方法で、血小板を含有しない血漿（ｐｘｐ
）が得られる。
係、）中に採取し、室温および２．０ＯＯＸ、Ｓｒで１
０分間遠心分離する、若干の血小板を含有する血漿を次
いで再び遠心分離する（ １０．０００ ｘｇで１５分
間）。この方法で、血小板を含有しない血漿（ｐｘｐ
）が得られる。
動物から大動脈を取り出してすぐに、ＴＥ０１（１００
ｍＭ ＩＪａＣｌ 、 ５ ０ ｍＭ ト
リ ス／ＨＣ） 、ｐ）１７．５ ）で充分にすすぐ。
ｍＭ ＩＪａＣｌ 、 ５ ０ ｍＭ ト
リ ス／ＨＣ） 、ｐ）１７．５ ）で充分にすすぐ。
大動脈から内側被膜を除去し、高速ホモｒナイデー、た
とえばブラウン（Ｂｒａｕｎ ） Ｍ Ｘ ３２を用い
て、大豆トリプシン抑止体（１６ｍ９７１）およびベン
ズアミジン（１，５７ｉ／ｌ）を含有するＴＢＢＲ（Ｋ
ＤＴＡ ２鮨含有ＴＢ８ ）中で均質化する。
とえばブラウン（Ｂｒａｕｎ ） Ｍ Ｘ ３２を用い
て、大豆トリプシン抑止体（１６ｍ９７１）およびベン
ズアミジン（１，５７ｉ／ｌ）を含有するＴＢＢＲ（Ｋ
ＤＴＡ ２鮨含有ＴＢ８ ）中で均質化する。
８本の大動脈から均質化され、固形物２０％（重量／容
ｔ）を含有する材料を１００．００Ｄｘｇで１２，００
０ｘｇで２０分間遠心分離する。生成する上澄液を固形
硫酸アンモニウムで９０係飽和まで飽和し、６０分間攪
拌し、次いで１２，０ＯＯＸｇで２０分間遠心分離する
。
ｔ）を含有する材料を１００．００Ｄｘｇで１２，００
０ｘｇで２０分間遠心分離する。生成する上澄液を固形
硫酸アンモニウムで９０係飽和まで飽和し、６０分間攪
拌し、次いで１２，０ＯＯＸｇで２０分間遠心分離する
。
沈殿を少量のＴＢＳに懸濁し、ベンズアミジン（１，５
７，Ｆ／ｌ）含有ＴＢＢを用いて透析する。透析した留
分をＴＢＳで平衡にしたヒドロキシアパタイト カラム
（ＩＸ２０ｃｍ）に適用する。カラムを４床量のＴＢＢ
で洗浄する。ＶＡＣタンパク質をこのカラムから０〜５
００ｍＭの直線勾配によりリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） ２００ｍで溶出する。ＶＡＣ含有留分を集
め、ＮａＣｊ ５０ ｍＭおよびトリス／ＨＣノ２０Ｉ
ｎＭを用いてｐＨ７，５で透析する。
７，Ｆ／ｌ）含有ＴＢＢを用いて透析する。透析した留
分をＴＢＳで平衡にしたヒドロキシアパタイト カラム
（ＩＸ２０ｃｍ）に適用する。カラムを４床量のＴＢＢ
で洗浄する。ＶＡＣタンパク質をこのカラムから０〜５
００ｍＭの直線勾配によりリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） ２００ｍで溶出する。ＶＡＣ含有留分を集
め、ＮａＣｊ ５０ ｍＭおよびトリス／ＨＣノ２０Ｉ
ｎＭを用いてｐＨ７，５で透析する。
同一緩衝液をＤＥＡＢ−セファセル カラム（３ｘ５ｃ
ＩＬ）＆ｃも使用し、このカラムで透析したＶＡＣ材料
をクロマトグラフィ処理する。カラムを４床量の平衡緩
衝液で洗浄した後釦、ＶＡＣをトリス／ＨＣＩ （ｐｉ
（７，５） ２０ｍＭ中のＮａＣノ溶液（５０〜５ＱＱ
ｍ）Ａの直線勾配を使用）２００＋ｄにより浴出する。
ＩＬ）＆ｃも使用し、このカラムで透析したＶＡＣ材料
をクロマトグラフィ処理する。カラムを４床量の平衡緩
衝液で洗浄した後釦、ＶＡＣをトリス／ＨＣＩ （ｐｉ
（７，５） ２０ｍＭ中のＮａＣノ溶液（５０〜５ＱＱ
ｍ）Ａの直線勾配を使用）２００＋ｄにより浴出する。
ＶＡＣ含有留分を集め、ｐＨ７，５でＮａＣｊ５００
ｍＭおよびトリス／ＨＣ１ｔ２ＱｍＭで透析し、・ 次
いでＰＭ−ｉＱ限外濾過膜を用いるアミコン（Ａｍ１ｃ
ｏｎ ） ａ縮セルで濃縮する。２Ｍ容量の濃縮物を５
Ｑ ｍＭ ＮａＣ１および２Ｑ ｍＭ ）リス／ＨＣ
Ｉで平衡にした（ ｐ）１７．５ ’）セファデックス
Ｇ−Ｉ ＤＯカラム（３Ｘ８０ｃＩＩＬ）に適用する
。
ｍＭおよびトリス／ＨＣ１ｔ２ＱｍＭで透析し、・ 次
いでＰＭ−ｉＱ限外濾過膜を用いるアミコン（Ａｍ１ｃ
ｏｎ ） ａ縮セルで濃縮する。２Ｍ容量の濃縮物を５
Ｑ ｍＭ ＮａＣ１および２Ｑ ｍＭ ）リス／ＨＣ
Ｉで平衡にした（ ｐ）１７．５ ’）セファデックス
Ｇ−Ｉ ＤＯカラム（３Ｘ８０ｃＩＩＬ）に適用する
。
溶出液を２ｄづつの留分として集め、これらの活性留分
を別々に、グリセロール含有ＴＢｓ １０容量係で透析
し、−７０℃で貯蔵する。全精製処理は０〜４℃で行な
う。
を別々に、グリセロール含有ＴＢｓ １０容量係で透析
し、−７０℃で貯蔵する。全精製処理は０〜４℃で行な
う。
２種の異なる方法をｖＡＣ活性の測定に使用する：ａ）
一段階凝血試験（変性プロトロンビン時間試験） ｂ）トロンビン形成試験 一段階凝血試験は次のとおりにして行なう：シリコン処
理したガラス皿で、被験留分１７５ ｍｃｌまたは対照
としてＴＢＳ １７５ ｍｃｌをＰＦＰ ５ Ｑ ｍａ
ｌおよび稀ＢＴＰ ２５ ｍａｍと攪拌する（１分間蟲
り９００回転）。６７℃で３分間インキュベートした後
忙、ＮａＣノ８Ｑ ｍＭ 、 ＣａＣ７２２０ｍＭおよ
びトリス／ＨＣＩ Ｉ Ｑ ｍＭを含有する緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）を加えることにより凝血を開始させる。フィ
ブリン形成はペイトン デュアル アグリｌ’−シａン
モジュー ル（Ｐａｙｔｏｎ ＤｕａｌＡｇｇｒｅｇａ
ｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ） Ｃホーンストラ（Ｈｏｒ
ｎｓｔｒａ、 Ｇ、 ）、フィル、トランス、アール。
一段階凝血試験（変性プロトロンビン時間試験） ｂ）トロンビン形成試験 一段階凝血試験は次のとおりにして行なう：シリコン処
理したガラス皿で、被験留分１７５ ｍｃｌまたは対照
としてＴＢＳ １７５ ｍｃｌをＰＦＰ ５ Ｑ ｍａ
ｌおよび稀ＢＴＰ ２５ ｍａｍと攪拌する（１分間蟲
り９００回転）。６７℃で３分間インキュベートした後
忙、ＮａＣノ８Ｑ ｍＭ 、 ＣａＣ７２２０ｍＭおよ
びトリス／ＨＣＩ Ｉ Ｑ ｍＭを含有する緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）を加えることにより凝血を開始させる。フィ
ブリン形成はペイトン デュアル アグリｌ’−シａン
モジュー ル（Ｐａｙｔｏｎ ＤｕａｌＡｇｇｒｅｇａ
ｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ） Ｃホーンストラ（Ｈｏｒ
ｎｓｔｒａ、 Ｇ、 ）、フィル、トランス、アール。
ソシ、ロンーンＢ （Ｐｈｉ’ｌ。Ｔｒａｎｓ、 Ｒ，
８ｏａ。
８ｏａ。
Ｌｏｎｄｏｎ Ｂ ）、２９４．３５５〜３７１頁（１
９８１年）〕を用いて光学的に記録する。対照試料の凝
血時間は６５秒であった。この試験は精製中に、ＶＡＣ
活性の存在について種々の留分を検査するために使用し
た。Ｎ製処理中に生成したｖｈｃを測定するために、Ｖ
ＡＣ活性の１単位を前記試験で凝血時間を１００秒に延
長するＶＡＣの量と定める。
９８１年）〕を用いて光学的に記録する。対照試料の凝
血時間は６５秒であった。この試験は精製中に、ＶＡＣ
活性の存在について種々の留分を検査するために使用し
た。Ｎ製処理中に生成したｖｈｃを測定するために、Ｖ
ＡＣ活性の１単位を前記試験で凝血時間を１００秒に延
長するＶＡＣの量と定める。
いくつかの場合に、ＢＴＰの代りに、精製牛トロンビン
または精製牛因子Ｘ、を使用する。この半精製凝血系で
は、使用したトロンビンまたは因子Ｘａの量は対照試料
の凝血時間がまた６５秒であるようにする。
または精製牛因子Ｘ、を使用する。この半精製凝血系で
は、使用したトロンビンまたは因子Ｘａの量は対照試料
の凝血時間がまた６５秒であるようにする。
トロンビン形成試験は次のとおりにして行なった：
精製牛因子Ｘａ（１５０ｎＭ ） ２０ ｍａｌ、Ｃａ
Ｃｊ２（１００ｍＭ ） ３０１１０１、稀ＶＡＣ３Ｑ
ｍａｌおよびＰ ８／Ｐ Ｃ−りン脂質膜（最Ｐ：ｍ
度は第６図に示されている） ３０ ｍｃｌを、ＴＢＳ
Ａ （０，５Ｍ９／ １１）ヒト血清アルデミン含有Ｔ
ＢＳ） １８１ ｍａ１含有プラスチック皿に入れる。
Ｃｊ２（１００ｍＭ ） ３０１１０１、稀ＶＡＣ３Ｑ
ｍａｌおよびＰ ８／Ｐ Ｃ−りン脂質膜（最Ｐ：ｍ
度は第６図に示されている） ３０ ｍｃｌを、ＴＢＳ
Ａ （０，５Ｍ９／ １１）ヒト血清アルデミン含有Ｔ
ＢＳ） １８１ ｍａ１含有プラスチック皿に入れる。
混合物を３７℃で３分間、テフロン攪拌機を用いて攪拌
する。トロンビン形成は精製牛因子■（３３，３３ｍｃ
Ｍ ） ９ ｍｃｌを加えることにより開始させる。種
々の経過時間の後釦、試料５ Ｑ ｍａｌを反応混合物
から採取し、次いでサーモスタットで３７℃ｔｃｍ度調
節した、ＴＢ８１！ｉ ９ Ｑ Ｑ ｍａｌおよび色原
性基質Ｓ ２２３８ （５ｍＭ ） ５ ｗａｌを含有
する１ｄ容積のプラスチック皿の内容物に加える。
する。トロンビン形成は精製牛因子■（３３，３３ｍｃ
Ｍ ） ９ ｍｃｌを加えることにより開始させる。種
々の経過時間の後釦、試料５ Ｑ ｍａｌを反応混合物
から採取し、次いでサーモスタットで３７℃ｔｃｍ度調
節した、ＴＢ８１！ｉ ９ Ｑ Ｑ ｍａｌおよび色原
性基質Ｓ ２２３８ （５ｍＭ ） ５ ｗａｌを含有
する１ｄ容積のプラスチック皿の内容物に加える。
反応混合物中のトロンビンの量をコントロン スペクト
ロメーター ウビコン（ＫｏｎｔｒｏｎＳｐｅｃｔｒｏ
ｍｅｔｅｒ Ｕｖｉｋｏｎ ） ８１０で、既知量の精
製牛トロンビンを用いた分析からグラフに描かれた評価
曲線を使用して測定した４ Ｄ ５ ｎｍにおける吸光
値の変化から計算する。ＶＡＣにより生じた抑止チは次
のように定める： 抑止俤−（１−−）Ｘ１００チ （式中ａはｎＭ ＩＩａ／分車位のｖＡＣ不在における
トロンビン形成速度であり、そしてｂはｎＭＩＩａ／分
単位のＶＡＣ不在忙おけるトロンビン形成速度である）
。
ロメーター ウビコン（ＫｏｎｔｒｏｎＳｐｅｃｔｒｏ
ｍｅｔｅｒ Ｕｖｉｋｏｎ ） ８１０で、既知量の精
製牛トロンビンを用いた分析からグラフに描かれた評価
曲線を使用して測定した４ Ｄ ５ ｎｍにおける吸光
値の変化から計算する。ＶＡＣにより生じた抑止チは次
のように定める： 抑止俤−（１−−）Ｘ１００チ （式中ａはｎＭ ＩＩａ／分車位のｖＡＣ不在における
トロンビン形成速度であり、そしてｂはｎＭＩＩａ／分
単位のＶＡＣ不在忙おけるトロンビン形成速度である）
。
タンパク質
ビタミンに一依存因子プロトロンビンおよび因子Ｘ、は
クエン酸塩処理した牛血漿の精製により得られる〔ステ
ンフロ（１３ｔｅｎｆｌｏ ：ｒ、 ）によるジャーナ
ル オデ バイオロジカル ケミストリイ（、Ｔ、 Ｂ
１０１． Ｃ！ｈｅｍ、 ）、２５１．３５５〜３６３
頁（１９７６年）′−参照〕。クエン酸バリウム吸着お
よび溶出、硫酸アンモニウムによる分別およびＤＩ！Ｘ
ＡＩ！！−セファデックス上でのクロマトグラフィの後
に、プロトロンビンおよび因子ＩＸまたは因子Ｘの混合
物を含有する２種のタンパク質留分が・ 得られる。因
子Ｘはフシカワらの方法（（ＩＰｕｊｉｋａｖａ ｅｔ
