JPH05155780A - 溶性酵素によるリポタンパク質除去 - Google Patents
溶性酵素によるリポタンパク質除去Info
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- JPH05155780A JPH05155780A JP3204204A JP20420491A JPH05155780A JP H05155780 A JPH05155780 A JP H05155780A JP 3204204 A JP3204204 A JP 3204204A JP 20420491 A JP20420491 A JP 20420491A JP H05155780 A JPH05155780 A JP H05155780A
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- ldl
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 溶性ホスホリパーゼＡ2 の治療に有効な量を
血液中の低密度リポタンパク質を低下させるために被検
者に投与する方法。 【効果】 ホスホリパーゼＡ2 がＬＤＬ中に存在するリ
ン脂質の加水分解により血漿ＬＤＬを変異し、その結果
変異したＬＤＬが異化プロセスにより血流から速やかに
除去される。
血液中の低密度リポタンパク質を低下させるために被検
者に投与する方法。 【効果】 ホスホリパーゼＡ2 がＬＤＬ中に存在するリ
ン脂質の加水分解により血漿ＬＤＬを変異し、その結果
変異したＬＤＬが異化プロセスにより血流から速やかに
除去される。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は一般に血液中のコレステロール
濃度を低下させることにより高コレステロール血症を治
療する方法に関する。より詳しくは本発明は高コレステ
ロール血症患者中へ、その血液中の低密度リポタンパク
質の変異のために溶性ホスホリパーゼＡ2 を投与するこ
とに関する。容易に異化できる形態にある変異された低
密度リポタンパク質は生体内クリアランスプロセスによ
り血流から速やかに除去される。
濃度を低下させることにより高コレステロール血症を治
療する方法に関する。より詳しくは本発明は高コレステ
ロール血症患者中へ、その血液中の低密度リポタンパク
質の変異のために溶性ホスホリパーゼＡ2 を投与するこ
とに関する。容易に異化できる形態にある変異された低
密度リポタンパク質は生体内クリアランスプロセスによ
り血流から速やかに除去される。
【０００２】
【発明の背景】冠心臓疾患は合せたすべての形態の癌を
含めて他の疾患より多い年間死亡数を占める。疫学的研
究は、全血漿コレステロール及び低密度リポタンパク質
コレステロールの濃度が高いほど冠心臓疾患を生ずる可
能性が大きいことを立証した。低密度リポタンパク質
（「ＬＤＬ」）は限外濾過で1.０１９〜1.０６３ｇ／ml
の密度範囲内に浮かぶものである。それらは約７５％の
脂質（主にコレステリルエステル、コレステロール及び
リン脂質）及び２５％のタンパク質からなる。５１0,０
００ダルトンの分子量を有するアポリポタンパク質Ｂは
ＬＤＬの主タンパク質成分である。
含めて他の疾患より多い年間死亡数を占める。疫学的研
究は、全血漿コレステロール及び低密度リポタンパク質
コレステロールの濃度が高いほど冠心臓疾患を生ずる可
能性が大きいことを立証した。低密度リポタンパク質
（「ＬＤＬ」）は限外濾過で1.０１９〜1.０６３ｇ／ml
の密度範囲内に浮かぶものである。それらは約７５％の
脂質（主にコレステリルエステル、コレステロール及び
リン脂質）及び２５％のタンパク質からなる。５１0,０
００ダルトンの分子量を有するアポリポタンパク質Ｂは
ＬＤＬの主タンパク質成分である。
【０００３】電子顕微鏡検査下で、ＬＤＬは直径２０〜
２５ナノメートルの球形粒子のように見える。各ＬＤＬ
粒子は、リン脂質、非エステル化コレステロール及びア
ポリポタンバク質Ｂからなる親水性被膜により水性血漿
から保護された油性コア中にコレステリルエステル約１
５００分子を含む。全コレステロールの約６５〜７０％
はＬＤＬ中で運ばれる。従って、ＬＤＬの除去はコレス
テロール濃度の不随的低下を生ずる。
２５ナノメートルの球形粒子のように見える。各ＬＤＬ
粒子は、リン脂質、非エステル化コレステロール及びア
ポリポタンバク質Ｂからなる親水性被膜により水性血漿
から保護された油性コア中にコレステリルエステル約１
５００分子を含む。全コレステロールの約６５〜７０％
はＬＤＬ中で運ばれる。従って、ＬＤＬの除去はコレス
テロール濃度の不随的低下を生ずる。
【０００４】コレステロール及びＬＤＬ濃度はコレステ
ロール又は脂肪の高い食事摂取を有する多くの人中に、
及び異常な、しかしＬＤＬに対する細胞表面受容体中に
遺伝子欠損を遺伝された稀でない群を含めて種々の家族
性高脂質血症をもつ人中に高い。全血漿コレステロール
及びＬＤＬコレステロールの濃度は食事又は薬物により
低下できる。しかし、薬物療法はその使用を制約する潜
在的な重い副作用を有することができる。より特定的に
は、コレステロール合成を低下する薬物（例えばロバス
タチン）は肝臓障害、白内障及び胎児の異常を生ずる可
能性を有する。さらに、多くの家族性高コレステロール
血症（すべての同型接合型及び若干の異種接合型）は食
事及び薬物療法に耐性である。また、薬物療法は通常高
密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）の濃度、並びにＬＤ
Ｌの濃度を低下し、前者はアテローム硬化症に対し保護
性であると思われる。
ロール又は脂肪の高い食事摂取を有する多くの人中に、
及び異常な、しかしＬＤＬに対する細胞表面受容体中に
遺伝子欠損を遺伝された稀でない群を含めて種々の家族
性高脂質血症をもつ人中に高い。全血漿コレステロール
及びＬＤＬコレステロールの濃度は食事又は薬物により
低下できる。しかし、薬物療法はその使用を制約する潜
在的な重い副作用を有することができる。より特定的に
は、コレステロール合成を低下する薬物（例えばロバス
タチン）は肝臓障害、白内障及び胎児の異常を生ずる可
能性を有する。さらに、多くの家族性高コレステロール
血症（すべての同型接合型及び若干の異種接合型）は食
事及び薬物療法に耐性である。また、薬物療法は通常高
密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）の濃度、並びにＬＤ
Ｌの濃度を低下し、前者はアテローム硬化症に対し保護
性であると思われる。
【０００５】血漿瀉血、患者の高コレステロール血漿の
直接除去及び低コレステロール流体による置換、は単に
ＨＤＬ濃度の一時的低下を生じ、良好な療法である。し
かし、血漿瀉血は非常に費用がかゝる。さらに、この療
法は多量のヒト血漿製品の長期投与のために感染性疾患
及び他の合併症の伝達を生ずることができる。血漿によ
る置換の必要を不要にするＬＤＬのみの特異的除去はア
フィニティークロマトグラフィー装置例えばポリアニオ
ンカラム又は抗ＬＤＬ抗体カラムの使用により行なうこ
とができる。しかし、この方法は通常２カラムシステム
を必要とし、１カラムが血漿からＬＤＬを除去し、同時
に他のカラムが再生される。吸収剤の制限された容量が
この方法を厄介で費用のかゝるものにする。
直接除去及び低コレステロール流体による置換、は単に
ＨＤＬ濃度の一時的低下を生じ、良好な療法である。し
かし、血漿瀉血は非常に費用がかゝる。さらに、この療
法は多量のヒト血漿製品の長期投与のために感染性疾患
及び他の合併症の伝達を生ずることができる。血漿によ
る置換の必要を不要にするＬＤＬのみの特異的除去はア
フィニティークロマトグラフィー装置例えばポリアニオ
ンカラム又は抗ＬＤＬ抗体カラムの使用により行なうこ
とができる。しかし、この方法は通常２カラムシステム
を必要とし、１カラムが血漿からＬＤＬを除去し、同時
に他のカラムが再生される。吸収剤の制限された容量が
この方法を厄介で費用のかゝるものにする。
【０００６】血液中のＬＤＬはまたそのホスホリパーゼ
Ｃ又はＤとの反応により優先的に除去することができ、
それは濾過又は遠心分離により他の血液成分から分離で
きるＬＤＬ粒子を与える。この方法は１９８８年９月６
日に提出された米国特許出願第２４1,０６７号中に開示
されている。この療法はむしろ費用がかゝらないけれど
も、その使用は体外適用に限定される。
Ｃ又はＤとの反応により優先的に除去することができ、
それは濾過又は遠心分離により他の血液成分から分離で
きるＬＤＬ粒子を与える。この方法は１９８８年９月６
日に提出された米国特許出願第２４1,０６７号中に開示
されている。この療法はむしろ費用がかゝらないけれど
も、その使用は体外適用に限定される。
【０００７】最近、酵素ホスホリパーゼＡ2 により変異
されたＬＤＬが生体内異化プロセスにより血液プールか
ら速やかに浄化されることが認められた。１９８７年９
月２５日に提出された米国特許出願第１０1,２６２号中
に記載されているように、固定化ホスホリパーゼＡ2 を
含むリアクターが血漿ＬＤＬ濃度を低下させるために体
外又は体内治療に使用される。この方法に関する１つの
