CN109833320B

CN109833320B - 人参皂苷在制备激活tmem16a离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物

Info

Publication number: CN109833320B
Application number: CN201910209646.3A
Authority: CN
Inventors: 安海龙; 陈娅斐; 郭帅; 王徐朝; 展永; 史赛; 李军委; 刘雨菲
Original assignee: Hebei University of Technology
Current assignee: Hebei University of Technology
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109833320A

Abstract

本发明提供了一种人参皂苷在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物，涉及生物技术领域。本发明人参皂苷是指人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2；人参皂苷来源于传统中药，其生物安全性高且毒副作用较低，将人参皂苷应用于制备激活TMEM16A离子通道的产品，可用于制备实验试剂、试剂盒以及以TMEM16A离子通道为靶点的药物，具有激活效果好和毒副作用低的优点。

Description

人参皂苷在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种人参皂苷在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物。

背景技术

阴离子通道是生物膜(细胞内膜系统和细胞膜)中普遍存在的一种通道，其主要功能在于跨膜运输各种阴离子，运输方向依赖于离子所处的电化学梯度，属于被动运输。生物体内有多种阴离子如I^-、Br^-、NO₃ ^-、SCN^-、PO₄ ^3-、F^-和Cl^-等，其中Cl^-是含量最多的一种阴离子，因此阴离子通道又被叫做氯离子通道。氯离子转运障碍会引起肺囊性纤维化，失聪，肾结石和骨质疏松症等多种疾病。氯离子通道主要包括配体门控氯离子通道、电压门控氯离子通道、cAMP依赖氯离子通道和钙激活氯离子通道。

钙激活氯离子通道(calcium-activatedchloridechannel，CaCCs)是一类广泛表达于内皮细胞、上皮细胞等非兴奋细胞，以及心肌细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞等兴奋细胞上的阴离子通道，具有多种重要的生理功能。

2008年CaCCs鉴定出的第一个分子身份为TMEM16A。TMEM16A属于具有多次跨膜结构的蛋白质家族——TMEM16家族，TMEM16A蛋白质结构具有8个跨膜域，氨基端与羧基端均位于细胞内。TMEM16A在血管上皮细胞、胰腺上皮细胞、唾液腺上皮细胞和支气管粘膜下颌下腺腺泡中有TMEM16A表达，在乳腺和肾小管中也有TMEM16A表达。TMEM16A作为CaCCs中的一种对上皮体液转运、胃肠动力调节、平滑肌收缩等多种生理过程具有重要的作用。TMEM16A功能与腹泻、便秘、高血压、肿瘤等多种疾病密切相关。因此筛选出能够制备有效激活TMEM16A的产品对TMEM16A的研究和制备药物具有重要作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供人参皂苷在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用，所述人参皂苷为人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2，人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2对TMEM16A离子通道具有良好的激活作用，可应用于制备TMEM16A离子通道的激活剂或以TMEM16A离子通道作为靶点的药物。

本发明的第二目的在于提供一种TMEM16A离子通道的激活剂，该激活剂以人参皂苷Rf和/或人参皂苷Rg2作为活性成分。

本发明的第三目的在于提供一种包含上述激活剂的试剂盒。

本发明的第四目的在于提供一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，该药物以人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐为活性物质；和/或以人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐为活性物质。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

本发明提供了人参皂苷在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用，所述人参皂苷为人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2。

本发明还提供了一种TMEM16A离子通道的激活剂，所述激活剂以人参皂苷Rf和/或人参皂苷Rg2作为激活TMEM16A离子通道的活性成分。

优选地，所述激活剂用于体外激活细胞的TMEM16A离子通道；

所述人参皂苷Rf的浓度为10-500μmol/L；优选为100-500μmol/L；更优选为200-500μmol/L；

所述人参皂苷Rg2的浓度为20-200μmol/L；优选为50-150μmol/L；更优选为100-150μmol/L。

本发明还提供了一种包含上述激活剂的试剂盒。

本发明还提供了一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，所述药物以人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐为活性物质；和/或以人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐为活性物质。

