CN114158735B - 一种益生菌组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种益生菌组合物。与现有技术相比，本发明提供的益生菌组合物中包含益生元水苏糖、L‑阿拉伯糖以及药食同源成分圆包车前子壳和奇亚籽，其丰富的膳食纤维与益生菌协同增效，一方面通过“脑‑肠‑菌群轴”机制途径修复损伤的肠黏膜、平衡肠道菌群、改善肠道微生态环境；另一方面，益生菌代谢产物和益生菌、益生元成分能够激活人体自身存在的肠道有益菌的益生功能，增强人体自身免疫力，消除炎症反应，从根源上恢复肠道正常的蠕动状态，恢复自身正常排便功能，并且，本发明的配方安全无副作用，不会反弹。

Description

一种益生菌组合物及其应用
技术领域
本发明属于功能性食品技术领域，尤其涉及一种益生菌组合物及其应用。
背景技术
随着人们饮食结构的改变及精神心理和社会因素的影响，便秘发病率呈增高趋势，据不完全统计，便秘在人群中的患病率高达27%，尤其功能性便秘已经成为全世界范围内高发性疾病，成人发病率从2.5%上升到79%，儿童发病率从0.7%上升到29.6%。
便秘是指粪便在肠内滞留过久，秘结不通，排便周期延长，或周期不长，但粪便干结，排便艰难或粪质不硬，虽有便意，但便而不畅的一种病症。便秘往往不被引起重视，而导致一些并发症。宿便堆积在肠道里，不断产生各种毒气、毒素，造成肠内环境恶化、肠胃功能紊乱、内分泌失调、新陈代谢紊乱、食欲及睡眠差、精神紧张。宿便还会压迫肠壁，使肠粘膜受伤，肠蠕动变慢，导致习惯性便秘和顽固性便秘，其产生的臭气导致口臭和臭屁，产生多种毒素被肠道反复吸收，通过血液循环到达人体的各个部位，导致或加重面色晦暗、皮肤粗糙、褐斑、痤疮、肥胖、高血压、心脏病等。
便秘的治疗通常分为一般治疗、药物治疗和器械辅助治疗。
一般治疗通常首先排除器质性病变，然后根据便秘轻重等因素综合治疗，采取合理的饮食习惯，增加膳食纤维、饮水量，养成良好的排便习惯等进行控制。
药物治疗主要是采用开塞露、矿物油等软化大便，使其易于排出，或者服用泻药促进排便。目前治疗便秘的保健品和药品很多，如容积性泻药、刺激性泻药、润滑性泻药和肠动力促进剂等，但都有不同程度的弊端存在：如强力排泄给身体带来损伤，导致脾虚加重，肠道津液大量丢失，使排便更加困难；或药物有其他副作用，容易形成依赖性；又或者价格较高；亦或是只能短期缓解症状，但远期疗效不理想且不良反应较多，易反复发作，不宜长期使用。因此治疗便秘不能只图一时之快，不能长期依靠泻药来解决便秘的问题，也不应仅仅依靠治标的药物来缓解便秘，应当采用润肠通便，增加肠道津液，改善和恢复肠道内环境，使排便的功能恢复正常。
器具辅助是采用生物反馈疗法（排便反射治疗）、认知疗法（排除患者焦虑、抑郁等心理因素，消除紧张情绪）或者手术疗法辅助治疗。但是，上述三种治疗法中，药物治疗大多是通过刺激肠道的运动达到排便的目的，其通常具有不良反应或者其停药后即发生逆转，只可治标不能治本，因此，药物治疗通常只能用于暂时性的便秘患者。器具辅助治疗通常需要长期坚持，且治疗的效果也不佳，无法达到根治的效果。一般治疗是目前采用较多的方法，但是一般疗法的效果最弱，目前，最常用的治疗便秘的方法，是服用中药类复方制剂或者服用富含膳食纤维的食物，中药类复方制剂的效果较好，但是中药毕竟是药品，是药三分毒，长期服用会具有副作用；膳食纤维是最安全的食物 疗法，但是膳食纤维服用通常对于青壮年的效果较佳，而对于老年人的顽固性便秘患者效果甚微。
近年来，很多研究证明，肠道菌群在便秘的发生发展中起到很重要的作用。肠道菌群一旦失衡，肠道内有害菌就会增多，产生腐胺、苯酚、吲哚等大量有毒物质，导致肠中毒、麻痹，肠道蠕动就会变得缓慢很多。此外，一旦肠道菌群失调，像凝结芽孢杆菌、双歧杆菌等这样的有益菌就会大量减少，无法产生足够多的乙酸、乳酸、酪酸等促进肠道健康和蠕动的物质，这类物质匮乏，肠营养和肠动力就不足，导致大便在肠内滞留，进而会导致便秘。而便秘又能进一步加重肠道菌群紊乱，形成恶性循环。尤其是有害菌产的毒素如果不及时排出去，毒害被肠壁血管吸收，就会进入血液循环，进而诱发很多其他疾病。
并且肠道菌群在中枢神经系统的正常发育中也起着至关重要的作用，它们似乎可以通过微生物-肠嗜铬细胞-迷走传入神经信号与中枢神经系统和肠道相互作用。肠道神经系统可以独立于中枢神经系统而发挥作用，它包含有与肠道正常运动和感觉功能相关的反射通路。“脑-肠-菌群轴”可能间接影响人的情绪、代谢和行为，精神心理因素引起脑功能障碍表现进而引起肠道动力、分泌和免疫功能紊乱，也会因肠道菌群失衡而影响神经递质的释放导致肠道功能改变引起便秘。目前，越来越多的证据支持双向“微生物-肠-脑轴”的存在，它在调节肠动力中起着关键作用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种靶向脑肠菌群轴有效改善便秘的益生菌组合物及其应用。