主要な欠点は固定化ホスホリパーゼＡ2 が使用されるこ
とを必要とすることである。従ってそれは変異されたＬ
ＤＬの生体内クリアランスの概念に基づく治療系の技術
的設計に大きい制約を課する。とりわけ、固定化酵素を
含むリアクターを治療の間患者に体外的又は体内的に連
結しなければならない。また、固定化プロセスがしばし
ば酵素活性を著しく低下する。
されたＬＤＬが生体内異化プロセスにより血液プールか
ら速やかに浄化されることが認められた。１９８７年９
月２５日に提出された米国特許出願第１０1,２６２号中
に記載されているように、固定化ホスホリパーゼＡ2 を
含むリアクターが血漿ＬＤＬ濃度を低下させるために体
外又は体内治療に使用される。この方法に関する１つの
主要な欠点は固定化ホスホリパーゼＡ2 が使用されるこ
とを必要とすることである。従ってそれは変異されたＬ
ＤＬの生体内クリアランスの概念に基づく治療系の技術
的設計に大きい制約を課する。とりわけ、固定化酵素を
含むリアクターを治療の間患者に体外的又は体内的に連
結しなければならない。また、固定化プロセスがしばし
ば酵素活性を著しく低下する。
【０００８】
【発明の概要】従って本発明の目的は、血漿交換、アフ
ィニティークロマトグラフィー又は固定化酵素含有リア
クターを含む厄介な又は費用のかゝる方法に頼ることな
く血漿コレステロール濃度を低下させる簡単かつ低コス
トの方法を提供することである。
ィニティークロマトグラフィー又は固定化酵素含有リア
クターを含む厄介な又は費用のかゝる方法に頼ることな
く血漿コレステロール濃度を低下させる簡単かつ低コス
トの方法を提供することである。
【０００９】本発明の他の目的は血漿コレステロールの
濃度を血液プールからその除去により低下し、それによ
り、コレステロールの合成を阻止することによりそれを
低下する低コレステロール血薬物に関連することが知ら
れている重い副作用を避ける方法を提供することであ
る。本発明の他の目的は血漿コレステロールを血液プー
ルから除去することによりその濃度を低下する、従って
家族性高コレステロール血症を有する同型接合及び異種
接合両患者の治療に有効である方法を提供することであ
る。
濃度を血液プールからその除去により低下し、それによ
り、コレステロールの合成を阻止することによりそれを
低下する低コレステロール血薬物に関連することが知ら
れている重い副作用を避ける方法を提供することであ
る。本発明の他の目的は血漿コレステロールを血液プー
ルから除去することによりその濃度を低下する、従って
家族性高コレステロール血症を有する同型接合及び異種
接合両患者の治療に有効である方法を提供することであ
る。
【００１０】本発明のなお他の目的はＬＤＬの除去によ
り血漿コレステロールの濃度を低下させ、一方アテロー
ム硬化症に対して保護を与えると思われ、血液中の存在
が望ましいであろうＨＤＬを保持する方法を提供するこ
とである。これら及び他の目的は説明が進むにつれて一
層明らかになろう。本発明によれば、溶性ホスホリパー
ゼＡ2 が治療に有効な量で適当な方法により投与され
る。１態様において、酵素が食塩水中に溶解され、被検
者の血流中へ、静脈内に徐々に潅流される。
り血漿コレステロールの濃度を低下させ、一方アテロー
ム硬化症に対して保護を与えると思われ、血液中の存在
が望ましいであろうＨＤＬを保持する方法を提供するこ
とである。これら及び他の目的は説明が進むにつれて一
層明らかになろう。本発明によれば、溶性ホスホリパー
ゼＡ2 が治療に有効な量で適当な方法により投与され
る。１態様において、酵素が食塩水中に溶解され、被検
者の血流中へ、静脈内に徐々に潅流される。
【００１１】この処置、基本的に薬物療法、は血漿ＬＤ
Ｌの異化を非常に促進する。その結果、被検者の血液中
のＬＤＬ及びコレステロールの濃度が数時間内に実質的
に低下する。
Ｌの異化を非常に促進する。その結果、被検者の血液中
のＬＤＬ及びコレステロールの濃度が数時間内に実質的
に低下する。
【００１２】
【詳細な説明】ホスホリパーゼＡ2 （ホスファチド２−
アシルヒドロラーゼＥ（3.1.1.4 ）はホスホグリセリド
のｓｎ−２脂肪アシルエステル結合を加水分解し、遊離
脂肪酸及びリゾリン脂質を生ずる酵素の異なる系統群で
ある。ホスホリパーゼＡ2 は膵液中並びにヘビ及び節足
動物の毒液中に豊み、そこでそれらが分解性機能を供す
る。しかしそれらはまた、これまで研究されたすべての
細胞型中に微量に生じ、そこでそれらはリン脂質の代謝
及び代謝回転に関与することにより正常細胞の機能に重
要な役割を演ずる。
アシルヒドロラーゼＥ（3.1.1.4 ）はホスホグリセリド
のｓｎ−２脂肪アシルエステル結合を加水分解し、遊離
脂肪酸及びリゾリン脂質を生ずる酵素の異なる系統群で
ある。ホスホリパーゼＡ2 は膵液中並びにヘビ及び節足
動物の毒液中に豊み、そこでそれらが分解性機能を供す
る。しかしそれらはまた、これまで研究されたすべての
細胞型中に微量に生じ、そこでそれらはリン脂質の代謝
及び代謝回転に関与することにより正常細胞の機能に重
要な役割を演ずる。
【００１３】今日まで３０個以上の完全なアミノ酸配列
が種々の源からのホスホリパーゼA2に対して報告され
た。一般的にいえば、これらの酵素は小さく、４〜７個
のジスルフィド結合で架橋されたポリペプチド鎖中に約
１２０個のアミノ酸残基を有する。哺乳動物組織及びヘ
ビの毒液から分離されたすべてのホスホリパーゼＡ2 は
著しい相同性を示し、それらの共通の化学的類似性に関
して一緒に考えることができる。一方、ミツバチ毒酵素
は他のホスホリパーゼＡ2 に比べてその構造が実質的に
異なる。従って、これまで配列されたすべてのホスホリ
パーゼＡ2 は２つの範疇に分類でき、ハチ毒ホスホリパ
ーゼＡ2 が１つの範疇に属し、種々の脊椎動物から他の
酵素は第２の大きい範疇を形成する。
が種々の源からのホスホリパーゼA2に対して報告され
た。一般的にいえば、これらの酵素は小さく、４〜７個
のジスルフィド結合で架橋されたポリペプチド鎖中に約
１２０個のアミノ酸残基を有する。哺乳動物組織及びヘ
ビの毒液から分離されたすべてのホスホリパーゼＡ2 は
著しい相同性を示し、それらの共通の化学的類似性に関
して一緒に考えることができる。一方、ミツバチ毒酵素
は他のホスホリパーゼＡ2 に比べてその構造が実質的に
異なる。従って、これまで配列されたすべてのホスホリ
パーゼＡ2 は２つの範疇に分類でき、ハチ毒ホスホリパ
ーゼＡ2 が１つの範疇に属し、種々の脊椎動物から他の
酵素は第２の大きい範疇を形成する。
【００１４】酵素の第２の大きい相同範疇はさらにそれ
らのアミノ酸配列に基づいて２つの構造クラスに分類で
きる〔ヘインリクソン（Heinrikson) ほか、J. Biol.Ch
em.,２５２；４９１３（１９７７）〕。残基１１と６９
〔こゝに及び以下、ガラガラヘビ〔クロタルス・アトロ
ックス（Crotalus atrox) 〕酵素の番号付与系に基づ
く〕の間のジスルフィド架橋により規定される群Ｉ酵素
には哺乳動物膵臓並びにコブラ及びウミヘビのヘビ系統
群の毒液からのものが含まれる。推定活性部位に近いシ
ステインにジスルフィドにより連結されたカルボキシ末
端配列延長をもつ群II酵素には哺乳動物血小板並びにク
サリヘビ（マムシ及び旧世界クサリヘビともに）及びガ
ラガラヘビの系統群の毒液からホスホリパーゼＡ2 が含
まれる。
らのアミノ酸配列に基づいて２つの構造クラスに分類で
きる〔ヘインリクソン（Heinrikson) ほか、J. Biol.Ch
em.,２５２；４９１３（１９７７）〕。残基１１と６９
〔こゝに及び以下、ガラガラヘビ〔クロタルス・アトロ
ックス（Crotalus atrox) 〕酵素の番号付与系に基づ
く〕の間のジスルフィド架橋により規定される群Ｉ酵素
には哺乳動物膵臓並びにコブラ及びウミヘビのヘビ系統
群の毒液からのものが含まれる。推定活性部位に近いシ
ステインにジスルフィドにより連結されたカルボキシ末
端配列延長をもつ群II酵素には哺乳動物血小板並びにク
サリヘビ（マムシ及び旧世界クサリヘビともに）及びガ
ラガラヘビの系統群の毒液からホスホリパーゼＡ2 が含
まれる。
【００１５】ミツバチ毒ホスホリパーゼＡ2 は群Ｉ及び
II酵素とは構造的に全く異なる。大きさで類似するけれ
ども、それはより少ないジスルフィド結合を有し、他の
ホスホリパーゼＡ2 との多くの配列相同を見いだすこと
が困難である。しかし、ミツバチ毒酵素は、残基４３〜
５０を含む群ＩホスホリパーゼＡ2 の活性部位領域中の
配列に等しい配列：Cys −Cys −Arg −Thr −His −As
p−Met −Cys を有する。
II酵素とは構造的に全く異なる。大きさで類似するけれ
ども、それはより少ないジスルフィド結合を有し、他の
ホスホリパーゼＡ2 との多くの配列相同を見いだすこと
が困難である。しかし、ミツバチ毒酵素は、残基４３〜
５０を含む群ＩホスホリパーゼＡ2 の活性部位領域中の
配列に等しい配列：Cys −Cys −Arg −Thr −His −As
p−Met −Cys を有する。
【００１６】Ｃ．アトロックスからのホスホリパーゼＡ
2 がＬＤＬをその中に存在するリン脂質の加水分解によ
り変異できることはアガーベック(Aggerbeck) ほか、J.