优选地，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物治疗的疾病包括肺囊性纤维化、急性肺损伤、胃肠动力学障碍和干燥综合症中的一种或者多种。

优选地，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物用于治疗肺囊性纤维化，所述药物还包人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐、白藜芦醇或其药学上可接受的盐和银杏内酯B或其药学上可接受的盐中的至少一种。

优选地，按重量份数计，所述药物包括人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐50～150份，或，所述药物包括人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐50～150份；

所述药物还包括人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐10～20份；白藜芦醇或其药学上可接受的盐1～5份；和，银杏内酯B或其药学上可接受的盐10～20份；

更优选地，按重量份数计，所述药物包括人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐100～150份，或人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐50～100份；

所述药物还包括人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐12～18份；白藜芦醇或其药学上可接受的盐1.5～4.5份；和，银杏内酯B或其药学上可接受的盐12～18份；

进一步优选地，按重量份数计，所述药物包括人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐120～140份，或人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐65～85份；

所述药物还包括人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐15～16份；白藜芦醇或其药学上可接受的盐2～3份；和，银杏内酯B或其药学上可接受的盐13～15份。

优选地，所述药物还包括任意的药学领域可接受的辅料；所述辅料包括稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和香味剂中的一种或多种。

优选地，所述药物的剂型为注射剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊或口服液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

人参皂苷是一种存在于传统中药人参中的化合物，其生物安全性高且毒副作用较低，通过膜片钳实验可以看出，高浓度的人参皂苷可完全激活TMEM16A离子通道的开放。TMEM16A离子通道广泛分布于生物的各种组织中，比如神经元、肌肉细胞、上皮细胞、嗅觉和感光细胞、乳腺细胞和淋巴细胞等，在生命过程中扮演重要角色。因此将人参皂苷应用于制备激活TMEM16A离子通道的产品，具有激活效果好和毒副作用低的优点。基于上述发明构思，本发明还提供了TMEM16A离子通道的激活剂、包含TMEM16A离子通道的激活剂的试剂盒和一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物。

许多疾病的发生都是由于离子通道的结构改变，并且疾病也伴随着离子通道的抑制或者激活，因此离子通道已成为药物筛选的重要靶点。TMEM16A离子通道在呼吸道上皮、唾液腺、胰腺导管细胞和肠道上皮细胞中为氯离子的分泌提供路径，对上皮细胞液体分泌的过程十分重要；在冠状动脉、主动脉和肠系膜上动脉具有TMEM16A离子通道的表达；TMEM16A离子通道在血管收缩和增殖中的作用也十分重要，TMEM16A离子通道还参与神经元兴奋及膜电位调节。因此以TMEM16A离子通道作为靶点的药物适用于多种疾病的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中通过膜片钳记录到的不同浓度的人参皂苷Rf对TMEM16A通道电流的激活效果；

图2为本发明实施例1中通过膜片钳记录到的不同浓度的人参皂苷Rg2对TMEM16A通道电流的激活效果；

图3为本发明实施例2中人参皂苷Rf促进豚鼠回肠收缩效果；

图4为本发明实施例3中人参皂苷Rg2促进豚鼠回肠收缩效果；

图5为本发明实施例4小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞数量；

图6为本发明实施例4小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性因子的含量；

图7为本发明实施例5中人参皂苷Rf对小鼠唾液分泌量的影响；

图8为本发明实施例5中人参皂苷Rg2对小鼠唾液分泌量的影响。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

人参味甘、微苦，性微温，归脾、肺、心、肾经。具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智的功能，用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，气血亏虚，惊悸失眠等症状。

人参皂苷、糖类、氨基酸、蛋白质、挥发油和脂肪酸等是人参的主要活性物质，其中，人参皂苷约占人参干重的4％左右，是人参的主要活性成分。人参皂苷是由人参皂苷元与糖通过-O-相连的糖苷类化合物，性状多为白色粉末或针状晶体，吸湿性强。人参皂苷主要分为达玛烷型四环三萜皂苷，奥克梯隆型皂苷，齐墩果酸型五环三萜皂苷以及其他类型的人参皂苷。

