CN111437287A

CN111437287A - 榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用

Info

Publication number: CN111437287A
Application number: CN202010456890.2A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 张岩; 王金梅; 马常阳; 刘振花; 姜慧敏; 蒋圣军; 梁琼心
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-07-24

Abstract

本发明公开了一种榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用。本发明使用环磷酰胺建立小鼠免疫力低下模型，分别测定各组小鼠胸腺、脾脏指数，观察组织病理改变，以评价榴莲皮多糖对免疫器官的影响。取小鼠血清，用于测定吞噬细胞活力、抗氧化应激能力、细胞因子含量。取小鼠脾脏，测定白介素‑2（IL‑2）、白介素‑4（IL‑4）、白介素‑6（IL‑6）和肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）的含量。试验结果表明：榴莲皮多糖可有效改善环磷酰胺引起的免疫抑制和氧化应激，增强小鼠免疫能力；说明榴莲皮多糖可以增强小鼠免疫力，用作制备免疫增强药物。

Description

榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用

技术领域

本发明属于多糖药物技术领域，具体涉及一种榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用。

背景技术

榴莲为木棉科榴莲属常绿乔木榴莲(Durio zibethinus Murr)的果实，味甘性温，其果肉具有抗炎活性。榴莲皮为榴莲的果皮，属于榴莲果实的副产品，目前研究主要为表面化学作用和吸附功能，但关于其功能活性的研究相对较少，例如吴敏芝等人发现榴莲壳提取物具有止咳、镇痛及抗菌的作用，洪军等人的研究表明，证实榴莲果皮中提取的黄酮类化合物具有抗氧化及抗菌活性。本课题组早期研究发现，榴莲皮多糖可调节肠道菌群，治疗功能性便秘。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其治疗效果显著，且无毒副作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用。

上述榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用，具体的，榴莲皮多糖的适宜用量为243-1000mg/kg﹒d。

具体的，所述榴莲皮多糖经下述步骤制备获得：将干燥的榴莲皮用75-85％乙醇浸泡，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮，煎煮结束后过滤，滤液加95％乙醇至终浓度为70―85％，静置，取沉淀物，水溶后Sevage法除蛋白，再次醇沉，取沉淀物分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，淋洗后所得沉淀即为榴莲皮多糖。

进一步优选的，将干燥的榴莲皮用80％乙醇浸泡(80％乙醇浸泡2―4次，每次浸泡24±12h)，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮三次，煎煮结束后过滤，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加95％乙醇至乙醇终浓度为75％，冰箱中静置过夜(12h)，离心分离，收集沉淀，沉淀用水溶后采用Sevage法除蛋白(选用体积比为4∶1的氯仿—正丁醇混合液，采用本领域常规技术即可)；取上清液加95％乙醇至终浓度为70％，冰箱中静置过夜，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冷冻干燥即为榴莲皮多糖。

进一步优选的，煎煮水温80-85℃，第一次煎煮2h，第二次煎煮1h，第三次煎煮0.5h。

环磷酰胺为常用抗肿瘤药物，对多种肿瘤均有一定治疗作用。环磷酰胺无体外活性，主要通过肝脏P450酶水解进而发挥作用，其可引起免疫抑制和氧化应激反应。免疫功能较为复杂，涉及机体各个方面，所以关于免疫功能的影响需涉及多个方面。榴莲皮多糖是否同时具有免疫调节的作用，值得研究。本发明使用环磷酰胺腹腔注射建立小鼠免疫低下模型，研究了榴莲皮多糖增强免疫力方面的作用。

本发明利用榴莲皮多糖给予小鼠灌胃200mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)、50mg/(kg·d)，注射环磷酰胺70mg/(kg·d)，建立小鼠免疫抑制模型，了解小鼠免疫情况。本发明分别测定各组小鼠胸腺、脾脏指数，观察组织病理改变，以评价榴莲皮多糖对免疫器官的影响。取小鼠血清，用于测定吞噬细胞活力、抗氧化应激能力、细胞因子含量。取小鼠脾脏，测定白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。取小鼠盲肠内容物，测定短链脂肪酸(SCFA)的含量及肠道菌群的多样性。经试验发现：榴莲皮多糖能够增强小鼠的免疫力，调节肠道菌群，具有较好的免疫增强功效，可用于制备免疫增强和调节肠道菌群药物。