Biol. Chem., ２５１：３８２３（１９７６）により報
告された。ウサギ中のＬＤＬ代謝に関する我々の最近の
研究において、ミツバチ毒からのホスホリパーゼＡ2 に
より異化されたＬＤＬが血流から速やかに浄化されるこ
とが認められた。他の実験において、静脈内投与された
ホスホリパーゼＡ2 変異ＬＤＬの５５％が１０分内に血
液プールから除去されることが認められた。対照的に、
注入された自生、非変異ＬＤＬの濃度の１５％低下が注
入の１時間後に認められた。正常及び高コレステロール
血症の両方のウサギ中の自生及び変異ＬＤＬの生物学的
分布は異化されたＬＤＬが主に肝臓により除去されるこ
とを示す。
2 がＬＤＬをその中に存在するリン脂質の加水分解によ
り変異できることはアガーベック(Aggerbeck) ほか、J.
Biol. Chem., ２５１：３８２３（１９７６）により報
告された。ウサギ中のＬＤＬ代謝に関する我々の最近の
研究において、ミツバチ毒からのホスホリパーゼＡ2 に
より異化されたＬＤＬが血流から速やかに浄化されるこ
とが認められた。他の実験において、静脈内投与された
ホスホリパーゼＡ2 変異ＬＤＬの５５％が１０分内に血
液プールから除去されることが認められた。対照的に、
注入された自生、非変異ＬＤＬの濃度の１５％低下が注
入の１時間後に認められた。正常及び高コレステロール
血症の両方のウサギ中の自生及び変異ＬＤＬの生物学的
分布は異化されたＬＤＬが主に肝臓により除去されるこ
とを示す。
【００１７】異化されたＬＤＬが速やかに代謝されるこ
との発見は我々に高コレステロール血症を治療する新規
治療法を示唆した。より詳しくは、全血漿ＬＤＬ濃度
を、溶性ホスホリパーゼＡ2 を血流中で単に循環しその
中のＬＤＬを変異することにより低下できる。酵素的に
変異されたＬＤＬは次いで生体内変異化プロセスにより
速やかに除去され、それにより患者のコレステロール及
びＬＤＬ両濃度の低下を生ずる。
との発見は我々に高コレステロール血症を治療する新規
治療法を示唆した。より詳しくは、全血漿ＬＤＬ濃度
を、溶性ホスホリパーゼＡ2 を血流中で単に循環しその
中のＬＤＬを変異することにより低下できる。酵素的に
変異されたＬＤＬは次いで生体内変異化プロセスにより
速やかに除去され、それにより患者のコレステロール及
びＬＤＬ両濃度の低下を生ずる。
【００１８】ホスホリパーゼＡ2 はおそらく細胞膜中の
リン脂質を加水分解することにより若干の細胞例えば赤
血球の溶解を触媒することが知られている。この関係に
基づいて、酵素が被検者の組織又は器官に接近し有害な
効果を生ずることができないように固定化ホスホリパー
ゼＡ2 が最初に我々により血漿ＬＤＬの変異に使用され
た。
リン脂質を加水分解することにより若干の細胞例えば赤
血球の溶解を触媒することが知られている。この関係に
基づいて、酵素が被検者の組織又は器官に接近し有害な
効果を生ずることができないように固定化ホスホリパー
ゼＡ2 が最初に我々により血漿ＬＤＬの変異に使用され
た。
【００１９】本発明発明において、我々はそれにもかゝ
わらず血流中への溶性ホスホリパーゼＡ2 の投与が、適
当な方法で行なわれるならば、受容体に対し重大な又は
不可逆的な不利な副作用を生ずることなく血漿コレステ
ロール濃度を数時間内に実質的に低下できることを実証
した。種々の源からの精製ホスホリパーゼＡ2 が市販さ
れている。理想的にはヒトホスホリパーゼＡ2 はそれが
ヒト免疫系と最も適合性であるので高コレステロール血
症患者の治療に好ましい。ヒトホスホリパーゼＡ2 はア
ピッツーカストロ(Apitz-Castro)ほか、Biochem. Bioph
ys. Res. Comm., ９１：６３（１９７９）により記載さ
れた方法により血小板から精製できる（群II酵素）。血
小板からのヒトホスホリパーゼＡ2 の遺伝子が最近クレ
マー（Kramer) ほか、J. Biol.Chem., ２６４：５７６
８（１９８８）によりクローン化されたので、この酵素
の多量の生産が今日可能であると思われる。
わらず血流中への溶性ホスホリパーゼＡ2 の投与が、適
当な方法で行なわれるならば、受容体に対し重大な又は
不可逆的な不利な副作用を生ずることなく血漿コレステ
ロール濃度を数時間内に実質的に低下できることを実証
した。種々の源からの精製ホスホリパーゼＡ2 が市販さ
れている。理想的にはヒトホスホリパーゼＡ2 はそれが
ヒト免疫系と最も適合性であるので高コレステロール血
症患者の治療に好ましい。ヒトホスホリパーゼＡ2 はア
ピッツーカストロ(Apitz-Castro)ほか、Biochem. Bioph
ys. Res. Comm., ９１：６３（１９７９）により記載さ
れた方法により血小板から精製できる（群II酵素）。血
小板からのヒトホスホリパーゼＡ2 の遺伝子が最近クレ
マー（Kramer) ほか、J. Biol.Chem., ２６４：５７６
８（１９８８）によりクローン化されたので、この酵素
の多量の生産が今日可能であると思われる。
【００２０】こゝに記載した態様において、２つの源、
すなわちハチ毒液及びガラガラヘビ（Ｃ．アトロック
ス）毒液からの溶性ホスホリパーゼＡ2 を用いた。各酵
素はそれぞれホスホリパーゼＡ2 系統群の２範疇の１つ
を代表する。ハチ毒酵素は前記のように、哺乳動物及び
爬虫類源からのホスホリパーゼＡ2 とは構造的に異な
る。後者の酵素はさらに２つの群に分類することがで
き、両群中の酵素は配列において高度に相同性である。
例えば、ウシ膵臓ホスホリパーゼＡ2 （群Ｉ酵素）及び
Ｃ．アトロックスホスホリパーゼＡ2 （群II酵素）の配
列を比較すると、それらの相同配列は長さで７〜２０個
のアミノ酸の範囲にあり、ともに最小配列の６２％を含
む。結晶学的研究はさらに、これらの２種の酵素がまた
それらの三次元構造において類似することを示す。従っ
て、Ｃ．アトロックス酵素はハチ毒酵素を１つの例外と
して、これまで研究されたすべてのホスホリパーゼＡ2
の代表である。
すなわちハチ毒液及びガラガラヘビ（Ｃ．アトロック
ス）毒液からの溶性ホスホリパーゼＡ2 を用いた。各酵
素はそれぞれホスホリパーゼＡ2 系統群の２範疇の１つ
を代表する。ハチ毒酵素は前記のように、哺乳動物及び
爬虫類源からのホスホリパーゼＡ2 とは構造的に異な
る。後者の酵素はさらに２つの群に分類することがで
き、両群中の酵素は配列において高度に相同性である。
例えば、ウシ膵臓ホスホリパーゼＡ2 （群Ｉ酵素）及び
Ｃ．アトロックスホスホリパーゼＡ2 （群II酵素）の配
列を比較すると、それらの相同配列は長さで７〜２０個
のアミノ酸の範囲にあり、ともに最小配列の６２％を含
む。結晶学的研究はさらに、これらの２種の酵素がまた
それらの三次元構造において類似することを示す。従っ
て、Ｃ．アトロックス酵素はハチ毒酵素を１つの例外と
して、これまで研究されたすべてのホスホリパーゼＡ2
の代表である。
【００２１】ウサギでの我々の実験の結果はハチ毒又は
Ｃ．アトロックスからのホスホリパーゼＡ2 が、血流中
へ注入した後、コレステロール濃度を低下できることを
示す。より特定的に、本発明の１態様において、いずれ
かの源からのホスホリパーゼＡ2 の治療に有効な量（例
えばハチ毒酵素5,０００単位又はＣ．アトロックス酵素
５００単位、表１及び２参照）を初めに食塩水の予定体
積中に溶解した。生じたホスホリパーゼＡ2 溶液を９０
分の期間にわたってウサギの血流中へ徐々に投与した。
この処理の結果、全血漿コレステロールにおける２６〜
４３％（平均３３％) の降下が投与の終りに認められ
た。コレステロール濃度の低下はその後の一定時間続い
た。全コレステロール濃度における３３〜６０％（平均
４５％）の全低下が、投与の終った３時間後、すなわち
投与を開始した4.５時間後に認められた。
Ｃ．アトロックスからのホスホリパーゼＡ2 が、血流中
へ注入した後、コレステロール濃度を低下できることを
示す。より特定的に、本発明の１態様において、いずれ
かの源からのホスホリパーゼＡ2 の治療に有効な量（例
えばハチ毒酵素5,０００単位又はＣ．アトロックス酵素
５００単位、表１及び２参照）を初めに食塩水の予定体
積中に溶解した。生じたホスホリパーゼＡ2 溶液を９０
分の期間にわたってウサギの血流中へ徐々に投与した。
この処理の結果、全血漿コレステロールにおける２６〜
４３％（平均３３％) の降下が投与の終りに認められ
た。コレステロール濃度の低下はその後の一定時間続い
た。全コレステロール濃度における３３〜６０％（平均
４５％）の全低下が、投与の終った３時間後、すなわち
投与を開始した4.５時間後に認められた。
【００２２】 表１：ホスホリパーゼＡ2 （ＰＬＡ2 ）の注入における高コレステロール血 ウサギ中のコレステロール測定 ──────────────────────────────────── ウサギ１ ウサギ２ ウサギ３ ──────────────────────────────────── 注入ＰＬＡ2 活量 １０００単位 ５０００単位 ５００単位 （ハチ毒） （ハチ毒） (C.アトロックス） 全コレステロール(mg/dl) 初 期 ８９８ ５８９ １９０ ９０分 ７８５(-13%)* ４３６(-26%) １３５(-29%) 4.5時間 −− ３９２(-33%) １１１(-42%) 全トリグリセリド(mg/dl) 初 期 １１５ １６２ ７７ ９０分 ６０(-48%)* １００(-38%) １００(+30%) 4.5時間 −− １５０( -7%) −− * （変化％）