人参皂苷Rf为达玛烷型四环三萜皂苷中原人参三醇型人参皂苷，具有如结构式(Ⅰ)所示结构：

人参皂苷Rg2的性状呈白色结晶粉末，易溶于水、乙醇、甲醇，不溶于苯、乙醚，熔点约为186℃，人参皂苷Rg2包括烷基侧链、类醇骨架和含糖单元三部分，具有如结构式(Ⅱ)所示结构：

需要说明的是，本发明所述的人参皂苷Rf为具有如上述结构式(Ⅰ)所示结构的化合物，人参皂苷Rg2为具有如上述结构式(Ⅱ)所示结构的化合物；本发明不限制上述两种人参皂苷的来源，例如可以为但不限于为通过化学合成得到的人参皂苷；通过从天然物质，例如可以为但不限于为从人参属中的人参、西洋参和三七中提取得到的人参皂苷；还可以为通过微生物代谢得到的人参皂苷，所述微生物可以为经过诱变或者基因工程改造的微生物。

将人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2应用于制备激活TMEM16A离子通道的产品，具有多种用途，例如可以为但不限于为将上述两种人参皂苷作为实验试剂，应用于以TMEM16A离子通道为靶点的体外的细胞实验或体内的动物实验，以满足实验室对TMEM16A离子通道、CaCCs离子通道以及其他离子通道的机制研究，以进一步揭示离子通道对生物的机体和病理的影响；将上述两种人参皂苷应用于激活TMEM16A离子通道，还可以作为潜在的药物活性成分，所述药物可以为以TMEM16A离子通道为靶点的药物的活性成分，以治疗由于TMEM16A离子通道异常，例如TMEM16A缺陷或者被抑制造成的疾病。

本发明还提供了一种TMEM16A离子通道的激活剂，该激活剂以人参皂苷Rf和/或人参皂苷Rg2作为激活TMEM16A离子通道的活性成分，可以有效激活TMEM16A离子通道。该激活剂可将人参皂苷Rf或人参皂苷Rg2独立的作为激活剂的活性成分，也可以将两种人参皂苷混合使用。

在一些可选的实施方式中，该激活剂用于体外激活细胞的TMEM16A离子通道，可作为一种用于细胞实验的实验试剂，其中，人参皂苷Rf的有效浓度为10-500μmol/L，例如可以为但不限于为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、150μmol/L、175μmol/L、200μmol/L、225μmol/L、250μmol/L、275μmol/L、300μmol/L、325μmol/L、350μmol/L、375μmol/L、400μmol/L、425μmol/L、450μmol/L、475μmol/L或500μmol/L；优选为100-500μmol/L；更优选为200-500μmol/L；

人参皂苷Rg2的有效浓度为20-200μmol/L，例如可以为但不限于为20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、150μmol/L、175μmol/L或200μmol/L；优选为50-150μmol/L；更优选为100-150μmol/L。通过调整和优化人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2的浓度可以进一步优化两种人参皂苷对TMEM16A离子通道的激活效果。

本发明还提供了一种包含上述激活剂的试剂盒，该试剂盒可应用于关于离子通道机制研究的体外细胞实验或体内的动物实验。可选地，该试剂盒还可以包含常规的分子生物学试剂和实验耗材。

在一些优选的实施方式中，该试剂盒用于细胞的膜片钳实验，除去作为活性成分的人参皂苷Rf和/或人参皂苷Rg2，所述试剂盒还可以包括细胞浴液和电极内液。其中细胞浴液优选为由下列组分组成：145mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、2mmol/L mol/LgCl₂、2mmol/LCaCl₂和10mmol/L HEPES；电极内液优选为由下列组分组成：130mmol/L KCl、2mmol/L mol/LgCl₂、10mmol/L EGTA和10mmol/L HEPES。

本发明还提供了一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，该药物以人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐为活性物质；和/或以人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐为活性物质。