本发明提供了一种益生菌组合物，包括：
圆苞车前子壳 12~32重量份；
奇亚籽 12~24重量份；
水苏糖 8~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~30重量份；
凝结芽孢杆菌 28~52重量份。
优选的，所述凝结芽孢杆菌的有效活菌数为1.0×1012~2.8×1012CFU/g。
优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌TBC169。
优选的，包括：
圆苞车前子壳 24~32重量份；
奇亚籽 12~20重量份；
水苏糖 10~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~24重量份；
凝结芽孢杆菌 36~44重量份。
优选的，包括：
圆苞车前子壳 24~28重量份；
奇亚籽 12~16重量份；
水苏糖 12~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~16重量份；
凝结芽孢杆菌 40~44重量份。
优选的，包括：
圆苞车前子壳 24重量份；
奇亚籽 16重量份；
水苏糖 12重量份；
L-阿拉伯糖 16重量份；
凝结芽孢杆菌 40重量份；
或者包括：
圆苞车前子壳 28重量份；
奇亚籽 12重量份；
水苏糖 16重量份；
L-阿拉伯糖 12重量份；
凝结芽孢杆菌 44重量份；
或者包括：
圆苞车前子壳 32重量份；
奇亚籽 20重量份；
水苏糖 12重量份；
L-阿拉伯糖 8重量份；
凝结芽孢杆菌 52重量份。
本发明还提供了上述的益生菌组合物在制备预防和/或改善便秘的食品中的应用。
优选的，所述益生菌组合物通过“脑-肠-菌群轴”机制预防和/或改善便秘。
本发明还提供了一种改善便秘的益生菌复合膳食纤维固体饮料，包括上述益生菌组合物。
本发明还提供了一种改善便秘的益生菌复合膳食纤维固体饮料，其制备的方法包括将所述益生菌组合物中的各组分粉碎、过筛、混料、制粒、内包工序。
本发明提供了一种益生菌组合物，包括：圆苞车前子壳12~32重量份；奇亚籽12~24重量份；水苏糖8~16重量份；L-阿拉伯糖8~30重量份；凝结芽孢杆菌28~52重量份。与现有技术相比，本发明提供的益生菌组合物中包含益生元水苏糖、L-阿拉伯糖以及药食同源成分圆包车前子壳和奇亚籽，其丰富的膳食纤维与益生菌协同增效，一方面通过“脑-肠-菌群轴”机制途径修复损伤的肠黏膜、平衡肠道菌群、改善肠道微生态环境；另一方面，益生菌代谢产物和益生菌、益生元成分能够激活人体自身存在的肠道有益菌的益生功能，增强人体自身免疫力，消除炎症反应，从根源上恢复肠道正常的蠕动状态，恢复自身正常排便功能，并且，本发明的配方安全无副作用，不会反弹。
进一步，本发明采用凝结芽孢杆菌TBC169，其表层蛋白具有保水润肠作用；同时能够在促进肠道内其他益生菌生长、促进肠道蠕动，促进肠道血液循环、增强对营养物质的吸收、提高人体抵抗力、改善肠道损伤状态、促进肠道修复等多方面起到协同增强的效果，对中老年慢性便秘、顽固性便秘具有极好的改善效果；还可增强免疫力、消除炎症反应、修复损伤的肠黏膜、平衡肠道菌群，从而防止中老年人便秘的复发；并且本发明提供的益生菌组合物可以从多个机制层面起到显著改善便秘的作用，且是从源头上对肠道菌群及肠道内相关神经递质的改善，从而缓解便秘，安全无副作用，且不易反弹；再者本发明以益生菌、药食同源成分与益生元，协同增效。
附图说明
图1为本发明实施例提供的益生菌组合物影响小鼠结肠收缩蛋白TMEM 16A蛋白表达水平检测结果图；
图2为本发明实施例提供的益生菌组合物影响小鼠结肠收缩蛋白ATP2B2蛋白表达水平检测结果图；
图3为本发明实施例提供的益生菌组合物影响小鼠结肠收缩蛋白TMEM 16A基因表达水平检测结果图；
图4为本发明实施例提供的益生菌组合物影响小鼠结肠收缩蛋白ATP2B2基因表达水平检测结果图；
图5为本发明实施例中小鼠便秘前后血清中促炎因子TNF-α的变化柱形图；
图6为本发明实施例中小鼠便秘前后血清中促炎因子IFN-γ的变化柱形图；
图7为本发明实施例中小鼠便秘前后血清中促炎因子IL-6的变化柱形图；
图8为本发明实施例中小鼠便秘前后血清中抑炎因子IL-4的变化柱形图；