【００２３】 表２：５００単位Ｃ．アトロックス毒の緩徐注入におけるリポタンパク質 ／コレステロール測定 ──────────────────────────────────── 全コレステロール ＨＤＬ ＬＤＬ ＶＬＤＬ ──────────────────────────────────── 初 期 ２８３ １６ １７１ ９６ ９０分 １６０ ３２ １０２ ２６ 変化％ −４３％ ＋１００％ −４０％ −７３％ 4.5時間 １１４ ３７ ５１ ２６ 変化％ −６０％ ＋１３１％ −７０％ −７３％ ──────────────────────────────────── これらの実験におけるコレステロール低下に関するかな
りの相違は多くの理由のために予期された。
りの相違は多くの理由のために予期された。
【００２４】第１に、ウサギ中の初期コレステロール濃
度が非常に異なる、すなわち１９０〜８９８mg／dlの範
囲にあった。また、異なる源及び異なる量のホスホリパ
ーゼＡ2 が使用された。それにもかゝわらず、我々の結
果は明らかに数時間内に血漿コレステロールを実質的に
低下するホスホリパーゼＡ2 の効果を示す。対照的に、
血漿トリグリセリドの濃度は９０分の静脈内潅流の終り
に１実験において増加、他において低下が認められた。
とにかく、第３の実験において投与が終った３時間後に
測定したトリグリセリド濃度が初期濃度と実質的に同様
であったことが示された。これらの結果は表１中に示さ
れる。
度が非常に異なる、すなわち１９０〜８９８mg／dlの範
囲にあった。また、異なる源及び異なる量のホスホリパ
ーゼＡ2 が使用された。それにもかゝわらず、我々の結
果は明らかに数時間内に血漿コレステロールを実質的に
低下するホスホリパーゼＡ2 の効果を示す。対照的に、
血漿トリグリセリドの濃度は９０分の静脈内潅流の終り
に１実験において増加、他において低下が認められた。
とにかく、第３の実験において投与が終った３時間後に
測定したトリグリセリド濃度が初期濃度と実質的に同様
であったことが示された。これらの結果は表１中に示さ
れる。
【００２５】我々の実験結果はまたＣ．アトロックスホ
スホリパーゼＡ2 がハチ毒酵素より血漿コレステロール
の低下に一層有効であることを示唆する。表１中に示さ
れるように、コレステロール濃度の匹敵できる低下を達
成するためにＣ．アトロックス毒の量に比べて１０倍量
のハチ毒からの酵素が必要であった。１実験において、
異なるリポタンパク質のコレステロール含量の変化をホ
スホリパーゼＡ2 の投与の前後に測定した。表２中に示
されるように、ホスホリパーゼＡ2 の投与が終った３時
間後に全コレステロール濃度の１６９mg／dlの低下（２
８３mg／dlから１１４mg／dlに）があった。この低下は
ＬＤＬコレステロールの１２０mg／dlの相当する低下
（１７１mg／dlから５１mg／dlに）により達成された。
随伴する低下は本発明の基礎原理に一致する。すなわ
ち、血流中の全コレステロールの約６５〜７０％がＬＤ
Ｌで運ばれるので、ホスホリパーゼＡ2 により変異され
たＬＤＬの速やかな異化が血漿コレステロールの低下を
達成する。この関係において、被検者中へのホスホリパ
ーゼＡ2 の静脈内潅流後の血漿ＬＤＬの変異が、直接Ｌ
ＤＬ中のリン脂質の加水分解のモニターにより、及び間
接的にろ紙上のリポタンパク質移動度の増加をクロマト
グラフ的にモニターすることにより、両方で確認された
ことが指摘されるべきである。
スホリパーゼＡ2 がハチ毒酵素より血漿コレステロール
の低下に一層有効であることを示唆する。表１中に示さ
れるように、コレステロール濃度の匹敵できる低下を達
成するためにＣ．アトロックス毒の量に比べて１０倍量
のハチ毒からの酵素が必要であった。１実験において、
異なるリポタンパク質のコレステロール含量の変化をホ
スホリパーゼＡ2 の投与の前後に測定した。表２中に示
されるように、ホスホリパーゼＡ2 の投与が終った３時
間後に全コレステロール濃度の１６９mg／dlの低下（２
８３mg／dlから１１４mg／dlに）があった。この低下は
ＬＤＬコレステロールの１２０mg／dlの相当する低下
（１７１mg／dlから５１mg／dlに）により達成された。
随伴する低下は本発明の基礎原理に一致する。すなわ
ち、血流中の全コレステロールの約６５〜７０％がＬＤ
Ｌで運ばれるので、ホスホリパーゼＡ2 により変異され
たＬＤＬの速やかな異化が血漿コレステロールの低下を
達成する。この関係において、被検者中へのホスホリパ
ーゼＡ2 の静脈内潅流後の血漿ＬＤＬの変異が、直接Ｌ
ＤＬ中のリン脂質の加水分解のモニターにより、及び間
接的にろ紙上のリポタンパク質移動度の増加をクロマト
グラフ的にモニターすることにより、両方で確認された
ことが指摘されるべきである。
【００２６】表２中にまた示されるように、超低密度リ
ポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）のコレステロール含量の
変化のパタンがＬＤＬのそれに実質的に従う。一方ＨＤ
Ｌのコレステロール含量は血液プール中へのホスホリパ
ーゼＡ2 の投与後に低下しないことが認められた。おそ
らく、ホスホリパーゼＡ2がＨＤＬ中のものよりもＬＤ
Ｌ（及びＶＬＤＬ）中のリン脂質と優先的に反応する。
類似の現像はまたリン脂質と反応する他の酵素、すなわ
ちホスホリパーゼＣ、で観察された。前記のように、Ｈ
ＤＬはアテローム硬化症に対し保護性であると思われ
る。従って、ＨＤＬ中のものよりもＬＤＬ中に存在する
リン脂質の攻撃に対するホスホリパーゼA2の優先は高コ
レステロール血症の治療用薬物としてこの酵素を使用す
ることに追加利益を与える。
ポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）のコレステロール含量の
変化のパタンがＬＤＬのそれに実質的に従う。一方ＨＤ
Ｌのコレステロール含量は血液プール中へのホスホリパ
ーゼＡ2 の投与後に低下しないことが認められた。おそ
らく、ホスホリパーゼＡ2がＨＤＬ中のものよりもＬＤ
Ｌ（及びＶＬＤＬ）中のリン脂質と優先的に反応する。
類似の現像はまたリン脂質と反応する他の酵素、すなわ
ちホスホリパーゼＣ、で観察された。前記のように、Ｈ
ＤＬはアテローム硬化症に対し保護性であると思われ
る。従って、ＨＤＬ中のものよりもＬＤＬ中に存在する
リン脂質の攻撃に対するホスホリパーゼA2の優先は高コ
レステロール血症の治療用薬物としてこの酵素を使用す
ることに追加利益を与える。
【００２７】ホスホリパーゼＡ2 は、おそらく細胞膜中
のリン脂質の加水分解により、若干の細胞に損傷を生ず
ることが知られている。前記のようにホスホリパーゼＡ
2 処置によりウサギがうけたかもしれない損傷の程度の
基準として溶血検定を各実験の終りに行なった。生じた
遊離ヘモグロビン含量と初期全ヘモグロビン含量との比
によって示して赤血球の単に１０〜２０％が全実験にお
いて溶解したことが認められた。対照的に、リポタンパ
ク質中のリン脂質の８０〜９０％がホスホリパーゼＡ2
による潅流の終りに加水分解した。明らかにＬＤＬを含
めて血漿タンパク質がホスホリパーゼＡ2 による攻撃に
対して赤血球より一層抵抗力がない。とにかく、ホスホ
リパーゼＡ2 処置されたすべてのウサギが操作にもかゝ
わらず生存しただけでなく、またそれらを他の実験のた
めにと殺する前２か月以上の間健康であった。
のリン脂質の加水分解により、若干の細胞に損傷を生ず
ることが知られている。前記のようにホスホリパーゼＡ
2 処置によりウサギがうけたかもしれない損傷の程度の
基準として溶血検定を各実験の終りに行なった。生じた
遊離ヘモグロビン含量と初期全ヘモグロビン含量との比
によって示して赤血球の単に１０〜２０％が全実験にお
いて溶解したことが認められた。対照的に、リポタンパ
ク質中のリン脂質の８０〜９０％がホスホリパーゼＡ2
による潅流の終りに加水分解した。明らかにＬＤＬを含
めて血漿タンパク質がホスホリパーゼＡ2 による攻撃に
対して赤血球より一層抵抗力がない。とにかく、ホスホ
リパーゼＡ2 処置されたすべてのウサギが操作にもかゝ
わらず生存しただけでなく、またそれらを他の実験のた
めにと殺する前２か月以上の間健康であった。
【００２８】従って、我々は本発明の有効性、すなわち
被検者の血流中へ適当な方法でホスホリパーゼＡ2 を投
与しそれにより被検者に重大な又は不可逆的な効果を生
ずることなく数時間内に血漿コレステロールの実質的な
低下を達成すること、を明らかに示した。投与されるホ
スホリパーゼＡ2 の投薬量は、もちろん治療される状態
の重さ、選ばれる投与の経路、被検者の体重、ホスホリ
パーゼＡ2 の比活性及び酵素の源による。投薬量効果の