ａｌ、 ）、バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ） ｌ ｉ、４８８２〜４８９１頁（１９７
２年）〕を使用し、およびＲＶＶ−Ｘ（７シカワら（Ｆ
ｕｊｉｋａｗａ ａｔ ａｌ、 ）、バイオケミストリ
イ、１１．４８９２〜４８９９頁（１９７２年）〕を使
用して活性化する。プロトロンビンは因子ＩＸからヘパ
リン−寒天親和クロマトグラフイ〔フシカワら、バイオ
ケミストリボ、１２．４９３８〜４９４５頁〕釦より分
離する。ヘパリン−寒天カラムからのプロトロンビン含
有留分を集め、オーベエンスら（０ｖｅｎｓ ｅｔ ａ
ｍ、 ）の方法〔ジャーナル オデ バイオロジカル
ケミストリ イ （ｘ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２ ４ ９ 、 ５９４〜６０５頁（１９７
４年）〕を用いてさらに精製する。プロトロンビンおよ
び因子Ｘａの濃度はロージングら（Ｒｏｓｉｎｇ ｅｔ
ａｌ、 ）の方法〔ジャーナル オデバイオロジカル
ケミストリボ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２５
５．２７４〜２８３頁（１９８０年）〕を用いて測定す
る。ＢＴＰはバンダムーメイヤース（Ｖａｎ Ｄａｍ−
Ｍｉｅｒｅｓ ）らにより「デルード コーアギュレー
ション エンデイムス、メＩＩ Ｐ オデ エンデ
ィマチック アナリシス、ベルラグケミ−社（’ Ｂｌ
ｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ −
ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎａｌ
ｙｓｉｇ ’、ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）
、（ワインハイム市）に記載されている方法を用いて測
定する。タンパク質濃度はローリボ（ＬＯｗｒｙ ）ら
によりジャーナル オデバイオロジカル ケミストリボ
（、Ｔ、 Ｂ１１１゜Ｃｈｅｍ。）、１９３．２６５貞
（１９５１年）に記載された方法により測定する。
クエン酸塩処理した牛血漿の精製により得られる〔ステ
ンフロ（１３ｔｅｎｆｌｏ ：ｒ、 ）によるジャーナ
ル オデ バイオロジカル ケミストリイ（、Ｔ、 Ｂ
１０１． Ｃ！ｈｅｍ、 ）、２５１．３５５〜３６３
頁（１９７６年）′−参照〕。クエン酸バリウム吸着お
よび溶出、硫酸アンモニウムによる分別およびＤＩ！Ｘ
ＡＩ！！−セファデックス上でのクロマトグラフィの後
に、プロトロンビンおよび因子ＩＸまたは因子Ｘの混合
物を含有する２種のタンパク質留分が・ 得られる。因
子Ｘはフシカワらの方法（（ＩＰｕｊｉｋａｖａ ｅｔ
ａｌ、 ）、バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ） ｌ ｉ、４８８２〜４８９１頁（１９７
２年）〕を使用し、およびＲＶＶ−Ｘ（７シカワら（Ｆ
ｕｊｉｋａｗａ ａｔ ａｌ、 ）、バイオケミストリ
イ、１１．４８９２〜４８９９頁（１９７２年）〕を使
用して活性化する。プロトロンビンは因子ＩＸからヘパ
リン−寒天親和クロマトグラフイ〔フシカワら、バイオ
ケミストリボ、１２．４９３８〜４９４５頁〕釦より分
離する。ヘパリン−寒天カラムからのプロトロンビン含
有留分を集め、オーベエンスら（０ｖｅｎｓ ｅｔ ａ
ｍ、 ）の方法〔ジャーナル オデ バイオロジカル
ケミストリ イ （ｘ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２ ４ ９ 、 ５９４〜６０５頁（１９７
４年）〕を用いてさらに精製する。プロトロンビンおよ
び因子Ｘａの濃度はロージングら（Ｒｏｓｉｎｇ ｅｔ
ａｌ、 ）の方法〔ジャーナル オデバイオロジカル
ケミストリボ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２５
５．２７４〜２８３頁（１９８０年）〕を用いて測定す
る。ＢＴＰはバンダムーメイヤース（Ｖａｎ Ｄａｍ−
Ｍｉｅｒｅｓ ）らにより「デルード コーアギュレー
ション エンデイムス、メＩＩ Ｐ オデ エンデ
ィマチック アナリシス、ベルラグケミ−社（’ Ｂｌ
ｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ −
ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎａｌ
ｙｓｉｇ ’、ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）
、（ワインハイム市）に記載されている方法を用いて測
定する。タンパク質濃度はローリボ（ＬＯｗｒｙ ）ら
によりジャーナル オデバイオロジカル ケミストリボ
（、Ｔ、 Ｂ１１１゜Ｃｈｅｍ。）、１９３．２６５貞
（１９５１年）に記載された方法により測定する。
リン脂質、リン脂質膜およびリン脂質リボ・戸−ムの製
造 １．２−ゾオレオイルーａｎ−グリセロ−６−ホスホコ
リン（１８：１シス／１８：１シス−ｐｃ）および１，
２−オレオイル−ａｎ−グリセロ−６−ホスホセリン（
１８：１シス／１８：１シス−ｐｓ）をロージング（Ｒ
ｏｅｉｎｇ）らによりジャーナル オデ バイオロジカ
ル ケミストリボ（：ｒ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２５５．２７４〜２８３頁（１９８０年）に記載さ
れたとおりにして製造する。２層よりなるｐｃおよびＰ
Ｓの別々のリン脂質膜を超音波を使用して、ロージング
らによりジャーナル オプ バイオロジカル ケミスト
リボ、２２５．２７４〜２８３頁（１９８０年）に記載
されたとおり和して製造する。リン脂質リポゾームの供
給溶液は必要量のリン脂質をクロロホルムに溶解するこ
と和より製造する。クロロホルムは窒素を使用して蒸発
させる。残留するリン脂質を数個のガラスピーズと６分
間注意して混合した５チグリセロール含有ＴＢａ中に懸
濁し、次いで１０．０００ ｘｇで１０分間、遠心分離
する。この溶液を捨て、残留物を５チグリセロール含有
ＴＢ８に注意して再懸濁する；この方法でリン脂質−リ
ボ・戸−ム供給溶液が得られる。これらのりボゾームは
室温で貯蔵する。リン脂質濃度はボッチャー（Ｂｏｔｔ
ｃｈｅｒ ）らによるリン酸塩分析〔アナル。
造 １．２−ゾオレオイルーａｎ−グリセロ−６−ホスホコ
リン（１８：１シス／１８：１シス−ｐｃ）および１，
２−オレオイル−ａｎ−グリセロ−６−ホスホセリン（
１８：１シス／１８：１シス−ｐｓ）をロージング（Ｒ
ｏｅｉｎｇ）らによりジャーナル オデ バイオロジカ
ル ケミストリボ（：ｒ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
） ２５５．２７４〜２８３頁（１９８０年）に記載さ
れたとおりにして製造する。２層よりなるｐｃおよびＰ
Ｓの別々のリン脂質膜を超音波を使用して、ロージング
らによりジャーナル オプ バイオロジカル ケミスト
リボ、２２５．２７４〜２８３頁（１９８０年）に記載
されたとおり和して製造する。リン脂質リポゾームの供
給溶液は必要量のリン脂質をクロロホルムに溶解するこ
と和より製造する。クロロホルムは窒素を使用して蒸発
させる。残留するリン脂質を数個のガラスピーズと６分
間注意して混合した５チグリセロール含有ＴＢａ中に懸
濁し、次いで１０．０００ ｘｇで１０分間、遠心分離
する。この溶液を捨て、残留物を５チグリセロール含有
ＴＢ８に注意して再懸濁する；この方法でリン脂質−リ
ボ・戸−ム供給溶液が得られる。これらのりボゾームは
室温で貯蔵する。リン脂質濃度はボッチャー（Ｂｏｔｔ
ｃｈｅｒ ）らによるリン酸塩分析〔アナル。
キミ、アクタ、 （Ａｎａｌ、 Ｃｈｉｎ、 Ａｃｔａ
、 ） ’ｌ ４．２０３〜２０７頁（１９６１年）〕
により測定する。
、 ） ’ｌ ４．２０３〜２０７頁（１９６１年）〕
により測定する。
８Ｄ８ − ＦＡＩ
ＳＤＳの存在における板上でのデル電気泳動をラエムリ
（Ｌａｅｍｌｉ ） Ｋより記載された方法〔ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ ）、２２７．６８０〜６８５頁（１
９７０年））に従い、アクリルアミド１０重量Ｉ ＮＩ
Ｎ３−メチレン−ビスアクリルアミｒＯ，２７！Ｊ
１％オヨヒｓＤｓ Ｏ，１１１ｔｌヲ含有するデルを使
用して行なう。減じられたジスルフィド架橋を有するデ
ル試料中にβ−メルカプトエタノール５！Ｊ［を存在さ
せる。デルは下記のとおりに染色する： １）エタノール５０重量慢中のコーマツシイプ／Ｉ／
−（ｃｏｏｍａｇｓｉａ Ｂｌｕθ）Ｒ−２５００，２
５１ｔチおよび酢酸１５重量％で染色し、エタノールｉ
ｏｗｅｓおよび酢酸１０重量係で脱色。
（Ｌａｅｍｌｉ ） Ｋより記載された方法〔ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ ）、２２７．６８０〜６８５頁（１
９７０年））に従い、アクリルアミド１０重量Ｉ ＮＩ
Ｎ３−メチレン−ビスアクリルアミｒＯ，２７！Ｊ
１％オヨヒｓＤｓ Ｏ，１１１ｔｌヲ含有するデルを使
用して行なう。減じられたジスルフィド架橋を有するデ
ル試料中にβ−メルカプトエタノール５！Ｊ［を存在さ
せる。デルは下記のとおりに染色する： １）エタノール５０重量慢中のコーマツシイプ／Ｉ／
−（ｃｏｏｍａｇｓｉａ Ｂｌｕθ）Ｒ−２５００，２
５１ｔチおよび酢酸１５重量％で染色し、エタノールｉ
ｏｗｅｓおよび酢酸１０重量係で脱色。
２）セグレスト（８層ｇｒｅｅｔ ）らにより［メンー
ズ イン エンディモロシイＪ （Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
］！ｚｇ７ｍｏｌｏｇ７ Ｊ、２８巻、５４〜６３頁
（１９７２年）に記載された方法を使用して塩基性ファ
クシンから生成されたシックの試薬〔メルク社（Ｍｅｒ
ｃｋ ）を用いて染色。
ズ イン エンディモロシイＪ （Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
］！ｚｇ７ｍｏｌｏｇ７ Ｊ、２８巻、５４〜６３頁
（１９７２年）に記載された方法を使用して塩基性ファ
クシンから生成されたシックの試薬〔メルク社（Ｍｅｒ
ｃｋ ）を用いて染色。
３）メリル（Ｍｅｒｒｉｌ ）らによりエレクトロホレ
シス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ）、６．１７
〜２３頁（１９８２年）に記載されたとおりにして銀で
染色。
シス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ）、６．１７
〜２３頁（１９８２年）に記載されたとおりにして銀で
染色。
等電点決定
タンパク質の等電−測定はアムホリン担体アムホライト
を含有する既製の薄層ポリアクリルアミド（ＦＡＧ板、
ＩＪＫＢ ）を用いて６．５〜９．５の範囲の−で製造