附图说明

图1为不同组别小鼠的脾组织病理切片(400x)，图中，BC为空白对照组，MC为模型组，PC为阳性对照组，HD、MD、LD分别为榴莲皮多糖的高、中、低剂量组。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，如无特殊说明，乙醇均指的体积浓度。

实施例

下述应用试验中所用榴莲皮多糖经下述步骤获得：取干燥榴莲皮4.2kg，将干燥的榴莲皮用80％乙醇浸泡(80％乙醇浸泡3次，每次浸泡24h)，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮三次(煎煮水温80-85℃，第一次煎煮2h，第二次煎煮1h，第三次煎煮0.5h)。煎煮结束后过滤，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加95％乙醇至乙醇终浓度为75％，冰箱中静置过夜(12h)，离心分离，收集沉淀，沉淀用水溶后采用Sevage法除蛋白(选用体积比为4∶1的氯仿—正丁醇混合液，采用本领域常规技术即可)。取上清液加95％乙醇至终浓度为70％，冰箱中静置过夜(12h)，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冷冻干燥(12h，-50±5℃)即为榴莲皮多糖，约53g。

应用试验

一、试验动物

SPF级昆明小鼠，雄，20-22g，购买于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0004。实验前适应性饲养1周(温度25±2℃，光照12h/d，湿度40～45％)，喂养标准饲料，自由饮水。

二、试验试剂与仪器

表1实验试剂

表2实验仪器

三、实验分组及给药

昆明小鼠按体重随机分为6组，每组10只。高、中、低剂量组分别灌胃200、100、50mg/kg榴莲皮多糖，阳性对照组灌胃香菇菌多糖片3g/kg，模型组、空白组灌胃生理盐水；连续给药21天。第18、19、20、21天，空白组注射生理盐水，其余组以70mg/kg腹腔注射环磷酰胺进行造模。末次给药后，小鼠禁食不禁水12h，称重，脱颈处死。

四、指标测定

1、胸腺指数和脾脏指数的测定

取脾脏和胸腺，清洗，称重。计算小鼠脾脏指数和胸腺指数。

胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(10g)；脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(10g)。

2、ELISA法测定血清中细胞因子水平

取冻存的血清，ELISA试剂盒分别测定IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α含量。

3、抗氧化应激能力测定

取脾脏约50mg，用眼科剪尽快剪碎组织块，加入约脾脏体积9倍的生理盐水，在匀浆管中进行匀浆。将制备好的10％匀浆以2500g离心10min，取上清。按照试剂盒说明书分别检测MDA含量、CAT、SOD和T-AOC活性。

4、乳酸脱氢酶(ACP)和酸性磷酸酶(LDH)活力测定

取冻存的血清，按照试剂盒使用说明，分别用微量酶标法和微板法测定乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶的活力值。

5、HE染色法

小鼠胸腺、脾脏部位冲洗干净，将其放入4％的多聚甲醛溶液中，固定24h，之后脱水，常规石蜡包埋，切片。采用苏木素-伊红染色5min，之后脱水，用中性树胶封片。

五、数据处理

结果采用均值±SD值表示，数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。

六、榴莲皮多糖增强免疫力的结果与分析

1、榴莲皮多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

表3给出了榴莲皮多糖对小鼠免疫器官的影响。表3可以看出，与空白组相比，模型组的脾脏指数和胸腺指数显著降低(P<0.001)，造模成功；与模型组相比，高剂量组的胸腺、脾脏指数显著升高(P<0.01)。中剂量组与高剂量组组胸腺指数虽高于模型组，但差异不显著。

表3榴莲皮多糖对小鼠免疫器官的影响(n＝10)

与空白组比:^***P＜0.001,^**P﹤0.01，^*P﹤0.05；与模型组比:^###P＜0.001,^##P﹤0.01，^#P﹤0.05。

2、榴莲皮多糖对小鼠细胞因子含量的影响

表4给出了榴莲皮多糖对细胞因子含量的影响。通过ELISA测定榴莲皮多糖对血清中IL-2，IL-4，IL-6和TNF-α的影响。如表4所示，与空白组比较，模型组中IL-2，IL-4，IL-6和TNF-α的水平显著降低(P<0.01)，这表明环磷酰胺可以抑制免疫活性。在灌胃不同剂量榴莲皮多糖后，经环磷酰胺处理的小鼠的IL-2，IL-4，IL-6和TNF-α水平得到了提高，尤其是高剂量组效果最好，与阳性对照组相近。说明榴莲皮多糖可以通过调节细胞因子的水平来恢复环磷酰胺诱导的免疫抑制并提高免疫力。