例として、ハチ毒ホスホリパーゼＡ2 の量を1,０００単
位から5,０００単位に増加すると全コレステロールの低
下が１３％から２６％に、２倍になったことが表１中に
示される。また、前記のように、Ｃ．アトロックスホス
ホリパーゼＡ2 が血漿コレステロール濃度の低下におい
てハチ毒酵素より非常に有効である。従って、低投薬量
がＣ．アトロックス酵素に使用されよう。実際には投与
される投薬量は結局治療する専門職業人により決定され
よう。ＬＤＬ濃度を、重大な又は不可逆的な副作用を生
ずることなく低下するホスホリパーゼＡ2 の投薬量はこ
ゝに「治療に有効な量」として示される。
被検者の血流中へ適当な方法でホスホリパーゼＡ2 を投
与しそれにより被検者に重大な又は不可逆的な効果を生
ずることなく数時間内に血漿コレステロールの実質的な
低下を達成すること、を明らかに示した。投与されるホ
スホリパーゼＡ2 の投薬量は、もちろん治療される状態
の重さ、選ばれる投与の経路、被検者の体重、ホスホリ
パーゼＡ2 の比活性及び酵素の源による。投薬量効果の
例として、ハチ毒ホスホリパーゼＡ2 の量を1,０００単
位から5,０００単位に増加すると全コレステロールの低
下が１３％から２６％に、２倍になったことが表１中に
示される。また、前記のように、Ｃ．アトロックスホス
ホリパーゼＡ2 が血漿コレステロール濃度の低下におい
てハチ毒酵素より非常に有効である。従って、低投薬量
がＣ．アトロックス酵素に使用されよう。実際には投与
される投薬量は結局治療する専門職業人により決定され
よう。ＬＤＬ濃度を、重大な又は不可逆的な副作用を生
ずることなく低下するホスホリパーゼＡ2 の投薬量はこ
ゝに「治療に有効な量」として示される。
【００２９】ホスホリパーゼＡ2 の治療に有効な量は処
置される状態に適する経路により投与できる。好ましく
は酵素は治療される被検者の血流中へ注射される。好ま
しい経路例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、気管
支、鼻、経口などが、治療される状態及び使用される酵
素の生化学的性質で変化することは当業者により容易に
理解されよう。
置される状態に適する経路により投与できる。好ましく
は酵素は治療される被検者の血流中へ注射される。好ま
しい経路例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、気管
支、鼻、経口などが、治療される状態及び使用される酵
素の生化学的性質で変化することは当業者により容易に
理解されよう。
【００３０】ホスホリパーゼＡ2 を純粋又は実質的に純
粋なタンパク質として投与することが可能であるけれど
も、それを薬学的配合物又は調製物として与えることが
好ましい。本発明の配合物は人及び獣医学の使用に対し
ともに、精製したホスホリパーゼＡ2 並びに１種又はそ
れ以上のその薬学的に許容できる担体及び、場合により
他の治療成分を含む。担体は配合物の他の成分と適合性
であり、その受容体に有害でない意味で「許容可能」で
なければならない。望ましくは、配合物はタンパク質が
不適合であることが知られた酸化性物質及び他の物質を
含むべきでない。むしろ、担体が酵素の保存期間を延長
できるように酵素を安定化できることが好ましい。
粋なタンパク質として投与することが可能であるけれど
も、それを薬学的配合物又は調製物として与えることが
好ましい。本発明の配合物は人及び獣医学の使用に対し
ともに、精製したホスホリパーゼＡ2 並びに１種又はそ
れ以上のその薬学的に許容できる担体及び、場合により
他の治療成分を含む。担体は配合物の他の成分と適合性
であり、その受容体に有害でない意味で「許容可能」で
なければならない。望ましくは、配合物はタンパク質が
不適合であることが知られた酸化性物質及び他の物質を
含むべきでない。むしろ、担体が酵素の保存期間を延長
できるように酵素を安定化できることが好ましい。
【００３１】配合物は便宜には単位剤形で提供すること
ができ、薬学技術においてよく知られた方法により製造
できる。すべての方法は精製ホスホリパーゼＡ2 を１種
又はそれ以上の補助的成分を構成する担体と関連させる
段階を含む。一般に、錠剤又は粉末のための配合物は凍
結乾燥ホスホリパーゼＡ2と微粒固体担体とを均一かつ
十分にブレンドし、次いで、錠剤の場合のように、必要
であれば生成物を所望形状及び大きさに造形することに
より製造される。これらの固体配合物は経口摂取する。
ができ、薬学技術においてよく知られた方法により製造
できる。すべての方法は精製ホスホリパーゼＡ2 を１種
又はそれ以上の補助的成分を構成する担体と関連させる
段階を含む。一般に、錠剤又は粉末のための配合物は凍
結乾燥ホスホリパーゼＡ2と微粒固体担体とを均一かつ
十分にブレンドし、次いで、錠剤の場合のように、必要
であれば生成物を所望形状及び大きさに造形することに
より製造される。これらの固体配合物は経口摂取する。
【００３２】一方、非経口投与に使用される配合物は便
宜にはホスホリパーゼＡ2 の無菌水溶液を含む。好まし
くは溶液は受容体の血液と等張である。そのような配合
物は固体ホスホリパーゼＡ2 を水中に溶解して水溶液を
生成し、次いで溶液を無菌することにより便宜に製造で
きる。配合物は単位又は多−用量容器例えば密封アンプ
ル又はバイアル中で提供できる。
宜にはホスホリパーゼＡ2 の無菌水溶液を含む。好まし
くは溶液は受容体の血液と等張である。そのような配合
物は固体ホスホリパーゼＡ2 を水中に溶解して水溶液を
生成し、次いで溶液を無菌することにより便宜に製造で
きる。配合物は単位又は多−用量容器例えば密封アンプ
ル又はバイアル中で提供できる。
【００３３】我々はこゝに本発明の特定の態様を記載し
た。しかし変形及び改変を本発明に行なって本発明の利
点の若干又はすべてを達成できることが明らかであろ
う。例えば、本発明において使用できるホスホリパーゼ
Ａ2 はこれまでに分離され、研究された酵素に限定され
ない。しかし、それらが血液中に可溶性であり、そこに
存在するもの以外の補因子を必要としないことが好まし
い。
た。しかし変形及び改変を本発明に行なって本発明の利
点の若干又はすべてを達成できることが明らかであろ
う。例えば、本発明において使用できるホスホリパーゼ
Ａ2 はこれまでに分離され、研究された酵素に限定され
ない。しかし、それらが血液中に可溶性であり、そこに
存在するもの以外の補因子を必要としないことが好まし
い。
【００３４】また、組換えＤＮＡ技術により合成され
た、リン脂質のｓｎ−２アシルエステル結合を加水分解
できるだけでなく、また若干の他の望ましい性質を有す
るハイブリッドタンパク質を使用することが可能であ
る。例として、ＬＤＬを変異できるだけでなく、また胃
のプロテアーゼによる消化に耐性であるハイブリッドタ
ンパク質は、高コレステロール血症の治療のために経口
経路により便宜かつ有効に投与できるであろう。
た、リン脂質のｓｎ−２アシルエステル結合を加水分解
できるだけでなく、また若干の他の望ましい性質を有す
るハイブリッドタンパク質を使用することが可能であ
る。例として、ＬＤＬを変異できるだけでなく、また胃
のプロテアーゼによる消化に耐性であるハイブリッドタ
ンパク質は、高コレステロール血症の治療のために経口
経路により便宜かつ有効に投与できるであろう。
【００３５】本発明の他の改良はポリエチレングリコー
ル−ホスホリパーゼＡ2 及びその変形の使用を含む。ポ
リエチレングリコールの酵素に対する共有結合的結合は
酵素の表面上の部位に対する接近を遮断し、それにより
血流からのクリアランス、プロテアーゼによる攻撃及び
抗体の結合、並びに免疫応答の発生に必要な抗原提供細
胞によるプロセシングを阻止することが認められた。そ
の結果、投与された酵素の抗原性を少くし、また循環寿
命を長くする〔ハーシュフィールド(Hershfie-ld) ほ
か、N. Engl. J. Med., ３１６：５８９（１９８７）；
ホー（Ho) ほか、Drug Metab. Dispos.,１４：３４９
（１９８６）；チュア（Chua) ほか、Annalsof Interna
lMed.,１０９：１１４（１９８８）〕。
ル−ホスホリパーゼＡ2 及びその変形の使用を含む。ポ
リエチレングリコールの酵素に対する共有結合的結合は
酵素の表面上の部位に対する接近を遮断し、それにより
血流からのクリアランス、プロテアーゼによる攻撃及び
抗体の結合、並びに免疫応答の発生に必要な抗原提供細
胞によるプロセシングを阻止することが認められた。そ
の結果、投与された酵素の抗原性を少くし、また循環寿
命を長くする〔ハーシュフィールド(Hershfie-ld) ほ
か、N. Engl. J. Med., ３１６：５８９（１９８７）；
ホー（Ho) ほか、Drug Metab. Dispos.,１４：３４９
（１９８６）；チュア（Chua) ほか、Annalsof Interna
lMed.,１０９：１１４（１９８８）〕。
【００３６】あるいは、ＬＤＬに対する酵素の特異的標
的のためにＬＤＬに向かう抗体に接合したホスホリパー
