CN115531346B - 一种仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents
一种仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物制剂领域。本发明涉及仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒及其制备方法。本发明制备得到的仿生融合膜包裹脂质纳米粒,不仅能增加尿酸酶的稳定性,提高尿酸酶抗蛋白酶水解能力,延长其体内循环时间,还能提高其生物利用度和降解尿酸的能力,显著减轻痛风性关节炎大鼠的疼痛和关节水肿,可用于高尿酸血症、痛风性关节炎和其它相关疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药制剂领域,涉及一种仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒及其制备方法。
背景技术
痛风性关节炎是痛风的第一临床表现,典型表现为不定期的急性发作。病程较长时,单钠尿酸盐形成结晶沉积在组织中形成痛风石。中国高尿酸血症的总体患病率约为13.2%,痛风发病率约为1.1%,已成为继糖尿病之后又一常见代谢性疾病。高尿酸血症是痛风的关键诱发因素,高尿酸血症的主要临床症状是血尿酸增高,目前治疗高尿酸血症主要有抑制尿酸生成、促进尿酸排泄、碱化尿液以及分解尿酸等药物。黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇通过抑制尿酸合成降低血尿酸浓度,但别嘌醇可能导致患者严重的超敏反应;苯溴马隆等药物通过抑制肾小管中尿酸重吸收而促进尿酸排泄,但可能会引起患者肾功能损害等不良反应;碳酸氢钠等药物通过碱化尿液,可预防尿酸性结石的形成,但长期服用可能会导致尿酸性的结石出血。本发明涉及的尿酸酶是降尿酸非常有效的蛋白质药物。它可以在短时间内将人体内形成的尿酸转化为更易溶,更容易排泄的尿囊素具有特异性强,催化效率高的特点,但尿酸酶治疗存在体内活性低、稳定性差和免疫原性高等缺点。
本文所述的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,具有过氧化氢酶活性和超氧化物歧化酶活性,能有效分解尿酸酶分解尿酸时产生的过氧化氢;同时也是尿酸酶在尿酸氧化中的有效模拟物,可以降低尿酸氧化的活化能;纳米粒子还是优良的光热试剂,具有高生物相容性和优良的光热效应。白藜芦醇是一种天然植物抗毒素多酚,具有抗氧化和抗炎特性。可在免疫细胞中调节NF-κB、MAPK和mTOR等主要的信号通路。最新研究表明,白藜芦醇抑制尿酸钠介导的腹膜间皮细胞系中IL-1β的产生,并且在尿酸钠诱导的痛风性关节炎小鼠模型中具有抑制关节炎症的治疗潜力。巨噬细胞外泌体不仅可以将促炎性M1巨噬细胞转化为抗炎性M2巨噬细胞从而提高尿酸酶的治疗效果,而且能增加尿酸酶的炎症靶向性,降低尿酸酶的免疫原性,提高尿酸酶的生物相容性。巨噬细胞膜对巨噬细胞外泌体涉及的以上四个方面具有协同增效的作用,除此之外,巨噬细胞膜还能延长药物在体内的半衰期,增强药物在体内的稳定性。仿生融合膜在保留上述单一膜结构生物学效应的同时还提高了药物有效载荷。
经查询专利及文献,目前尚无相同细胞来源的外泌体和细胞膜载带药物(包括巨噬细胞外泌体和巨噬细胞膜载带药物)的任何报道,尚无透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒的任何报道,尚无尿酸酶、透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒、白藜芦醇复方制剂的任何报道。本发明的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒不仅能增加尿酸酶的稳定性,延长体内循环作用时间,还能增强尿酸酶炎症靶向性和显著减轻痛风性关节炎大鼠的疼痛和关节水肿。巨噬细胞外泌体具有免疫逃逸属性和炎症靶向特性。本发明的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒对温度和胰蛋白酶降解具有良好的稳定性,循环半衰期长,安全性好。纳米反应器可以有效地将尿酸酶降解为尿囊素和过氧化氢,并使用具有过氧化氢酶活性的铂纳米粒去除过氧化氢及过氧化氢对机体造成的毒副作用,此外,过氧化氢分解产生的氧气反过来可以促进尿酸酶降解尿酸形成级联反应。制剂外裹的仿生融合膜能延长尿酸酶体内循环时间和提高炎症部位靶向能力,同时铂纳米粒还是一种光热剂,与白藜芦醇联用,光热疗法联合免疫疗法不仅能显著减轻痛风性关节炎大鼠的疼痛和关节水肿,还有利于减轻炎症反应和组织恢复。本发明制备了仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,可用于高尿酸血症、痛风性关节炎和其它相关疾病的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒及其制备方法。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒克服了尿酸酶稳定性差、易被酶降解、生物利用度低、靶向性差等缺点,并通过尿酸酶与纳米酶形成级联反应,不仅有利于提高尿酸降解效率,而且可以消除尿酸降解过程中产生的过氧化氢。外覆的仿生融合膜能延长尿酸酶体内循环时间和提高炎症部位靶向能力,光热疗法联合免疫疗法不仅能显著减轻痛风性关节炎大鼠的疼痛和关节水肿,还有利于减轻炎症反应和组织恢复。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒为尿酸酶提供了可供选择的新型制剂,可用于高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗。
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,其特征在于,包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、巨噬细胞外泌体和巨噬细胞膜的仿生融合膜包裹层;所述的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,铂纳米粒制备方法中的缓冲液1包括硼酸-硼砂缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中的一种;缓冲液1pH为8.0-9.5,其余各组分质量比:氯铂酸钾12-50份,透明质酸5-20份,左旋抗坏血酸500-2000份,盐酸多巴胺5-20份,超纯水1为5000-20000份,超纯水2为5000-20000份,超纯水3为5000-20000份,缓冲液1为5000-20000份;仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为0.1-10U/mL,其制备方法中所用的缓冲液2包括硼酸-硼砂缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中的一种;缓冲液2的pH为8.0-9.5;仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,所述的制剂中尿酸酶含量为0.1-10U/mL,其余各组分质量比:铂纳米粒0.1-10份,白藜芦醇0.1-10份,磷脂485-2000份,胆固醇150-600份,缓冲液2为2500-10000份。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,制备步骤所括:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在20-30℃下搅拌12-16小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至60-90℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,60-90℃下持续搅拌2-8小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤2-4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8-9.5的缓冲液1中形成盐酸多巴胺溶液,在20-30℃条件下避光磁力搅拌20-60分钟,得到1倍体积的聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/10至1倍体积的聚多巴胺溶液E中,超声10-40分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 8.0-9.5的缓冲液2中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于二氯甲烷、三氯甲烷、无水乙醇、乙醚、甲醇中的一种或多种有机溶剂中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后,加入铂纳米粒和尿酸酶混合液体,35-40℃恒温振荡2-4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作3-6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(2E+7)个/mL至(5E+7)个/mL的巨噬细胞,无血清培养基饥饿培养12-48小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心5-20分钟,收集上层液体,在4℃离心10-40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心40-90分钟,收集试管底部液体,加入于pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心40-90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH 7.4磷酸盐缓冲液,4℃离心5-10分钟,去除上层液体,加入2-4倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和0.5-2mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10-20分钟,探头超声3-6分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,采用BCA法测定膜蛋白质浓度,即根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B按体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入pH 7.4磷酸盐缓冲液补足,加样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,以膜蛋白浓度比1:1至1:20溶于pH 7.4磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10-20分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比1:2至2:1混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
