CN110464742B - 一种麒麟菜提取物及其在制备治疗器官纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麒麟菜提取物制备防治器官纤维化的口服液,它包括按质量百分含量计的如下组分:胶浆剂0.5%‑2%,防腐剂0.2%‑1%、助溶剂0.1%‑1%,麒麟菜提取物余量。麒麟菜提取物的制备方法包括以下步骤:1)将麒麟菜洗净;2)取质量为M1的步骤1)处理过的麒麟菜,加入质量为M2的水,依次经过匀浆、灭菌、过滤、离心,收集上清液,然后用超滤膜系统超滤,0.1微米的微孔膜,截留分子量为5000道尔顿,操作压力差在0.1‑0.5MPa,得到麒麟菜提取物,其中,M1:M2=1:8‑12。本发明制备的口服液,具有显著的治疗器官纤维化功效,对于治疗器官纤维化效果优于吡非尼酮和尼布尼达。另外,麒麟菜提取物的制备方法采用超滤膜系统加压超滤,效率优于层析提取技术。
Description
技术领域
本发明涉及食品药物技术领域,更具体地,涉及一种麒麟菜提取物及其在制备治疗器官纤维化药物中的应用。
背景技术
纤维化(fibrosis)可发生于多种器官,主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多,实质细胞减少,持续进展可致器官结构破坏和功能减退,乃至衰竭,严重威胁人类健康和生命。在全世界范围内,组织纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因,据美国有关统计资料证明,因各种疾病而致死的病人中,接近45%可以归于组织纤维增生疾病。目前,在医药行业中,用于治疗器官纤维化的药物品种十分稀缺,目前上市的药物吡非尼酮只可以缓解症状,但是很难达到彻底除根,标本兼治的目的。
麒麟菜(Eucheuma muricatum),红藻纲,红翎菜科,藻体肥厚多肉,圆柱状,扁压或扁平,辐射或两侧分枝,该属约有20种,中国约有5种,为热带性海藻,具有很高的药用价值,麒麟菜多肽组份来源于麒麟菜。现有技术中暂无文献报道麒麟菜多肽组份治疗器官纤维化的功能,在国内外均未发现用麒麟菜多肽组份作治疗器官纤维化药物或特医食品使用的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供麒麟菜提取物制备防治器官纤维化的口服液,通过建立新的提取纯化方法,从麒麟菜中纯化获得的麒麟菜多肽组份,制备的口服液具有显著的治疗器官纤维化功效,对于治疗器官纤维化效果优于吡非尼酮和尼布尼达。
本发明的目的采用如下技术方案实现:
一种麒麟菜提取物制备防治器官纤维化的口服液,其特征在于,它包括按质量百分含量计的如下组分:
胶浆剂0.5%-2%,防腐剂0.2%-1%、助溶剂0.1%-1%,蜂蜜2%,麒麟菜提取物余量。
优选地,所述麒麟菜提取物制备方法包括以下步骤:
1)将麒麟菜洗净;
2)取质量为M1的步骤1)处理过的麒麟菜,加入质量为M2的水,依次经过匀浆、灭菌、过滤、离心,收集上清液,用超滤膜系统超滤,0.1微米的微孔膜,截留分子量为5000道尔顿,操作压力差在0.1-0.5MPa,得到麒麟菜提取物;其中,M1:M2=1:8-12。麒麟菜提取物含三种多肽分子,三种多肽分子分别为:GIYYGQCSEICGINHGFMPIVVEATSLPNYVSWISNKLNE、MISDSQIFIAMLFALVSAVLAIQLGAELYS、TGACFCLIYQGVLYP。
采用本方法获取的麒麟菜多肽效率比凝胶层析分离麒麟菜多肽法高,获得麒麟菜浓度高,活性更好;无需添加氯化钾消除胶状物。
优选地,步骤2)中,离心转速为3000-4000转/每分钟,离心时间为8-12分钟。
优选地,步骤2)中,M1:M2=1:10。
优选地,所述胶浆剂为生物纤维素。增加产品黏稠、缓和的性质,干扰味蕾的味觉而起到矫味的作用。
优选地,所述防腐剂为山梨酸钾。
优选地,所述助溶剂为甘油酯。
优选地,所述甘油酯为单硬脂酸甘油酯。