ゼＡ2 を投与することが望ましいかもしれない。薬物有
効性の増加又は薬物副作用の低下が薬物の担体例えば抗
体あるいは標的分子又は細胞に対する優先的親和力を有
する他の溶性結合性タンパク質に対する化学的結合によ
り達成できることが該技術においてよく知られている
〔ハーウィッツ(Hurwitz) ほか、J. Med. Chem.,２８：
１３７（１９８５）；チル（Till) ほか、Science,２４
２：１１６６（１９８８）〕。
的のためにＬＤＬに向かう抗体に接合したホスホリパー
ゼＡ2 を投与することが望ましいかもしれない。薬物有
効性の増加又は薬物副作用の低下が薬物の担体例えば抗
体あるいは標的分子又は細胞に対する優先的親和力を有
する他の溶性結合性タンパク質に対する化学的結合によ
り達成できることが該技術においてよく知られている
〔ハーウィッツ(Hurwitz) ほか、J. Med. Chem.,２８：
１３７（１９８５）；チル（Till) ほか、Science,２４
２：１１６６（１９８８）〕。
【００３７】次の実施例は本発明の理解を助けるために
提供され、その真の範囲は特許請求の範囲中に示され
る。発明の精神から逸脱することなく示した操作に改変
を行なうことができることが理解される。 実施例１ ハチ毒ホスホリパーゼＡ2 （1,０００又は5,０００単
位）を約５mlの無菌生理食塩水中に溶解して２００単位
毎mlの濃度を有する酵素溶液を形成した。ハチ毒ホスホ
リパーゼＡ2 はシグマ（Sigma, St. Louis, MO) から購
入した。酵素活性はダイズＬ−α−ホスファチジルコリ
ンを基質として用いて２５℃でpH8.９で測定した。
提供され、その真の範囲は特許請求の範囲中に示され
る。発明の精神から逸脱することなく示した操作に改変
を行なうことができることが理解される。 実施例１ ハチ毒ホスホリパーゼＡ2 （1,０００又は5,０００単
位）を約５mlの無菌生理食塩水中に溶解して２００単位
毎mlの濃度を有する酵素溶液を形成した。ハチ毒ホスホ
リパーゼＡ2 はシグマ（Sigma, St. Louis, MO) から購
入した。酵素活性はダイズＬ−α−ホスファチジルコリ
ンを基質として用いて２５℃でpH8.９で測定した。
【００３８】酵素溶液を、１％コレステロール食〔プリ
ナー（Purina,Framingham, MA) 〕を１〜３週間与えた
ニュージーランドシロウサギ〔ヘイゼルトン（Hazelto
n,Denver, PA) 〕中へ９０分間にわたって静脈内に徐々
に潅流した。潅流はミニカス(Minicath)注入セット２３
Ｇ〔デゼレート・メディカル（Deseret Med. Inc.,Sand
y, UT)〕で辺縁静脈を通して行なった。
ナー（Purina,Framingham, MA) 〕を１〜３週間与えた
ニュージーランドシロウサギ〔ヘイゼルトン（Hazelto
n,Denver, PA) 〕中へ９０分間にわたって静脈内に徐々
に潅流した。潅流はミニカス(Minicath)注入セット２３
Ｇ〔デゼレート・メディカル（Deseret Med. Inc.,Sand
y, UT)〕で辺縁静脈を通して行なった。
【００３９】３時点、すなわち潅流を開始した後０時、
９０分及び4.５時間、に血液試料を、全コレステロール
及びトリグリセリドの濃度並びに溶血の測定のためにミ
ニカス注入セット２１Ｇで耳動脈から採取した。全コレ
ステロール測定は、コレステロールエステルヒドロラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、ヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩、４−アミ
ノアンチピリン、及びアジ化ナトリウムのリン酸塩緩衝
液中の混合物を含むキット、コレスーキネット（Choles
-Cinet) を用いて行なった。キットはスクラボ・ダイア
グノスチック（Scalavo Diagnostics, Wayne, NJ) から
購入した。コレステロールはヘンリー（Henry)ほか、
「臨床化学；原理及び手法（Clinical Chemistry ; Pri
nciples and Techuiques）」、ハーパーほか(Harp-er a
nd Rows)編、１４４０、New York（１９７５）により記
載された自動化システムで比色法により測定した。
９０分及び4.５時間、に血液試料を、全コレステロール
及びトリグリセリドの濃度並びに溶血の測定のためにミ
ニカス注入セット２１Ｇで耳動脈から採取した。全コレ
ステロール測定は、コレステロールエステルヒドロラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、ヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩、４−アミ
ノアンチピリン、及びアジ化ナトリウムのリン酸塩緩衝
液中の混合物を含むキット、コレスーキネット（Choles
-Cinet) を用いて行なった。キットはスクラボ・ダイア
グノスチック（Scalavo Diagnostics, Wayne, NJ) から
購入した。コレステロールはヘンリー（Henry)ほか、
「臨床化学；原理及び手法（Clinical Chemistry ; Pri
nciples and Techuiques）」、ハーパーほか(Harp-er a
nd Rows)編、１４４０、New York（１９７５）により記
載された自動化システムで比色法により測定した。
【００４０】全トリグリセリド測定はアボット（Abbot
t, NorthChicago, IL)からのＡ−ジェント（Ａ−gent)
キットで得た。Ａ−ジェントはＮＡＤＨ、ホスホエノー
ルピルビン酸塩、ＡＴＰ二ナトリウム塩、ＭｇＳＯ4 ：
トリス緩衝液、無水コハク酸、リパーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ及びグリセロールの混合
物である。トリグリセリドは微生物リパーゼにより遊離
グリセロール及び遊離脂肪酸に加水分解された。遊離さ
れた遊離グリセロールは次いでアボートからの自動化シ
ステム、バイオクロマチック・アナライザー（Biochrom
atic Analyzer)１００で３４０nmにおけるＮＡＤＨの消
失により測定した。ブコロ（Bucolo) ほか、Clinical c
hemistry, １９；４７６（１９７５）；サンプソン(Sam
pson) ほか、Clinical Chemistry, ２１：１９８３（１
９７５）。
t, NorthChicago, IL)からのＡ−ジェント（Ａ−gent)
キットで得た。Ａ−ジェントはＮＡＤＨ、ホスホエノー
ルピルビン酸塩、ＡＴＰ二ナトリウム塩、ＭｇＳＯ4 ：
トリス緩衝液、無水コハク酸、リパーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ及びグリセロールの混合
物である。トリグリセリドは微生物リパーゼにより遊離
グリセロール及び遊離脂肪酸に加水分解された。遊離さ
れた遊離グリセロールは次いでアボートからの自動化シ
ステム、バイオクロマチック・アナライザー（Biochrom
atic Analyzer)１００で３４０nmにおけるＮＡＤＨの消
失により測定した。ブコロ（Bucolo) ほか、Clinical c
hemistry, １９；４７６（１９７５）；サンプソン(Sam
pson) ほか、Clinical Chemistry, ２１：１９８３（１
９７５）。
【００４１】種々の時点で測定した全コレステロール及
びトリグリセリド濃度は表１、見出し「ウサギ１」及び
「ウサギ２」下の２つの欄中に示される。溶血はカーン
（Kahn) ほか、Ann. Clin. Lab. Science,１１：１２６
（１９８１）により報告された方法に従い分光測光的に
測定した。静脈内潅流後の遊離ヘモグロビンは全ヘモグ
ロビンに対する初期値の１０〜２０％であると認められ
た。
びトリグリセリド濃度は表１、見出し「ウサギ１」及び
「ウサギ２」下の２つの欄中に示される。溶血はカーン
（Kahn) ほか、Ann. Clin. Lab. Science,１１：１２６
（１９８１）により報告された方法に従い分光測光的に
測定した。静脈内潅流後の遊離ヘモグロビンは全ヘモグ
ロビンに対する初期値の１０〜２０％であると認められ
た。
【００４２】実施例II Ｃ．アトロックスホスホリパーゼＡ2 （５００単位）を
約５mlの無菌生理食塩水中に溶解して約８０単位毎mlの
濃度を有する酵素溶液を形成した。Ｃ．アトロックスホ
スホリパーゼＡ2 はマイアミ・サーペンタリウム(Miami
Serpentarium,Salt Lake City, UT) から購入した凍結
乾燥Ｃ．アトロックス（ニシヒシモンガラガラヘビ）毒
からハチモリ（Hachimori)ほか、Biochemistry, １０：
１９７１（１９７５）により記載された操作により精製
した。酵素活性はダイズＬ−α−ホスファチジルコリン
を基質として用いて２５℃でpH8.９で測定した。