本发明提供的铂纳米粒扫描电镜结果(图1A)中可以看出铂纳米粒的平均粒径大约在90nm左右,颗粒较小,颗粒间隔较为疏松。这种结构有利于增大催化面积,提高纳米酶催化活性。铂纳米粒的透射电镜图(图1B)中可以看出铂纳米粒外观呈圆球形,形貌较规则;本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒平均粒径为182nm,小于200nm(图2)。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒增加了尿酸酶的炎症靶向性,使用仿生融合膜对脂质纳米粒进行伪装,使脂质纳米粒具有生物膜的表达特征蛋白和特殊功能。本发明制备的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜和巨噬细胞外泌体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3A)和蛋白质印迹法结果(图3B)相比较,外泌体特征蛋白CD9/CD81(24-27kDa)和CD63(50kDa)均有表达;本发明制备的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜与巨噬细胞膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3A)和蛋白质印迹法结果(图3B)相比较,巨噬细胞膜特征蛋白TNFR2(48kDa)均有表达,表明提取巨噬细胞外泌体和巨噬细胞膜的膜蛋白结构依然完整,不影响其生理功能。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒主动靶向到炎症部位的原因分析如下:(1)巨噬细胞外泌体对炎症部分信号分子有主动识别能力,可将促炎性M1巨噬细胞转化为抗炎性M2巨噬细胞;(2)仿生融合膜包裹的纳米粒继承了生物膜的表面特异蛋白,使双膜的免疫逃逸属性、长循环能力和主动靶向特性在仿生融合膜包裹纳米粒中得到保留,增加了制剂对炎症部位的聚集。
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒可提高尿酸酶的稳定性,增强其抗胰蛋白酶水解的能力。4℃储存稳定性实验中,随着储存时间的延长,尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对酶活性始终高于游离尿酸酶。储存第7天时,尿酸酶的相对活性仅有(50.1±0.01)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(72.1±0.01)%和(87.9±0.05)%。结果表明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒可显著增强尿酸酶在4℃条件的储存稳定性(图4)。37℃放置稳定性实验中,游离尿酸酶的活性下降较快;放置第19天时,尿酸酶的相对活性为(0.89±0.01)%,基本失去活性,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(24.4±0.17)%和(51.7±0.04)%;尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对酶活性始终高于游离尿酸酶;研究结果表明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对酶活性可提高尿酸酶在37℃条件下的稳定性(图5)。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒增加酶稳定性的原因可能有:(1)尿酸酶被包封在纳米囊内且外裹生物膜,内部微环境相对稳定,受外界影响较小,因此不易被降解,从而稳定性提高;(2)巨噬细胞外泌体的免疫逃逸属性使纳米粒能够逃避单核吞噬细胞系统的清除,从而延长了血液循环时间,提高了药物在体内的稳定性。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒在抗胰蛋白酶水解实验中,尿酸酶在胰蛋白酶作用下相对活性迅速下降,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒相对活性下降较慢,尿酸酶在1小时后相对活性下降至(55.0±1.6)%,而仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒在1小时内相对活性均保持在95%以上;24小时尿酸酶的相对活性仅为(4.5±1.2)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(46.6±1.6)%和(52.4±1.7)%,研究结果表明尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒可保护尿酸酶避免被胰蛋白酶分解而失活,负载仿生融合膜后,尿酸酶对胰蛋白酶降解的抵抗进一步增强(图6)。游离尿酸酶在前12小时活性下降较快;12小时游离尿酸酶的相对活性仅为(46.6±3.9)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(72.7±1.8)%和(93.4±4.2)%;120小时游离尿酸酶的相对活性降为0,但尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒仍有活性分别为(47.9±4.1)%和(79.3±1.8)%。结果表明游离尿酸酶的活性会受血浆成分的影响,而将其包封在尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中后,血浆对其影响减小,而包裹仿生融合膜后,血浆对尿酸酶活性的影响进一步减小(图7)。
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒体内给药后,活性-时间曲线下面积相对于游离尿酸酶有明显提高(图8),为游离酶的9.38倍,活性最大值为游离酶的1.12倍,体内平均滞留时间为游离药的7.04倍;研究结果表明,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒能显著提高尿酸酶的生物利用度,同等剂量下能使药物在更长时间内保持较高活性,延长药物在体内的作用时间。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒治疗SD大鼠高尿酸模型中,从结果中可以看出仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的体内尿酸总体波动比模型组和尿酸酶组更小(图9),说明制剂的治疗效果更好,安全性更高。模型组尿酸水平在6小时达到最高点为(218.3±22.9)μmol/L,随后尿酸水平缓慢下降,72小时模型组与对照组尿酸水平相比仍有显著性差异*P<0.05,说明造模成功。尿酸酶组在8小时后降尿酸能力明显下降,其原因可能是游离酶容易被清除,因此8小时后降尿酸速度较慢。12小时仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒组与对照组尿酸水平相比没有显著性差异,说明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒组SD大鼠尿酸基本恢复正常。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒治疗急性痛风性关节炎SD大鼠模型后脚踝肿胀结果可以看出(图10),仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒有助于缓解急性痛风性关节炎过程中的关节水肿。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒在急性关节炎模型初期给予光热照射,有助于快速缓解关节水肿,后期给予光热照射可以加快骨关节炎的恢复。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,明显提高了尿酸酶的生物利用度,原因可能包括:(1)尿酸酶与铂纳米粒构成的纳米酶联用形成级联反应。尿酸酶介导尿酸分解生成过氧化氢作为副产物,尤其是关节腔内代谢缓慢和封闭的内部环境明显加剧了过氧化氢的积累,这不仅会导致细胞氧化应激,还会导致慢性关节损伤。铂纳米粒作为一种纳米酶,可降解尿酸和消除过氧化氢。铂纳米粒与尿酸酶联用形成级联反应,通过顺序消除尿酸和过氧化氢来最大限度地提高治疗效果,提高尿酸酶的生物利用度;(2)仿生融合膜和脂质纳米粒的双重保护,避免尿酸酶被蛋白酶水解和吞噬细胞清除;(3)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒能增强尿酸酶的稳定性,使其在长时间内保持较高活性;(4)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的级联反应能改善尿酸酶的体内行为,提高生物利用度。
本发明的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,具有稳定性好、炎症靶向性好、生物相容性好和免疫原性低的特点,为大分子治疗药物递送提供了一种有效的手段。所述仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,其中的仿生融合膜采用巨噬细胞外泌体和巨噬细胞膜融合,巨噬细胞外泌体不仅可以将促炎性M1巨噬细胞转化为抗炎性M2巨噬细胞从而提高尿酸酶的治疗效果,还可以增加尿酸酶的炎症靶向性,降低尿酸酶的免疫原性,提高尿酸酶的生物相容性,而巨噬细胞膜对以上四个方面具有协同增效的作用,且巨噬细胞膜能延长药物在体内的半衰期,增强药物在体内的稳定性。仿生融合膜保留了单一外泌体和单一巨噬细胞膜各自独特的生物学特征的同时,还提高了药物有效载荷。
本发明不用于通常报道的含有尿酸酶的递送载体和制备工艺。尿酸酶递送载体研究报道的有:①将尿酸酶结合或交联于高分子材料或制剂,如与壳聚糖或葡聚糖吸附或共价结合,或与白蛋白交联,或与脂质体表面共价结合;②将尿酸酶包封于材料或制剂中,如包封于金属有机框架、包封于两性离子中、包封于纳米胶囊中、透皮微针等。但以上各种方式存在酶易脱落、生物相容性较低、易引起凝血、稳定性和特异性不理想、安全性不确定等缺点。由于其内源性特征和独特的生物学特性,外泌体已成为最有吸引力的候选治疗剂和递送纳米平台之一,然而,其低效的药物有效载荷等障碍极大地阻碍了外泌体的治疗适用性。为了提高外泌体的负载能力和递送效率,设计杂合的类外泌体纳米囊泡,以更好地桥接合成的纳米载体和天然外泌体。目前已有少量杂合外泌体负载小分子药物仿生制剂的报道,如:巨噬细胞外泌体杂合脂质体膜负载多柔比星用于肿瘤靶向给药、成纤维细胞外泌体杂合脂质体负载氯膦酸盐用于肺纤维化药物递送等。目前尚无相同细胞来源的外泌体和细胞膜载带药物(包括巨噬细胞外泌体和巨噬细胞膜载带药物)的任何报道,尚无透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒的任何报道,尚无尿酸酶、透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒、白藜芦醇复方制剂的任何报道。本发明首次制备仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。该脂质纳米粒能增加尿酸酶的稳定性,提高尿酸酶抗蛋白酶水解能力,提高生物利用度,提高尿酸降解效率,增强炎症靶向能力。
附图说明
图1为本发明制得的铂纳米粒的扫描电镜(图1A)和透射电镜图(图1B)。
试验条件:采用quanta FEG 450场发射扫描电子显微镜测定得到铂纳米粒的扫描电镜图(图1A),采用Tecnai G2 F20 S-Twin透射电镜仪测定得到铂纳米粒的透射电镜图(图1B)。
研究结果:扫描电镜结果图(图1A)中可以看出铂纳米粒的颗粒平均粒径大约在90nm左右,颗粒较小,颗粒间隔较为疏松。这种结构有利于增大催化面积,提高纳米酶催化活性。透射电镜结果图(图1B)中可以看出铂纳米粒外观呈圆球形,形貌较规则。图1中的铂纳米粒全称是:透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒。
图2为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的粒径。
试验条件:采用马尔文激光粒度仪测定仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒粒径。
