JPH03502054A - 生体液中の低密度リポ蛋白質の低下 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 心臓病（ＣＨＤ）は、年間で、全ての種類の癌を合わせたものを含む他のいずれ の病気より多い死亡原因となっている。観測疫学についての研究は、総血漿コ１ ７ステロール及び低密度リボ蛋白質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の濃度が高い ほど、ＣＨＤに罹る率が高くなることを立証している。

Ｌ　Ｄ　１．、は、約２．５−３．０Ｘ１０’ダルトンの質量及び約２１−２３ ナノメーターの直径を有し、球形である。ＬＤＬ粒子の各々は油状コアーに約１ ５００分子のコレステロールエステルを含み、該油状コアーは、約８００分子の リン脂質、５００分子のエステル化されないコレステロール及びアポプロティン Ｂ−１００又ハアボＢと呼ばれる５１０，０００ダルトンの蛋白質からなる親水 性層によって、水性血漿から遮蔽されている。

総血漿コレステロール及びｌ−５Ｉ）　Ｌ、　−Ｃ４度を、食事療法、薬剤及び 血液からの低密度リボ蛋白質の除去により低下させることができるかもしれない 。しかし、はとんどの薬剤は潜在的に重い副作用を有する。より具体的には、コ レステロール合成を減じる薬剤は重大な肝損傷、白円陣及び胎児奇形をひき起こ すかもしれない。更に、家族性の高コレステロール血症において、同型接合体の 及び多くの異型接合体のヒトは薬剤治療に抵抗する。

高ＬＤＬ含量の患名の血液血漿を直接除去し、プラズマフェレーシスによってＬ 　Ｄ　Ｌを除去し、低ＬＤＬ含量の又はＩ−Ｄ　Ｌを含まない液と代えることは コレステロール及び低密度リボ蛋白質の血漿濃度を低下させるのに有効であるこ とが示されている。しかし、プラズマフエレーシスはかなり成功した治療法では あるが、主に、代替液が血漿分画であるため、極端に高価な、非特異的な技術で ある。

ポリアンオン（ヘパリン／アガロース又は硫酸デキストラン）を用いる一つの方 法、及びアガロースに結合する抗−Ｌ　Ｄ　Ｌ抗体を用いる他の方法の２種類の アフィンティー−カラム吸着方法によって、ＬＤＬを選択的に除去することが実 験的に評価されている。これらのシステムにおいては血漿交換は必要とされない が、これらのシステムにおいて容量が限定されているという問題点を解決すべく 、アフィニティー配位子を含む一対のカラムが一般に使用され、このことはこれ らの技術の確立及び操作を困難にしまた高価なものとしている。

発明の要約 本発明は、Ｌ　Ｄ　Ｌに含まれるコレステロールを便を介して排出し、ＬＤＬが 患者自身の代謝プロセスによって内因的に迅速に除去されるように、酵素をＬ　 Ｄ　Ｌ、の改質のために用いることに関する。

本発明の一つの実施態様は、 ａ）低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）に存在するレシチンの２位のエステル結合を加 水分解し得る酵素を選択し、及びｂ）　　ＬＤＬ含有血液を酵素と接触させてＬ ＤＬに存在するレシチンの２位のエステル結合を加水分解し、改質されたＬ　Ｄ 　Ｌが代謝されるようにＬＤＬを改質することにより、より少ないＬＤＬ含量を 有する血液を供給する ことを含む血液中のＬＤＬ！度を低下させる方法である。

別の実施態様は、酵素を含む反応器であって、改質されないＬＤＬ−１含有血液 が入り、改質されて反応器を出るように設計された反応器を含む。

酵素的方法を用いる、血液からの低密度リボ蛋白質の除去は、これまでの先行技 術で述べた方法に比較して固有の有利性を有する。例えば、酵素は基質に結合し 、基質を改質し及び離脱するという有利性を有する触媒であるため、ＬＤＬを改 質する酵素を用いる装置は、長期にわたる有効寿命を有しほとんど又は全く保守 を必要としない。

図面の簡単な説明 第１図は、血液に含まれるＬＤＬの生体内改質に適する移植可能な酵素反応器の 略図である。

第２図は、血液に含まれるＬＤＬの体外改質に適する酵素反応器の略図である。

第３図は、６４時間にわたるウサギ内におけるホスホリパーゼＡ２で改質された ヒ）ＬＤＬの減少曲線を示す。

第４図は、４時間にわたるウサギ内におけるホスホリパーゼＡ２で改質されたヒ ［、ＤＬの減少曲線を示す。

発明の詳細な説明 低密度リボ蛋白質の低下を酵素的に達成することができる。具体的には、リゾグ リ七ロリン脂質と脂肪酸を生産するべく、酵素を水とグリ七ロリン脂質との反応 を触媒するのに用いることができる。これは、具体的にはグリセリン骨格の２位 のアシル残基の加水分解によって起こる。次いで、得られた改質された１、　Ｄ 　Ｌを患者の代謝プロセスによって内因的に除去し、そのコレステロールを便を 介して排出する。