在一些可选的实施方式中，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物治疗的疾病包括肺囊性纤维化、急性肺损伤、胃肠动力学障碍和干燥综合症中的一种或者多种。

肺囊性纤维化(CysticFibrosis，CF)是囊性纤维化跨膜电导调节体(cysticfibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)发生基因突变所致，CFTR功能缺陷导致了肺部的改变，Cl^-分泌减少和Na⁺流入增加，水吸收增加，卤化物和碳酸氢盐的分泌受损严重，这些会导致严重的后果。首先，减少电解质和水的分泌会导致呼吸道表面脱水，从而导致粘膜纤毛间隙受损；其次，碳酸氢盐分泌减少会使顶端细胞表面液体酸化，从而导致抗菌机制的缺陷；第三，碳酸氢盐分泌减少损害了杯状细胞和粘膜下腺中粘蛋白的释放和扩增。最终结果是CF患者的被致密的粘液阻塞并为慢性感染和炎症提供有利环境，这将导致不可逆性的结构性肺损伤和肺功能下降。TMEM16A激活剂可以激活TMEM16A通道，刺激阴离子转运，从而改善呼吸道杯状细胞的粘蛋白的释放和粘膜纤毛清除功能。因此，TMEM16A可以作为肺囊性纤维化的重要治疗靶点，TMEM16A的激活可以补偿CF患者中CFTR基因受损引起的功能失调。

急性肺损伤是指由心源性以外的各种非内外因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其病理生理特点之一为急性肺水肿，是由各种病因导致肺内炎症反应，液体渗出积蓄于肺间质和肺泡内，形成肺水肿。在肺泡上皮细胞存在着许多种离子通道，可以帮助肺泡内外液体的转运，肺泡上皮细胞钠、氯离子的异常转运在肺水肿的形成过程中起着重要作用。氯离子通道与急性肺损伤相关的主要作用有调节细胞容积和跨上皮细胞的离子和液体运输。

胃肠动力学障碍：胃肠动力学障碍属于常见疾病，其表现形式多样，例如可以为但不限于为胃肠功能减弱、胃肠功能亢进和胃肠功能紊乱。胃肠运动的调节主要受肠神经系统和体液因素的影响。TMEM16A基因表达于小肠间质细胞中，能够控制平滑肌的收缩节律。人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2可以激活TMEM16A离子通道蛋白活性，进而影响胃肠平滑肌的收缩张力，从而可以用于胃肠动力疾病的治疗。

干燥综合征是一种慢性自身免疫性炎症疾病，主要累及外分泌腺，导致机能受损。干燥综合征的典型表现是眼干(包括干眼症，干燥性角结膜炎)及口干(口干症)。

在一些优选的实施方式中，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物用于治疗肺囊性纤维化，所述药物还包人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐、白藜芦醇或其药学上可接受的盐和银杏内酯B或其药学上可接受的盐中的至少一种。

人参皂苷Rb1存在于五加科植物人参的根、茎和叶中，西洋参的根、茎和叶中，三七的根和叶中，化学名称为(3β,12β)-20-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧]-12-羟基达玛脂-24-烯-3-yl2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-葡萄糖基苷；白藜芦醇，化学名称为3,4',5-三羟基二苯乙烯，广泛存在于多种植物体内，是植物体在紫外线照射下、外来病菌入侵等不利条件下产生的一种植物抗毒素；银杏内酯B为从银杏中提取的萜类化合物，含有3个内酯环，一个螺[4,4]壬环，属于二萜类，化学名称为1-羟基-(1β)-银杏内酯A。

在一些优选的实施方式中，按重量份数计，用于治疗肺囊性纤维化的药物包括人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐50～150份，或，所述药物包括人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐50～150份，人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2的重量份数分别独立的例如可以为但不限于为50份、55份、60份、65份、70份、75份、80份、85份、90份、95份、100份、105份、110份、115份、120份、125份、130份、135份、140份、145份或150份。