研究结果:仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒为(182.3±1.65)nm,PDI为(0.12±0.02)。
图3为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、巨噬细胞外泌体、巨噬细胞膜和仿生融合膜的表面膜蛋白表征。图3A为仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜与巨噬细胞膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳图,图3B为仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜与巨噬细胞膜的蛋白质印迹法结果图。
试验条件:将制备所得仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、巨噬细胞外泌体、巨噬细胞膜和仿生融合膜溶液分别和蛋白上样缓冲液混合,100℃高温下加热10分钟使蛋白变性,12000转速下离心10分钟,随后吸取上清液,作为电泳上样液品。配制10%分离胶、5%浓缩液。蛋白上样,电泳至胶底部,取下胶板,用0.25%考马斯亮蓝染色40分钟,而后分别用纯水、脱色液反复洗涤、脱色,直至凝胶背景清晰,在凝胶成像系统下拍照(图3A)。通过蛋白组免疫印迹法对纳米粒中外泌体和巨噬细胞膜的几类特异性粘附蛋白进行表征,配制10%分离胶、5%浓缩液。蛋白上样,电泳至胶底部,取下胶板,转膜后将膜用清洗三次,每次5分钟后,移至含有封闭液的平皿中,25℃下脱色摇床上摇动封闭2小时,孵育抗体后,进行化学发光,将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值(图3B)。
研究结果:仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、巨噬细胞外泌体、巨噬细胞膜和仿生融合膜溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3A)和蛋白质印迹法结果(图3B)相比较,外泌体特征蛋白CD9/CD81(24-27kDa)和CD63(50kDa)均有表达;仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、巨噬细胞外泌体、巨噬细胞膜和仿生融合膜溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳,巨噬细胞膜特征蛋白TNFR2(48kDa)有表达,说明提取巨噬细胞外泌体和巨噬细胞膜后其膜蛋白结构依然完整,不影响其生理功能。
图4为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒4℃储存稳定性。
试验条件:将游离尿酸酶和尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒样品溶液放置于4℃的冰箱中,分别于第0、1、2、3、4、5、6、7、14、19、24、29天时测定样品溶液中尿酸酶的活性。尿酸酶的初始酶活性被定为100%,计算各时间点酶的相对活性。
研究结果:随着储存时间的延长,尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对酶活性始终高于游离尿酸酶。储存第7天时,尿酸酶的相对活性仅有(50.1±0.01)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(72.1±0.01)%和(87.9±0.05)%。结果表明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒可显著增强尿酸酶在4℃条件的储存稳定性。
图5为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒37℃储存稳定性。
试验条件:将游离尿酸酶,尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒样品溶液放置于4℃的冰箱中,分别于第0、1、2、3、4、5、6、7、14、19、24、29天时测定样品溶液中尿酸酶的活性。尿酸酶的初始酶活性被设定为100%,计算各时间点酶的相对活性。
研究结果:游离尿酸酶的活性下降较快,放置第19天时,尿酸酶的相对活性为(0.89±0.01)%,基本失去活性。而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(24.4±0.17)%和(51.7±0.04)%。尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对酶活性始终高于游离尿酸酶。结果表明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒可提高尿酸酶在37℃条件下的稳定性。
图6为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的抗胰蛋白酶水解的能力。
试验条件:取游离尿酸酶,尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒样品,分别与等体积的胰蛋白酶溶液混匀,于37℃水浴中保存,分别于0、0.167、0.333、0.5、1、2、3、4、6、8、24、48、72小时测定混合溶液中尿酸酶的活性,将各组尿酸酶的初始活性设定为100%,计算各时间点游离酶的相对活性。
研究结果:游离尿酸酶在胰蛋白酶作用下相对活性迅速下降,1小时时游离尿酸酶的相对活性为(55.0±1.6)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒样品溶液的相对活性分别为(79.8±1.3)%和(91.9±1.4)%;24小时尿酸酶的相对活性仅为(4.5±1.2)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒样品溶液的相对活性分别为(46.6±1.6)%和(52.4±1.7)%。结果表明尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒可保护尿酸酶避免被胰蛋白酶分解而失活,在脂质纳米粒上再包裹仿生融合膜后,尿酸酶对胰蛋白酶的抵抗进一步增强。
图7为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的血浆稳定性。
试验条件:取相同浓度的游离尿酸酶,尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,分别与5倍体积的含10%胎牛血清(FBS)的空白血浆混合,于37℃下孵育,分别于0、1、2、4、8、12、24、48、72、120小时,测定各组酶活性,平行测定三次。各组均设定初始活性为100%,计算活性保留分数。
研究结果:游离尿酸酶在前12小时活性下降较快;12小时游离尿酸酶的相对活性仅为(46.6±3.9)%,而尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的相对活性分别为(72.7±1.8)%和(93.4±4.2)%。120小时游离尿酸酶的相对活性降为0,但尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒仍有活性分别为(47.9±4.1)%和(79.3±1.8)%。结果表明游离尿酸酶的活性会受血浆成分的影响,而将其包封在尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中后,血浆对其影响减小,而在脂质纳米粒上再包裹仿生融合膜后,血浆对尿酸酶活性的影响将进一步减小。
图8为本发明制得仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒活性-时间曲线图。
试验条件:将20只SD雄性大鼠(在给药前禁食12小时,但不禁水),随机分成4组,每组5只,分别为正常对照组、高尿酸血症模型组、尿酸酶、本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒,给药剂量相同(以尿酸酶计),给药后定时采血进行药代动力学研究。
研究结果:本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒体内给药后,活性-时间曲线下面积相对于游离尿酸酶有明显提高,为游离酶的9.38倍,活性最大值为游离酶的1.12倍,体内平均滞留时间为游离药的7.04倍,说明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒能显著提高尿酸酶的生物利用度,同等剂量下能使药物在更长时间内保持较高活性,延长药物在体内的作用时间。
图9为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒治疗高尿酸血症SD大鼠模型后体内尿酸浓度-时间图。
试验条件:将20只SD雄性大鼠(在给药前禁食12小时,但不禁水),随机分成4组,每组5只,分别为正常对照组、高尿酸血症模型组、尿酸酶、本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。除正常对照组外,其他各组均按照500mg/kg灌胃给予次黄嘌呤2mL后,再按照100mg/kg皮下注射氧氰酸钾0.1mL,建立高尿酸大鼠模型。连续6天,并于给药前称重。之后禁食12小时后,于第7天相同时间建模,建模1小时后,各组静脉注射相同剂量尿酸酶或含尿酸酶的制剂。给药后定时采血,取上层血清,用尿酸试剂盒检测血尿酸水平。
研究结果:仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒4小时体内尿酸为(272.70±64.70)μmol/L,模型组体内尿酸水平在4小时达到最高点为(1456.08±119.58)μmol/L,是仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒给药后体内尿酸水平的5倍,尿酸酶组4小时体内尿酸为(600.15±37.22)μmol/L,是仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒体内尿酸水平的2.2倍。12小时仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的尿酸水平基本恢复正常水平,从图中可以看出仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒组的体内尿酸总体波动比模型组和尿酸酶更小,说明制剂的治疗效果更好,安全性更高。72小时模型组与对照组尿酸水平相比仍有显著性差异(*P<0.05),说明造模成功。尿酸酶在8小时后降尿酸能力明显下降其原因可能是游离酶容易被清除,因此后续降尿酸速度较慢。
图10为本发明制得仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒治疗急性痛风性关节炎SD大鼠模型后脚踝肿胀图。
试验条件:将30只SD雄性大鼠随机分成6组(自由饮食饮水),每组5只,分别为正常对照组、模型组、尿酸酶、本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒(无激光组,0.5小时激光组,6、12、24、48小时激光组)。取踝关节背侧为穿刺点,用无菌注射器至胫骨肌腱内侧向踝关节腔内注射100μL浓度为2.5mg/100mL的微晶尿酸钠混悬液。造模成功标准:造模关节较健侧关节皮温升高,踝关节均出现不同程度红肿,行走缓慢,骨性标志消失,足爪卷曲,三足步态。造模前后测定踝关节直径。造模后,各组各只鼠分别称重、测量关节直径、采集关节热成像,获得0点痛风指标。采集0点血样。造模30分钟后,关节腔注射给药(25U/kg),模型组和正常组给生理盐水。无激光组不给予激光;0.5小时激光组给药30分钟后给予激光照射(808nm,1W/cm2,5分钟);6、12、24、48小时激光组给药后6、12、24、48小时激光照射(808nm,1W/cm2,5分钟)。