图9为本发明实施例中小鼠便秘前后血清中抑炎因子IL-10的变化柱形图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种益生菌组合物，包括：
圆苞车前子壳 12~32重量份；
奇亚籽 12~24重量份；
水苏糖 8~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~30重量份；
凝结芽孢杆菌 28~52重量份。
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
本发明提供的益生菌组合物含有益生元、药食同源成分与益生菌，安全无副作用，可显著改善便秘。
在本发明提供的益生菌组合物中，药食同源成分包含圆苞车前子壳与奇亚籽；在本发明中，所述圆苞车前子壳优选以圆苞车前子壳粉的形式加入；所述圆苞车前子壳在益生菌组合物中的含量优选为16~32重量份，更优选为24~32重量份，再优选为24~28重量份；在本发明提供的实施例中，所述圆苞车前子壳在益生菌组合物中的含量具体可为12重量份、16重量份、24重量份、28重量份或32重量份；在本发明中，所述奇亚籽优选以奇亚籽粉的形式加入；所述奇亚籽粉在益生菌组合物中的含量优选为12~22重量份，更优选为12~20重量份，再优选为12~16重量份；在本发明提供的实施例中，所述奇亚籽在益生菌组合物中的含量具体可为24重量份、22重量份、16重量份、12重量份或20重量份。
在本发明提供的益生菌组合物中，益生元为水苏糖与L-阿拉伯糖；所述水苏糖在益生菌组合物中的含量优选为10~16重量份，更优选为12~16重量份；在本发明提供的实施例中，所述水苏糖在益生菌组合物中的含量具体为8重量份、10重量份、12重量份或16重量份；所述L-阿拉伯糖在益生菌组合物中的含量优选为8~24重量份，更优选为8~20重量份，再优选为8~16重量份，最优选为12~16重量份；在本发明提供的实施例中，所述L-阿拉伯糖在益生菌组合物中的含量具体可为20重量份、24重量份、16重量份、12重量份、8重量份或20重量份。
本发明提供的益生菌组合物中的益生菌为凝结芽孢杆菌TBC169，其有效活菌数优选为大于等于1011CFU/g，更优选为1.0×1012~2.8×1012 CFU/g；所述凝结芽孢杆菌优选为凝结芽孢杆菌TBC169；凝结芽孢杆菌TBC169表层蛋白具有保水润肠作用，其进入肠道分泌大量乳酸，能促进肠道蠕动，恢复肠动力，同时分泌抗菌凝固素，抑制肠道有害菌，消除产毒源，排除肠道毒素，解除肠道毒素对肠道的麻痹作用；并且，凝结芽孢杆菌TBC169能分解多糖为低聚糖，提供肠道有益菌生长所需营养物质，促进有益菌增殖，快速恢复肠道菌群平衡状态；再者，凝结芽孢杆菌TBC169还能产生40多种消化酶有效消除便秘患者腹胀、食欲减退等伴随症状。
在本发明中，进一步优选的，所述益生菌组合物包括：
圆苞车前子壳 24~32重量份；
奇亚籽 12~20重量份；
水苏糖 10~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~24重量份；
凝结芽孢杆菌 36~44重量份。
更进一步优选的，所述益生菌组合物包括：
圆苞车前子壳 24~28重量份；
奇亚籽 12~16重量份；
水苏糖 12~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~16重量份；
凝结芽孢杆菌 40~44重量份。
具体的，本发明提供的益生菌组合物包括：
圆苞车前子壳 24重量份；
奇亚籽 16重量份；
水苏糖 12重量份；
L-阿拉伯糖 16重量份；
凝结芽孢杆菌 40重量份；
或者包括：
圆苞车前子壳 28重量份；
奇亚籽 12重量份；
水苏糖 16重量份；
L-阿拉伯糖 12重量份；
凝结芽孢杆菌 44重量份；
或者包括：
圆苞车前子壳 32重量份；
奇亚籽 20重量份；
水苏糖 12重量份；
L-阿拉伯糖 8重量份；
凝结芽孢杆菌 52重量份。
本发明提供的益生菌组合物中包含益生元水苏糖、L-阿拉伯糖以及药食同源成分圆包车前子壳和奇亚籽，其丰富的膳食纤维与益生菌协同增效，一方面通过“脑-肠-菌群轴”机制途径修复损伤的肠黏膜、平衡肠道菌群、改善肠道微生态环境；另一方面，益生菌代谢产物和益生菌、益生元成分能够激活人体自身存在的肠道有益菌的益生功能，增强人体自身免疫力，消除炎症反应，从根源上恢复肠道正常的蠕动状态，恢复自身正常排便功能，并且，本发明的配方安全无副作用，不会反弹。
本发明还提供了一种上述益生菌组合物在制备预防和/或改善便秘的食品中的应用。
优选的，所述益生菌组合物通过“脑-肠-菌群轴”机制预防和/或改善便秘。