所望の方法でＬ　Ｄ　Ｌを改質するための公知の酵素の一つとしてホスホリパー ゼΔ２がある。ハチ毒、ヘビ塩、ブタの膵臓を含む多くの供給源からホスホリパ ーゼＡ２を得ることができる。これらの各々はシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ　 （：ｈｅｍｉｃａｌｓ）等の会社から商業的に入手可能である。ヒトの免疫系に 最もよく適合するため、理想的にはヒトホスホリパーゼＡ２が好ましい。現在、 少量のヒトホスホリパーゼＡ２のみが入手可能であるが、酵素生産技術が向上す るにつれて供給も増加するものと予想される。

ＬＤＬ含有血液を改質のための酵素と接触させるために多くの方法を採用するこ とができる。これは、おそらくはエアゾール混合物に含まれる酵素を用いる鼻か らの吸入により、経皮バッチに含まれる酵素を用いる経皮注入により、非経口注 射により、または経口摂取により達成できるかもしれない。しかし、好ましい実 施態様においては、アガロースビーズ、膜又は中空繊維等の酵素担体上又は酵素 担体内に、酵素を固定化し又は捕捉する。体外又は理想的には体内における使用 に適する反応器内に、酵素担体を含ませることができる。体内における使用は、 移植するかまたは体のくぼみに挿入するかのいずれであってもよい。さらに、ま た固定化された酵素反応器は体外でＬＤＬ含有血液を改質するのにも用いること ができる。

所望のＬ　Ｄ　Ｌ改質濃度、患者への酵素導入の方法、所望の酵素の接触時間等 の要因によって、好適な酵素用量は大幅に変化する。

投与方法は所望の酵素用量に影響する。例えば、酵素を担体に固定化することが 要求される投与方法においては、固定化工程によりしばしば酵素効率が減じる。

したがって、この固定化による損失を補填するため１．酵素用量を増加しなｌｊ ればならない。しかし、担体上に酵素を固定化する方法は、鼻からの吸入、注射 等の方法より、より長い投与に適する。長期にわたる投与は短時間でのＬ　Ｄ　 Ｌの急な減少を要求しないため、酵素の総用量はかなり低くなるであろう。

所望のＬ　Ｄ　Ｌ改ｊｌｔａ度に関して、別の要因もある。例えば、ＬＤＬ濃度 を約５０％だけ減じなければならない患者にとっては、ＬＤＬ濃度を７５％だけ 減じなければならない患者に対するより、より低い酵素用量が要求される。した がって、患者の大きさ、所望のＬＤＬ改質濃度、酵素導入方法、酵素滞留時間及 び種々の他の考慮すべき要因に応じて、酵素用量は、それより大きい用量範囲も 考えられるが大人のヒトに対して約１０〜約２００■であると考えられる。蛋白 質１ミＩＪグラムにつき約８００酵素単位があるので、これは約ｇ、　ｏ　ｏ　 ｏ〜約１６０，０００酵素単位の用量に対応する。

酵素効率において更に考慮すべき点は酵素補助要因の存在である。ここで用いら れる場合、酵素補助要因は、酵素ではないが、酵素を正しく機能させるのに必要 な補助物質と規定される。例えば、ホスホリパーゼＡ２はＣａ　＋　２や恥゛２ 等のイオンの存在下で活性が増大することも知られている。酵素の機能を最大限 に発揮させるためにはこれらのイオンが必要とされるが、酵素を患者の血液と接 触する前にこれらのイオンを酵素に添加する必要はない。というのは、酵素活性 をその最大限まで活性化するのに十分な量でこれらのイオンがほとんど必ず自然 に血液中に存在するからである。

移植可能な酵素反応器の一態様の略図を第１図に示す。一般に１０で表わされる 反応器は、血液人口１２及び血液出口１４を含む、チューブ２０を含む。酵素、 好ましくはアガロースビーズ１６等の不溶性支持体上に固定化されたホスホリパ ーゼＡ２酵素がチューブ内に含まれる。酵素含有ビーズ床のいずれか一方の端に 位置するじゃま板又はスクリーン１８は、反応チューブ内にビーズを保持するた めに用いられる。操作においては、ＬＤＬを含む血液は血液人口１２から反応器 １０に入る。血液は第１じゃま板１８を通過し、固定化酵素床１６に入る。床上 に固定化された酵素は血液内に含まれるＬＤＬを改質し、これによりＬＤＬは患 者の自然な代謝プロセスにより代謝される。改質されたＬＤＬを含む血液は第２ じゃま板１８を通過し、反応器の血液出口１４から排出する。血液は患者の肝臓 に達するまで患者の体内を通過し、肝臓内で改質されたＬＤＬは代謝される。

