CN111450237A

CN111450237A - 一种用于骨质疏松治疗药物开发的新靶点

Info

Publication number: CN111450237A
Application number: CN202010189052.3A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: 63919 Troops of PLA
Current assignee: 63919 Troops of PLA
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明发现了TMEM16A通道蛋白在骨质疏松疾病中的调节作用，为骨质疏松的诊断与治疗寻找新的靶点与方法，具体涉及TMEM16A通道蛋白在骨质疏松治疗中的应用，尤其是TMEM16A通道蛋白，在制备预防或治疗骨质疏松症的试剂或药物中的应用。

Description

一种用于骨质疏松治疗药物开发的新靶点

技术领域

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及TMEM16A通道蛋白在预防或治疗骨质疏松症中的应用。

背景技术

骨丢失是由成骨细胞、破骨细胞和骨细胞介导的骨代谢失衡引起的。骨骼作为人体的钙库在体内钙平衡调控中发挥至关重要的作用，机体及细胞钙代谢在骨丢失过程中扮演重要角色。

钙作为重要的第二信使，进入胞内后可以发挥多种不同功能，包括激活胞内第二信使系统，启动基因转录，促进胞内钙库钙释放以及调节钙依赖性离子通道的开放和关闭。胞内钙离子与胞质内的钙调蛋白依赖性激酶(CaMKs)以及钙调磷酸酶结合来激活下游信号通路从而最终作用于关键转录因子，包括CREB和 NFAT等。在成骨细胞分化过程中NFATc1与成骨细胞关键转录因子Osterix相互结合增强其对成骨细胞功能基因Colla1的转录活性，促进成骨细胞功能。破骨细胞在分化过程中会出现胞内钙振荡，这是破骨细胞分化过程中关键信号通路 Calcineurin/NFATc1信号活化所必须的。除此之外，胞内钙信号还可以通过对其他信号通路的调控，包括Wnt，Hedgehog，PKA，PKC等途径进行传递从而影响骨发育。由此可见，胞内钙信号传递对成骨细胞和破骨细胞功能调控是极为重要的。

在胞内钙信号传递的多种方式中，激活钙依赖性离子通道的开放可能是胞内钙浓度变化最迅速直接的反应，引发瞬时或长时程的生理变化。钙依赖性离子通道主要包括钙激活钙离子通道，钙激活钾离子通道以及钙激活氯离子通道等，其中钙激活钾离子通道作为最早发现的钙依赖性离子通道，直接参与细胞分泌及神经电信号调控，而钙激活钙离子通道则作为细胞钙库操纵性钙内流的主要手段。

氯离子作为机体内最主要的阴离子在细胞膜内外电化学平衡维持中发挥非常重要的作用。近年来大量研究证实氯离子通道异常会引起多种疾病的发生，如囊性纤维化，先天性肌强直症，癫痫症，Bartter综合征等。目前研究发现三类氯离子通道与骨代谢密切相关，包括CLC(chloride channels)，CLIC(Chloride Intracellular Channels)和CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 氯离子通道。CLC是一类电压门控的氯离子通道，为氯离子沿化学梯度的跨膜移动提供途径，这些氯离子通道基因的突变，会引起骨表型的变化，如Clcn5基因敲除小鼠表现出个体较小，脊柱后侧凸等骨发育异常；Clcn7基因的缺失则会导致骨硬化症。CLIC主要存在于细胞器上，该家族中只有CLIC5参与骨代谢的调控，CLIC5基因突变的小鼠骨骼发育异常。CFTR定位于上皮细胞顶膜，是跨上皮盐分的运输、液体流动和离子浓缩的枢纽，Cftr基因敲除的小鼠表现出骨发育及代谢异常，如骨长度减小，松质骨体积减少等。以上研究表明，氯离子通道对骨发育及骨重塑过程具有非常重要的调控作用。