本发明提供的益生菌组合物对便秘改善效果显著，不易反弹、安全性高，从恢复肠道菌群平衡和改善“脑-肠-菌群轴”机制层面，从根源上恢复机体免疫力，恢复肠道正常蠕动功能。
本发明还提供了一种改善便秘的益生菌复合膳食纤维固体饮料，包括上述的益生菌组合物；所述益生菌复合膳食纤维固体饮料中益生菌组合物的质量含量优选大于等于50%，更优选为60%~90%，再优选为70%~90%，最优选为80%~90%；在本发明提供的实施例中，所述益生菌复合膳食纤维固体饮料中益生菌组合物的质量含量具体为84.46%。
按照本发明，所述益生菌复合膳食纤维固体饮料还包括辅料；所述辅料优选为微晶纤维素、二氧化硅与羧甲基纤维素钠中的一种或多种。
本发明提供的益生菌复合膳食纤维固体饮料使通过将各组分粉碎、筛分（或不筛分）、按比例混合、制粒或不制粒、包装等常规制备方法制得，并无特殊的限制。
进一步，本发明采用具有独特保水性表层蛋白、高活菌数的凝结芽孢杆菌TBC169菌株，将其与圆苞车前子壳、奇亚籽、水苏糖、L-阿拉伯糖等主要原料成分进行配比，经制粒工艺制备得到能够有效改善便秘的固体饮料产品。
进一步，本发明所提供的益生菌复合膳食纤维固体饮料产品，是经过干法制粒工艺所得到的，该发明的颗粒剂型产品的冲溶性极好；制粒的粒径优选为20~80目。
进一步本发明还提供了一种改善便秘的益生菌复合膳食纤维固体饮料，其制备的方法包括将上述益生菌组合物中的各组分粉碎、过筛、混料、制粒、内包工序。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种益生菌组合物及其应用进行详细描述。
以下实施例中所用的原辅料及市售产品的相关信息如下：
（1）物料信息
注释：本发明所用的凝结芽孢杆菌菌粉的制备方法参照之前申请的专利【专利号：201310105638 .7 ，专利名称“凝结芽孢杆菌在制备预防和治疗幽门螺杆菌感染制剂中的应用”】
（2）市售产品信息
实施例
为验证益生菌与其余各组分以不同比例配比后的协同作用，本发明对各组分的相对用量进行优选。具体而言，按照重量份计，本发明提供的益生菌组合物采用包括表1主要原料制备而成（单位：份）。
动物实验验证不同配比对小鼠便秘改善情况
实验动物：小鼠（20±2 g）
造模：
将小鼠正常饲养一周后，皮下注射5 mg/kg盐酸洛哌丁胺生理盐水悬浊液，每天9:00和18:00各一次，连续7天，其中选取10只作为正常组给予同剂量的生理盐水。选取粪便干结、数量减少、重量减轻的小鼠作为便秘模型小鼠。
分组治疗：
选取造模成功的小鼠80只，随机分成模型组、配方A组、配方B组、配方C、配方D、配方E、配方F，每组各10只；选取正常饲养健康小鼠10只，作为空白对照组。对于各治疗组（配方A组、配方B组、配方C、配方D、配方E、配方F），按照0.4 mL/kg·bw的剂量（各组方配成的溶液浓度为1 mM），连续灌胃7天。正常组和模型组灌胃同剂量生理盐水。实验过程中，每日上午定时测定所有小鼠的体重、膳食摄入量、饮水量、粪便重量和粪便湿度。结束灌胃治疗后，收集粪便，计数并称重。收集的粪便置于真空冷冻干燥机内冻干，计算粪便含水量。得到结果见表2。
结果分析：从表2中可以看出便秘小鼠在经由各配方组治疗后，均能够从一定程度上缓解由洛哌丁胺引起的排便频率和粪便含水量的降低；但是，不同配方中凝结芽孢杆菌与药食同源成分及益生元的配比不同，其对小鼠便秘症状的改善情况差异较大。配方D相比于其他配方，对于洛哌丁胺引起的便秘小鼠粪便含水量降低、排便时间延长、排便量变少等症状的改善效果更显著，这可能是因为，配方D中凝结芽孢杆菌TBC169与其他药食同源成分及益生元成分在此配比下，能够将各自对肠道的有益效果发挥到最佳程度，从而有助于粪便运输和排出。
为进一步验证不同配方对小鼠便秘的改善效果，继续开展以下试验：
不同配比的组方对小鼠肠道蠕动能力的改善
由于小肠推进率可直接反映小肠的运动能力。本实施例中通过灌胃墨汁检测相关推进速率情况来比较各组方对小鼠肠道蠕动能力的改善效果。
在末次灌胃治疗结束后第二天，给小鼠灌胃墨汁，灌胃体积均为 0.2 mL。随后将小鼠立即转移到干净的笼子，随意摄入食物和水。记录从灌胃墨汁到第1颗黑色粪便排出的时间。第9天，小鼠禁食过夜，灌胃方法同第8天，30 min后，小鼠腹腔注射氯胺酮（100mg/kg·bw）麻醉，取血后脱颈椎处死，开腹，小心地取出从幽门到盲肠的整个小肠，测量墨汁行进的距离和小肠全长。得到结果见表3。
小肠推进率/%=墨汁推进距离/结肠长度×100%