所述药物还包括：人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐10～20份，例如可以为但不限于为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份；白藜芦醇或其药学上可接受的盐1～5份，例如可以为但不限于为1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份或5份；和银杏内酯B或其药学上可接受的盐10～20份，例如可以为但不限于为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份。

通过优化各活性组分的配比，可以提高各组分之间的协同增效作用，以进一步优化对肺囊性纤维化的治疗效果。

在一些优选的实施方式中，按重量份数计，用于治疗肺囊性纤维化的药物包括如下组分：人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐100～150份、人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐12～18份、白藜芦醇或其药学上可接受的盐1.5～4.5份和银杏内酯B或其药学上可接受的盐12～18份。更优选地，按重量份数计，用于治疗肺囊性纤维化的药物包括如下组分：人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐120～140份；人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐15～16份；白藜芦醇或其药学上可接受的盐2～3份；和，银杏内酯B或其药学上可接受的盐13～15份。

在另一些优选的实施方式中，按重量份数计，用于治疗肺囊性纤维化的药物包括如下组分：人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐50～100份、人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐12～18份、白藜芦醇或其药学上可接受的盐1.5～4.5份和银杏内酯B或其药学上可接受的盐12～18份。更优选地，按重量份数计，用于治疗肺囊性纤维化的药物包括如下组分：人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐65～85份、人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐15～16份、白藜芦醇或其药学上可接受的盐2～3份和银杏内酯B或其药学上可接受的盐13～15份。

上述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，包括用于治疗人的与TMEM16A离子通道相关的疾病，也可以包括用于治疗例如可以为但不限于为牛、马、羊、狗、猫、猪或鼠的与TMEM16A离子通道相关的疾病。

上述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物除去药物的活性成分，还可以包括药学领域可接受的辅料，例如可以为但不限于包括稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和香味剂中的一种或多种。上述药物的剂型例如可以为但不限于为注射剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊或口服液，本发明对此不做限制。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果：

实施例1

电生理实验鉴定出人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2对TMEM16A通道的激活作用：实施例利用膜片钳技术采用全细胞模式记录TMEM16A的电流。所用仪器为EPC 10放大器(HEKA，德国)以及PULSE软件(HEKA)数据记录。将稳转TMEM16A通道的CHO细胞铺于细胞爬片上，细胞浴液成分为145mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、2mmol/L mol/LgCl₂、2mmol/L CaCl₂、10mmol/LHEPES，以及不同浓度的人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2。

人参皂苷Rf浓度依次为10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、和500μmol/L；pH 7.4，使用NaOH调节；人参皂苷Rg2浓度依次为1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L；pH 7.4，使用NaOH调节。

渗透压控制在300-310mOsm/L，电极内液成分为130mmol/L KCl，2mmol/L mol/LgCl₂，10mmol/L EGTA，和10mmol/L HEPES(pH 7.4，使用NaOH调节)渗透压控制在290-300mOsm/L。

膜片钳的记录程序为先是将膜电压钳制在-80mV，接着给-60到+100不同的阶跃电压，最后膜电压为-80mV，结果如图1和图2所示。图1为不同浓度的人参皂苷Rf下TMEM16A的电流大小，图2为不同浓度的人参皂苷Rg2下TMEM16A的电流大小，可以看出随着人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2浓度的增大，TMEM16A的电流也逐步增加。

实施例2

取Hatley豚鼠一只，杀死后立即解破开腹腔，取出一段回肠10cm左右，置于氧饱和的台式液培养皿中。沿肠壁去除肠系膜，然后将回肠剪成长度为1-1.5cm的小段3-8段，用5mL注射器吸取台式液将肠内容物冲洗干净，换以新鲜的台式液备用。