第２図は、血液内のＬＤＬを改質するための体外反応システムの一態様の略図で ある。加工される血液は患者２２から螺動性ポンプ２４を介して除去され、入口 チューブ２６に入る。入口チューブから血液は一般に２８と表わされる体外反応 器に入口２９から入る。体外反応器はシェル３０、固定化酵素を含むビーズの懸 濁液３２、フィルター３４、螺動性ポンプ３６、再循環チューブ３８及び血液出 口４０を含む。

一旦、血液が入口２９から反応器２８に入ると、血液は酵素懸濁液３２と接触す る。酵素は血液内に含まれるＬＤＬを改質し、このことにより、ＬＤＬは患者の 自然な代謝プロセスによって代謝される。血液／懸濁液混合物を螺動性ポンプ３ ６と再循環チューブ３８によって循環しＬＤＬと酵素を良好に接触させる。フィ ルター３４は慧濁状態の酵素含有ビーズ３２を反応器シェル３０内に保持する役 割を有する。加工された血液は反応器２８の血液出口４０から排出し戻りチュー ブ４２を通して患者２２に戻り、プロセス循環を完了する。

発明の詳細は以下の実施例により得られるであろう。

アガロース１グラムに対して固定化ホスホリパーゼＡ２を４、０００〜１０，０ ００単位含むアガロースビーズを焼結ガラスロートに入れた。これらを蒸留水及 びリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄した。ビーズに空気を引き込むことによって 、ビーズを乾燥し、次いで反応容器に入れた。次いで、反応容器に、ＰＢＳ緩衝 液（ｐＨ＝７．６＞　、５ｍＭのＣａ”：１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 及び２■の低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）の混合物を満たした。満たした後、小さ なエアポケットのみを残して反応容器を密封した。

反応容器を３７℃で３時間振盪した。１．２８７ρの密度を有するＮａＢｒ−Ｎ ａＣ１溶液を用いて反応溶液の密度を１．０６３ρに調節した。次いで、この溶 液を２２時間４０．００Ｏｒｐｍで遠心分離により回転した。

遠心分離にかけた溶液の最上部層（オレンジ色を有する）を除去し透析バッグに 入れた。次いで、これを、４℃で１．　ＯＯ６生理食塩水溶液１ソトルを用いて １゛８時間透析した。

１■の透析１７た、ホスホリパーゼＡ２で改質したＬＤＬ　（ＦＡ２−ＬＤＬ） をＩＣＩ法により１　　ｍＣｉ　　Ｎａ　１２Ｍを用いてヨウ素化した。次いで 、得られた”Ｊ−ＦＡ２−ＬＤＬ溶液を４℃に維持した１、　００６生理食塩水 １リットルを用いて透析した。

透析の終了後に、”Ｊ−ＦＡ、−ＬＤＬ溶液の沈殿度について試験した。沈殿度 が９５％以上である場合は、２００μＣ１の溶液をウサギの耳に位置する静脈に 注射した。２．５．１０．１５．３０．４５及び６０分間の間隔毎に、血液サン プルを１　ｔａｌｌずつウサギの耳に位置する動脈から抜いた。次いで抜いた血 液を回転して血漿を分離し、１０μβの血漿をガンマ−カウンターで計測した。

各々の時刻におけるカウント数を注射した総カウントで割り、次いで１００を掛 けて、血漿内に残存するカウントパーセントを計算した。次いでこのデータを時 間に対してプロットし、減少曲線を得た。

第３図は、上記操作によって決定されたウサギ内における、ホスホリパーゼＡ２ で改質されたヒ）　Ｌ　Ｄ　Ｌの減少曲線である。第３図においては、血漿中の ＬＩ）Ｌの相対濃度（初期濃度Ｃ０に対する瞬間濃度Ｃとして規定された）を６ ４時間に亘って時間に対してプロットした。

第４図は、改質されたＬＤＬの減少特性をより便宜に立証するため、実験のはじ めの４時間だけを示す以外は、第３図と同様のデータに基づいている。

両方の図から、酵素で改質されたヒ）ＬＤＬは元のヒ）ＬＤＬのものに比べてよ り速い速度でウサギから排出されることが容易にわかる。

興味深いことには、酵素で改質されたＬ　Ｄ　Ｌの減少曲線は２つの領域を示す 。第１の領域は、急なほとんど垂直に近い領域であって、酵素で改質されたり、 　Ｄ　Ｌの注射後約１５分間続いている。