研究结果:给药后给予激光照射的与未给予激光照射的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒大鼠脚踝直径在给药后1小时有差异,可能是因为激光照射仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇级联反应脂质纳米粒,提供能量加速铂纳米粒从膜中通过胞吐的方式释放出来,透明质酸(40-100KDa)具有炎症靶向作用和组织再生的能力,急性伤口中在损伤部位积聚的透明质酸碎片会激活免疫系统以控制组织完整性的破裂;多巴胺具有抗炎作用和粘附性,同时可以消除激光照射带来的炎症;铂纳米粒可以降低尿酸分解的活化能,降解尿酸;给药后6、12、24和48小时给予激光照射的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒与未给予激光照射的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒组大鼠脚踝直径在给药后48小时有差异,可能是因为炎症消退后期,给予光热治疗有利于骨关节的恢复。实验结果说明仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒有助于缓解急性痛风性关节炎过程中的关节水肿。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒在急性关节炎模型初期给予光热照射,有助于快速缓解关节水肿,后期给予光热照射可以加快骨关节炎的恢复。
具体实施方式
为了进一步说明本发明及其优点,给出了下列特定的实施例,应理解这些实施例仅有于具体说明而不是作为本发明范围的限制。
实施例1:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为硼酸-硼砂缓冲液pH 8.6,其余各组分质量比:氯铂酸钾12份,透明质酸6份,左旋抗坏血酸680份,盐酸多巴胺10.2份,超纯水1为9000份,超纯水2为11000份,超纯水3为12000份,硼酸-硼砂缓冲液10400份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为0.1U/mL,缓冲液2为硼酸-硼砂缓冲液pH8.8,其余各组分质量比:铂纳米粒0.4份,白藜芦醇0.8份,磷脂842份,胆固醇290份,硼酸-硼砂缓冲液5500份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在20℃下搅拌12小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至60℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,60℃下持续搅拌2小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤2次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8.6的硼酸-硼砂缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于20℃避光磁力搅拌20分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入7/10体积的聚多巴胺溶液E中,超声10分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 8.8的硼酸-硼砂缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于13mL二氯甲烷中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,35℃恒温振荡2小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作3次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(2E+7)个/mL的巨噬细胞,无血清培养基饥饿培养12小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心5分钟,收集上层液体,在4℃离心10分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心40分钟,收集试管底部液体,加入于pH为7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心40分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心5分钟,去除上层液体,加入2倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和0.5mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10分钟,再探头超声3分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B,以体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足;加样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:12溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比3:2混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例2:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒、仿生融合膜包裹层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 8.8,其余各组分质量比:氯铂酸钾15份,透明质酸6.8份,左旋抗坏血酸800份,盐酸多巴胺10.4份,超纯水1为12000份,超纯水2为13000份,超纯水3为9000份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液11200份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为0.4U/mL,缓冲液2为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 8.9,其余各组分质量比:铂纳米粒0.8份,白藜芦醇1.5份,磷脂1000份,胆固醇500份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液6500份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在22℃下搅拌13小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至65℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,65℃下持续搅拌3小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤3次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于25℃避光磁力搅拌25分钟,得到1倍体积聚多巴胺溶液E,将产物D加入4/5倍体积的聚多巴胺溶液E中,超声15分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 8.9中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于8mL三氯甲烷中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,37℃恒温振荡3小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作3次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(3E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养36小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心10分钟,收集上层液体,在4℃离心15分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心60分钟,收集试管底部液体,加入于pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心60分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入处方量pH7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心7分钟,去除上层液体,加入2倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置15分钟,再探头超声5分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足;加样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:14溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声15分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比8:5混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压12次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压12次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例3:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH 9,其余各组分质量比:氯铂酸钾17份,透明质酸8份,左旋抗坏血酸1040份,盐酸多巴胺11.2份,超纯水1为14000份,超纯水2为8000份,超纯水3为8000份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液12000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为0.8U/mL,缓冲液2为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH9.5,其余各组分质量比:铂纳米粒10份,白藜芦醇10份,磷脂2000份,胆固醇580份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液2500份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在25℃下搅拌14小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至70℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,70℃下持续搅拌7小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 