CN110343189A - 榴莲皮多糖、提取方法及其在制备调节肠道菌群和/或治疗功能性便秘药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调节肠道菌群的榴莲皮多糖的提取方法，具体为榴莲皮用水煎煮，过滤，滤液加95%乙醇至终浓度为70±5%，静置，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加95%乙醇至终浓度为70±5%，静置，沉淀经洗涤、冻干即为榴莲皮多糖。本发明还公开了榴莲皮多糖在制备治疗功能性便秘药物方面的应用。本发明经实验发现：榴莲皮多糖能显著升高血清中胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、P物质含量和显著降低生长抑素（SS）的含量；持续服用后可显著提高肠道中Lachnospiraceae‑NK4A136‑group的相对丰度，降低脱硫弧菌的相对丰度，增加排便量和肠推动率，改善功能性便秘。说明：榴莲皮多糖是调节肠道菌群、治疗功能性便秘的理想药物。

Description

榴莲皮多糖、提取方法及其在制备调节肠道菌群和/或治疗功 能性便秘药物方面的应用

技术领域

本发明属于多糖药物技术领域，具体涉及一种榴莲皮多糖的提取方法及其在制备治疗功能性便秘药物方面的应用。

背景技术

功能性便秘（functional constipation，FC）是一种功能性疾病，是指症状起源于中、下胃肠道的功能性胃肠病。由于不良生活习惯、社会与心理、药物作用等因素所致的便秘，例如不良排便习惯、饮食习惯，生活规律改变，服用抗胆碱等药物，情绪抑郁等因素影响，多会出现便秘，这种便秘则属于功能性便秘。其临床表现为排便困难、次数减少、排便时间延长等，便秘对患者的生活质量造成了极大的影响。

流行病学研究表明，慢性便秘的高患病率与年龄增长有关，且女性高于男性，其次是饮食和环境等。功能性便秘不利于儿童的成长，影响成人的日常生活，因此预防与治疗功能性便秘极其重要。目前，市场上用于治疗功能性便秘的药物多存在疗效不佳、有毒副作用等缺陷。

肠道菌群属于一个复杂的微生态体系，肠道菌群代谢可影响肠道的免疫应答，有益菌的活跃有利于营养的吸收和能量的调节。在一些疾病领域，如：癌症、治疗炎症性肠病和结肠炎、肥胖等，细菌修饰肠道已被证实是有益的治疗。越来越多的证据表明，肠道菌群组成的变化与便秘和相关代谢紊乱有关。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可用于治疗功能性便秘的榴莲皮多糖，其治疗效果显著，且无毒副作用，不会引起耐药性。

本发明还提供了上述榴莲皮多糖的提取方法及其在制备调节肠道菌群和治疗功能性便秘药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种榴莲皮多糖的提取方法，其具体为：榴莲皮用水煎煮，过滤，滤液加95%乙醇至终浓度为70±5%，静置，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加95%乙醇至终浓度为70±5%，静置，沉淀经洗涤、冻干即为榴莲皮多糖。

进一步的，上述榴莲皮多糖的提取方法为：将榴莲皮用水煎煮2-4次，煎煮水温80-85℃，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加95%乙醇至终浓度为70%，冰箱中静置过夜，离心分离，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加95%乙醇至终浓度为70%，冰箱中静置过夜，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冻干即为榴莲皮多糖。榴莲皮多糖可以显著提高肠道菌群中Lachnospiraceae-NK4A136-group的相对丰度，降低脱硫弧菌的相对丰度。

进一步优选的，可将榴莲皮用水煎煮3次，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h。

本发明提供了采用上述提取方法制备得到的榴莲皮多糖。

本发明还提供了上述榴莲皮多糖在制备调节肠道菌群和/或治疗功能性便秘药物方面的应用。进一步的，榴莲皮多糖具体用量可以是200 mg/kg、100 mg/kg等。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

榴莲皮来源于木棉科榴莲属榴莲的果壳，坚硬多刺的外壳很难处理，目前现有研究主要为表面化学性质及其作为活性炭的吸附功能，药理活性主要有抗炎、止咳、镇痛、抗菌等。多糖是榴莲皮中重要的活性物质之一。目前，尚无中药榴莲皮多糖对大鼠功能性便秘治疗的报道。本发明从榴莲皮中提取获得榴莲皮多糖，并通过测定中药榴莲皮多糖对大鼠功能性便秘各项生化指标，考察其调节肠道菌群，治疗功能性便秘的效果，实验结果证明：榴莲皮多糖对大鼠功能性调节肠道菌群，便秘疗效显著，且无毒副作用。