优选地,还包括调味剂,所述调味剂的添加量占口服液总重量的0.1-0.2%,所述调味剂为柠檬酸钠。调味剂用于调节口感和味道。
最优选地,所述口服液包括按质量百分含量计的如下组分:麒麟菜提取物97%,生物纤维素0.5%,柠檬酸钠0.2%,蜂蜜2%,山梨酸钾0.2%,单硬脂酸甘油酯0.1%。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:
本发明本发明通过建立新的提取纯化方法,可以更加高效地从麒麟菜中纯化获得的具有活性的麒麟菜提取物,具有显著的治疗器官纤维化功效,对于治疗器官纤维化效果优于吡非尼酮和尼布尼达。进一步地,本发明制备得到了一种利用麒麟菜提取物的口服液,该口服液可用于器官纤维化的治疗。
附图说明
图1为小鼠肺组织、肾组织、肝组织、心肌组织中HYP含量分析对比图;
图2为小鼠肺组织、肾组织、肝组织、心肌组织中过氧化物歧化酶含量分析对比图;
图3为小鼠肺组织、肾组织、肝组织、心肌组织中丙二醛含量分析对比图;
图4为小鼠肺组织、肾组织、肝组织、心肌组织中还原型谷胱甘肽含量分析对比图;
图5为小鼠肺组织HE染色对比图。
图5中:1为正常组,2为模型组,3为低剂量组,4为中剂量组,5为高剂量组,6为吡非尼酮组。
具体实施例方式
下面,结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1:
一种麒麟菜提取物,其制备方法包括以下步骤:
1)将麒麟菜洗净;
2)取100g的步骤1)处理过的麒麟菜,加入1000g的水,依次经过匀浆、高压蒸汽灭菌、三层纱布过滤、离心,收集上清液,用超滤膜系统超滤,0.1微米的微孔膜,截留分子量为5000道尔顿,操作压力差在0.1-0.5MPa,得到麒麟菜提取物(含1%三肽分子:GIYYGQCSEICGINHGFMPIVVEATSLPNYVSWISNKLNE、MISDSQIFIAMLFALVSAVLAIQLGAELYS、TGACFCLIYQGVLYP);其中,离心转速为3500转/每分钟,离心时间为10分钟。高压蒸汽灭菌控制参数如下:0.6千克/厘米2压力下(110℃)灭菌10分钟;纱布为医用纱布,2mmX1mm孔。
实施例2:
一种麒麟菜提取物,其制备方法包括以下步骤:
1)将麒麟菜洗净;
2)取100g的步骤1)处理过的麒麟菜,加入800g的水,依次经过匀浆、高压蒸汽灭菌、三层纱布过滤、离心,收集上清液,用超滤膜系统超滤,0.1微米的微孔膜,截留分子量为5000道尔顿,操作压力差在0.1-0.5MPa,得到麒麟菜提取物(含1%三肽分子:GIYYGQCSEICGINHGFMPIVVEATSLPNYVSWISNKLNE、MISDSQIFIAMLFALVSAVLAIQLGAELYS、TGACFCLIYQGVLYP);其中,离心转速为3000转/每分钟,离心时间为8分钟。其它与实施例1相同。
实施例3:
一种麒麟菜提取物,其制备方法包括以下步骤:
1)将麒麟菜洗净;
2)取100g的步骤1)处理过的麒麟菜,加入1200g的水,依次经过匀浆、高压蒸汽灭菌、三层纱布过滤、离心,收集上清液,用超滤膜系统超滤,0.1微米的微孔膜,截留分子量为5000道尔顿,操作压力差在0.1-0.5MPa,得到麒麟菜提取物(含1%三肽分子:GIYYGQCSEICGINHGFMPIVVEATSLPNYVSWISNKLNE、MISDSQIFIAMLFALVSAVLAIQLGAELYS、TGACFCLIYQGVLYP);其中,离心转速为4000转/每分钟,离心时间为12分钟。其它与实施例1相同。
实施例4:
一种口服液,包括按质量百分含量计的如下组分:实施例1制备得到的麒麟菜提取物97%,生物纤维素0.5%,柠檬酸钠0.2%,蜂蜜2%,山梨酸钾0.2%,单硬脂酸甘油酯0.1%。
口服液的制备方法包括以下步骤:按配方配比将各原料混合在一起,搅拌混匀;无菌灌装:按每瓶20ml体积灌装,密封,即得。
实施例5:
一种口服液,包括按质量百分含量计的如下组分:实施例1制备得到的麒麟菜提取物96%,生物纤维素1%,柠檬酸钠0.1%,蜂蜜2%,山梨酸钾0.5%,单硬脂酸甘油酯0.4%。