结果分析：洛哌丁胺会抑制肠道蠕动，延迟肠道内容物的输送。而经由本发明的各组方灌胃治疗后，小鼠肠道蠕动能力得到明显改善。由表3数据可以看出，模型组小鼠小肠推进率显著低于空白组（P＜0.01），首粒黑便排出时间也显著高于空白组（p＜0.01），说明使用洛哌丁胺诱导的小鼠便秘模型造模成功。治疗组的各配方组小鼠小肠推进率显著高于模型组（P＜0.01或p＜0.05），首粒黑便排出时间相比于便秘模型组也有明显的缩短，说明本发明中各配方对小鼠肠道蠕动都有一定的改善效果。其中配方D组促进小肠蠕动的效果是最好的，小肠推进率比便秘模型组提高49.42%，具有显著性差异；其次效果较好的为配方E组、C组，肠道蠕动改善提高率均大于35%（其他各配方组相比于便秘模型组在小肠推进率提高方面的情况为：配方D组＞配方E组＞配方C组＞配方B组＞配方F组＞配方A组=49.42%＞37.25%＞36.2%＞32.82%＞30.71%＞27.3%）；配方D组小鼠首粒黑便排出时间相比于便秘模型组大大缩短了132.68 min（2.2 h），具有显著性差异；而其他各配方组小鼠对于小肠蠕动的改善效果没有配方D组效果更好。
探究不同配方对小鼠胃肠激素变化的影响
将收集到的小鼠（连续灌胃7天后的小鼠）血液静置2 h，3000 rpm离心15 min后获得血清，参照相应试剂盒说明书进行试验，根据标准曲线计算血清中胃动素（motilin,MD）、胃泌素（gastrin, Gas）、内皮素（endothelin，ETH）、生长抑素（somatostatin，SS）、P物质（substance P，SP）和血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）的浓度。实验结果见表4。
结果分析：各组小鼠血清中胃肠调节肽水平如表4所示，相比模型组，各配方组灌胃治疗后，小鼠血清中Gas、MTL、SP等兴奋性递质的水平有了明显提高（P＜0.05或p＜0.01），血清中VIP、ET-1、SS等抑制性递质的水平有了一定程度的降低（P＜0.05或p＜0.01）。配方D组对Gas、MTL、SP、VIP、ET的恢复能力相比于其余配方组效果更优，组间有一定的差异性（p＜0.05或p＜0.01）；对于降低SS的能力，配方D组、配方E组和配方F组，无较明显的效果差异，可能是因为不同组方对便秘的调节作用机制与SS的关系并不很大，更多的是对血清中Gas、MTL、SP、VIP、ET这几种神经递质起到调节作用。总之，以上结果说明便秘严重影响了小鼠体内胃肠激素水平，本申请的组方制剂能够明显改善便秘引起的胃肠调节肽的分泌失调，尤其是配方D的配比能够起到最佳的改善效果。
综上研究可得结论：（1）本发明提供的益生菌组合物组可显著提高粪便中的含水量、粪便排出时间以及肠道蠕动速度；（2）本发明提供的益生菌组合物可以通过影响胃肠激素分泌的机制而起到显著改善便秘的作用。本配方成分可明显提高血清中Gas、MTL、SP等兴奋性递质的分泌水平，同时可明显降低血清中VIP、ET-1、SS等抑制性递质的分泌水平。
根据动物实验中小鼠各项便秘指标改善情况，本发明选择配方D作为最终的配比组方来制备益生菌复合膳食纤维固体饮料并选择市售含其他凝结芽孢杆菌菌株的通便产品进行比较研究。
研究内容如下：
通过测定短链脂肪酸的含量验证对便秘的改善作用
因为本发明中所用的益生菌凝结芽孢杆菌TBC169菌株，其表层蛋白具有保水性，具有特殊的保水润肠作用，且其能够分泌短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸等），短链脂肪酸是一类肠道（主要是结肠）菌群发酵的复杂碳水化合物的末端产物。短链脂肪酸具有一定的通便与修复结肠黏膜损伤的作用。便秘小鼠灌胃本发明产品后，由于其中存在活菌数较高的凝结芽孢杆菌TBC169菌株，其促进了肠道中的其他有益菌的生长，从而促使菌群代谢产物-短链脂肪酸水平均有明显提高。研究表明乙酸、丙酸等有机酸可直接刺激肠壁神经，加快肠道蠕动；乙酸是微生物的主要代谢产物，其浓度的增加可使肠管内渗透压增大，肠道内水分吸收增加，提高粪便质量和润滑度，使其更易于运输与排出。
本实验过程中小鼠造模及分组治疗的方式与前述方法保持一致，本实验中所采用的测定短链脂肪酸的方法为：
（1）前处理：以乙酸乙酯作为溶剂进行对小鼠粪便样本进行前处理，再经乙酸乙酯萃取、过滤后，取得上清液为样本，密封保存于-4℃冰箱中保存；
（2）分析检测：采用气相色谱法检测，使用强极性色谱柱（FFAP毛细管柱）以获得较好的分离效果。
实验结果见表5。
结果分析：
从表5的数据可以看出：服用产品后，小鼠的各种短链脂肪酸含量均比便秘模型组小鼠有明显提高，说明短链脂肪酸水平确实与小鼠便秘症状有确切相关性，且本实验中便秘小鼠造模成功。同样三款含有凝结芽孢杆菌的产品在灌胃小鼠后，可以看出，本发明的产品对便秘小鼠粪便短链脂肪酸含量的增加有更明显的促进效果，与便秘模型组相比，有显著性差异，与市售产品a组和b组相比均有一定的差异性（p＜0.01或p＜0.05）。