表4榴莲皮多糖对细胞因子含量的影响(n＝10)

3、榴莲皮多糖对小鼠ACP和LDH活力的影响

表5给出了榴莲皮多糖对血清ACP和LDH活力的影响。由表5可知，模型组血清中ACP和LDH的活力均低于空白组，而给药组和阳性对照组经过了处理后小鼠体内ACP的活力得到了显著提高(P<0.01)。高剂量组和中剂量组中LDH活力显著增高(P<0.05)。说明给药后的小鼠体内ACP和LDH活力得到有益调节。

表5榴莲皮多糖对血清ACP和LDH活力的影响(n＝10)

4、榴莲皮多糖对小鼠抗氧化能力的影响

表6给出了榴莲皮多糖对血清中SOD和T-AOC活性的影响。由表6可知，与空白组相比，模型组中SOD和T-AOC显著降低(P<0.001)，说明腹腔注射环磷酰胺可以降低小鼠体内的抗氧化能力，造模成功。阳性对照组、高剂量组与空白组的SOD和T-AOC活性相近；与模型组相比，高剂量组的SOD值和T-AOC活性极显著升高(P<0.001)，其中高、中、低剂量组均能极显著增高免疫抑制小鼠体内的SOD活力(P<0.001)。

表6榴莲皮多糖对血清中SOD和T-AOC活性的影响(n＝10)

与空白组比:^***P＜0.001,^**P﹤0.01，^*P﹤0.05，与模型组比:^###P＜0.001,^##P﹤0.01，^#P﹤0.05

表7给出了榴莲皮多糖对肝脏组织中CAT和MDA活性的影响。由表7可知，与空白组相比，模型组中CAT活力值显著降低(P<0.001)，MDA活力显著升高(P<0.001)，这表明造模成功。与模型组相比，阳性对照组即香菇菌多糖片CAT活性最高，高、中和低剂量组中CAT活性均显著升高(P<0.001)且高于模型组，MDA活力显著降低，高剂量组的MDA含量与阳性对照组相近。据此推测，榴莲皮多糖具有抗氧化能力。

表7榴莲皮多糖对肝脏组织中CAT和MDA活性的影响(n＝10)

5、榴莲皮多糖对小鼠免疫器官病理变化的影响

如图1所示，空白组中小鼠的脾组织形状正常，细胞排列未见异常。与空白组相比，模型组中细胞排列无序，数量减少。与模型组相比，榴莲皮多糖给药组细胞较多，排列紧密。说明给药榴莲皮多糖可以缓解CTX所致的免疫器官的损伤。

通过测定各组小鼠胸腺、脾脏指数，小鼠血清中白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含、吞噬细胞活力、抗氧化应激能力、盲肠内容物和短链脂肪酸(SCFA)的含量等指标。结果表明，与模型组相比，榴莲皮多糖高剂量组(200mg/kg)可显著提高胸腺、脾脏指数，改善脾脏组织结构；显著增高细胞因子中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α含量；提高血清中ACP、LDH、SOD和T-AOC活力；增高肝脏中CAT活力，降低MDA含量，增强免疫抑制模型小鼠的免疫活性。

上述结果表明：榴莲皮多糖可有效改善环磷酰胺引起的免疫抑制和氧化应激，增强小鼠免疫能力。说明榴莲皮多糖具有较好的免疫增强功效，可用于制备免疫增强药物。

Claims

1.榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用。

2.如权利要求1所述榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，榴莲皮多糖用量为243-1000 mg/kg﹒d。

3.如权利要求1所述榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，所述榴莲皮多糖经下述步骤制备获得：将干燥的榴莲皮用75-85%乙醇浸泡，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮，煎煮结束后过滤，滤液加95%乙醇至终浓度为70―85%，静置，取沉淀物，水溶后Sevage法除蛋白，再次醇沉，取沉淀物分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，淋洗后所得沉淀即为榴莲皮多糖。

4.如权利要求3所述榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，将干燥的榴莲皮用80%乙醇浸泡，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮三次，煎煮结束后过滤，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加95%乙醇至乙醇终浓度为75%，冰箱中静置过夜，离心分离，收集沉淀，沉淀用水溶后采用Sevage法除蛋白；取上清液加95%乙醇至终浓度为70%，冰箱中静置过夜，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冷冻干燥即为榴莲皮多糖。

5.如权利要求4所述榴莲皮多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，煎煮水温80-85℃，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h。