者の指示書に従い行なう。ゲルの一勾配はアノ−ｐとカ
ノードとの間の線に沿ってデルス） ＩＪツブを切断す
ることにより等電点の焦点を合せた後忙直ち釦測定する
。電解質は蒸留水を使用して各ストリップから溶出し、
水のβ値を組合せガラス電極を用いて測定する。
を含有する既製の薄層ポリアクリルアミド（ＦＡＧ板、
ＩＪＫＢ ）を用いて６．５〜９．５の範囲の−で製造
者の指示書に従い行なう。ゲルの一勾配はアノ−ｐとカ
ノードとの間の線に沿ってデルス） ＩＪツブを切断す
ることにより等電点の焦点を合せた後忙直ち釦測定する
。電解質は蒸留水を使用して各ストリップから溶出し、
水のβ値を組合せガラス電極を用いて測定する。
Ｇｌａ測定はクワダ（Ｋｕｗａｄａ ）らの方法〔アナ
Ａ／、バイオケミ、（ムｎａ１． Ｂｉｏａｈｅｍ、
） １３１５１７３〜１７９頁（１，９８３年）〕を使
用して、「ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ） ５
ＥＩ Ｂ’ Ｊカラム〔チロンパツク（ｃ肚ＯＭＰＡ
ＣＫ ） ）上でのＴＩＰＩ、Ｃ’により行なう。
Ａ／、バイオケミ、（ムｎａ１． Ｂｉｏａｈｅｍ、
） １３１５１７３〜１７９頁（１，９８３年）〕を使
用して、「ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ） ５
ＥＩ Ｂ’ Ｊカラム〔チロンパツク（ｃ肚ＯＭＰＡ
ＣＫ ） ）上でのＴＩＰＩ、Ｃ’により行なう。
例 ２
必要なリン脂質をクロロホルムに溶解し、カラム材料ス
フエロシル〔ローン−ブーラン社（Ｒｈ０ｎ６−ＰＯｕ
ｌｅｎｅ ） ）にスフエソシル１１当りリン脂′ｘ５
１１９の比率で加える。クロロホルムをＮ２ガスにより
蒸発させ、乾燥したスフェロシルリン脂質を次いでＶＡ
Ｃが懸濁されている緩衝液で洗浄する。リン脂質の若干
が負に！電している場合に、ｖＡＣはＣａ”＋および（
または） Ｍｎ” ”）存在でスフエロシル結合リン脂
質に結合する。
フエロシル〔ローン−ブーラン社（Ｒｈ０ｎ６−ＰＯｕ
ｌｅｎｅ ） ）にスフエソシル１１当りリン脂′ｘ５
１１９の比率で加える。クロロホルムをＮ２ガスにより
蒸発させ、乾燥したスフェロシルリン脂質を次いでＶＡ
Ｃが懸濁されている緩衝液で洗浄する。リン脂質の若干
が負に！電している場合に、ｖＡＣはＣａ”＋および（
または） Ｍｎ” ”）存在でスフエロシル結合リン脂
質に結合する。
例 ３
カオリン（基本的凝血を触媒する人工表面、この場合忙
粉砕ガラス）、イノシチン（リン脂質表面）およびＶ’
ＡＣが存在する緩衝液（２５ｍＭ ） １７ス／ ＭＣ
Ｉ 、 ｐＨ７−５、１００ｍＭ ＭａＣｊ ）
２ ０ ０ ｍ（！１をクエン酸塩処理した血小板
を含有しない血漿５ Ｑ ｍａｌと混合する。この混合
物を３７℃で３分間インキエベートシ、その後Ｃａ＋“
緩衝液（２００ｍＭ ）リス／ ＨＣＩ、ｐ）Ｉ ７．
５．８Ｑ ｍＭ ＮａＣｊ、２０ ｍｘ ＣａＣｊ２
） ２５０ ｍｃｌを加える。凝血時間は例１と同様化
して測定する。
粉砕ガラス）、イノシチン（リン脂質表面）およびＶ’
ＡＣが存在する緩衝液（２５ｍＭ ） １７ス／ ＭＣ
Ｉ 、 ｐＨ７−５、１００ｍＭ ＭａＣｊ ）
２ ０ ０ ｍ（！１をクエン酸塩処理した血小板
を含有しない血漿５ Ｑ ｍａｌと混合する。この混合
物を３７℃で３分間インキエベートシ、その後Ｃａ＋“
緩衝液（２００ｍＭ ）リス／ ＨＣＩ、ｐ）Ｉ ７．
５．８Ｑ ｍＭ ＮａＣｊ、２０ ｍｘ ＣａＣｊ２
） ２５０ ｍｃｌを加える。凝血時間は例１と同様化
して測定する。
例 ４
ヒト血液を静脈注射忙よりクエン酸三ナトリウム（約１
３ｍＭクエン酸塩の最Ｍａ度）に採血し、２０００ ｘ
ｇで室温において１０分間遠心分離する。生成する血漿
を１０．０００ｘｇで１５分間再遠心分離して、血小板
を含有しない血漿（ＰＰＰ ）を得る。数人の健康な献
血者から得られた血漿を混合することによりＩ’ＦＰの
標準プールを作る。
３ｍＭクエン酸塩の最Ｍａ度）に採血し、２０００ ｘ
ｇで室温において１０分間遠心分離する。生成する血漿
を１０．０００ｘｇで１５分間再遠心分離して、血小板
を含有しない血漿（ＰＰＰ ）を得る。数人の健康な献
血者から得られた血漿を混合することによりＩ’ＦＰの
標準プールを作る。
ヒト贋帯を出産後１５分間以内に得る。この動脈を水冷
ＴＢＳ緩衝液で直ち忙潅流し、次いでジエリイ オシ
ワートン（Ｊｅｌｌｙ ｏｆ Ｗａｒｔｏｎ ）から自
由に製造し、回転ミキサー〔ブラウン（Ｂｒａｕｎ ）
ＭＸ３２を用いて’１’Ｂ８中で均質化する。１０繋均
質物（重量／容量）を分別する。
ＴＢＳ緩衝液で直ち忙潅流し、次いでジエリイ オシ
ワートン（Ｊｅｌｌｙ ｏｆ Ｗａｒｔｏｎ ）から自
由に製造し、回転ミキサー〔ブラウン（Ｂｒａｕｎ ）
ＭＸ３２を用いて’１’Ｂ８中で均質化する。１０繋均
質物（重量／容量）を分別する。
この均質物のセファデックスＧ−１００上での１０＋０
００ ｘｇ何回転下上澄液分別により再現可能な特異な
様相が得られる（第７図参照）。■買で測定して凝血系
であると見做される留分が第７図に示されている。凝血
原活性は空容積（ｖｏｉｄｖｏｘｕｍｅ ）で溶出する
。この活性はヒト先天的因子ｘａ−不足血漿を使用した
実験により示されるよう釦、ＭＰＴＴ中の因子ｖｎの存
在で検知できるだけである。従って、この凝血原は組織
トロンボプラスチンであると考えねばならない。
００ ｘｇ何回転下上澄液分別により再現可能な特異な
様相が得られる（第７図参照）。■買で測定して凝血系
であると見做される留分が第７図に示されている。凝血
原活性は空容積（ｖｏｉｄｖｏｘｕｍｅ ）で溶出する
。この活性はヒト先天的因子ｘａ−不足血漿を使用した
実験により示されるよう釦、ＭＰＴＴ中の因子ｖｎの存
在で検知できるだけである。従って、この凝血原は組織
トロンボプラスチンであると考えねばならない。
成る留分は明確な抗凝血活性を示した。これらの留分を
集め、ＤＩＡＪＣ−セファセル クロマトグラフィによ
りさらに精製する（第８ム図参照）。
集め、ＤＩＡＪＣ−セファセル クロマトグラフィによ
りさらに精製する（第８ム図参照）。
この抗凝血体は５ Ｑ ｍＭ ＮａＣｊおよび５０ ｍ
Ｍ ）リス／１１（’ｊ（ｐＨ７，９）でＤＩＡＩＣ−
セファセルに結合するように見える。この活性をＮａＣ
Ｊの直線勾配でｐＨ７，９において、１５０〜１６０
ｍＭ ＭａＣｊで溶出する。抗凝血活性を示すＤＩＡＩ
！ｉ留分を集め、セフ丁デツクスＧ−７５デル濾過忙処
する（！８ Ｂ図参照）。このカラム（１，５Ｘ ５０
信）はＴＢＳで平衡にする。この活性は約３０，０００
〜６０，０００ダルトンの分子量に相当する留分忙現わ
れる。
Ｍ ）リス／１１（’ｊ（ｐＨ７，９）でＤＩＡＩＣ−
セファセルに結合するように見える。この活性をＮａＣ
Ｊの直線勾配でｐＨ７，９において、１５０〜１６０
ｍＭ ＭａＣｊで溶出する。抗凝血活性を示すＤＩＡＩ
！ｉ留分を集め、セフ丁デツクスＧ−７５デル濾過忙処
する（！８ Ｂ図参照）。このカラム（１，５Ｘ ５０
信）はＴＢＳで平衡にする。この活性は約３０，０００
〜６０，０００ダルトンの分子量に相当する留分忙現わ
れる。
抗凝血活性の量の測定のための定量分析としてＭＰＴＴ
を使用する（第９図参照）。抗凝血活性の１単位は凝血
の開始剤としくＨＴＰ（最終濃度９５μｙタンパク質／
ｌ１ｌｊ）を使用してＭＰＴＴ中における凝塊形成時間
を６５秒のその対照値から１００秒忙延長する量と定義
する。この分析を用いて、湿った動脈組織１０ｇから、
約１２００単位の抗凝血活性を有するタンパク質２１１
９が単離できることが計算された。
を使用する（第９図参照）。抗凝血活性の１単位は凝血
の開始剤としくＨＴＰ（最終濃度９５μｙタンパク質／
ｌ１ｌｊ）を使用してＭＰＴＴ中における凝塊形成時間
を６５秒のその対照値から１００秒忙延長する量と定義
する。この分析を用いて、湿った動脈組織１０ｇから、
約１２００単位の抗凝血活性を有するタンパク質２１１
９が単離できることが計算された。
変性プロトロンビン時間試験は下記のとおりにして行な
う： シリコン処理したガラス キュベツトで、ＰＩＦＰ５０
ｍｃｌをＴＢＳ １５０ ｍａｌ、標単１１１ＴＰ稀
釈液２５ＺＩＩｃユおよびＴＢＳ （対照） ２５ ｍ
ｏユまたは動脈均質物留分２５ ｍａｌと３７℃でかき
まぜる。３分間インキュベートした後に、ゼロ時点でＣ
ａｚ＋緩衝液（８０ｍＭ ＮａＣＪ −２０ｍＭ （’
ＬＣＪ２およびｉ ｏ ｍＭ ）リス／ＨＣＩ ；ｐＨ
７，９） ２５０ｍｃ１の添加により凝血を開始させる
。フイデ１７・ン形成は「ペイトン デュアル アダレ
ゾ−ジョン モジュー ルＪ （Ｐａｙｔｏｎ ｎｕａ
ｌムｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ）を用いて
光学的に追跡する。因子ＸｉａをＭＰＴＴ中で凝血の開
始に使用した場合に、ＨＴＩ”は省略し、精製因子Ｘａ
２５ ｍａｌをＣａ”＋緩衝液２５０ ｍａｌとともに
稀釈Ｐ１１’Ｐに加える。
う： シリコン処理したガラス キュベツトで、ＰＩＦＰ５０
ｍｃｌをＴＢＳ １５０ ｍａｌ、標単１１１ＴＰ稀
釈液２５ＺＩＩｃユおよびＴＢＳ （対照） ２５ ｍ
ｏユまたは動脈均質物留分２５ ｍａｌと３７℃でかき
まぜる。３分間インキュベートした後に、ゼロ時点でＣ
ａｚ＋緩衝液（８０ｍＭ ＮａＣＪ −２０ｍＭ （’
ＬＣＪ２およびｉ ｏ ｍＭ ）リス／ＨＣＩ ；ｐＨ
７，９） ２５０ｍｃ１の添加により凝血を開始させる
。フイデ１７・ン形成は「ペイトン デュアル アダレ
ゾ−ジョン モジュー ルＪ （Ｐａｙｔｏｎ ｎｕａ
ｌムｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ）を用いて
光学的に追跡する。因子ＸｉａをＭＰＴＴ中で凝血の開
始に使用した場合に、ＨＴＩ”は省略し、精製因子Ｘａ
２５ ｍａｌをＣａ”＋緩衝液２５０ ｍａｌとともに
稀釈Ｐ１１’Ｐに加える。
この分析は前記のＸａ−開始ＭＰＴＴと同様に行なう。
但しｘａ−試料の代りに精製トロンビン２５ ｍａｌを
使用する。
使用する。
タンパク質
プロテアーゼ タイ７°Ｉおよびトリプシン１ｍｃ３．
４．２．１．４）はシグマ（８１６ｍａ ）から得る。
４．２．１．４）はシグマ（８１６ｍａ ）から得る。
ＨＴＰはパン ダム ミニラス（’７ａｎＤａｍ Ｍｉ
ｅｒａｓ ）らによりメソーズ オデ エンディマチッ
ク アナリシス （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｌｌｆｎｚ
ｙｍａｔｉｃ・ムｎａｌｙｓｉｓ ） ５．５５２〜３
６５頁（１９８４年）に記載されたようにしてヒト脳か
ら製造する。因子Ｘｔａｓ ｆロトロンピンオヨヒトロ
ンピンはロージイングはロージングら忙よりジャーナル
オデバイオロジカル ケミストリイ（、Ｔ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２５５．２７４〜２８３頁（１９
８０年）に記載されたようにして、クエン酸塩処理した