钙激活的氯离子通道(CaCCs)是一类受胞内钙调控的氯离子通道，1982年发现于爪蟾的卵母细胞中，细胞内钙离子浓度的升高引起CaCCs的开放，使细胞膜发生去极化，进而抑制多精受精，证实了受钙调控的氯离子通道的存在。 CaCCs广泛分布于机体各个组织中，参与了众多的生理过程，包括上皮细胞分泌、嗅觉转导、平滑肌收缩以及心肌和神经系统兴奋。有关CaCCs分子基础的问题一度未能解决，直到2008年，三个研究小组分别报道了TMEM16A是CaCCs的分子基础。由于TMEM16A开放依赖于胞内钙离子的浓度变化，因此明确钙离子通过直接结合还是中间信号通路传导的方式激活TMEM16A通道开放就显得尤为重要。2017年出版的两篇Nature文章中同时报道了TMEM16A蛋白的晶体结构，发现TMEM16A上的氨基酸E650，E698，E701，E730和D734聚集在一起形成2个Ca2+结合位点，证实钙离子可以通过直接结合激活TMEM16A离子通道活性，解析了钙对氯离子通道激活的作用机制。

通过对TMEM16A的通道活性和作用机制的研究，以寻找骨丢失的新靶点，为治疗骨质疏松提供新选择，势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TMEM16A通道蛋白在预防或治疗骨质疏松症中的应用。

本发明所述应用是指TMEM16A通道蛋白，在制备预防或治疗骨质疏松症的试剂或药物中的应用。

上述试剂或药物是指其成分包含TMEM16A通道蛋白的试剂或药物。

本发明是通过如下实验方式获得的：

1、TMEM16A的变化对小鼠破骨细胞分化的影响实验，证实转染TMEM16A siRNA后，破骨细胞的分化受到抑制，TRAP阳性的多核破骨细胞数量减少，证明TMEM16A是破骨细胞分化所必需的。

2、TMEM16A的变化对小鼠骨表型的影响实验，证实破骨细胞特异的TMEM16A基因敲除会抑制破骨细胞活性，导致骨量增加；破骨细胞特异的 TMEM16A转基因促进破骨细胞活性，导致骨量减少。

3、TMEM16A通过影响钙信号调控破骨细胞的功能试验，证实TMEM16A 基因敲除通过抑制钙信号，进而抑制破骨细胞的分化和功能。

4、TMEM16A在尾吊小鼠模拟失重，导致的骨丢失中的作用试验，证实尾吊小鼠骨组织中TMEM16A表达降低，尾吊小鼠骨的BMD、BV/TV、Tb.Th、 Tb.N参数的数值比非尾吊小鼠低。

TMEM16A基因敲除缓解了尾吊导致的这些指标的降低，说明TMEM16A基因敲除对尾吊导致的骨丢失具有保护作用。

5、骨质疏松病人骨组织中TMEM16A的表达水平与破骨细胞功能基因表达水平的相关性试验，证实TMEM16A的表达水平在骨质疏松骨组织样本中明显高于正常骨密度的骨组织，TMEM16A的表达与骨组织破骨细胞功能基因的表达呈正相关。

本发明通过动物实验和对临床中骨质疏松患者骨组织样本的分析，得出如下结论：

1、TMEM16A影响破骨细胞的分化，降低TMEM16A的表达抑制破骨细胞的分化；

2、破骨细胞特异的TMEM16A基因敲除小鼠骨量增加，破骨细胞特异的 TMEM16A转基因小鼠骨量降低；

3、TMEM16A基因敲除能够对抗尾吊模拟失重导致的骨丢失；

4、TMEM16A通过影响胞内钙信号调控破骨细胞的分化和功能；

5、骨质疏松病人骨组织TMEM16A表达水平与破骨细胞功能基因表达水平呈现正相关。

本发明发现了TMEM16A通道蛋白在骨质疏松疾病中的调节作用，为骨质疏松的预防或治疗提供了新的方法，为相关疾病的临床诊断和治疗奠定基础。本发明对于骨质疏松的预防或治疗具有重要意义。

附图说明

图1 TMEM16A对破骨细胞分化和功能的影响

图2破骨细胞特异的TMEM16A基因敲除小鼠骨表型的变化

图3破骨细胞特异的TMEM16A转基因小鼠骨表型的变化

图4 TMEM16A基因敲除对小鼠破骨细胞分化和功能的影响

图5 TMEM16A基因敲除对小鼠破骨细胞钙信号的影响

图6尾吊模拟失重28天对骨组织中TMEM16A表达的影响

图7 WT和cKO小鼠尾吊模拟失重28天后骨表型的变化

图8骨质疏松病人和非骨质疏松人骨组织中TMEM16A的表达变化

图9骨质疏松病人骨组织TMEM16A表达水平与破骨细胞功能基因表达水平的相关性分析图

图10为实验例一和实验例四的PCR反应程序图

具体实施方式

以下的实验例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实验例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实验例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实验例一、Tmem16a的变化对小鼠破骨细胞分化的影响