第２の領域は、かなりゆるやかであって、酵素的に改質されないＬＤＬの減少に ほぼ等しい。改質酵素が存在するにもかかわらずこのゆるやかな減少曲線は酵素 によって改質されないＬＤＬの曲線と似ており、元のＬ　Ｄ　Ｌと同じ速度で減 少している。あらかじめ設定された出発条件に対して至適の酵素用量を決定する のに有用なデータを提供するのに使用することができるので、これらの二つの領 域比較及び第２の領域が優勢となりはじめる区域は重要可溶性及び固定化ホスホ リパーゼＡ２で処理されたヒト血漿及びＬ　Ｄ　Ｌ、の遊離脂肪酸含量を薄層及 びガス液体クロマトグラフィーを用いて分析した。、不飽和脂肪酸、本質的には リルン酸、濃度は、酵素的に処理した血漿及び単離した元のＬＤＬの両方で増加 した。改質されたＬＤＬ及びヒト血漿のペーパー電気泳動においては、元のＬＤ Ｌ及び血漿コントロールに比較して、改質されたＬ　Ｄ　Ｌバンドはより速く移 動した。この結果は、その実効負電荷を増加するようにＬＤＬがホスホリパーゼ Ａ２によって改質されることを示唆している。改質されたＬＤＬを大きさを除く ｌｌＰシＣ分析にかけたところ、元のＬＤＬに匹敵する単一ピークを示した。

これは、酵素による改質の後にＬ　Ｄ　Ｌ凝集形成がないことを示唆しており、 観測された粒子実効電荷の増加と合致することから凝集が起こっていないらしい ことが更に示唆されている。

同等性 当該技術の専門家は、決まりきった実験法のみから、前述の特定の物質、工程等 と多くの同等のものを認識し又は確認することができるであろう。このような同 等のものは以下の請求の範囲によって包含される。

第１図 第２図 時間（ｈｒ） 第３図 時間（ｈｒ） 第４図 圃際署査報告 ｍ、、１１−、、。−ａ１Ａ＠１８．＋ｔｌ、ｅｅＮ＠、　　ＰＣＴ／ＵＳ　　 ８８１０３２４５国際調査報告 ＵＳ　８８０３２４５ ＳＡ　　２４８２９

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）に存在するレシチンの２位のエステル結合 を加水分解し得る酵素を選択し、及びｂ）酵素がＬＤＬに存在するレシチンの２ 位のエステル結合を加水分解し得るような条件でＬＤＬ含有血液を酵素と接触さ せて、改質されたＬＤＬがより速く代謝されるようにＬＤＬを改質することによ り、より少ないＬＤＬ含量を有する血液を供給する工程を含む被検者の血液中の ＬＤＬ濃度を低下する方法。
2. ２．酵素がホスホリパーゼＡ２からなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載 の方法。
3. ３．ホスホリパーゼＡ２がハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ ２及びヒトホスホリパーゼＡ２からなる群から選はれる請求の範囲第２項に記載 の方法。
4. ４．酵素を被検者の血液と体外で接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．酵素を被検者の血液と生体内で接触させる請求の範囲第１項に記載の方法。
6. ６．鼻からの吸収、経皮注入、非経口注射及び経口摂取からなる群から選ばれる 方法により、酵素を患者の体に入れる請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．酵素を患者の体に移植により入れる請求の範囲第５項に記載の方法。
8. ８．酵素が表面に固定化されている請求の範囲第１項に記載の方法。
9. ９．アガロースビーズ、膜及び中空繊維からなる群から選はれるものの表面に、 ホスホリパーゼＡ２が固定化されている請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．血液入口、酵素がＬＤＬに存在するレシチンの２位のエステル結合を加水 分解し得るものである固定化酵素、及び血液出口を含む酸素反応器を含む、血液 のＬＤＬ含量を低下させる装置。
11. １１．酵素がホスホリバーゼＡ２からなる群から選はれる請求の範囲第１０項に 記載の装置。
12. １２．ホスホリパーゼＡ２がハチ毒ホスホリパーゼＡ２、ヘビ毒ホスホリパーゼ Ａ２及びヒトホスホリパーゼＡ２からなる群から選はれる請求の範囲第１１項に 記載の装置。
13. １３．アガロースビーズ、膜、及び中空繊維からなる群から選はれるものの表面 に、ホスホリパーゼＡ２が固定化されている請求の範囲第１１項に記載の装置。
14. １４．ヒトの体と適合する物質でつくられていることにより、移植及び生体内で の使用が可能な請求の範囲第１０項に記載の装置。
15. １５．血液を酵素と体外で接触させる請求の範囲第１０項に記載の装置。