9.0的三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于25℃避光磁力搅拌40分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入9/10体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 9.5的三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于4mL无水乙醇中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,37℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作5次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压15次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压15次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(3E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养24小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心16分钟,收集上层液体,在4℃离心30分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心70分钟,收集试管底部液体,加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心70分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心8分钟,去除上层液体,加入3倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置15分钟,再探头超声5分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:18溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比20:19混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压16次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压16次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例4:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液pH 9.3,其余各组分质量比:氯铂酸钾20份,透明质酸20份,左旋抗坏血酸1800份,盐酸多巴胺20份,超纯水1为8000份,超纯水2为7000份,超纯水3为6000份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液20000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为0.9U/mL,缓冲液2为三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液pH 8.6,其余各组分质量比:铂纳米粒1.5份,白藜芦醇2.4份,磷脂1223份,胆固醇550份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液7000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在26℃下搅拌16小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至70℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,80℃下持续搅拌4小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤3次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 9.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于28℃避光磁力搅拌40分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入3/5体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于18mL乙醚中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,38℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压17次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压17次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(4E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养24小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心15分钟,收集上层液体,在4℃离心15分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心80分钟,收集试管底部液体,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心80分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心8分钟,去除上层液体,加入4倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和2mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置18分钟,再探头超声5分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:6溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声19分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比7:10混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压18次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压18次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例5:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为硼酸-硼砂缓冲液pH 8.4,其余各组分质量比:氯铂酸钾23份,透明质酸18份,左旋抗坏血酸2000份,盐酸多巴胺18份,超纯水1为18000份,超纯水2为16000份,超纯水3为7000份,硼酸-硼砂缓冲液16000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为1U/mL,缓冲液2为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 9,其余各组分质量比:铂纳米粒1份,白藜芦醇1份,磷脂970份,胆固醇300份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液5000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在29℃下搅拌15小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至90℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,90℃下持续搅拌7小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8.4的硼酸-硼砂缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于29℃避光磁力搅拌50分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入2/5体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于11mL乙醚中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,37℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压18次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压18次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(5E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养48小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心20分钟,收集上层液体,在4℃离心40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心90分钟,收集试管底部液体,加入于pH为7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加pH为7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心8分钟,去除上层液体,加入3倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1.5mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置15分钟,再探头超声5分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:10溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声15分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比1:1混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例6:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 8.5,其余各组分质量比:氯铂酸钾25份,透明质酸10份,左旋抗坏血酸1000份,盐酸多巴胺10份,超纯水1为10000份,超纯水2为10000份,超纯水3为10000份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液5000-20000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为2.4U/mL,缓冲液2为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH 8.2,其余各组分质量比:铂纳米粒2.4份,白藜芦醇3.3份,磷脂1720份,胆固醇280份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液4000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在29℃下搅拌15小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至85℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,85℃下持续搅拌7小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH为8.