1、从小鼠的骨髓中分离骨髓单核细胞进行破骨向诱导分化

C57BL/6小鼠(又称野生型小鼠或WT小鼠，用WT表示)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级。

6-8周龄雄性C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡灭菌；取双侧股骨、胫骨，用无菌注射器吸取无菌PBS冲洗骨髓腔数次，收集液体于15ml离心管中，1000r/min离心5分钟；弃上清液，加入5ml红细胞裂解液，裂解5分钟；离心，弃上清液，用5ml含有10％胎牛血清和双抗的α-MEM培养基(完全培养基)+10ng/ml M-CSF重悬，接种于10cm培养皿中，置入5％CO₂，37℃细胞培养箱培养24小时；收集上清液离心，弃上清液，用含有30ng/ml M-CSF+50ng/ml RANKL的完全培养基重悬，细胞计数后以1*10⁵/孔的密度接种于24孔板中，每隔两天换一次含有30ng/ml M-CSF+50ng/ml RANKL的完全培养基，5天后即为诱导成熟的破骨细胞。

2、Tmem16a siRNA转染破骨细胞

Tmem16a siRNA

正义链5′-GAGUCUUAGAGAAGUCACU-3’

反义链5′-AGUGACUUCUCUAAGACUC-3’

Tmem16a negative control简写为NC

正义链5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3’

反义链5′-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG-3’

将骨髓单核细胞接种于24孔板的同时进行siRNA的转染，转染处理分为两组，分别为转染Tmem16a NC组和转染Tmem16a siRNA组，转染剂量为1*10⁵个细胞转染20pmol。

3、检测指标

细胞RNA的提取

收集诱导分化5天的破骨细胞，加入Trizol，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min，4℃，12000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。注：尽量不要吸取中间界面。加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置5-10min。4℃，12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃，7500g离心5min，尽量弃上清。室温晾干或真空干燥10-15min。加入30-50μl ddH₂O，测O.D.值定量RNA浓度。

RNA的反转录反应

使用Takara公司RT kit

具体方法如下：

反转录反应如下：

混匀，37℃反应15min；85℃，5s，放置冰上；将得到的10μl反转录反应后的cDNA稀释20倍，到200μl，-20度保存以备下一步实时定量PCR检测。

实时定量PCR检测细胞中RNA的表达

使用Takara公司SYBR进行实时定量PCR检测。

具体步骤如下：

构建PCR反应体系如下：

混匀

反应程序见附图10。

检测破骨细胞分化基因的引物序列如下：

Acp5-F	5’-GCGACCATTGTTAGCCACATACG-3’
		Acp5-R	5’-CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT-3’
Gapdh-F	5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’
		Gapdh-R	5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’
MMP9-F	5’-GCTGACTACGATAAGGACGGCA-3’
		MMP9-R	5’-GCGGCCCTCAAAGATGAACGG-3’
NFATc1-F	5’-ACG CTA CAG CTG TTC ATT GG-3’
		NFATc1-R	5’-CTT TGG TGT TGG ACA GGA TG-3’
Ctsk-F	5’-CAGCAGAGGTGTGTACTATG-3
		Ctsk-R	5’-GCGTTGTTCTTATTCCGAGC-3’
Ano1-F	5’-ATTTCACCAATCTTGTCTCCATCA-3’
		Ano1-R	5’-TGATAACTCCGAGGACGATTGCA-3’

(TMEM16A的基因名称为Ano1)