取一上述备用的肠管段，置于盛有台式液的培养皿中，在其两端对角壁处，分别用缝针穿线，并打结。注意保持肠管通畅，勿使其封闭。肠管一端连线系于浴槽的固定钩上，然后放入37℃麦氏浴槽中。再将肠管的另一端系结在张力换能器的悬臂梁上，调节前负荷至1g。待离体回肠稳定30分钟后，记录一端正常收缩曲线后，依次向麦氏浴槽中滴加人参皂苷Rf溶液，观察并记录其收缩曲线，结果如图3所示：首先加入了乙酰胆碱引起回肠收缩，然后加入阿托品对收缩作用进行了抑制，从而验证了实验所用回肠组织具有良好的活性。随后加入了100μmol/L的人参皂苷Rf引起了回肠的收缩，把人参皂苷Rf增加到200μmol/L后收缩力更大，最后用TMEM16A抑制剂CaCCinh-A01对收缩的回肠进行了抑制。

实施例3

实验方法同实施例2，结果如图4所示：首先加入了乙酰胆碱引起回肠收缩，然后加入阿托品对收缩作用进行了抑制，从而验证了实验所用回肠组织具有良好的活性。随后加入了50μmol/L的人参皂苷Rg2引起了回肠的收缩，把人参皂苷Rg2增加到100μmol/L后收缩力更大，最后用TMEM16A抑制剂CaCCinh-A01对收缩的回肠进行了抑制。

实施例4

小鼠急性肺损伤模型建立：Balb/c小鼠，雄性，体重20±1g，随机分文7组，每组5只；LPS：浓度为0.001％的LPS的生理盐水；人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2的给药剂量为20mg/kg。腹腔注射给药，给药1h后，鼻腔滴注造模，鼻腔滴注12h后，处死小鼠收集小鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织，进行相应的指标检测，各组腹腔注射给药以及鼻腔滴注造模给予的药物如表1所示。实验结果如图5和图6所示。人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2抑制体内白细胞和炎性细胞因子增多，对小鼠急性肺损伤发挥保护作用。

表1各组腹腔注射给药以及鼻腔滴注造模给予的药物

试验组	腹腔注射	鼻腔滴注
			空白对照组	生理盐水	生理盐水
试验组1	生理盐水	LPS
			试验组2	人参皂苷Rf	生理盐水
试验组3	人参皂苷Rf	LPS
			试验组4	人参皂苷Rg2	生理盐水
试验组5	人参皂苷Rg2	LPS
			阳性对照	地塞米松	LPS

实施例5

BALB/c小鼠，普通级，体质量18～22g，随机分为7组，每组5只；空白对照组为生理盐水，实验1组～实验组3施用人参皂苷Rf，给药剂量依次为5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg；实验组4～实验组6施用人参皂苷Rg2，给药剂量依次为5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg。每日灌胃给药1次，共给药6周，从第三周开始每周测定小鼠唾液流量。测定前禁食1h，不禁水。测量采用干棉球法：将无菌脱脂棉放入实验小鼠口颊内，于3min后取出，称湿重。结果如图7和图8所示。从图7和图8可以看出，人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2可以促进小鼠唾液的分泌，并且随着给药量的增加，唾液分泌量也随之升高，说明人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2具有促进唾液分泌的功能，可用于制备治疗口干症的药物。

实施例6

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rf 75份、人参皂苷Rg2 75份、人参皂苷Rb1 15份、白藜芦醇2.5份和银杏内酯B 15份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例7

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rf 50份、人参皂苷Rb1 20份、白藜芦醇1份和银杏内酯B 20份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例8

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rf 150份、人参皂苷Rb1 10份、白藜芦醇5份和银杏内酯B 10份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例9

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rf 100份、人参皂苷Rb1 18份、白藜芦醇2和银杏内酯B 18份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例10

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rf 120份、人参皂苷Rb1 15份、白藜芦醇3和银杏内酯B 14份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例11

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rg2 50份、人参皂苷Rb1 20份、白藜芦醇1份和银杏内酯B 20份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例12

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rg2 150份、人参皂苷Rb1 10份、白藜芦醇5份和银杏内酯B 10份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例13

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rg2 100份、人参皂苷Rb1 12份、白藜芦醇4.5份和银杏内酯B 12份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