本发明进一步从“脑-肠-菌群轴”研究本发明产品配方对小鼠便秘改善效果的作用机制，同时与市售通便产品进行比较：
对小鼠结肠收缩功能相关蛋白和基因表达的检测
（1）有研究报道，TMEM 16A在巨结肠患者结肠中具有低表达的特点。有研究指出，TMEM 6A编码的钙激活氯离子通道具有调控气道和外分泌腺、平滑肌收缩、神经元信号及胃肠道系统节律性运动的功能。此外，有研究表明，TMEM 16A低表达于顽固性功能性便秘患者结肠组织中，其作用机制可能是通过调节c-kit表达以发挥调控结肠平滑肌运动功能的作用，从而对便秘起到调节作用。作为一种P型离子转运ATP酶，ATP2B2基因的主要功能在于将细胞内过量的二价钙离子泵出细胞，从而可起到维持细胞内钙离子稳态的作用。有研究曾报道，TMEM 16A 表达下调可能与功能性便秘小鼠结肠收缩功能减弱密切相关，TMEM 16A可能通过调节ATP2B2表达而起到调控功能性便秘小鼠发病机制的作用。
（2）本实验中对小鼠的处理方法同前述方法一致，其中，采用免疫印迹法和凝胶电泳方法检测小鼠结肠中 TMEM 16A、ATP2B2蛋白表达情况。两种蛋白检测结果见图1、图2；两种基因表达量的检测结果见图3、图4。图1中#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01），**表示与模型组比较有显著性差异（p＜0.01），*表示与模型组比较有差异但不显著（p＜0.05）；图2中#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01），**表示与模型组比较有显著性差异（p＜0.01），*表示与模型组比较有差异但不显著（p＜0.05）；图3中#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01），**表示与模型组比较有显著性差异（p＜0.01），*表示与模型组比较有差异但不显著（p＜0.05）；图4中#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01），**表示与模型组比较有显著性差异（p＜0.01），*表示与模型组比较有差异但不显著（p＜0.05）。
（3）结果分析：从图1和图2数据可以看出：模型组小鼠TMEM 16A蛋白表达水平较空白组明显降低，ATP2B2蛋白表达水平较空白组明显升高（P<0.01），说明便秘确实会影响结肠收缩功能相关蛋白的变化，同时也说明便秘模型小鼠造模成功；经本发明配方产品治疗后，TMEM 16A蛋白表达水平显著回升（P＜0.01），同时ATP2B2蛋白水平有显著回落（P＜0.01），说明本发明的配方产品，可以通过影响黏液蛋白表达而起到显著改善小鼠便秘的效果。同时可以看出，用市售产品a和市售产品b在给予小鼠治疗后，虽然两种蛋白表达水平有所改善（p＜0.05），但效果并没有本发明的配方产品所起到的效果好。
从图3和图4数据可以看出：模型组小鼠TMEM 16A基因表达水平较空白组明显降低（P<0.01），ATP2B2基因表达水平较空白组有明显升高（P<0.01），一方面说明便秘确实会影响结肠收缩功能相关基因表达的变化，同时说明便秘模型小鼠造模成功；经本发明配方产品治疗后，TMEM 16A基因表达水平显著回升（P＜0.01），同时ATP2B2基因水平有显著回落（P＜0.01），说明本发明的配方产品，可以通过影响结肠收缩功能相关基因的表达而起到显著改善小鼠便秘的效果。同时可以看出，用市售产品a和市售产品b在给予小鼠治疗后，虽然两种基因表达水平有所改善（p＜0.05），但效果并没有本发明的配方产品所起到的效果好。
对小鼠血清中炎症因子表达情况的检测
（1）通过检测小鼠便秘前后血清中促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6）、抑炎因子（IL-4、IL-10）的变化，以探究本产品组方对便秘改善的作用机制，得到结果如图5~图9所示。