牛血液から精製する。因子Ｖはリンｒホー） （Ｌｉｎ
ｄｈｏｕｔ ）らによりバイオケミストリイ、２１．４
５９４〜５５０２頁（１９８２年）に記載されたように
して、牛血液から！′ＩＩＨする。因子ｖｅＬは因子Ｖ
をトロンビンとインキュベートすることにより得る。
ｅｒａｓ ）らによりメソーズ オデ エンディマチッ
ク アナリシス （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｌｌｆｎｚ
ｙｍａｔｉｃ・ムｎａｌｙｓｉｓ ） ５．５５２〜３
６５頁（１９８４年）に記載されたようにしてヒト脳か
ら製造する。因子Ｘｔａｓ ｆロトロンピンオヨヒトロ
ンピンはロージイングはロージングら忙よりジャーナル
オデバイオロジカル ケミストリイ（、Ｔ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２５５．２７４〜２８３頁（１９
８０年）に記載されたようにして、クエン酸塩処理した
牛血液から精製する。因子Ｖはリンｒホー） （Ｌｉｎ
ｄｈｏｕｔ ）らによりバイオケミストリイ、２１．４
５９４〜５５０２頁（１９８２年）に記載されたように
して、牛血液から！′ＩＩＨする。因子ｖｅＬは因子Ｖ
をトロンビンとインキュベートすることにより得る。
プロトロンビン濃度は分子を７２，０００およびら：ジ
ャーナル オプ バイオロジカル ケミスト リ イ
（：ｒ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ） 、
２４９ 、 ５９４〜６０５頁（１９７４年）〕、およ
び因子Ｖ濃度は算する〔ネセイン（Ｍｅａｈｅｌｍ ）
ら：ジャーナルオデ バイオロジカル ケミストリイ（
ｘ、 Ｂｉｏｌ。
ャーナル オプ バイオロジカル ケミスト リ イ
（：ｒ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ） 、
２４９ 、 ５９４〜６０５頁（１９７４年）〕、およ
び因子Ｖ濃度は算する〔ネセイン（Ｍｅａｈｅｌｍ ）
ら：ジャーナルオデ バイオロジカル ケミストリイ（
ｘ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 ）、２５４．５０８〜５１７頁（１９７９
年）〕。
年）〕。
因子Ｘａおよびトロンビン濃度は活性部位滴定に ・
より決定する〔ロージング（Ｒｏｓｉｎｇ ）ら；ジャ
ーナル オプ バイオロジカル ケミストリイ（：ｒ、
Ｂｉｏｌ、、 Ｃｈｅｍ、 ）、２５６．２７４〜２
８３頁（１９８０年）〕、その他のタンパク質濃度はロ
ーリイ（Ｌｏｗｒ７ ）らによりジャーナル オプバイ
オロジカル ケミストリイ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、χ１９６．２６５頁に記載のとおりに決定する。
より決定する〔ロージング（Ｒｏｓｉｎｇ ）ら；ジャ
ーナル オプ バイオロジカル ケミストリイ（：ｒ、
Ｂｉｏｌ、、 Ｃｈｅｍ、 ）、２５６．２７４〜２
８３頁（１９８０年）〕、その他のタンパク質濃度はロ
ーリイ（Ｌｏｗｒ７ ）らによりジャーナル オプバイ
オロジカル ケミストリイ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、χ１９６．２６５頁に記載のとおりに決定する。
リン脂質および脂質小胞の製造
０１ｅ２Ｇｒｏ −Ｐ −Ｃｈｏ （１、２−ゾオレオ
イルー１３ｎ−グリセロ−６−ホスホコリン）および０
１ｅ２Ｇｒｏ−Ｐ −８ｅｒ （１ｅ ２−ジオレオ
イル−ｓｎ −グリセロ−３−ホスホセリン）はロージ
ングら忙より記載された（１９８０年）とおりにして製
造する。０１ｅ２ＧｒＯ−Ｚ Ｂａｒ ／ ０１ｅ２
Ｇｒｏ −Ｅ −Ｃｈ。
イルー１３ｎ−グリセロ−６−ホスホコリン）および０
１ｅ２Ｇｒｏ−Ｐ −８ｅｒ （１ｅ ２−ジオレオ
イル−ｓｎ −グリセロ−３−ホスホセリン）はロージ
ングら忙より記載された（１９８０年）とおりにして製
造する。０１ｅ２ＧｒＯ−Ｚ Ｂａｒ ／ ０１ｅ２
Ｇｒｏ −Ｅ −Ｃｈ。
（そル比２０：８０）よりなる１個の２層小胞は超音波
処理忙より製造する。リン脂質濃度はプツチャー（Ｂ”
ｏｔｔｃｈｅｒ ）らの方法（７ナル、Ａ’ミ。
処理忙より製造する。リン脂質濃度はプツチャー（Ｂ”
ｏｔｔｃｈｅｒ ）らの方法（７ナル、Ａ’ミ。
アクタ（Ａｎａｌ、 Ｃｈｉｎ、 Ａｃｔａ ）、２４
．２０３〜２０７頁（１９６１年）〕によるリン酸塩分
析により測定する。
．２０３〜２０７頁（１９６１年）〕によるリン酸塩分
析により測定する。
プロトロンビン活性の時間経過は異なる濃度の抗凝血剤
で評価する。（Ｘ、Ｃａ”）、（ｘ。
で評価する。（Ｘ、Ｃａ”）、（ｘ。
ａ ａリン
脂質、Ｃａ ２ ＋ ）または（”ａ ％ ｖａ、リン
脂質、Ｃａ” ）の混合物を５０ ｍＭ ）リス／ Ｍ
ＣＩ 。
脂質、Ｃａ ２ ＋ ）または（”ａ ％ ｖａ、リン
脂質、Ｃａ” ）の混合物を５０ ｍＭ ）リス／ Ｍ
ＣＩ 。
１７５ ｍＭ ＮａＣ１，０，５１１９／ｄ ヒ） 血
清フルプミン中でｐＨ７，９において６７℃で異なる量
の抗凝血剤ととも、にかきまぜる。３分後忙、プロトロ
ンビン −活性化はプロテア−ゼの添゛加により開始さ
せる。
清フルプミン中でｐＨ７，９において６７℃で異なる量
の抗凝血剤ととも、にかきまぜる。３分後忙、プロトロ
ンビン −活性化はプロテア−ゼの添゛加により開始さ
せる。
異なる時間間隔で、試料２５ ｍｃｌを反応混合物から
、ＴＢＳ 、 ２ ｍＭ ＫＤＴＡおよび０．２３
ｍＭ ８２２３８（＃終審量＝１Ｍ）を含有するキュベ
ツト（３７℃にサーモスタットにより調節する）に移す
、コントロン スペクトロホトメーター ウピコン８１
０で測定し、既知量の精製トロンビンを用いた分析にも
とづいてグラフに描いた評価曲線と測定した４ ０５
ｎｘＱにおける吸光値の変化から、生成されたトロンビ
ンの量を異なる濃度の抗凝血剤について計算する。
、ＴＢＳ 、 ２ ｍＭ ＫＤＴＡおよび０．２３
ｍＭ ８２２３８（＃終審量＝１Ｍ）を含有するキュベ
ツト（３７℃にサーモスタットにより調節する）に移す
、コントロン スペクトロホトメーター ウピコン８１
０で測定し、既知量の精製トロンビンを用いた分析にも
とづいてグラフに描いた評価曲線と測定した４ ０５
ｎｘＱにおける吸光値の変化から、生成されたトロンビ
ンの量を異なる濃度の抗凝血剤について計算する。
リン脂質は２０：８０のモル比のＯ’１Ｊ２ＧｒＯ−ｇ
−Ｓｅｒおよび０１ｅ２ＣｋＴＯ−Ｐ−Ｃｈｏよりなる
小胞として加える。
−Ｓｅｒおよび０１ｅ２ＣｋＴＯ−Ｐ−Ｃｈｏよりなる
小胞として加える。
Ｇ−７５クロマトグラフイの数留分にりいて、ＭＰＴＴ
中で試験し、８Ｄ８− ＰＡＧＦ！で分析する。この結
果（第１０図）はこの抗凝血剤が約３２，０００ダルト
ンの分子量を有することを示唆した。抗凝血活性と３２
に一帯との間の関係はポリアクリル７ミｖ ｒルを薄片
に切り、次いでこの薄片から牛血清アルブミン０．５Ｉ
ＩＩ９／ｊＬ（含有ＴＢＥＩ 忙よりタンパク質を溶出
することにより確認する。抗凝血活性は３２に一帯に相
当する薄片からの溶出液中にだけ見い出された。さらに
また、この活性は５６℃で熱的に移動性であることが見
い出され、原材料と同様のＭＰＴＴ ＩＣおける投与量
応答関係を有することが示された。
中で試験し、８Ｄ８− ＰＡＧＦ！で分析する。この結
果（第１０図）はこの抗凝血剤が約３２，０００ダルト
ンの分子量を有することを示唆した。抗凝血活性と３２
に一帯との間の関係はポリアクリル７ミｖ ｒルを薄片
に切り、次いでこの薄片から牛血清アルブミン０．５Ｉ
ＩＩ９／ｊＬ（含有ＴＢＥＩ 忙よりタンパク質を溶出
することにより確認する。抗凝血活性は３２に一帯に相
当する薄片からの溶出液中にだけ見い出された。さらに
また、この活性は５６℃で熱的に移動性であることが見
い出され、原材料と同様のＭＰＴＴ ＩＣおける投与量
応答関係を有することが示された。
ピーク抗凝血活性を含有するＧ−７５留分を集め、これ
を用いてこの抗凝血剤の特徴をさらに確認する。この抗
凝血剤を５６℃でインキュベートすると、活性が測定で
きない２分後まで急速忙減少する。この抗凝血剤は３７
℃でプロテアーゼタイプＩとともにインキュベートする
と２時間以内にその活性を完全に失い、他方トリプシン
は３時間のインキュベーションの後に抗凝血剤をはとん
ど不活性化しない（第１１図参照）。これらの実験で使
用されたプロテアーゼ タイプ■およびチロシン濃度は
２．５ ｎＭ ）ロンビンを１５分で完全く不活性化す
る。反応混合物からＭＰＴＴ Ｋ持ち込まれたｆ−テア
ーゼ タイプＩおよびチロシンの量は対照凝塊形成時間
に対し作用を有するものではない。
を用いてこの抗凝血剤の特徴をさらに確認する。この抗
凝血剤を５６℃でインキュベートすると、活性が測定で
きない２分後まで急速忙減少する。この抗凝血剤は３７
℃でプロテアーゼタイプＩとともにインキュベートする
と２時間以内にその活性を完全に失い、他方トリプシン
は３時間のインキュベーションの後に抗凝血剤をはとん
ど不活性化しない（第１１図参照）。これらの実験で使
用されたプロテアーゼ タイプ■およびチロシン濃度は
２．５ ｎＭ ）ロンビンを１５分で完全く不活性化す
る。反応混合物からＭＰＴＴ Ｋ持ち込まれたｆ−テア
ーゼ タイプＩおよびチロシンの量は対照凝塊形成時間
に対し作用を有するものではない。
作用の様式
ＭＰＴＴはＨＴＰで触発された場合および因子Ｘａで開
始された場合の両方で、抗凝血剤の存在で延長される。
始された場合の両方で、抗凝血剤の存在で延長される。
しかしながら、トロンビン肪発凝血は抑止されない。
これらの発見により、プロトロンビンのトロンビンへの
因子Ｘ 因子■６、リン脂質およびＣＩ！Ｌ２＋Ｎ による変換に対する抗凝血剤の効果を評価する。
因子Ｘ 因子■６、リン脂質およびＣＩ！Ｌ２＋Ｎ による変換に対する抗凝血剤の効果を評価する。
前記実験条件下に、トロンビン形成は抗凝血剤により投
与量依存様相で抑止される（第１３Ａ図）。
与量依存様相で抑止される（第１３Ａ図）。
因子ｖａが存在しない場合の因子Ｘ＆、 ＋Ｊン脂質
およびＣａ２＋によるプロトロンビンの活性化はこの抗
凝血剤によりまた抑止できる（１１１３３図）。
およびＣａ２＋によるプロトロンビンの活性化はこの抗
凝血剤によりまた抑止できる（１１１３３図）。
しかしながら、リン脂質が存在しない場合忙この活性化
が生じると、この抑止は見られない（第１３Ｃ”図）。
が生じると、この抑止は見られない（第１３Ｃ”図）。
例 ５
ｖＡＣに対するポリクロナル抗体
牛ｖＡＣに対するポリクロナル抗体をウサギで産生させ
る。例１に記載の方法に従い精製した牛ＶＡＣを等量の
完全フレンドアジュバントと混合する。混合物をウサギ
に皮下注射する。４週間後に、ウサギを精製牛ＶＡＣの
皮下注射により追加抗原刺戟する。この抗原刺戟は２：
ｊ！４間の間隔で２回繰返す。最後の抗原刺戟の後の１
０日目に、ウサギを出血させ、集めた血液を凝血させて
血清を得る。
る。例１に記載の方法に従い精製した牛ＶＡＣを等量の