約５mlの無菌生理食塩水中に溶解して約８０単位毎mlの
濃度を有する酵素溶液を形成した。Ｃ．アトロックスホ
スホリパーゼＡ2 はマイアミ・サーペンタリウム(Miami
Serpentarium,Salt Lake City, UT) から購入した凍結
乾燥Ｃ．アトロックス（ニシヒシモンガラガラヘビ）毒
からハチモリ（Hachimori)ほか、Biochemistry, １０：
１９７１（１９７５）により記載された操作により精製
した。酵素活性はダイズＬ−α−ホスファチジルコリン
を基質として用いて２５℃でpH8.９で測定した。
【００４３】実施例Ｉに記載したと同様の操作に従っ
た。種々の時点で測定した全コレステロール及びトリグ
リセリドの濃度は表１、見出し「ウサギ３」の下の右欄
中に示される。ホスホリパーゼＡ2 処置後の遊離ヘモグ
ロビンは全ヘモグロビンに対する初期値の１０〜２０％
であると認められた。
た。種々の時点で測定した全コレステロール及びトリグ
リセリドの濃度は表１、見出し「ウサギ３」の下の右欄
中に示される。ホスホリパーゼＡ2 処置後の遊離ヘモグ
ロビンは全ヘモグロビンに対する初期値の１０〜２０％
であると認められた。
【００４４】実施例III Ｃ．アトロックスホスホリパーゼＡ2 （５００単位）を
約５mlの無菌生理食塩水中に溶解して約８０単位毎mlの
濃度を有する酵素溶液を形成した。血液試料は種々の時
点に採取した。全操作は実施例Ｉ及びIIに記載した操作
に従って行なった。
約５mlの無菌生理食塩水中に溶解して約８０単位毎mlの
濃度を有する酵素溶液を形成した。血液試料は種々の時
点に採取した。全操作は実施例Ｉ及びIIに記載した操作
に従って行なった。
【００４５】異なる血漿リポタンパク質のコレステロー
ル含量はスクラボ・ダンアグノスチックス（Sclavo Dia
gnostics, Wayne,NJ)からのキット、コレスーキネット
を用いて次のように測定した。塩化マンガン及びヘパリ
ンによる血漿沈殿後、沈殿しなかったＨＤＬコレステロ
ールを上澄み中で測定した。ＬＤＬコレステロールに対
する値は全コレステロールとＨＤＬコレステロールプラ
ストリグリセリドの 1/5（ＶＬＤＬの概算値）との差と
して計算した。
ル含量はスクラボ・ダンアグノスチックス（Sclavo Dia
gnostics, Wayne,NJ)からのキット、コレスーキネット
を用いて次のように測定した。塩化マンガン及びヘパリ
ンによる血漿沈殿後、沈殿しなかったＨＤＬコレステロ
ールを上澄み中で測定した。ＬＤＬコレステロールに対
する値は全コレステロールとＨＤＬコレステロールプラ
ストリグリセリドの 1/5（ＶＬＤＬの概算値）との差と
して計算した。
【００４６】たの場合に、ＬＤＬコレステロール濃度
を、トリグリセリド及びＬＤＬを除くために1.００６の
密度で４2,０００rpm で２２時間遠心分離した後測定し
た。ＶＬＤＬ及びトリグリセリドを除いた後、全コレス
テロール及びＨＤＬコレステロールを測定した。ＬＤＬ
コレステロールを全コレステロールとＨＤＬコレステロ
ールとの間の差として計算した。
を、トリグリセリド及びＬＤＬを除くために1.００６の
密度で４2,０００rpm で２２時間遠心分離した後測定し
た。ＶＬＤＬ及びトリグリセリドを除いた後、全コレス
テロール及びＨＤＬコレステロールを測定した。ＬＤＬ
コレステロールを全コレステロールとＨＤＬコレステロ
ールとの間の差として計算した。
【００４７】種々の時点で測定したＬＤＬ、ＨＤＬ及び
ＶＬＤＬのコレステロール含量は表２中に示される。溶
血検定もまた行なった。実施例Ｉ及びIIにおけるよう
に、潅流後の遊離ヘモグロビンは全ヘモグロビンに対す
る初期値の１０〜２０％であった。
ＶＬＤＬのコレステロール含量は表２中に示される。溶
血検定もまた行なった。実施例Ｉ及びIIにおけるよう
に、潅流後の遊離ヘモグロビンは全ヘモグロビンに対す
る初期値の１０〜２０％であった。
フロントページの続き (72)発明者 ロバート エス ランガー ジュニア アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02143サマーヴィル グリーンヴィル ス トリート 46 (72)発明者 レジーヌ ラベック アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01880ウェイクフィールド スポールディ ング ストリート ６ (72)発明者 クローディー ジ ペ ミューロン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01701フレミンガム 523エイ ウースター ロード 1612
Claims (12)
- 【請求項１】 被検者の血液中の低密度リポタンパク質
（ＬＤＬ）の濃度を低下させる方法であって、ホスホグ
リセリドのｓｎ−２脂肪アシルエステル結合を加水分解
できる酵素を選ぶ段階；及び酵素の治療に有効な量を被
検者中へ、血液中のＬＤＬのホスホグリセリドのｓｎ−
２脂肪アシルエステル結合を加水分解し、従ってＬＤＬ
を生体内異化プロセスにより血液から速やかに除去され
る形態に変異させるために投与する段階を含む方法。 - 【請求項２】 酵素がホスホリパーゼＡ2 である、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ホスホリパーゼＡ2 が節足動物毒から精
製される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ホスホリパーゼＡ2 がハチ毒から精製さ
れる、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ホスホリパーゼＡ2 がコブラ毒、ウミヘ
ビ毒、ガラガラヘビ毒、マムシ毒、旧世界クサヘビ毒、
膵臓及び血小板からなる群から精製される、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項６】 ホスホリパーゼＡ2 がガラガラヘビ毒か
ら精製される、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 酵素が被検者中へのその投与の前にＬＤ
Ｌに向かう抗体に結合される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 酵素が被検者中へのその投与の前にポリ
エチレングリコールに共有結合で結合される、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項９】 酵素が胃のタンパク質分解に耐性のハイ
ブリッドタンパク質である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 投与が静脈内注射、皮下注射、筋肉内
注射、腹腔内注射、鼻吹入法、及び経口摂取からなる群
から選ばれる方法により行なわれる、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１１】 投与が、酵素を溶解した食塩水の静脈
内潅流により行なわれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 酵素が被検者中へのその投与の前に薬
学的に許容できる賦形剤中に含有される、請求項１に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US567261 | 1990-08-14 | ||
| US07/567,261 US5178864A (en) | 1990-08-14 | 1990-08-14 | Lipoprotein removal by soluble enzymes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05155780A true JPH05155780A (ja) | 1993-06-22 |
Family
ID=24266420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3204204A Pending JPH05155780A (ja) | 1990-08-14 | 1991-08-14 | 溶性酵素によるリポタンパク質除去 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5178864A (ja) |
| EP (1) | EP0471549A3 (ja) |
| JP (1) | JPH05155780A (ja) |
| AU (1) | AU644196B2 (ja) |