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于21℃避光磁力搅拌60分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/10体积的聚多巴胺溶液E中,超声16分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 8.2的三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于6mL甲醇中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,36℃恒温振荡3小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作4次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压16次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压16次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(4E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养16小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心15分钟,收集上层液体,在4℃离心30分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心80分钟,收集试管底部液体,加入于pH为7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心40-90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心6分钟,去除上层液体,加入2.5倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1.1mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置16分钟,再探头超声5分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:1溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比6:5混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压15次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压15次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例7:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH 8,其余各组分质量比:氯铂酸钾28份,透明质酸10.4份,左旋抗坏血酸1200份,盐酸多巴胺6.8份,超纯水1为16000份,超纯水2为15000份,超纯水3为5000份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液6000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为3.3U/mL,缓冲液1为硼酸-硼砂缓冲液pH 8.5,其余各组分质量比:铂纳米粒3.3份,白藜芦醇0.4份,磷脂485份,胆固醇180份,硼酸-硼砂缓冲液3000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在30℃下搅拌16小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至90℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,80℃下持续搅拌4小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤3次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH为8的三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于25℃避光磁力搅拌40分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/5体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH为8.5的硼酸-硼砂缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于25mL二氯甲烷和甲醇中的一种或多种有机溶剂中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,37℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压15次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压15次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(5E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养48小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心20分钟,收集上层液体,在4℃离心40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心90分钟,收集试管底部液体,加入于pH为7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心9分钟,去除上层液体,加入4倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10分钟,再探头超声3分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:4溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比3:5混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压18次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压18次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例8:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液pH 8.1,其余各组分质量比:氯铂酸钾30份,透明质酸11.2份,左旋抗坏血酸1120份,盐酸多巴胺6份,超纯水1为7000份,超纯水2为17000份,超纯水3为19000份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液7000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为4.2U/mL,缓冲液2为硼酸-硼砂缓冲液pH 9.2,其余各组分质量比:铂纳米粒4.2份,白藜芦醇0.1份,磷脂1890份,胆固醇600份,硼酸-硼砂缓冲液9000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在30℃下搅拌16小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至80℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,80℃下持续搅拌6小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8.1的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于20℃避光磁力搅拌20分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/4体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 9.2的硼酸-硼砂缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于30mL无水乙醇和甲醇中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,38℃恒温振荡2小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作5次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压12次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压12次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(2E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养20小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心18分钟,收集上层液体,在4℃离心28分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心55分钟,收集试管底部液体,加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心82分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心9分钟,去除上层液体,加入2倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1.2mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置13分钟,再探头超声3分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:9溶于pH 7.4的硼酸-硼砂缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声17分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比9:10混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压18次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压18次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例9:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为硼酸-硼砂缓冲液pH 