完全フレンドアジュバントと混合する。混合物をウサギ
に皮下注射する。４週間後に、ウサギを精製牛ＶＡＣの
皮下注射により追加抗原刺戟する。この抗原刺戟は２：
ｊ！４間の間隔で２回繰返す。最後の抗原刺戟の後の１
０日目に、ウサギを出血させ、集めた血液を凝血させて
血清を得る。
免疫グロブリン（工ｇ）は下記の方法化機いこの血清か
らＸ離する： ａ）血清を３６℃で６０分間加熱する：ｂ）次いで、血
清を５０ ｍＭ トリス、Ｉ Ｄ ＯｍＭｘａｃｔ （
ｐＨ８−２）で平衡にしたＤＥＡＮ −セファセルに適
用する； Ｃ）非結合タンパク質を５０優飽和で （ＮＨ４）２８０４により沈殿させる：ｄ）沈殿したタ
ンパク質を遠心分離によりペレット状にし、このペレッ
トを５０ ｍＭ ）すス、Ｉ Ｑ Ｑ ｍＭＮａＣｊ
（ｐＨ７，９）に再懸濁し、同一緩衝液に対して完全忙
透析する； ｅ）生成するタンパク質混合物は抗ＶＡＣＩｇを含有す
る。
らＸ離する： ａ）血清を３６℃で６０分間加熱する：ｂ）次いで、血
清を５０ ｍＭ トリス、Ｉ Ｄ ＯｍＭｘａｃｔ （
ｐＨ８−２）で平衡にしたＤＥＡＮ −セファセルに適
用する； Ｃ）非結合タンパク質を５０優飽和で （ＮＨ４）２８０４により沈殿させる：ｄ）沈殿したタ
ンパク質を遠心分離によりペレット状にし、このペレッ
トを５０ ｍＭ ）すス、Ｉ Ｑ Ｑ ｍＭＮａＣｊ
（ｐＨ７，９）に再懸濁し、同一緩衝液に対して完全忙
透析する； ｅ）生成するタンパク質混合物は抗ＶＡＣＩｇを含有す
る。
失火動脈、生恥、ラットおよびウマ大動脈およびヒト′
Ｒ帯動脈から、ｖＡＣ活性を示すタンパク質留分を前記
の方法に従い単離する。
Ｒ帯動脈から、ｖＡＣ活性を示すタンパク質留分を前記
の方法に従い単離する。
これらのタンパク質を硫酸ｒデシルエステルの存在下に
および非減少条件下忙ポリアクリルアミド デル上での
電気泳動により分離する。電気泳動完了後釦、タンパク
質をトービン（Ｔｏｗｂｉｎ ）らに記載された〔ブロ
ク、ナトル、アヵド、サイ。
および非減少条件下忙ポリアクリルアミド デル上での
電気泳動により分離する。電気泳動完了後釦、タンパク
質をトービン（Ｔｏｗｂｉｎ ）らに記載された〔ブロ
ク、ナトル、アヵド、サイ。
（Ｐｒｏｃ、 Ｍａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ８ａＬ ）米
国、４°３５０〜４５５４（１９７９年）〕どおりにし
て、ｒルからニトロセルロース シー）ｋｊｌす。シー
トラ抗ＶＡＣ−工ｇとインキュベートシ、シートを充分
に洗浄した後に、ホースラディツシュ パーオキシダー
ゼと結合したヤギ抗つサギエｇとともにインキュベート
する。ヤギ抗つサヤエｇはパーオキシダーゼ用の基質で
あって、シアミン ベジジン テトラヒｒロクロリげに
より可視にする。
国、４°３５０〜４５５４（１９７９年）〕どおりにし
て、ｒルからニトロセルロース シー）ｋｊｌす。シー
トラ抗ＶＡＣ−工ｇとインキュベートシ、シートを充分
に洗浄した後に、ホースラディツシュ パーオキシダー
ゼと結合したヤギ抗つサギエｇとともにインキュベート
する。ヤギ抗つサヤエｇはパーオキシダーゼ用の基質で
あって、シアミン ベジジン テトラヒｒロクロリげに
より可視にする。
前記処理の完了後のニトロセルロース シート上の褐色
帯はヤギ抗つサギエｇの存在を示している。さらにまた
、この斑点は抗”７ＡＣ−工ｇが結合しているタンパク
質および抗ＶｊｋＣ−工ｇの存在を示している。
帯はヤギ抗つサギエｇの存在を示している。さらにまた
、この斑点は抗”７ＡＣ−工ｇが結合しているタンパク
質および抗ＶｊｋＣ−工ｇの存在を示している。
失火動脈、生恥、ラットおよびウマ大動脈およびヒ）Ｍ
帯動脈から単離されたＶＡＣ−活性を有する夕：／／ｆ
り質の免疫斑点（ｉｍｍｕｍｏｂｌｏｔｓ ）を第１４
図に示す。
帯動脈から単離されたＶＡＣ−活性を有する夕：／／ｆ
り質の免疫斑点（ｉｍｍｕｍｏｂｌｏｔｓ ）を第１４
図に示す。
これらの結果から、次のことが結論できる二基本釣に前
記方法を使用して、ＶＡＣ活性を有するタンパク質留分
を失火動脈、生恥、ラットおよびウマ大動脈およびヒ）
７１４９帯動脈から得ることができる。さらにまた、単
離された、ｖＡＣ活性を有するタンパク質留分はウサギ
において楕製牛ｖｈｃに対して生じた抗ＶＡＣ−Ｘｇと
反応する、分子量約３２，０００、約３４，０００およ
び約７０，０００を有するタンパク質を含有する。
記方法を使用して、ＶＡＣ活性を有するタンパク質留分
を失火動脈、生恥、ラットおよびウマ大動脈およびヒ）
７１４９帯動脈から得ることができる。さらにまた、単
離された、ｖＡＣ活性を有するタンパク質留分はウサギ
において楕製牛ｖｈｃに対して生じた抗ＶＡＣ−Ｘｇと
反応する、分子量約３２，０００、約３４，０００およ
び約７０，０００を有するタンパク質を含有する。
例 ６
大容積リン脂質小胞を使用するＶＡＣの精製工程１．２
−ジオレオイル−ａｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（
ｐｓ ）および１．２−ジオレオイル−５ｎ−グリセロ
−６−ホスホコリン（ｐｃ ）よりなる大容積リン脂質
小胞（ｌ１ｖｖ 、）をパンデパート（Ｖａｎ ａｅ
Ｗａａｒｔ、Ｐ、 ）らの既知の方法〔バイオケミスト
リイ、２２．２４２７〜２４３２頁（１９８３年）〕に
より製造する。
−ジオレオイル−ａｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（
ｐｓ ）および１．２−ジオレオイル−５ｎ−グリセロ
−６−ホスホコリン（ｐｃ ）よりなる大容積リン脂質
小胞（ｌ１ｖｖ 、）をパンデパート（Ｖａｎ ａｅ
Ｗａａｒｔ、Ｐ、 ）らの既知の方法〔バイオケミスト
リイ、２２．２４２７〜２４３２頁（１９８３年）〕に
より製造する。
精製工程では、Ｐａ／ＰＣ（モル比２０：８０）含有Ｌ
ＶＶを使用する。しかしながら、負に帯電したリン脂質
が存在しなければならないという制限条件付きでその他
のモル比も使用できる。リン脂質中の脂肪酸の鎖長はま
た変えることができ・る。
ＶＶを使用する。しかしながら、負に帯電したリン脂質
が存在しなければならないという制限条件付きでその他
のモル比も使用できる。リン脂質中の脂肪酸の鎖長はま
た変えることができ・る。
５０ｍＭトリス／Ｔ１Ｃｌ、１００ ｍｙｔ ＮａＣＪ
（ＰＨ７，９）中のＬＶＶ 、±１ｍＭリン脂質を等
量ＯＶＡＣ活性活性含有タンパク分留分合する。このタ
ンパク質は５０ｍＭトリス／ １１１Ｃｊ、１００ ｍ
Ｍ ＮａＣｊ。
（ＰＨ７，９）中のＬＶＶ 、±１ｍＭリン脂質を等
量ＯＶＡＣ活性活性含有タンパク分留分合する。このタ
ンパク質は５０ｍＭトリス／ １１１Ｃｊ、１００ ｍ
Ｍ ＮａＣｊ。
１０ ｍＭ Ｃ’ａＣ／２ （ｐＨ７−９）に入れる。
混合物を室温で５分間放置する。次いで、混合物を２０
．０００Ｘｇで３０分間遠心分離する。得られたペレッ
トを５０ＩｎＭトリス／ ＨＣＩ、１００ ｍＭ Ｎａ
Ｃｊ 。
．０００Ｘｇで３０分間遠心分離する。得られたペレッ
トを５０ＩｎＭトリス／ ＨＣＩ、１００ ｍＭ Ｎａ
Ｃｊ 。
１６ ｍＭＣａＣｊ２ （ｐＪ（７，９）に再懸濁し、
次いで再遠心分離する。生成するペレットを次いで５Ｑ
ｍＭトリス／ＨＣノ、Ｉ Ｑ Ｑ ｍＭ Ｎａｃｌ
、 １０ ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＫＤＴ
Ａ ） （ｐＨ７，９）に再懸濁し、次いで再び遠心分
離する。生成する上澄液はＶＡＣ−活性を含有する。
次いで再遠心分離する。生成するペレットを次いで５Ｑ
ｍＭトリス／ＨＣノ、Ｉ Ｑ Ｑ ｍＭ Ｎａｃｌ
、 １０ ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＫＤＴ
Ａ ） （ｐＨ７，９）に再懸濁し、次いで再び遠心分
離する。生成する上澄液はＶＡＣ−活性を含有する。
前記方法は精製ＶＡＣｆｔ得るためのこの方法における
効果的な精製工程である。
効果的な精製工程である。
ａ）タンパク質の量はローリイらの方法〔Ｄｏｗｒｙ。
０．Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ、 Ｎ、Ｖ、 Ｆａｒ
ｒ、 Ａ、Ｌ、およびＲａｎｄａｌｌ ＲｌＪ、 、ジ
ャーナル オデ バイオｏジカル ケミストリイ（Ｊ、
Ｂｔｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、１９３．２６５頁（１９５
１年）〕を用いて決定した。
ｒ、 Ａ、Ｌ、およびＲａｎｄａｌｌ ＲｌＪ、 、ジ
ャーナル オデ バイオｏジカル ケミストリイ（Ｊ、
Ｂｔｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、１９３．２６５頁（１９５
１年）〕を用いて決定した。
ｂ）Ｖ’ＡＣｊｍ位は一連の試験稀釈を使用し、例１に
記載の一段階凝血試験を用いて決定した。対照試料の凝
血時間は６５秒であった。ＶＡＣ活性の１単位はこの凝
血時間を１００秒に延長するＶＡＣの量と定義する。
記載の一段階凝血試験を用いて決定した。対照試料の凝
血時間は６５秒であった。ＶＡＣ活性の１単位はこの凝
血時間を１００秒に延長するＶＡＣの量と定義する。
表 Ｂ
負に帯電したリン脂質リポψ−五ｋ
ａ）凝血時間（ｔｃ ）は例１に記載の一段階凝血試験
を用いて決定した。
を用いて決定した。
ｂ） リン脂質リポゾーム（ｐｓ／ｐｃ ： ５０ ／
５０−ｖ−／ｌ／／ ｍｐ ； １ ｍ ）、’７Ａ
Ｃ５ｍａｌ （２５０ｍａｇ／ｉｄ ：比活性−７０単
位／Ｗ９）、および５％グリセロールおよび添加カチオ
ン含有ＴＢＳ （ｐＨ７，５）１００ ｍａｌの供給溶
液５ Ｑ ｍａｌを室温で一緒に混合し、次いで１５，
０００ ｘｇで１５分間遠心分離し、得られた上澄液’
ｌ ５ ｍａｌをＴＢ８で１７５ ｍｃｌのｊｌ終濃度
に稀釈し、次いで一段階凝血試験により試験する。残り
の上置液はＳｎ２− ＰＡＧＥにより分析する（１４図
）。
５０−ｖ−／ｌ／／ ｍｐ ； １ ｍ ）、’７Ａ
Ｃ５ｍａｌ （２５０ｍａｇ／ｉｄ ：比活性−７０単
位／Ｗ９）、および５％グリセロールおよび添加カチオ
ン含有ＴＢＳ （ｐＨ７，５）１００ ｍａｌの供給溶
液５ Ｑ ｍａｌを室温で一緒に混合し、次いで１５，
０００ ｘｇで１５分間遠心分離し、得られた上澄液’
ｌ ５ ｍａｌをＴＢ８で１７５ ｍｃｌのｊｌ終濃度
に稀釈し、次いで一段階凝血試験により試験する。残り
の上置液はＳｎ２− ＰＡＧＥにより分析する（１４図
）。
Ｃ）得られたリボプーム沈殿は５４グリセロールおよび
ＩＣＤＴム５１１１１含有ＴＢ８ （ｐＨ７，５） １
５０ ｍａｌ中に再び懸濁する。上澄液を１５＋０００
ｘｇで１５分間遠心分離する。上澄液のＶＡＣ活性は
ｂ）に記載のとおりに分析した。
ＩＣＤＴム５１１１１含有ＴＢ８ （ｐＨ７，５） １
５０ ｍａｌ中に再び懸濁する。上澄液を１５＋０００
ｘｇで１５分間遠心分離する。上澄液のＶＡＣ活性は
ｂ）に記載のとおりに分析した。
ａ） Ｎ、Ｄ、−測定しない。
表 Ｃ