实施例14

本实施例提供了一种用于治疗肺囊性纤维化的药物，按重量份数计包含如下活性成分：人参皂苷Rg2 75份、人参皂苷Rb1 15份、白藜芦醇2份和银杏内酯B 15份；和辅料：微晶纤维素80份、交联聚维酮9份和硬脂酸镁份；活性成分和辅料按照1:9混合，混合均匀后直接压片工艺压制而成。

效果例

分别将上述实施例6～14提供的片剂粉碎成浓度为0.3mg/mL的悬浊液。本实验采用CFTR敲除昆明小鼠制造囊性纤维化小鼠模型(CFTR^-/-)，采用胸腔液体转运研究方法确定。

实验分组分为WT对照组，WT注射iso组，肺囊性纤维化模型组(CFTR^-/-)和实验组；WT对照组注射0.25mL等渗液；WT注射iso组注射含有0.1mM异丙肾上腺素的等渗液0.25mL；肺囊性纤维化(CFTR^-/-)模型组注射0.1mM异丙肾上腺素的等渗液0.25mL；实验组注射分别注射含有实施例6～实施例14的药物0.3mg/mL和0.1mM异丙肾上腺素的等渗液0.25mL。

实验方法：小鼠吸入乙醚麻醉后，用注射器将0.25ml等渗液体注入右侧胸膜腔，穿刺点为第五肋间与腋前线交界处，穿刺时针尖斜面与肺表面平行，以免刺破肺脏。分别观察60min后处死动物，快速剪开胸腔收集胸腔内液体，尽量收集胸膜腔中的液体测量体积。

胸腔液体吸收率(％)＝(Vi-Vt)/Vi×100％(其中Vi：注射前等渗液体体积；Vt：注射后60min收集标本的体积。采用异丙肾上腺素(iso)促进小鼠胸腔液体分泌。)结果如表2所示：

表2小鼠胸膜腔中的液体的吸收率

由上述可以看出，注射异丙肾上腺素能够促进小鼠胸膜腔中的液体的吸收，但是将CFTR敲除后异丙肾上腺素不能促进小鼠对等渗液的吸收，人参皂苷Rf和/或人参皂苷Rg2与人参皂苷Rb1、白藜芦醇和银杏内酯B配合使用可以促进小鼠胸膜腔中的液体的吸收，能够促进TMRM16A的激活以弥补CFTR功能的缺失，从而促进胸膜腔中的液体的吸收；进一步的从各实施例的对比也可以看出，优化药物中各组分的配比能够提高小鼠胸膜腔中的液体的吸收率，提高药物的治疗效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.人参皂苷在制备通过激活TMEM16A离子通道用于治疗疾病的产品中的应用，所述人参皂苷由人参皂苷Rf和人参皂苷Rg2组成；

所述疾病包括肺囊性纤维化、急性肺损伤和干燥综合症中的一种或者多种。

2.一种通过激活TMEM16A离子通道用于治疗疾病的药物，其特征在于，所述药物由人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐和/或人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐，以及人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐、白藜芦醇或其药学上可接受的盐和银杏内酯B或其药学上可接受的盐组成；

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，按重量份数计，所述药物由人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐50~150份或人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐50~150份，以及人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐10~20份、白藜芦醇或其药学上可接受的盐1~5份和银杏内酯B或其药学上可接受的盐10~20份组成。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，按重量份数计，所述药物由人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐100~150份或人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐50~100份，以及人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐12~18份、白藜芦醇或其药学上可接受的盐1.5~4.5份和银杏内酯B或其药学上可接受的盐12~18份组成。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，按重量份数计，所述药物由人参皂苷Rf或其药学上可接受的盐120~140份或人参皂苷Rg2或其药学上可接受的盐65~85份，以及人参皂苷Rb1或其药学上可接受的盐15~16份、白藜芦醇或其药学上可接受的盐2~3份和银杏内酯B或其药学上可接受的盐13~15份组成。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的药物，其特征在于，所述药物还包括任意的药学领域可接受的辅料；

所述辅料包括稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和香味剂中的一种或多种。

7.根据权利要求2-5中任一项所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊或口服液。