附图说明

图1为组内操作分类学单元（OTUs）的秩丰度曲线（A）和物种积累曲线（B）；

图2为榴莲皮多糖高剂量组（HD）和模型组（MC）样品中差异最大的2个菌株的丰度分布。横坐标为两组样本间差异最大的2个菌株的分类名称，纵坐标为菌株的相对丰度。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明中，如无特殊说明，乙醇均指体积浓度。

实施例1

一种榴莲皮多糖的提取方法，具体为：取干燥榴莲皮4.2 kg，加水至淹没榴莲皮，用水煎煮三次（煎煮水温80-85℃，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h）。合并滤液，减压浓缩，浓缩液加95%乙醇至乙醇终浓度为75%，冰箱中静置过夜（12 h），离心分离，收集沉淀，沉淀用水溶后采用Sevage法除蛋白（选用体积比为4∶1的氯仿—正丁醇混合液，采用本领域常规技术即可）。取上清液加95%乙醇至终浓度为70%，冰箱中静置过夜（12 h），沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冷冻干燥（-50±5 ℃条件下冷冻12 h）即为榴莲皮多糖，约53 g。

大鼠功能性便秘模应用实验

1）试验动物

SPF级的Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠，体重200-220 g。动物购买于河南省实验动物中心。许可证号：SCXK（豫）2017-0001。

2）实验试剂

盐酸洛哌丁胺：2 mg/片，西安杨森制药有限公司。阿拉伯树胶粉：天津市科密欧化学试剂有限公司。大鼠胃动素(MTL) ELISA试剂盒、大鼠胃泌素(GAS) ELISA试剂盒、大鼠P物质(SP) ELISA试剂盒、大鼠生长抑素（SS）ELISA试剂盒，均由南京森贝伽生物科技有限公司提供。

3）实验方法：大鼠功能性便秘模型的建立

54只SPF级的Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠适应性饲养一周（温度25±2 ℃，光照12h/d，湿度40-45 %），喂养标准饲料，自由饮水。给药前一天称量每只大鼠的体重，按体重随机分组，共分为6组，每组9只。即：空白组，模型组，阳性对照组，榴莲皮多糖高、中、低剂量组。进行实验的大鼠按照分组分笼饲养。

除空白组外，盐酸洛哌丁胺以1.5 mg•kg与生理盐水配制成2 mL的溶液进行灌胃造模，2次/d。空白组每天以2 mL生理盐水进行灌胃。在大鼠便秘模型建立期间，每隔一天定时地收集大鼠的24 h便粒，称取便粒的湿重，放入电热干燥箱中，在50℃下干燥8 h，称取便粒的干重，造模进行10 d。期间观察各组大鼠的便粒形状与大鼠活动情况。造模期间，空白组大鼠饮食、活动均为正常，其它各组大鼠活动、饮食量均减少，毛色暗淡，易脱毛。其它各组大鼠的便粒与空白组相比，排便量减少。

表1 造模药物对大鼠24h便粒重的影响（n=9）

表1中可以看出，与空白组相比，模型组（ p ＜0.001）24 h便粒重量均极显著降低，表明便秘模型成功。

4）实验方法：榴莲皮多糖的给药治疗

大鼠功能性便秘模型建立成功后，将造模成功的大鼠进行给药治疗。空白组与模型组每天以1mL/100g体重灌胃生理盐水。阳性对照组：福松（聚乙二醇4000散）每天以3g/kg的剂量溶于生理盐水，以1mL/100g灌胃给药。榴莲皮多糖高、中、低剂量组分别按200mg/kg、100mg/kg、50 mg/kg，每天一次均以1 mL/100g灌胃给药。给药7 d。

给药期间，每天收集6 h便粒，称取重量，记录数据。给药结束后，禁食不禁水12 h后，全部以2 mL灌胃活性炭悬浮液，灌胃1 h后，用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉，将大鼠剪取幽门至下端盲肠处的小肠轻拉平铺至直线。测量剪取的小肠长度（即小肠全长）及其幽门一直到活性炭运动前端的长度（即墨汁推进长度），计算小肠推进率。腹主动脉取血，3000转离心10min，离心得到血清并检测大鼠的胃动素MTL、胃泌素GAS、生长抑素SS及P物质的含量。

无菌环境下取每只大鼠的盲肠内容物约0.2 g, 按照制造商的说明书，使用TIANamp Stool DNA试剂盒对每笼3只大鼠的大约0.2 g合并的盲肠内容物进行DNA提取。使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit检测 DNA浓度。以 20-30 ng DNA为模板，采用包含"CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT "序列的上游 引物和包含" GGACTACNVGGGTWTCTAATCC "序列的下游引物扩增 V3和 V4区。反向引物含有每个样品独有的6 bp错误校正条形码.按照制造商手册，在Illumina MiSeq平台上进行焦磷酸测序。16SrRNAV3-V4区扩增测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