实验结果详见图1a和图1b。

图1a，说明TMEM16A的mRNA水平的表达降低；

图1b，说明破骨细胞的分化和功能基因(Nfatc1，Acp5，Ctsk，Mmp9)的表达受到抑制。

破骨细胞TRAP染色

TRAP染色按Sigma TRAP染色试剂盒说明进行。

去离子水37℃预热备用，细胞用PBS冲洗，将25ml柠檬酸盐溶液，65ml 丙酮和8ml37％甲醛配制成细胞固定液，室温固定细胞30秒，去离子水冲洗3 次；将六偶氮副品红液0.5ml和亚硝酸盐溶液0.5ml混匀30秒，静置2分钟；取100ml烧杯，加入下列溶液：37℃预热的去离子水45ml、预先配置好的六偶氮副品红液和亚硝酸盐溶液混合液1ml、萘酚AS-BI磷酸盐0.5ml、醋酸缓冲液 2ml、酒石酸盐溶液1ml配成染色孵育液，水浴加热至37℃，将染色孵育液孵育细胞，37℃，0.5小时，去离子水冲洗，镜下观察，光镜下观察含有3个细胞核以上的染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞，结果见图1c，说明TRAP阳性的多核破骨细胞数量减少，说明TMEM16A是破骨细胞分化必不可少的。

实验例二、TMEM16A的变化对小鼠骨表型的影响

1、破骨细胞特异的TMEM16A基因敲除小鼠的获得

将带有两个Floxp位点的Flxop小鼠(TMEM16A^f1/f1)与破骨细胞特异表达 Ctsk的Cre小鼠(Ctsk Cre)交配，获得Ctsk Cre，TMEM16A^f1/-的小鼠，再将获得的小鼠与TMEM16A^f1 ^/f1交配，获得Ctsk Cre，TMEM16A^f1/f1(标记为cKO)的小鼠，同窝的TMEM16A^f1/f1小鼠(标记为WT)作为对照。

2、破骨细胞特异的TMEM16A基因敲除小鼠的基因型鉴定

分别将上述步骤得到的每只小鼠进行如下实验步骤：

2.1提取小鼠鼠尾的基因组DNA；

2.2以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用TMEM16A的鉴定引物和Ctsk Cre的鉴定进行PCR扩增。如果采用TMEM16A的鉴定引物得到了约 271bp和183bp的靶序列，待测小鼠的基因型为TMEM16A^f1/-；如果只得到了约 271bp的靶序列，待测小鼠的基因型为TMEM16A^f1/f1；如果采用Ctsk Cre的鉴定引物得到了约210bp的靶序列，待测小鼠中含有Cre基因，小鼠的基因型为Ctsk Cre，TMEM16A^f1/-或Ctsk Cre，TMEM16A^f1/f1，如果没有条带，小鼠的基因型为 TMEM16A^f1/-或TMEM16A^f1/f1。

TMEM16A primer F：5’-CTGATAGCAAATGAGGCAGA-3’

TMEM16A primer R：5’-GCCATTCTCTTCCAAGACTT-3’

Ctsk Cre primer F：5’-CGATGCAACGAGTGATGAGG-3’

Ctsk Cre primer R：5’-CGCATAACCAGTGAAACAGC-3’

PCR反应体系(20μl)：两条引物(10μM)各0.8μl，2×Taq Mix 10μl，基因组DNA 1μl，加ddH2O补足到20μl。

PCR反应程序：94℃ 3min；94℃ 1min；62℃ 30s；72℃ 1min，循环35 次；72℃7min。

选取基因型为TMEM16A^f1/f1(用WT表示)，Ctsk Cre，TMEM16A^f1/f1(用cKO 表示)的小鼠进行骨表型检测。

3、破骨细胞特异的TMEM16A转基因小鼠的获得

构建带有TRAP启动子和TMEM16A的质粒，利用纤维显微注射的方法将表达在体注射到小鼠受精卵中，所生后代为转基因小鼠，转基因小鼠与野生小鼠交配，后代获得同窝的野生型小鼠和转基因小鼠。

4、破骨细胞特异的TMEM16A转基因小鼠的基因型鉴定

按照上述步骤2对小鼠进行基因型鉴定，所用到的引物序列为：Primer F： 5’-CTTCCGTTTGCCATCC-3’，Primer R：5’-AACTTCCCAATGTAGC-3’。如果得到了约450bp的靶序列，待测小鼠的基因型为转基因小鼠(用TG表示)，如果没有条带，待测小鼠的基因型为野生型(用WT表示)。