8.2,其余各组分质量比:氯铂酸钾35份,透明质酸12份,左旋抗坏血酸1400份,盐酸多巴胺5份,超纯水1为5000份,超纯水2为6000,超纯水3为14000份,硼酸-硼砂缓冲液6800份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为6.1U/mL,缓冲液2为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH9.4,其余各组分质量比:铂纳米粒0.1份,白藜芦醇4.2份,磷脂525份,胆固醇250份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液8000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在23℃下搅拌13小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至75℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,75℃下持续搅拌7小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤3次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8.2的硼酸-硼砂缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于24℃避光磁力搅拌28分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/3体积的聚多巴胺溶液E中,超声19分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 9.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于8mL二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种有机溶剂中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,38℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压17次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压17次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(5E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养36小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心16分钟,收集上层液体,在4℃离心18分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心80分钟,收集试管底部液体,加入于pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入处方量pH为7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心5分钟,去除上层液体,加入2倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和0.5mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10分钟,再探头超声3分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:20溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比2:1混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压18次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压180次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例10:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 9.2,其余各组分质量比:氯铂酸钾40份,透明质酸14份,左旋抗坏血酸500份,盐酸多巴胺12份,超纯水1为19000份,超纯水2为20000份,超纯水3为18000份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液14000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为7.2U/mL,缓冲液2为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH 8,其余各组分质量比:铂纳米粒6.1份,白藜芦醇8.9份,磷脂698份,胆固醇150份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液10000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在26℃下搅拌15小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至85℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,85℃下持续搅拌6小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤3次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH为9.2的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中形成盐酸多巴胺溶液,于24℃避光磁力搅拌40分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入9/20体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 8的三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于20mL二氯甲烷、三氯甲烷和无水乙醇中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,37℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压20次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压20次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(5E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养48小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心20分钟,收集上层液体,在4℃离心40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心90分钟,收集试管底部液体,加入处方量pH为8的三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液后,在4℃离心90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心10分钟,去除上层液体,加入2倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10分钟,再探头超声3分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,例如根据样品数量,取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:16溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比9:5混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压11次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压11次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例11:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH 8.3,其余各组分质量比:氯铂酸钾45份,透明质酸16份,左旋抗坏血酸1600份,盐酸多巴胺14份,超纯水1为6000份,超纯水2为5000份,超纯水3为16000份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液8000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为8.9U/mL,缓冲液2为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 8.4,其余各组分质量比:铂纳米粒7.2份,白藜芦醇6.1份,磷脂1438份,胆固醇380份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4500份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在25℃下搅拌16小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至80℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,80℃下持续搅拌4小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤3次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH为8.3的缓冲液1中形成盐酸多巴胺溶液,于23℃避光磁力搅拌40分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/2体积的聚多巴胺溶液E中,超声40分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于方量pH 8.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于15mL无水乙醇、乙醚和甲醇中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,37℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压120次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压20次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(5E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养48小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心20分钟,收集上层液体,在4℃离心40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心90分钟,收集试管底部液体,加入于pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心10分钟,去除上层液体,加入3倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和1mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置20分钟,再探头超声6分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度;取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:2溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比1:2混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