口服液的制备方法包括以下步骤:按配方配比将各原料混合在一起,搅拌混匀;无菌灌装:按每瓶20ml体积灌装,密封,即得。
实施例6:
一种口服液,包括按质量百分含量计的如下组分:实施例1制备得到的麒麟菜提取物94%,生物纤维素2%,柠檬酸钠0.2%,蜂蜜2%,山梨酸钾0.8%,单硬脂酸甘油酯1%。
口服液的制备方法包括以下步骤:按配方配比将各原料混合在一起,搅拌混匀;无菌灌装:按每瓶20ml体积灌装,密封,即得。
实施例4制备得的口服液的动物实验效果评价
1.方法
动物及分组SPF级KM小鼠,21g±1g,60只,雌性。小鼠随机数字表法分为对照组(正常组)、模型组、吡非尼酮组(50mg/kg)、尼布尼达组(50mg/kg)和低(1mg/kg)剂量组、中(5mg/kg)剂量组、高(10mg/kg)剂量组,每组10只。用1%戊巴比妥钠按照50mg/Kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠后,仰卧固定于操作台,用镊子拉出舌头暴露气管,在冷光源放大镜下缓慢注入5mg/kg博莱霉素。注射完毕后迅速竖起鼠板,旋转3分钟,使药液在肺内均匀分布,对照组同前方法气管内注入等体积等渗盐水,10天后开始以0.1ml/10g进行灌胃给药,对照组及模型组灌胃等体积的等渗盐水,其余各组灌胃相应剂量的药物,连续给药至35天,每天1次;给药35天后将小鼠麻醉取血处死,分离得到完整的两肺组织,称重,取右肺上叶同一部位,用4%的多聚甲醛固定48小时,石蜡切片,进行苏木精-伊红染色法(HE)染色供组织病理学观察,记过参见图1-图5;取左肺中叶同一部位进行肺组织HYP含量的检测,收集血浆,检测过氧化物歧化酶、丙二醛、还原型谷胱甘肽含量。统计学分析应用SPSS 17.0软件进行统计分析,多个样本均数的比较采用单因素方差分析,组间比较采用t检验,以P<0.05表示为差异有统计学意义。
2.结果与分析
普通凝胶层析和超滤获得麒麟菜组份的得率比较,结果见表1。
表1
方法 | 时间 | 有效成分浓度 |
凝胶层析分离 | 1小时处理1升 | 10微克/毫升 |
超滤膜系统超滤分离 | 1小时至少处理100升 | 500微克/毫升 |
本法获得的有效成分浓度和单位处理样品的效率均较凝胶层析法高,更适合工业化生产。
麒麟菜提取物主要含一组三肽分子:GIYYGQCSEICGINHGFMPIVVEATSLPNYVSWISNKLNE、MISDSQIFIAMLFALVSAVLAIQLGAELYS、TGACFCLIYQGVLYP。
1)小鼠肺组织HYP含量分析
各组小鼠肺组织HYP含量与对照组相比,各组小鼠肺组织HYP含量上升(P<0.01);与模型组相比,各组HYP含量明显下降(P<0.01)。
与正常组比较:*P<0.05;与模型组比较:#p<0.05
2)小鼠血浆过氧化物歧化酶、丙二醛、还原型谷胱甘肽含量分析
各组小鼠血浆过氧化物歧化酶、丙二醛、还原型谷胱甘肽含量与对照组相比,模型、低中、高剂量组小鼠血浆丙二醛含量上升(P<0.01);与对照组相比,各组小鼠血浆过氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽含量下降(P<0.01)。与模型组相比,各组小鼠血浆丙二醛含量明显下降(P<0.01);与模型组相比,各组小鼠血浆过氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽含量上升(P<0.01)。
3)肺组织病理变化分析
博来霉素处理4W后,肺泡结构紊乱,肺泡壁增厚,部分肺泡塌陷融合,并有炎性细胞浸润,可见细胞外基质大量沉积,成纤维细胞过度增殖,肺组织可见大片实变,纤维化程度严重;治疗组肺泡结构破坏,肺泡腔缩小,肺组织炎性细胞浸润较少,纤维组织增生减弱,肺组织实变少,较模型组有明显差异。
麒麟菜提取物口服液对大鼠肝纤维化效果评价