| CA (1) | CA2049119C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4897375A (en) * | 1981-02-26 | 1990-01-30 | Alloy Surfaces Company, Inc. | Process of preparing catalytic brass |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4331358A1 (de) * | 1992-10-12 | 1994-04-14 | Braun Melsungen Ag | Verfahren zur quantitativen selektiven Entfernung oder präparativen Gewinnung von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) oder/und Lipopolysacchariden (LPS) aus wäßrigen Flüssigkeiten |
| FR2722692B1 (fr) * | 1994-07-20 | 1997-03-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Medicament a base de phospholipase a2 de venin d'abeille |
| DE19515554C2 (de) * | 1995-04-27 | 1999-06-17 | Braun Melsungen Ag | Verwendung eines Mittels und Vorrichtung zur simultanen extrakorporalen Elimination von Tumor-Nekrose-Faktor alpha und bakteriellen Lipopolysacchariden aus Vollblut oder/und Blutplasma |
| US20020068327A1 (en) * | 1995-06-07 | 2002-06-06 | Peter D. Kwong | Non-naturally occurring targeted lipolytic compounds and related compositions and methods |
| ATE435023T1 (de) | 1996-09-11 | 2009-07-15 | Elizabeth Shanahan-Prendergast | Therapeutische formulierungen, die schlangen- und/oder insektengift enthalten, zur prophylaxe und therapie von neoplasmen |
| JP2000226335A (ja) * | 1998-12-04 | 2000-08-15 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 経口用酵素製剤、酵素含有食材及び酵素製剤の服用方法 |
| WO2007092735A2 (en) | 2006-02-02 | 2007-08-16 | Innovative Bio Therapies | An extracorporeal cell-based therapeutic device and delivery system |
| WO2010071692A2 (en) * | 2008-06-18 | 2010-06-24 | Innovative Biotherapies, Inc. | Methods for enhanced propagation of cells |
| KR20100076532A (ko) * | 2008-12-26 | 2010-07-06 | 학교법인 선목학원 | 봉독을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1509866A (en) * | 1975-06-10 | 1978-05-04 | Johnson & Johnson | Enteric coated digestive enzyme compositions |
| DE2829531A1 (de) * | 1978-07-05 | 1980-01-24 | Heuck Claus Christian Dr Rer N | Verfahren zur quantitativen bestimmung eines serumproteins in getruebten serum- und plasma-proben |
| CA1265785A (en) * | 1984-06-04 | 1990-02-13 | Kumi Yoshida | Triterpenyl esters of organic acids, process for their production, and hypolipidemic agents composed of them |
| CA1259915A (en) * | 1985-10-09 | 1989-09-26 | Sailen S. Mookerjea | Means to reduce plasma cholesterol |
| US4822608A (en) * | 1987-09-14 | 1989-04-18 | Vespa Laboratories, Inc. | Methods and compositions for the treatment of mammalian infections employing medicaments comprising hymenoptera venom or proteinaceous or polypeptide components thereof |
| US5232696A (en) * | 1987-09-25 | 1993-08-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Reduction of low density lipoproteins in biological fluids |
| FR2623508B1 (fr) * | 1987-11-20 | 1990-04-20 | Commissariat Energie Atomique | Proteine basique denommee phospholipase a2 isolee de venin de serpent de la famille des elapides et sa sequence en amino-acides, derives et fragments de ladite proteine, leur procede d'obtention, compositions therapeutiques et agents de diagnostic contenant ladite proteine et/ou ses derives et/ou ses fragments |
| US4927629A (en) * | 1987-12-17 | 1990-05-22 | Huntington Medical Research Institutes | Relaxation of smooth vascular muscle |
-
1990
- 1990-08-14 US US07/567,261 patent/US5178864A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-07-30 AU AU81448/91A patent/AU644196B2/en not_active Ceased
- 1991-08-13 EP EP19910307433 patent/EP0471549A3/en not_active Withdrawn
- 1991-08-13 CA CA002049119A patent/CA2049119C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-14 JP JP3204204A patent/JPH05155780A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4897375A (en) * | 1981-02-26 | 1990-01-30 | Alloy Surfaces Company, Inc. | Process of preparing catalytic brass |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8144891A (en) | 1992-02-20 |
| EP0471549A3 (en) | 1993-04-07 |
| CA2049119A1 (en) | 1992-02-15 |
| US5178864A (en) | 1993-01-12 |
| AU644196B2 (en) | 1993-12-02 |
| CA2049119C (en) | 1997-08-05 |
| EP0471549A2 (en) | 1992-02-19 |
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