ａ）アミｒ分解的（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ）活性は次
のようにして測定した： 因子Ｘａまたは因子町をＴＢＳＡ中の前記添加剤により
稀釈した。反応混合物をサーモスタットで３７℃に温度
調節されているプラスチック皿中でテフロン被覆攪拌機
゛により攪□拌する。１０分後ｋ、試料１００ ｍｃｌ
（Ｘａ）または５３ ｍａｌ （［ａ）を皿から採取す
る。この試料をサーモスタットで３７℃に温度調節され
ており、ＴＥ１０１８００ ｍｃｌおよびＴＢ８］Ｃ１
００１１＋ＣＩおよびＢ ２５３７ （２ｍＭ ）Ｉ
Ｑ Ｑ ｍａｌまたは８２２３８ （５ｍＭ）９００ｍ
ｃｌを含有するもう１つのプラスチック皿に入れる。
のようにして測定した： 因子Ｘａまたは因子町をＴＢＳＡ中の前記添加剤により
稀釈した。反応混合物をサーモスタットで３７℃に温度
調節されているプラスチック皿中でテフロン被覆攪拌機
゛により攪□拌する。１０分後ｋ、試料１００ ｍｃｌ
（Ｘａ）または５３ ｍａｌ （［ａ）を皿から採取す
る。この試料をサーモスタットで３７℃に温度調節され
ており、ＴＥ１０１８００ ｍｃｌおよびＴＢ８］Ｃ１
００１１＋ＣＩおよびＢ ２５３７ （２ｍＭ ）Ｉ
Ｑ Ｑ ｍａｌまたは８２２３８ （５ｍＭ）９００ｍ
ｃｌを含有するもう１つのプラスチック皿に入れる。
４０５ ｎｍにおける吸光値の変化をサーモスタットで
６７℃に温度調節されているコントロン スペクトロホ
トメーター ウビコン８１０を用いて測定した。
６７℃に温度調節されているコントロン スペクトロホ
トメーター ウビコン８１０を用いて測定した。
反応混合物中の各種添加剤の最終濃度は次のとおりであ
る：因子Ｘａ： １８−７ ｎＭ ｅ因子ＩＩａ ”１
−５ ｎＭ ＊ヒトＡＴ−［［： １８．７ ｎＭ ：
ヘパリン：１単位／肩ｊ；およびＶＡＣ： １０．７
ｎａｇ ／ｌｕｌ （比活性：１６００皐位／ダ）。
る：因子Ｘａ： １８−７ ｎＭ ｅ因子ＩＩａ ”１
−５ ｎＭ ＊ヒトＡＴ−［［： １８．７ ｎＭ ：
ヘパリン：１単位／肩ｊ；およびＶＡＣ： １０．７
ｎａｇ ／ｌｕｌ （比活性：１６００皐位／ダ）。
ｂ） Ｎ、Ｄ、雪測定しない。
図面の説明：
第１図はセファデックスＧ−１００上におけるｖＡＣデ
ル濾過を示す。
ル濾過を示す。
カラム（５Ｘ ８０ ａｒｔ ）は６ＣＪｃｔｎの圧力
高さで、５００ ｍＭ ＮａＣ’ｊおよび２０ｍＭトリ
ス／ ＨＣｊ（ｐＨ７，５）により平衡にして製造する
。ＤＥＡＪクロマトグラフィ後に得られたＶＡＣ含有留
分を２ゴまでＩ！ｋＨし、次いでセファデックスａ−１
００に通す、、６０ｃｒｒＬの圧力高さを維持する。空
容積は２４５１１１６（留分７０）である。次いで２ゴ
の留分を採取する。この留分を１０係グリセロール含有
ＴＢＳで透析し、その後、例１に記載の一段階凝血試験
によりＶＡＣ活性について試験する。凝血時間はＧ−１
００留分をＴＢＳで１：１０に稀釈して得る。ＶＡＣが
存在しない場合の凝血時間は６５秒である。
高さで、５００ ｍＭ ＮａＣ’ｊおよび２０ｍＭトリ
ス／ ＨＣｊ（ｐＨ７，５）により平衡にして製造する
。ＤＥＡＪクロマトグラフィ後に得られたＶＡＣ含有留
分を２ゴまでＩ！ｋＨし、次いでセファデックスａ−１
００に通す、、６０ｃｒｒＬの圧力高さを維持する。空
容積は２４５１１１６（留分７０）である。次いで２ゴ
の留分を採取する。この留分を１０係グリセロール含有
ＴＢＳで透析し、その後、例１に記載の一段階凝血試験
によりＶＡＣ活性について試験する。凝血時間はＧ−１
００留分をＴＢＳで１：１０に稀釈して得る。ＶＡＣが
存在しない場合の凝血時間は６５秒である。
ｇ２図はＶＡＣ’のＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析を示す。
アクリルアミド１０重量％、Ｎ、 １ｇ３−メチレン
ビスアクリルアミｒ０．２７重量係および５Ｄ８０．１
重Ｊｉ［を含有するデルを用いるＳＤＳ −ＰＡＧＥを
ラエムリの方法〔Ｌａｅｍｌｉ、英国；ネーチャー２２
７．６８０〜６８５°頁（１９７０年＞Ｊｌ／Ｃより行
なう。Ｘ軸上の数字の意味は次のとおりである： １）いづれかのジスルフィｒ結合が減じられている既知
分子量の対照タンパク質。
ビスアクリルアミｒ０．２７重量係および５Ｄ８０．１
重Ｊｉ［を含有するデルを用いるＳＤＳ −ＰＡＧＥを
ラエムリの方法〔Ｌａｅｍｌｉ、英国；ネーチャー２２
７．６８０〜６８５°頁（１９７０年＞Ｊｌ／Ｃより行
なう。Ｘ軸上の数字の意味は次のとおりである： １）いづれかのジスルフィｒ結合が減じられている既知
分子量の対照タンパク質。
２）２ｍｅｇの濃縮ＶＡＣ
３）２ｍＣｇの非濃ａ ＶＡＣ’
ゲルは例１忙記載の方法で、コーマシイ ブルーにより
染色し、脱色させる。
染色し、脱色させる。
第６図はＶＡＣの等電−の測定結果を示す。
等電点の焦点合せは３．５〜９．５の一範囲でＦＡＧ板
を用いて行なう０例１参照）。−勾配がゲルに形成され
た後に、ｅ ）ａ”ｂ２００ｍｃｇおよびＶＡＣ２Ｑ
ｍｃｇを適用する。ヒト九は対照として使用する（既知
等電点： ｐＨ６，８）。ゲルをコーマシイ ブルーで
染色する前に、ゲルを０．７Ｍ三塩化酢酸で６０分間固
定させる。
を用いて行なう０例１参照）。−勾配がゲルに形成され
た後に、ｅ ）ａ”ｂ２００ｍｃｇおよびＶＡＣ２Ｑ
ｍｃｇを適用する。ヒト九は対照として使用する（既知
等電点： ｐＨ６，８）。ゲルをコーマシイ ブルーで
染色する前に、ゲルを０．７Ｍ三塩化酢酸で６０分間固
定させる。
第４図は８ＤＳ−Ｐ居Ｅによる負に帯電したリン脂質り
〆ゾームに対するＷＡＣの結合を分析するものである。
〆ゾームに対するＷＡＣの結合を分析するものである。
ＢＤ８−ＰＡＧＩ！：は例１に記載のものと同一の板上
でラエムリの方法（Ｌａｅｍｌｉ 、英国：ネーチャー
２２７．６８０〜６８５頁（１９７０年）〕により行な
う。分析試料は表Ｂの説明で前記した結合実験から得る
。Ｘ軸上の数字の意味は次のとおりである： １）いづれかのジスルフィドの結合が減じられている既
知分子量の対照タンパク質。
でラエムリの方法（Ｌａｅｍｌｉ 、英国：ネーチャー
２２７．６８０〜６８５頁（１９７０年）〕により行な
う。分析試料は表Ｂの説明で前記した結合実験から得る
。Ｘ軸上の数字の意味は次のとおりである： １）いづれかのジスルフィドの結合が減じられている既
知分子量の対照タンパク質。
２）リボ・戸−ムの不存在下におけるＶＡＣ試料の遠心
分離後に得られた上澄液。
分離後に得られた上澄液。
３）リポゾームの存在におけるＶＡＣの遠心分離後に得
られた上澄液。
られた上澄液。
４）ｌＪ＆−戸一ムおよびＣａ２＋の存在下におけるＶ
ＡＣの遠心分離後に得られた上澄液。
ＡＣの遠心分離後に得られた上澄液。
５）１０關ＥＤＴＡ含有ＴＢＳ中に再懸濁した４）のリ
ボ・戸−ム沈殿の遠心分離後に得られた上澄液。
ボ・戸−ム沈殿の遠心分離後に得られた上澄液。
第５図はトロンビン形成の抑止（優・）に対するＶＡＣ
の濃度の影響を示すグラフである。
の濃度の影響を示すグラフである。
列記されているＶＡＣ’の濃度はこの試験系に存在する
最終濃度である。トロンビン形成はＣａＣｌ２ ｇ有Ｔ
Ｂ８Ａ １０ ｍＭ中の１ ｍｃＭプロトロンビン、１
０ ｎＭ因子Ｘａおよび［１，５Ｍ （Δ−Δ）または
５Ｍ（＠−・）リン脂質膜（ＰＣ／Ｐａ：４：１モル／
ｍｌ ）を用いて測定する。反応混合物は特定１ＯＶ
Ａｃ（比活性： １３００単位／ｒｎ９）とともに、プ
ロトロンビンを加えることなく、６７℃で６分間攪拌す
る。例１に示されているように、この混合物にプロトロ
ンビンを加えることによって、トロンビン形成を開始さ
せ、速度を測定する。ＭＡ（’が存在しない場合のトロ
ンビン形成速度は３．３ｄＭ■セ／分（Δ−Δ）または
１０−９ ｎＭ Ｉｔ、 ／分（〇−〇）である。
最終濃度である。トロンビン形成はＣａＣｌ２ ｇ有Ｔ
Ｂ８Ａ １０ ｍＭ中の１ ｍｃＭプロトロンビン、１
０ ｎＭ因子Ｘａおよび［１，５Ｍ （Δ−Δ）または
５Ｍ（＠−・）リン脂質膜（ＰＣ／Ｐａ：４：１モル／
ｍｌ ）を用いて測定する。反応混合物は特定１ＯＶ
Ａｃ（比活性： １３００単位／ｒｎ９）とともに、プ
ロトロンビンを加えることなく、６７℃で６分間攪拌す
る。例１に示されているように、この混合物にプロトロ
ンビンを加えることによって、トロンビン形成を開始さ
せ、速度を測定する。ＭＡ（’が存在しない場合のトロ
ンビン形成速度は３．３ｄＭ■セ／分（Δ−Δ）または
１０−９ ｎＭ Ｉｔ、 ／分（〇−〇）である。
第６図はＶＡＣＩｃよるトロンビン形成の抑止（％）に
対するリン脂質濃度の影響を示すグラフである。
対するリン脂質濃度の影響を示すグラフである。
トロンビン形成は１ｍｃＭ７’ロトロンピン、１０ｎＭ
因子ＸＡ、１０．７ ｎａｇ ／ ｔｔｉｌ ＶＡＣＣ
比活性：１３００単位／１ｖ）およびＴＢＳＡ中の各８
ｉ＃度のリン脂質膜（ｐｃ／ｐｇ：４：１モル１モル）
で測定する。因子父ユ、’７ＡＣおよびリン脂質ヲＴＢ
ＳＡ中で３７℃で３分間攪拌する。トロンビン形成は反
応混合物にプロトロンビンを加えること釦より開始させ
る。ｌ・ロンビン形成の速度は例１に記載のとおりに測
定する。トロンビン形成の抑止チ（○−Ｏ）は各リン脂
質濃度について’７ＡＣ’の存在しない場合の相当する
トロンビン形成速度（Δ−Δ）を用いて測定する。
因子ＸＡ、１０．７ ｎａｇ ／ ｔｔｉｌ ＶＡＣＣ
比活性：１３００単位／１ｖ）およびＴＢＳＡ中の各８
ｉ＃度のリン脂質膜（ｐｃ／ｐｇ：４：１モル１モル）
で測定する。因子父ユ、’７ＡＣおよびリン脂質ヲＴＢ
ＳＡ中で３７℃で３分間攪拌する。トロンビン形成は反
応混合物にプロトロンビンを加えること釦より開始させ
る。ｌ・ロンビン形成の速度は例１に記載のとおりに測
定する。トロンビン形成の抑止チ（○−Ｏ）は各リン脂
質濃度について’７ＡＣ’の存在しない場合の相当する
トロンビン形成速度（Δ−Δ）を用いて測定する。
第７図はヒ）Ｊｌｌｌ動帯均質物の１０，０００ ｘｇ
上澄液のセファデックスａ−１００上でのゲル濾過分別
を示す。
上澄液のセファデックスａ−１００上でのゲル濾過分別
を示す。
１０ｙ０００ ｘｇ上澄液２−をＴＢＳで予め平衡にし
たセファデックスＧ−１００カラム （１，５ｘ８０ｃｉ）上に装入する。カラムはＴＢＳで
溶出する。生成する留分の一定量をＭＰＴＴで試験する
。成る留分（ｍ ）は凝血原活性およびＨＴＰ、因子Ｘ
ａ、またはトロンビンを添加することなくＭＰＴＴで凝
血開始を示す。その他の別の留分（ロ）はＭＰＴＴで凝
血開始にＨＴＰを使用して、凝塊形成 、時間を１延
長する。これらの留分を集め、さらに分別する。
たセファデックスＧ−１００カラム （１，５ｘ８０ｃｉ）上に装入する。カラムはＴＢＳで
溶出する。生成する留分の一定量をＭＰＴＴで試験する
。成る留分（ｍ ）は凝血原活性およびＨＴＰ、因子Ｘ
ａ、またはトロンビンを添加することなくＭＰＴＴで凝
血開始を示す。その他の別の留分（ロ）はＭＰＴＴで凝
血開始にＨＴＰを使用して、凝塊形成 、時間を１延
長する。これらの留分を集め、さらに分別する。