成年雄性SD大鼠(200±20g)共50只,随机分为正常组、模型组、麒麟菜多肽低剂量组、麒麟菜多肽中剂量组、麒麟菜多肽高剂量组,每组各10只。麒麟菜多肽组及模型组给予0.03%硫代乙酰胺溶液腹腔注射,2次/周,共持续8周,正常组给予等体积生理盐水注射,从第5周开始,麒麟菜多肽低、中、高剂量组分别给予麒麟菜多肽溶液(1mg/kg,5mg/kg,10mg/kg)灌胃,1次/d,共4周,模型组给予等体积生理盐水灌胃,末次给药24h后处死SD大鼠,取动物血清、肝脏组织进行相关检测。与正常组比较,模型组ALT、AST、HA、LN、PCIII水平升高(P<0.05);与模型组比较,麒麟菜多肽各剂量组ALT、AST、HA、LN、PCIII水平明显下降(P<0.05);麒麟菜多肽可缓解硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化,ALT、AST为肝功能指标;HA、LN和PCIII作为肝纤维化的常用检测指标,对肝纤维化的诊断及预后具有重要的参考意义。结果见下表2。
表2
与模型组比较*P<0.05;与正常组比较#P<0.05。
实施例4的口服液对大鼠肾脏纤维化效果评价
40只昆明种小鼠适应性饲养3d后,随机分为对照组、模型组、治疗组、麒干预组,每组10只,雌雄各半。肾纤维化动物模型的建立:模型组、治疗组、干预组均皮下注射四氯化碳与橄榄油等体积混合液0.03mL/10g体质量,每周2次,持续6周;对照组以等体积橄榄油皮下注射,方法同实验组。治疗组于最后一次造模后24h,灌胃给予口服液50mg/(kg·d),连续给药6周;干预组在造模的同时即开始给与口服液,给药途径、剂量、方法同治疗组,连续给药12周;模型组和对照组在造模6周后则以等体积生理盐水灌胃。
观察各组动物精神状态、饮食、皮毛、大、小便等一般情况,并每两周称量体质量;在治疗或干预结束后,各组动物称量体质量,并腹腔注射4%水合氯醛0.1mL/10g体质量,麻醉后摘眼球取血,检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平,ELISA法检测血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原。
结果如下:
(1)血清BUN及Scr
与对照组相比,模型组血清BUN和Scr均有明显的增高(P<0.05),干预组BUN和Scr显著低于模型组(P<0.05);治疗6周后,治疗组血清BUN和Scr逐渐恢复,接近对照组,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见下表3。
表3
组别 | BUN(mmol/L) | Scr(μmol/L) |
对照组 | 8.21±2.50 | 32.68±5.63 |
模型组 | 19.36±4.22# | 93.86±6.78# |
治疗组 | 10.92±2.89* | 36.22±10.01* |
干预组 | 8.47±2.85* | 38.66±6.88* |
与模型组比较*P<0.05;与正常组比较#P<0.05。
(2)肾脏指数
与对照组比较,模型组小鼠肾脏指数显著增高。治疗组和干预组肾脏指数低于模型组(P<0.05),趋近于对照组。见下表4。
表4
组别 | 体质量(g) | 肾脏湿重(g) | 肾脏指数 |
对照组 | 46.23±3.01 | 0.85±0.12 | 1.75±0.03 |
模型组 | 34.82±2.88# | 1.18±0.11# | 3.12±0.06# |
治疗组 | 41.86±2.36* | 0.93±0.06* | 2.18±0.05* |
干预组 | 43.21±3.16* | 0.86±0.03* | 1.93±0.06* |
与模型组比较*P<0.05;与正常组比较#P<0.05。
(3)肾纤维化指标
与对照组比较,模型组小鼠血清中的HA、LN、PCIII、Ⅳ型胶原明显增高(P<0.05);治疗组、干预组小鼠经口服液治疗或干预后,上述纤维化指标明显低于模型组(P<0.05)。见下表5。