实施例12:
仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒包括尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和仿生融合膜包覆层。所述处方中的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,缓冲液1为三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液pH 9.5,其余各组分质量比:氯铂酸钾50份,透明质酸5份,左旋抗坏血酸600份,盐酸多巴胺16份,超纯水1为20000份,超纯水2为18000份,超纯水3为20000份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液18000份。仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒中所述的尿酸酶含量为10U/mL,缓冲液2为硼酸-硼砂缓冲液pH 8.7,其余各组分质量比:铂纳米粒8.9份,白藜芦醇7.2份,磷脂1592份,胆固醇450份,硼酸-硼砂缓冲液6000份。
制备方法:(1)铂纳米粒的制备方法:处方量的透明质酸溶于处方量的超纯水1中形成透明质酸溶液,处方量的氯铂酸钾溶于处方量的超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在25℃下搅拌12小时,得到液体A;将处方量的左旋抗坏血酸溶于处方量的超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至80℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,80℃下持续搅拌8小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH为9.5的缓冲液1中形成盐酸多巴胺溶液,于27℃避光磁力搅拌50分钟,得到聚多巴胺溶液E,将产物D加入1体积的聚多巴胺溶液E中,超声30分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将处方量的尿酸酶和步骤(1)得到的处方量的铂纳米粒溶于处方量pH 8.7的硼酸-硼砂缓冲液中得到铂纳米粒和尿酸酶混合液体,处方量的磷脂、处方量的胆固醇和处方量的白藜芦醇溶解于9mL三氯甲烷、无水乙醇、乙醚和甲醇中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后加入上述得到的铂纳米粒和尿酸酶混合液体,40℃恒温振荡4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压20次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压20次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(2E+7)个/mL的巨噬细胞,更换无血清培养基饥饿培养48小时,分别收集两部分,第一部分为上层,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心20分钟,收集上层液体,在4℃离心40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后4℃离心90分钟,收集试管底部液体,加入于pH为7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜:即在巨噬细胞B中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心10分钟,去除上层液体,加入2倍体积的细胞膜提取试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸)和0.5mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10分钟,再探头超声3分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,测定膜蛋白质浓度,即:取BCA试剂A与BCA试剂B体积比50:1充分混匀配置成BCA工作液,完全溶解蛋白标准品用磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL,将标准品按0、1、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,其中标准品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,样品体积不足20μL的加入磷酸盐缓冲液补足,各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置30分钟。测定562nm处的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度;以膜蛋白浓度比1:8溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比4:5混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压19次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压19次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒。
Claims (1)
1.一种仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒,其特征在于,包括:尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒;巨噬细胞外泌体与巨噬细胞膜的仿生融合膜包裹层;
所述的铂纳米粒为透明质酸和聚多巴胺复合涂层铂纳米粒,包括以下各组分:缓冲液1的pH为8.0-9.5,其余组分质量比为:
缓冲液1包括硼酸-硼砂缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中的一种;
所述的仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒,包括以下各组分:尿酸酶含量为0.1-10U/mL,缓冲液2pH为8.0-9.5,其余各组分质量份数比为:
缓冲液2包括硼酸-硼砂缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中的一种;
仿生膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒的制备方法包括下列步骤:(1)铂纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸溶于超纯水1中形成透明质酸溶液,氯铂酸钾溶于超纯水2中形成氯铂酸钾溶液,将透明质酸溶液加入氯铂酸钾溶液中形成透明质酸和氯铂酸钾的混合溶液,在20-30℃下搅拌12-16小时,得到液体A;将左旋抗坏血酸溶于超纯水3中形成左旋抗坏血酸溶液,并将其加热至60-90℃,得到液体B,在磁力搅拌下将液体B缓慢滴加至液体A中得到液体C,60-90℃下持续搅拌2-8小时,在加热过程中液体C的颜色从浅黄色逐渐变为黑色,离心,收集底部黑色产物,用超纯水洗涤2-4次,真空干燥后得到产物D;将处方量盐酸多巴胺溶于pH 8.0-9.5的缓冲液1中形成盐酸多巴胺溶液,于20-30℃避光磁力搅拌20-60分钟,得到1倍体积的聚多巴胺溶液E,将产物D加入1/10至1倍体积的聚多巴胺溶液E中,超声10-40分钟,离心,收集底部黑色产物,真空干燥,得到铂纳米粒;(2)尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶和步骤(1)得到的铂纳米粒溶于pH8.0-9.5的缓冲液2中得到尿酸酶和铂纳米粒混合液体,将磷脂、胆固醇和白藜芦醇溶解于二氯甲烷、三氯甲烷、无水乙醇、乙醚、甲醇中的一种或多种有机溶剂中,避光超声,减压去除有机溶剂,形成均匀薄膜后,加入尿酸酶和铂纳米粒混合液体,35℃-40℃恒温振荡2-4小时后分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜,重复操作3-6次,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,得到尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒;(3)巨噬细胞外泌体的制备方法:取细胞密度为(2E+7)个/mL至(5E+7)个/mL的巨噬细胞,无血清培养基饥饿培养12-48小时后,分别收集两部分,第一部分为上层液体,即细胞上清液A;第二部分为下层沉淀,即巨噬细胞B;将细胞上清液A在4℃离心5-20分钟,收集上层液体,在4℃离心10-40分钟,收集上层液体用滤膜过滤后,4℃离心40-90分钟,收集底部液体,加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液后,在4℃离心40-90分钟,取底部白色沉淀,得到巨噬细胞外泌体;(4)巨噬细胞膜的制备方法:将步骤(3)中收集得到的巨噬细胞B,按照细胞膜蛋白提取试剂盒说明书方法提取细胞膜,即在巨噬细胞B中加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液,4℃离心5-10分钟,去除上层液体,加入2-4倍体积的含蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和乙二胺四乙酸的细胞膜提取试剂和0.5-2mM的苯甲基磺酰氟,充分混匀后冰上静置10-20分钟,探头超声3-6分钟后离心,收集底部白色沉淀,得到巨噬细胞膜;(5)仿生融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的巨噬细胞外泌体和步骤(4)得到的巨噬细胞膜,以膜蛋白浓度比1:1至1:20溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,在冰浴条件下混合,超声10-20分钟,得到仿生融合膜;(6)仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒和步骤(5)得到的仿生融合膜,以体积比1:2至2:1混合,通过400nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤压10-20次,得到仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇的脂质纳米粒。
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