第８図はＤＫＡＥ−セファセル（Ａ）およびセファデッ
クスＧ−７５（Ｂ）上における本発明の抗凝血剤のクロ
マトグラフィ分析結果を示す。
クスＧ−７５（Ｂ）上における本発明の抗凝血剤のクロ
マトグラフィ分析結果を示す。
セファデックスＧ−１００カラムからの抗凝血剤を含有
する溶液集合体をＤＩＡＫ−セファセルに適用する。溶
出は５ Ｑ ｍＭ 〜５ Ｑ Ｑ ｍＭ ＮａＣ１の直
線勾配２００ｄを用いて行な５ （−−−）、留分（４
Ｘ／）を採取する。各留分についてＡ２８０を測定しく
−）、凝血の開始剤としてＨＴＰ Ｃ最終濃度：９５
ｎａｇタンパク質（ｄ）〕を使用ｔ、テ（−）、ＭＩ’
ＴＴで抗凝固活性を評価する。抗凝血活性を有する留分
を集め、濃縮し、次いでセファデックスＧ−７５に適用
する（Ｂ）。留分（２ｄ）を集める６Ａ２８０を各留分
について測定しく−）、また抗凝血活性（ｏ）を測定す
る。ｖＯはカラムの全容積を表わす。
する溶液集合体をＤＩＡＫ−セファセルに適用する。溶
出は５ Ｑ ｍＭ 〜５ Ｑ Ｑ ｍＭ ＮａＣ１の直
線勾配２００ｄを用いて行な５ （−−−）、留分（４
Ｘ／）を採取する。各留分についてＡ２８０を測定しく
−）、凝血の開始剤としてＨＴＰ Ｃ最終濃度：９５
ｎａｇタンパク質（ｄ）〕を使用ｔ、テ（−）、ＭＩ’
ＴＴで抗凝固活性を評価する。抗凝血活性を有する留分
を集め、濃縮し、次いでセファデックスＧ−７５に適用
する（Ｂ）。留分（２ｄ）を集める６Ａ２８０を各留分
について測定しく−）、また抗凝血活性（ｏ）を測定す
る。ｖＯはカラムの全容積を表わす。
第９図はＭＰＴＴにおける本発明の抗凝血剤の投与景応
答様相を示す、 抗凝血剤を量を変えてＭＰＴＴに適用する。凝血はｍＴ
ｐ （最終濃度： ９５−ｗａｇタンパク質／ｄ）で開
始させる。対照凝塊形成時間は６５秒である。
答様相を示す、 抗凝血剤を量を変えてＭＰＴＴに適用する。凝血はｍＴ
ｐ （最終濃度： ９５−ｗａｇタンパク質／ｄ）で開
始させる。対照凝塊形成時間は６５秒である。
第１０図はＧ−７５溶出液の数留分のデル電気゛泳動を
示すものである。
示すものである。
Ｇ−７５０数留分の各一定量をＳＤＳ −ＰＡＧＥによ
り評価する。ゲルはメリル（Ｍａｒｒｉｌ ）らに従い
〔エレクトロホレシス ジャーナル （Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｊ、 ） ３．１
７〜２！１頁（１９８２年）〕、銀染色する。レーン１
：濃縮された低分子量標準：レーン２〜６：非ａ縮Ｇ−
７５留分番号＝３５．６９．４１．４５および５０の各
一定量。
り評価する。ゲルはメリル（Ｍａｒｒｉｌ ）らに従い
〔エレクトロホレシス ジャーナル （Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｊ、 ） ３．１
７〜２！１頁（１９８２年）〕、銀染色する。レーン１
：濃縮された低分子量標準：レーン２〜６：非ａ縮Ｇ−
７５留分番号＝３５．６９．４１．４５および５０の各
一定量。
第１１図は本発明の抗凝血剤の活性に対するタンパク質
加水分解酵素の作用を示す。
加水分解酵素の作用を示す。
抗凝血剤はプロテアーゼ タイプ■（最終濃度二〇、１
１単位／ｄ）と１口）、またはトリプシン（最終濃度：
８８ＢＡＩＩＩ！：単位／Ｍ）と（Δ）、またはタン
パク質加水分解酵素を使用することなく（Ｏ）、６７℃
でインキュベートする。、指示されている時点で、抗凝
血剤の６ｎａｇタンパク質を含有する５ｍｃｌを反応混
合物から取り出し、ＭＰ’ｒＴに加える。凝塊形成は）
ＩＴＩｌ、（最終濃度：１８タンパク質ｍＣｇ ／ ｔ
ｒｔｌ ）で開始させる。対照凝塊形成時間は１１０秒
である。タンパク質加水分解酵素についてのこの図面に
示されている単位は製造業者により供給された数値から
計算する。
１単位／ｄ）と１口）、またはトリプシン（最終濃度：
８８ＢＡＩＩＩ！：単位／Ｍ）と（Δ）、またはタン
パク質加水分解酵素を使用することなく（Ｏ）、６７℃
でインキュベートする。、指示されている時点で、抗凝
血剤の６ｎａｇタンパク質を含有する５ｍｃｌを反応混
合物から取り出し、ＭＰ’ｒＴに加える。凝塊形成は）
ＩＴＩｌ、（最終濃度：１８タンパク質ｍＣｇ ／ ｔ
ｒｔｌ ）で開始させる。対照凝塊形成時間は１１０秒
である。タンパク質加水分解酵素についてのこの図面に
示されている単位は製造業者により供給された数値から
計算する。
Ｗ、１２図はＭ（Ｐ）ＴＴでＨＴＰ 、因子Ｘａまたは
トロンビンのいづれかにより誘発された凝塊形成時間に
対する本発明の血管系抗凝血剤の効果を示すものである
。
トロンビンのいづれかにより誘発された凝塊形成時間に
対する本発明の血管系抗凝血剤の効果を示すものである
。
凝血開始剤の濃度（ＥＴＰ １８ ｎａｇ ／タンパク
質７ｍ、 １．５ ｎＭ因子Ｘａまたは０．４ ｎＭ
） ｏンビン）は約１１０秒の対照凝塊形成時間（空
白長方形部分）が得られるように選択する。因子Ｘａを
使用する場合に、０１８２ＧｒＯＰ −ｓｅｒ ／ ０
１ｅ１２ＧｒＯ−Ｐ−Ｃｈｏ （モル比２０：８０）よ
りなるリン脂質小胞を反応混合物に加える。抗凝血剤の
３ ｎａｇタンパク質の存在における指定誘発剤により
生じた凝塊形成時間が影をつけた長方形部分く示されて
いる。
質７ｍ、 １．５ ｎＭ因子Ｘａまたは０．４ ｎＭ
） ｏンビン）は約１１０秒の対照凝塊形成時間（空
白長方形部分）が得られるように選択する。因子Ｘａを
使用する場合に、０１８２ＧｒＯＰ −ｓｅｒ ／ ０
１ｅ１２ＧｒＯ−Ｐ−Ｃｈｏ （モル比２０：８０）よ
りなるリン脂質小胞を反応混合物に加える。抗凝血剤の
３ ｎａｇタンパク質の存在における指定誘発剤により
生じた凝塊形成時間が影をつけた長方形部分く示されて
いる。
８１３図は（Ｘ５、ｖａｌ リン脂質、Ｃａ” ）、（
ｘｉミリン質、Ｃａ” ）および（Ｘａ、 Ｃ’ａ”
）によるプロトロンビン活性化に対する本発明の抗凝血
剤の作用を示す。
ｘｉミリン質、Ｃａ” ）および（Ｘａ、 Ｃ’ａ”
）によるプロトロンビン活性化に対する本発明の抗凝血
剤の作用を示す。
反応混合物は（Ａ ） １ ｍａＭプロトロンビン、０
．３ ｎＭＸａ、 ０．６ ｎＭＶａ、 Ｑ、５
ｍｃＭリン脂質およ。
．３ ｎＭＸａ、 ０．６ ｎＭＶａ、 Ｑ、５
ｍｃＭリン脂質およ。
びＩ Ｑ ｍＭ ＣａＣｌ２を抗凝血剤１２．Ｏｍｃｇ
／ ｔｄ （■）または１２．Ｏｍａｇ ／ ｒｘｌ
（ム）とともに、または抗凝血剤を使用することなく（
・）含有する；（Ｂ）１ ｍｃＭプロトロンビン、１０
ｎＭ ｘ、 、 Ｑ、５ ｍｃＭリン脂質およびｊ
Ｑ ｍＭ ＣａＣｌ２を抗凝血剤２．４ｍｃｇ／Ｍ（■
）または０−４８ ｍｃｇ／ ｍｌ （ム）とともに、
または抗凝血剤を使用することなく、（・）含有する：
（（’） １ ｍａＭゾロトロンビン、７５ ｎＭ Ｘ
５およびＩ Ｑ ｍＭ ＣａＣｌ２を抗凝血剤１２０
ｗａｇ ／ｙｔｌとともに（ム）または抗凝血剤を使用
することなく（■）含有する。指示時間で、試料を取り
出し、トロンビンを測定する。
／ ｔｄ （■）または１２．Ｏｍａｇ ／ ｒｘｌ
（ム）とともに、または抗凝血剤を使用することなく（
・）含有する；（Ｂ）１ ｍｃＭプロトロンビン、１０
ｎＭ ｘ、 、 Ｑ、５ ｍｃＭリン脂質およびｊ
Ｑ ｍＭ ＣａＣｌ２を抗凝血剤２．４ｍｃｇ／Ｍ（■
）または０−４８ ｍｃｇ／ ｍｌ （ム）とともに、
または抗凝血剤を使用することなく、（・）含有する：
（（’） １ ｍａＭゾロトロンビン、７５ ｎＭ Ｘ
５およびＩ Ｑ ｍＭ ＣａＣｌ２を抗凝血剤１２０
ｗａｇ ／ｙｔｌとともに（ム）または抗凝血剤を使用
することなく（■）含有する。指示時間で、試料を取り
出し、トロンビンを測定する。
＄１４図は免疫斑点（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ）を示し
ている。
ている。
この斑点は例５に記載の方法で得られたものである。レ
ーン１：失火動脈から単離されたＶＡＣ’活性を有する
タンパク質留分。レーン２：失火動脈から単離された”
／ＡＣ活性を有するタンパク質留分。
ーン１：失火動脈から単離されたＶＡＣ’活性を有する
タンパク質留分。レーン２：失火動脈から単離された”
／ＡＣ活性を有するタンパク質留分。
レーン３：生柿から単離され’？、： ｖＡＣ活性を有
するタンパク質留分。レーン４：ヒ）Ｊｉｌｌ￥ｆ動脈
から単離されたＶＡＣ活性を有するタンパク質留分。レ
ーン５：ラット大動脈から単離されたＶＡＣ活性を有す
るタンパク質留分。レーン６：ウマ大動脈から単離され
たＶＡＣ活性を有するタンパク質留分。
するタンパク質留分。レーン４：ヒ）Ｊｉｌｌ￥ｆ動脈
から単離されたＶＡＣ活性を有するタンパク質留分。レ
ーン５：ラット大動脈から単離されたＶＡＣ活性を有す
るタンパク質留分。レーン６：ウマ大動脈から単離され
たＶＡＣ活性を有するタンパク質留分。
第１５図はＧ−７５からの溶出液の種々の留分の抗凝血
活性（Ｂ）およびデル電気泳動（ム）を示す。
活性（Ｂ）およびデル電気泳動（ム）を示す。
Ｇ−７５からの溶出液の稲々の留分の特定量を前記した
ようにデル電気泳動に処する。吸着帯をメリルら（Ｍｅ
ｒｒｉｌ Ｃ，Ｒ，、Ｇｏｌｄｍａｎ Ｄ、およびＶａ
ｎＫｅｕｒｅｎ Ｍ、Ｌ、 ）によりエレクトロホレシ
ス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ） ３．１７〜
２３頁（１９８２年）！ＩＣ記載された方法を使用して
銀で染色する。電気泳動レーン１：低分子量を有する標
本物質；ｉｔ気泳動レーン２〜６：溶出量を増加して、
濃縮していないＧ−７５留分の等量。デル電気泳動によ
り分析されたＧ−７５留分の特定量を凝血開始１ｃＨＴ
Ｐを使用してＭＰＴＴ （前記参照）で試験する。対照
凝血時間は空白の長方形で示されている。影をつけた長
方形部分の下の数字は第１５Ａ図の電気泳動レーンの数
字釦対応する。
ようにデル電気泳動に処する。吸着帯をメリルら（Ｍｅ
ｒｒｉｌ Ｃ，Ｒ，、Ｇｏｌｄｍａｎ Ｄ、およびＶａ
ｎＫｅｕｒｅｎ Ｍ、Ｌ、 ）によりエレクトロホレシ
ス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ） ３．１７〜
２３頁（１９８２年）！ＩＣ記載された方法を使用して
銀で染色する。電気泳動レーン１：低分子量を有する標
本物質；ｉｔ気泳動レーン２〜６：溶出量を増加して、
濃縮していないＧ−７５留分の等量。デル電気泳動によ
り分析されたＧ−７５留分の特定量を凝血開始１ｃＨＴ
Ｐを使用してＭＰＴＴ （前記参照）で試験する。対照
凝血時間は空白の長方形で示されている。影をつけた長
方形部分の下の数字は第１５Ａ図の電気泳動レーンの数
字釦対応する。
第１６図は本発明の血管系抗凝血剤の熱脱活性を示す。
抗凝血剤は５６℃でインキュベートし、種々のインキュ
ベーション期間の後に、タンパク質３ ｍｃｇを含有す
る試料５ ｍａｌを採取し、直ち忙氷で冷却し、次いで
凝血開始剤としてＨＰＴを使用してＭＰＴＴで試験する
。対照試料の凝血時間は１１０秒である。
ベーション期間の後に、タンパク質３ ｍｃｇを含有す