图5中与模型组比较**有显著性差异（p＜0.01），*有差异但不显著（p＜0.05），#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01）；图6中与模型组比较**有显著性差异（p＜0.01），*有差异但不显著（p＜0.05），#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01）；图7中与模型组比较**有显著性差异（p＜0.01），*有差异但不显著（p＜0.05），#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01）；图8中与模型组比较**有显著性差异（p＜0.01），*有差异但不显著（p＜0.05），#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01）；图9中与模型组比较**有显著性差异（p＜0.01），*有差异但不显著（p＜0.05），#表示与空白组比较有显著性差异（p＜0.01）。
（2）结果分析：从图5、图6、图7可以看出便秘模型组小鼠的促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量明显升高，说明便秘会引起血清中促炎因子的变化，同时也说明便秘小鼠造模成功；而服用本发明产品以及市售通便产品a和b后，促炎因子的表达量下降，尤其是服用本发明产品后，TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量相比于模型组小鼠有显著性差异（p＜0.01），而对照市售产品组对促炎因子的抑制效果没有本发明的产品强（p＜0.05）。
从图8、图9可以看出便秘模型组小鼠相比正常组小鼠，体内抑炎因子IL-6、IL-10会显著下降，说明便秘会引起血清中抑炎因子的变化，同时说明便秘小鼠造模成功；而服用本发明产品以及市售通便产品a和b后，抑炎因子的表达量明显升高，尤其是服用本发明产品后，IL-6、IL-10的表达量相比于模型组小鼠有显著性差异（p＜0.01），而对照市售产品a、b组对抑炎因子表达的促进效果没有本发明的产品强（p＜0.05）。
综上可以看出：本发明的产品可以通过影响体内炎症因子的表达水平而对便秘有较理想的改善效果，本发明的配方可以提升抑炎因子的分泌、降低促炎因子的表达，改善体内炎症状态，从而有助于便秘患者增强自身免疫力，恢复身体正常排便状态。
综上研究可得到结论：（1）本发明提供的益生菌组合物可以通过恢复肠道菌群平衡，促进肠道有益菌生长、抑制肠道有害菌繁殖而起到有益的缓解便秘的效果；（2）本发明提供的益生菌组合物可以通过影响结肠收缩功能相关蛋白和基因的表达这一作用机制而对便秘起到有效的改善作用；（3）本发明提供的益生菌组合物也可以通过影响体内促炎因子、抑炎因子的分泌而缓解便秘；（4）本发明提供的益生菌组合物还可以通过影响肠道菌群分泌的产物-短链脂肪酸的含量变化而起到缓解便秘的作用。
本发明进一步开展人体试食试验，以证实本发明提供的益生菌组合物对便秘的改善效果。
将配方D（87份）、二氧化硅（2份）、甜菊糖苷（1份）、微晶纤维素（7份）、木糖醇（5份）与羧甲基纤维素钠混合（1份），经干法制粒工艺，得到粒径为20~80目的固体饮料产品。
便秘人群试食试验
（1）分组实施情况：选择患有便秘的自愿受试者，排除孕妇、有其他伴随疾病或正服用其他药物的患者，共计150人，其中接受配方D制备的固体饮料产品治疗组50人，接受市售产品a治疗对照组50人，接受市售产品b治疗对照组50人。3组受试者男女平均分配，平均年龄（36.5±5.5）岁；每天食用一次，每次2 g，记录受试者服用前及服用后的排便积分（服用周期为14天）情况，统计结果见表6。
（2）便秘人群症状积分依据：
排便频率：1~2 d排便1次计0分，3 d计2分，＞3 d计4分。
排便速度：＜5 min计0分，5~10 min计2分，＞10 min计4分。
排便时间：＜10 min/次计0分，10~15 min/次计2分，15~25 min/次计4分。
排便费力：不费力计0分，较费力计2分，需借助外力计4分。
粪便性状：正常计0分，干结计2分，硬球计4分。
（3）结果分析：从表6中可以看出便秘人群在服用本发明产品及市售产品后，便秘人群的排便频率、排便速度、排便时间、排便费力、粪便性状等积分均显著降低，同组治疗前后比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。服用本发明产品的便秘人群，治疗组临床症状积分明显低于对照组，两组比较具有显著性差异（P＜0.01），且与市售产品a组及b组治疗后的结果比较，也有一定的差异性，说明由本发明配方D和其余辅料制成的产品对便秘人群的改善效果显著优于市售产品组。
对便秘人群服用产品前后肠道菌群的检测