表5
组别 | Ⅳ型胶原(μg/L) | HA(μg/L) | LN(μg/L) | PCIII(μg/L) |
正常组 | 42.62±5.18 | 136.27±7.84 | 42.69±8.18 | 50.36±10.14 |
模型组 | 70.01±8.45# | 359.33±36.25# | 128.37±11.69# | 90.28±10.42# |
治疗组 | 53.68±7.64* | 172.63±20.21* | 73.87±11.14* | 60.56±12.63* |
干预组 | 50.06±6.03* | 150.42±32.08* | 56.08±10.45* | 52.25±9.72* |
与模型组比较*P<0.05;与正常组比较#P<0.05。
实施例4的口服液对大鼠心脏纤维化效果评价:
造模方法:异丙肾上腺素50mg/kg,小鼠连续注射10d,连续给药观察28d。分空白对照组与给药组(口服液)10mg/kg,每组5只。28d后,取心脏进行分析。
模型组的心脏重量显著增加,与对照组相比,体重变化无明显差异,而心脏重量增加。依那普利组和口服液组的体重与对照组和模型组对比,无显著性差异,但心脏重量与模型组比显著下降,与对照组相似。结果提示,灌服口服液可减轻异丙肾上腺素引起的心肌纤维化心脏重量的增加,提示口服液可在预防纤维化方面发挥作用。结果见下表6。
表6
组别 | Ⅳ型胶原(μg/L) | 左心室重(g) | 心脏/体重 | ACE(nM/mg) |
正常组 | 40.35±4.98 | 88.26±5.12 | 2.81±0.09 | 25.03±1.16 |
模型组 | 65.24±6.88# | 119.38±25.17# | 4.37±0.29# | 45.34±3.56# |
治疗组 | 52.63±6.28* | 92.31±15.24* | 3.14±0.14* | 26.17±3.58* |
干预组 | 51.05±5.33* | 90.23±13.23* | 3.02±0.22* | 15.36±1.72* |
与模型组比较*P<0.05;与正常组比较#P<0.05。
综上,本发明的实施例4的口服液对于治疗器官纤维化效果优于吡非尼酮和尼布尼达。
上述实施方式仅为本发明的优选实施例方式,不能以此来限定本发明保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种麒麟菜提取物制备防治器官纤维化的口服液,其特征在于,由按质量百分含量计的如下组分制成:
胶浆剂0.5%-2%,防腐剂0.2%-1%、助溶剂0.1%-1%,蜂蜜2%,调味剂0.1-0.2%,麒麟菜提取物 余量;
所述麒麟菜提取物制备方法包括以下步骤:
1)将麒麟菜洗净;
2)取质量为M1的步骤1)处理过的麒麟菜,加入质量为M2的水,依次经过匀浆、灭菌、过滤、离心,收集上清液,用超滤膜系统超滤,0.1微米的微孔膜,截留分子量为5000道尔顿,操作压力差在0.1-0.5MPa,得到麒麟菜提取物;其中,M1:M2=1:8-12,麒麟菜提取物含三种多肽分子,三种多肽分子分别为:GIYYGQCSEICGINHGFMPIVVEATSLPNYVSWISNKLNE、
MISDSQIFIAMLFALVSAVLAIQLGAELYS、RTGACFCLIYQGVLYP。
步骤2)中,离心转速为3000-4000转/每分钟,离心时间为8-12分钟;步骤2)中,M1:M2=1:10;
所述胶浆剂为生物纤维素;所述防腐剂为山梨酸钾;所述助溶剂为甘油酯;所述甘油酯为单硬脂酸甘油酯,所述调味剂为柠檬酸钠。
2.如权利要求1所述的口服液,其特征在于,所述口服液由按质量百分含量计的如下组分制成:麒麟菜提取物97%,生物纤维素0.5%,柠檬酸钠0.2%,蜂蜜2%,山梨酸钾0.2%,单硬脂酸甘油酯0.1%。
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