る試料５ ｍａｌを採取し、直ち忙氷で冷却し、次いで
凝血開始剤としてＨＰＴを使用してＭＰＴＴで試験する
。対照試料の凝血時間は１１０秒である。
第１図はセファデックスＧ −１００上テｖＡｃ ｆｉ
タンパク質ｒル濾過した場合の溶出留分の凝血時間と吸
光値を示すグラフである：第２図はＶＡＣのＳＤＳ −
ＰＡＧＥ分析結果を示す：第３図はｖＡＣの等電−〇測
定結果を示す：第４図はＳＤＳ −ＰＡＧＥによる負忙
帯電したリン脂質リポ１戸−ムに対するＶＡＣの結合を
示す；第５図はトロンビン形成の抑止（％）に対するＶ
ＡＣ１１１度の影響を示すグラフである；第６図はＶＡ
Ｃによるトロンビン形成の抑止（係）に対するリン脂質
濃度の影響を示すグラフである；第７図はヒト贋帯動脈
均質物の１０，０００ Ｋｇ上澄液のセファデックスＧ
−ＩＱＱ上でのｒル濾過分別を示す：第８図はＤＥｊｌ
−セファセル（Ａ）およびセファデックスＧ −７５（
Ｂ）上における本発明の抗凝血剤のクロマトグラフィ分
析結果を示す：第９図はＭＰＴＴにおける本発明の抗凝
血剤の投与量応答様相を示すグラフである：第１０図は
セファデックスＧ−７５クロマトグラフイ浴出液の留分
のゲル電気泳動を示す：第１１図は本発明の抗凝血剤の
活性に対するタンパク質加水分解酵素の作用を示す：第
１２図はＭ（Ｐ）ＴＴでＨＴＰ 、因子ｘ。 マタはトロンビンのいづれか釦より誘発された凝塊形成
時間に対する本発明の血管系抗凝血剤の効果を示す１１
１３図は（、■ 、リン脂質、ｘａ ａ Ｃ！ａ” ）、（Ｘａ％ リン脂質、Ｃａ ２ ＋
）および（ｘａ。 Ｃａ” ） ｋＣよるプロトロンビン活性化釦対する本
発明の抗凝血剤の作用を示す：第１４図はＶＡＣ活性を
有するタンパク質の免疫斑点を示す：第１５図はセファ
デックスＧ−７５からの溶出留分のゲル電気泳動（Ａ）
および抗凝血活性（Ａ）を示す；そして第１６図は本発
明の血管系抗凝血剤の熱脱活性を示すグラフである。 に面の浄書（内容に変更なし） 第１図 留分Ｉｋ−号 （ｐＨ） ＋ ２３４５ 第５図 最Ｍ−ＶＡＣ２１度（ｑ／ｒｎｆ） 第６図 ［リン指ｘ］ μＭ ５ （−） ＬＬｌｕＯ８どヮ慨 第８図 ン１Ｊ−−迅刑辰時間 （」−１シト）ｕＪｕ０９２゜ 洲■ 凝４ｆＦ＞Ｆ１ｅ４Ｍ Ｃｆｙ９）、 ＬＯＧ 尺ｒＬ
０凝へ形成＠間 （紗） −
蓑 凝塊形成時間（沙） −トコ Ｏ〕 ｍ ””）”′″＋＜ｏｑ 第１６図
タンパク質ｒル濾過した場合の溶出留分の凝血時間と吸
光値を示すグラフである：第２図はＶＡＣのＳＤＳ −
ＰＡＧＥ分析結果を示す：第３図はｖＡＣの等電−〇測
定結果を示す：第４図はＳＤＳ −ＰＡＧＥによる負忙
帯電したリン脂質リポ１戸−ムに対するＶＡＣの結合を
示す；第５図はトロンビン形成の抑止（％）に対するＶ
ＡＣ１１１度の影響を示すグラフである；第６図はＶＡ
Ｃによるトロンビン形成の抑止（係）に対するリン脂質
濃度の影響を示すグラフである；第７図はヒト贋帯動脈
均質物の１０，０００ Ｋｇ上澄液のセファデックスＧ
−ＩＱＱ上でのｒル濾過分別を示す：第８図はＤＥｊｌ
−セファセル（Ａ）およびセファデックスＧ −７５（
Ｂ）上における本発明の抗凝血剤のクロマトグラフィ分
析結果を示す：第９図はＭＰＴＴにおける本発明の抗凝
血剤の投与量応答様相を示すグラフである：第１０図は
セファデックスＧ−７５クロマトグラフイ浴出液の留分
のゲル電気泳動を示す：第１１図は本発明の抗凝血剤の
活性に対するタンパク質加水分解酵素の作用を示す：第
１２図はＭ（Ｐ）ＴＴでＨＴＰ 、因子ｘ。 マタはトロンビンのいづれか釦より誘発された凝塊形成
時間に対する本発明の血管系抗凝血剤の効果を示す１１
１３図は（、■ 、リン脂質、ｘａ ａ Ｃ！ａ” ）、（Ｘａ％ リン脂質、Ｃａ ２ ＋
）および（ｘａ。 Ｃａ” ） ｋＣよるプロトロンビン活性化釦対する本
発明の抗凝血剤の作用を示す：第１４図はＶＡＣ活性を
有するタンパク質の免疫斑点を示す：第１５図はセファ
デックスＧ−７５からの溶出留分のゲル電気泳動（Ａ）
および抗凝血活性（Ａ）を示す；そして第１６図は本発
明の血管系抗凝血剤の熱脱活性を示すグラフである。 に面の浄書（内容に変更なし） 第１図 留分Ｉｋ−号 （ｐＨ） ＋ ２３４５ 第５図 最Ｍ−ＶＡＣ２１度（ｑ／ｒｎｆ） 第６図 ［リン指ｘ］ μＭ ５ （−） ＬＬｌｕＯ８どヮ慨 第８図 ン１Ｊ−−迅刑辰時間 （」−１シト）ｕＪｕ０９２゜ 洲■ 凝４ｆＦ＞Ｆ１ｅ４Ｍ Ｃｆｙ９）、 ＬＯＧ 尺ｒＬ
０凝へ形成＠間 （紗） −
蓑 凝塊形成時間（沙） −トコ Ｏ〕 ｍ ””）”′″＋＜ｏｑ 第１６図
Claims (22)
- （１）凝血因子を活性化しないことを特徴とする抗凝血
性タンパク質。 - （２）因子ＸａおよびIIａを生物学的におよびアミド分
解的に抑止しない、特許請求の範囲第１項の抗凝血性タ
ンパク質。 - （３）血管系凝血原により、または因子Ｘａにより生じ
る凝血を抑止するが、トロンビンにより誘発される凝血
は抑止しない特許請求の範囲第１項の抗凝血性タンパク
質。 - （４）変性プロトロンビン−時間試験、および（または
）変性され、活性化された部分的トロンボプラスチン−
時間試験、および（または）非変性プロトロンビン−時
間試験、および（または）負に帯電したリン脂質および
Ｃａ＾２＾＋の存在下における凝血因子Ｘａによるプロ
トロンビン活性化および（または）負に帯電したリン脂
質およびＣａ＾２＾＋の存在下における因子 I Ｘａに
よる固有のＸ−活性化、および（または）単離され、刺
戟された血小板のプロトロンビン活性化、および（また
は）血管壁により誘発される凝血、および（または）血
小板の凝血依存性凝集、の抑止を示す特許請求の範囲第
１項の抗凝血性タンパク質。 - （５）それらの抑止効果がリン脂質の量に依存して変わ
り、リン脂質を加水分解せず、そして当該タンパク質に
より誘発されるプロトロンビン活性化の因子Ｘａによる
抑止がリン脂質濃度に依存する、特許請求の範囲第１項
の抗凝血性タンパク質。 - （６）たとえば小胞、リポゾームまたはエテロゾームに
見い出すことができる負に帯電したリン脂質に二価カチ
オンＣａ＾２＾＋およびＭｎ＾２＾＋を経て結合し、お
よび（または）スフエロシルと結合した負に帯電したリ
ン脂質に二価カチオンＣａ＾２＾＋およびＭｎ＾２＾＋
を経て結合し、および（または）このタンパク質の負に
帯電したリン脂質への結合が可逆性であり、そして負に
帯電したリン脂質表面からプロトロンビンおよび因子Ｘ
ａを排除することができる、特許請求の範囲第１項の抗
凝血性タンパク質。 - （７）約７０×１０＾３、約６０×１０＾３、約３４×
１０＾３または約３２×１０＾３の分子量を有する特許
請求の範囲第１項の抗凝血性タンパク質。 - （８）大動脈から単離できるものである特許請求の範囲
第１項の抗凝血性タンパク質。 - （９）強力に血管化した組織から単離できるものである
特許請求の範囲第１項の抗凝血性タンパク質。 - （１０）哺乳動物の血管壁から単離し、次いで精製した
ものであり；グリコプロテインではなく；ホスホリパー
ゼではなく；ｐＨ４．４〜４．６で等電点を有し；５６
℃におけるこの抗凝血性タンパク質の活性が熱的に不安
定であり；クエン酸塩処理血漿中のこの抗凝血性タンパ
ク質の活性が３７℃で数時間安定のままであり；この抗
凝血性タンパク質の活性がトリプシンおよび（または）
キモトリプシンにより完全に破壊されず；この抗凝血性
タンパク質の活性がコラゲナーゼおよび（または）エラ
スターゼにより作用を受けず；小胞、リポゾームまたは
エテロゾーム中に見い出すことができる負に帯電したリ
ン脂質に二価カチオンＣａ＾２＾＋およびＭ＾２＾＋を
経て結合し；スフエロシルに結合する負に帯電したリン
脂質に二価カチオンＣａ＾２＾＋およびＭｎ＾２＾＋を
経て結合し；このタンパク質の負に帯電したリン脂質に
対する結合が可逆性であつて、エチレンジアミンテトラ
酢酸（ＥＤＴＡ）により逆行でき；負に帯電したリン脂
質表面からプロトロンビンおよび因子Ｘａを排除し；変
性プロトロンビン−時間試験を抑止し；変性され、活性
化された部分的トロンボプラスチン−時間試験を抑止し
；インビトロで、負に帯電したリン脂質およびＣａ＾２
＾＋の存在で凝血因子Ｘａによるプロトロンビン活性化
を抑止し；因子ＸａおよびIIａの生化学的およびアミド
分解的活性を抑止せず；インビトロで、負に帯電したリ
ン脂質およびＣａ＾２＾＋の存在で因子 I Ｘａによる
固有のＸ−活性化を抑止し；インビトロで、単離され、
刺戟された血小板のプロトロンビン活性化を抑止し；イ
ンビトロで血管壁により誘発される凝血を阻止し；そし
てこのタンパク質により誘発される因子Ｘａによるプロ
トロンビン活性化の抑止がリン脂質の濃度に依存して変
わり、高いリン脂質濃度で減じられる；特許請求の範囲
第１項の抗凝血性タンパク質。 - （１１）特許請求の範囲第１項〜第１０項の１項または
２項以上に記載の抗凝血性タンパク質。 - （１２）特許請求の範囲第１項〜第１０項のいづれか１
項に記載のヒト抗凝血性タンパク質。 - （１３）特許請求の範囲第１項〜第１０項のいづれか１
項に記載の牛抗凝血性タンパク質。 - （１４）特許請求の範囲第１項〜第１０項のいづれか１
項に記載のネズミ抗凝血性タンパク質。 - （１５）特許請求の範囲第１項〜第１０項のいづれか１
項に記載のウマ抗凝血性タンパク質。 - （１６）抗凝血性タンパク質の製造方法であつて、血管
壁、強力に導管化した組織または内皮細胞培養物を （ａ）均質化し、差動遠心分離し、上澄液に下記の精製
処理： （ｂ）塩による沈殿 （ｃ）親和クロマトグラフィ （ｄ）イオン交換クロマトグラフィ （ｅ）分子篩を用いるクロマトグラフィ の一つまたは二つ以上をいずれか所望の順序で行ない、
所望により工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）に
従い得られた生成物を透析することができることを特徴
とする方法。 - （１７）免疫吸着クロマトグラフィによる精製をさらに
行なう特許請求の範囲第１６項の方法。 - （１８）タンパク質をリン脂質小胞を使用して精製する
特許請求の範囲第１６項または第１７項の方法。 - （１９）工程（ｂ）における沈殿に硫酸アンモニウムを
使用し、工程（ｃ）におけるクロマトグラフィにヒドロ
キシアパタイトを使用し、工程（ｄ）におけるクロマト
グラフィにＤＥＡＥ−セフアセルを使用し、そして工程
（ｅ）におけるクロマトグラフィにセフアデツクスＧ−
１００またはＧ−７５を使用する特許請求の範囲第１６
項〜第１８項のいづれか１項の方法。 - （２０）特許請求の範囲第１６項〜第１９項のいづれか
１項に従い製造された抗凝血性タンパク質。 - （２１）医薬的に不活性の賦形剤および（または）担体
に加えて、特許請求の範囲第１項〜第１５項および第２
０項のいづれか１項に記載の抗凝血性タンパク質の有効
量を含有することを特徴とする医薬製剤。 - （２２）特許請求の範囲第１項〜第１５項および第２０
項のいづれか１項の抗凝血性タンパク質の治療的処置に
おける使用。
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