（1）人群样本：便秘人群：35~50岁：40名；55~65岁：40名。其中从便秘人群中随机抽取20人作为服用本发明产品组，连续服由本发明配方D和其余辅料制成的产品14天；从便秘人群中随机抽取20人是连续服用14天的市售产品a，随机抽取20人是连续服用14天的市售产品b，剩余20名便秘人群不做治疗作为对照组。对粪便中双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、产气荚膜杆菌等进行活菌计数，同时以健康人群（包括5~8岁儿童12名、15~25岁青年15名、40~48岁中年15名）肠道菌群活菌数的平均值作为对照进行数据分析。
（2）检测方法：留取便秘人群的自然排便新鲜粪便中段0.5 g，置于样本袋存于-4℃冰箱，采用细菌DNA提取试剂盒提取DNA，使用荧光定量PCR（TaqMan探针法）对便秘人群进行肠道菌群检测，得到结果见表7。
（3）结果分析：由表7可看出，便秘人群肠道菌群数量与健康人群比有较大差异，最显著的是双歧杆菌数量明显低于健康人群。连续14d服用本发明配方D组所制成的益生菌复合膳食纤维固体饮料后，便秘人群肠道菌群结构有明显变化（P＜0.01），其中，双歧杆菌、乳杆菌的数量显著升高，而肠球菌、拟杆菌及产气夹膜杆菌等肠道有害菌数量也有明显的下降；相比于市售产品a和b，本发明配方所制备成的益生菌复合膳食纤维固体饮料，对便秘人群肠道菌群数量变化的影响更显著，说明本发明的配方确实通过改善肠道菌群的平衡，尤其是增加了肠道中乳杆菌、双歧杆菌等有益菌的数量，而起到改善便秘的有益效果。
便秘人群在停止服用产品后便秘复发率的统计（各组均30人），得到结果见表8。
结果分析：从表8可以看出：服用本发明产品的便秘人群，在停止服用后，连续一个月没有复发现象出现，仅在第45天时，偶然出现一名，复发率仅为3.3%，且连续两个半月，没再出现新复发的便秘人。而服用市售产品a和b的便秘人群，在停止服用产品后，在半个月内就出现复发现象，且随时间延长，复发率逐渐升高，便秘复发率分别高至33.3%和40%，复发率远超本发明产品组。

Claims (8)

1.一种益生菌组合物，其特征在于，由以下组分组成：
圆苞车前子壳 12~32重量份；
奇亚籽 12~24重量份；
水苏糖 8~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~30重量份；
凝结芽孢杆菌 28~52重量份；
所述凝结芽孢杆菌的有效活菌数为1.0×1012~2.8×1012 CFU/g；
所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌TBC169。
2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，由以下组分组成：
圆苞车前子壳 24~32重量份；
奇亚籽 12~20重量份；
水苏糖 10~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~24重量份；
凝结芽孢杆菌 36~44重量份。
3.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，由以下组分组成：
圆苞车前子壳 24~28重量份；
奇亚籽 12~16重量份；
水苏糖 12~16重量份；
L-阿拉伯糖 8~16重量份；
凝结芽孢杆菌 40~44重量份。
4.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，由以下组分组成：
圆苞车前子壳 24重量份；
奇亚籽 16重量份；
水苏糖 12重量份；
L-阿拉伯糖 16重量份；
凝结芽孢杆菌 40重量份；
或者包括：
圆苞车前子壳 28重量份；
奇亚籽 12重量份；
水苏糖 16重量份；
L-阿拉伯糖 12重量份；
凝结芽孢杆菌 44重量份；
或者包括：
圆苞车前子壳 32重量份；
奇亚籽 20重量份；
水苏糖 12重量份；
L-阿拉伯糖 8重量份；
凝结芽孢杆菌 52重量份。
5.权利要求1~4任意一项所述的益生菌组合物在制备预防和/或改善便秘的食品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述益生菌组合物通过“脑-肠-菌群轴”机制预防和/或改善便秘。
7.一种改善便秘的益生菌复合膳食纤维固体饮料，其特征在于，包括权利要求1~4任意一项所述的益生菌组合物。
8.一种改善便秘的益生菌复合膳食纤维固体饮料，其特征在于，其制备的方法包括将权利要求1~4任意一项所述益生菌组合物中的各组分粉碎、过筛、混料、制粒、内包工序。
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