5）数据处理：

双端测序得到的正反向reads首先进行两两拼接，保留序列长度大于200bp 的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于OTU 聚类，使用VSEARCH（1.9.6）进行序列聚类（序列相似性设为97%），比对的16S rRNA参考数据库是Silva 132。 然后利用RDPclassifier (Ribosomal Database Program) 贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果，采用对样本序列进行随机抽平的方法，计算α-多样性指数反映群落的物种丰度和多样性，作Rarefaction曲线图也同样反映物种丰富度和均匀度，结果见图1和2。

结果采用均值±SD值表示，数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异。

6）试验结果：见表2。

表2：榴莲皮多糖对便秘大鼠6 h便粒和肠蠕动率的影响

注: 所有数据采用表示。（n=9）与空白组比: ***P＜0.001 ,**P﹤0.01，*P﹤0.05，与模型组比:^###P＜0.001 , ^## P﹤0.01，^#P﹤0.05

由表2可知，通过盐酸罗哌丁胺造模，可见模型组给药后6h便粒和小肠推动率显著低于空白组，证明造模成功（P＜0.001)。通过给药治疗，榴莲皮多糖高、中、低剂量组和阳性对照组中，排便量和小肠推进率明显高于模型组，说明榴莲皮多糖高、中、低剂量组均有效促进便秘大鼠肠道蠕动，排便量增加。

表3：榴莲皮多糖对便秘大鼠MTL、GAS、SS及P物质的含量的影响

注: 所有数据采用表示。（n=9）与空白组比: ***P＜0.001 ,**P﹤0.01，*P﹤0.05，与模型组比:^###P＜0.001 , ^## P﹤0.01，^#P﹤0.05

由表3可知，模型组中MTL、GAS、p物质均明显低于空白组（P﹤0.01），ss显著高于空白组（P﹤0.01）。阳性对照组与高剂量组的MTL、GAS、p物质均显著高于模型组（P＜0.001），且高剂量组高于阳性对照组。由表3可知，榴莲皮多糖高、中、低剂量组成剂量依赖性，高剂量组效果最好。

图1给出了组内操作分类学单元（OTUs）的秩丰度曲线（A）和物种积累曲线（B）；由图片1可知，秩丰度曲线是光滑的，表明样品之间的均匀性很高，物种的积累曲线开始弯曲，这表明，随着样本量的增加，这种特殊情况不会显著增加。表明抽样充分，数据分析可行。

图2显示了榴莲皮多糖高剂量组（HD）和模型组（MC）样品中差异最大的2个菌株的丰度分布。横坐标为两组样本间差异最大的2个菌株的分类名称，纵坐标为菌株的相对丰度。由图2可知，我们在属级别上比较了HD组和MC组差异较大的两个菌。其中，高剂量的榴莲皮多糖增加了Lachnospiraceae_NK4A136_group的相对丰度，降低了脱硫弧菌的相对丰度。

结论：综上可以看出，榴莲皮多糖能显著升高血清中胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、P物质含量和显著降低生长抑素（SS）的含量，榴莲皮多糖通过降低致病菌(脱硫弧菌)的丰度，增加有益菌(Lachnospiraceae_NK4A136_group)的相对丰度，调节了肠道菌群的组成，改善功能性便秘。其中高剂量组效果最显著。

说明：榴莲皮多糖具有显著调节肠道菌群、治疗功能性便秘的作用，是治疗功能性便秘的理想药物。

Claims (5)

1.一种榴莲皮多糖的提取方法，其特征在于，榴莲皮用水煎煮，过滤，滤液加95%乙醇至终浓度为70±5%，静置，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加95%乙醇至终浓度为70±5%，静置，沉淀经洗涤、冻干即为榴莲皮多糖。

2.根据权利要求1所述榴莲皮多糖的提取方法，其特征在于，将榴莲皮用水煎煮2-4次，煎煮水温80-85℃，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加95%乙醇至终浓度为70%，冰箱中静置过夜，离心分离，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加95%乙醇至终浓度为70%，冰箱中静置过夜，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冻干即为榴莲皮多糖。

3.根据权利要求2所述榴莲皮多糖的提取方法，其特征在于，将榴莲皮用水煎煮3次，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h。

4.采用权利要求1至3任一所述提取方法制备得到的榴莲皮多糖。

5.权利要求4所述榴莲皮多糖在制备调节肠道菌群和/或治疗功能性便秘药物方面的应用。