5、μCT分析小鼠骨密度

颈椎脱臼法处死小鼠，将后肢小心剪下(胫骨、股骨保留完整)；小心将肌肉剔除，将完整骨组织置于无水乙醇中固定；用SCANCO MEDICAL μCT40扫描整个股骨；选取股骨远端生长板向下0.50mm-1.10mm位置，调整合适灰度分析值(识别松质骨与骨髓)，选取80个连续的层面进行分析；三维重建，分析骨密度(BMD)、骨组织中骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁的厚度(Tb.Th)、骨小梁的数量(Tb.N)、骨小梁间隙(Tb.SP)等参数。

结果如图2、图3所示；

图2a为WT和cKO小鼠股骨远端三维重建图，如图所示，小鼠的股骨骨密度增加，骨小梁数量增多

图2b为对WT和cKO小鼠股骨远端三维重建结果的分析图表，经过分析发现 cKO小鼠的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N的数值都比WT小鼠的高，而Tb.SP、 SMI都比WT小鼠的低。

图3a为WT和TG小鼠股骨远端三维重建图，如图所示，小鼠的股骨骨密度降低，骨小梁数量减少；

图3b为对WT和TG小鼠股骨远端三维重建图的分析图表，经过分析发现，TG 小鼠的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N的数值都比WT小鼠的低，而Tb.SP、SMI 都比WT小鼠的高，说明破骨细胞特异的TMEM16A基因敲除抑制破骨细胞活性，导致骨量增加，破骨细胞特异的TMEM16A转基因促进破骨细胞活性，导致骨量降低。

实验例三、TMEM16A通过影响钙信号调控破骨细胞的功能

1、TMEM16A基因敲除对小鼠破骨细胞分化和功能的影响

6-8周龄雄性的WT和cKO小鼠分离骨髓单核细胞，进行破骨向诱导分化， 5d后进行检测，破骨细胞RNA的提取、检测以及TRAP染色同实验例一。

破骨细胞的噬骨实验：购自Corning的噬骨培养板，接种骨髓单核细胞，加入RNAKL和M-CSF进行破骨向诱导分化，7天后用PBS对噬骨培养板进行清洗2-3次，加入10％的漂白剂溶液，在室温下孵育5分钟，该孔用蒸馏水洗涤两次并使其在室温下干燥3至5小时。在100X显微镜下观察噬骨陷窝。

结果如图4所示。

图4a为cKO小鼠和WT小鼠的破骨细胞基因功能表达图，如图所示cKO 小鼠的破骨细胞功能基因(Nfatc1，Acp5，Ctsk，Mmp9)的表达水平较WT的降低；

图4b为TRAP染色和噬骨实验的结果图，如图所示cKO小鼠来源的破骨细胞分化能力和噬骨功能都较WT小鼠的减弱。说明，TMEM16A基因敲除后，抑制破骨细胞的分化和功能。

2、TMEM16A对破骨细胞中钙信号的影响

破骨细胞内钙离子浓度的检测：6-8周龄雄性的WT和cKO小鼠分离骨髓单核细胞，进行破骨向诱导分化，2d后孵育Fluo-4 AM染液，检测细胞中钙离子浓度的变化，结果如图5a所示。

图5a为WT和cKO小鼠破骨细胞中钙离子浓度的图，结果表明TMEM16A 基因敲除导致破骨细胞中钙离子浓度降低。

破骨细胞内钙下游信号通路的检测：

破骨细胞蛋白的提取与检测，将诱导分化5天的WT和cKO小鼠的破骨细胞用吸液管吸出培养液，加入冷的PBS充分洗涤细胞表面2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。细胞裂解缓冲液(RIPA裂解液，含PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)裂解细胞，每孔加100μl细胞裂解缓冲液，冰上震荡10min，用细胞刮将细胞刮至孔一侧，将细胞碎片吸入1.5 ml离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3s，重复3-4次。4℃，12000g离心10min，留取上清，测定蛋白浓度，加入 5 xbuffer 100℃加热10min。检测破骨细胞中钙下游信号通路p-CaMKIV(IV型钙调蛋白激酶)，p-CREB(环磷腺苷效应元件结合蛋白)，Nfatc1(活化T-细胞核因子1)的变化，(以CaMKIV作为p-CaMKIV的参照，CREB作为p-CREB的参照，Gapdh作为总蛋白的内参)。结果如图5b所示。

图5b表明，基因敲除的cKO小鼠的破骨细胞中p-CaMKIV，p-CREB，和 Nfatc1明显弱于WT小鼠，即TMEM16A基因敲除抑制破骨细胞内的钙信号，说明TMEM16A通过影响细胞内的钙信号来调控破骨细胞的分化和功能。

实验例四、TMEM16A在尾吊模拟失重，导致的骨丢失中的作用

1、小鼠尾吊模拟失重实验

取3月龄的WT和cKO小鼠，小心固定于脱脂棉手套内，将尾巴露出；将一条长约6cm的膏药，粘贴于小鼠尾巴对侧皮肤上，并用医用胶布固定；用不锈钢串珠链穿过胶布，穿过吊梁小孔，在吊梁上方用夹子夹住固定；调整链子的长度，使小鼠后肢伸直时刚好不能触及笼子底端，头低位，使身体与水平面成-30 度左右的角度；尾吊28d后，处死小鼠，进行检测。

2、骨组织RNA的提取和检测

尾吊28天的WT和cKO小鼠(标记为HS-WT和HS-cKO)麻醉，处死，取胫骨和股骨，骨组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变碎，再加少量液氮，再研磨，如此反复直至研磨成粉末，按20-50mg组织/ml Trizol 加入Trizol，电动匀浆器充分匀浆。4℃，12000g离心10min，吸上清液到新的 EP管中。按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃ 12000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。加入等体积异丙醇混匀，室温放置5-10min。4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1 ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃，7000g离心5min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥10-15min。加入30-50μl ddH₂O，测O.D.值定量RNA 浓度。

RNA的反转录反应

使用Takara公司RT kit

具体方法如下：

反转录反应如下：

实时定量PCR检测组织中TMEM16A(Ano1)的表达

使用美国Takara公司SYBR进行实时定量PCR检测。

具体步骤如下：

构建PCR反应体系如下：

混匀

PCR反应程序见附图10。

3、骨组织蛋白的提取和检测

尾吊28天的WT和cKO小鼠(标记为HS-WT和HS-cKO)麻醉，处死，取胫骨和股骨，骨组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变碎，再加少量液氮，再研磨，如此反复直至研磨成粉末，按照1mg/8μl加入裂解缓冲液(RIPA裂解液，含PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)，4℃旋转裂解20-30min，4℃，12000g离心10min，吸取上清液测定蛋白浓度，加入5 x buffer，100℃加热10min，-20℃保存。

Wesrern Blot检测骨组织中TMEM16A的表达。

结果如图6、图7所示

图6a为骨组织中TMEM16A(Ano1)mRNA表达图，发现小鼠尾吊后骨组织中TMEM16A(Ano1)的表达降低，基因敲除后TMEM16A的mRNA水平降低；图6b为骨组织中TMEM16A蛋白水平图，发现小鼠尾吊后骨组织中 TMEM16A的蛋白水平降低，基因敲除后TMEM16A的蛋白水平降低。

图7a为骨组织三维重建结果图，结果表明转基因小鼠的骨密度降低，骨小梁的数量减少；图7b对三维重建结果分析图，分析发现尾吊小鼠骨的BMD、 BV/TV、Tb.Th、Tb.N参数的数值比非尾吊小鼠低，TMEM16A基因敲除缓解了尾吊导致的这些指标的降低，说明TMEM16A基因敲除对尾吊导致的骨丢失具有保护作用。(其中Ctrl代表非尾吊小鼠)。

实验例五、骨质疏松病人骨组织中TMEM16A的表达水平与破骨细胞功能基因表达水平的相关性

1、临床骨质疏松病人的收集标准

所有骨组织样本来自骨折病人置换的髋关节

女性骨质疏松病人：绝经5年以上(建议大于60岁)；无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。

对照组筛选标准：

无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。

2、临床检测指标：

骨密度的检测：双能X线骨密度仪测定腰椎骨密度和髋关节骨密度；

生化指标的检测：测定血清中CTX-1(骨吸收)和PINP(骨形成)作为比对和初步分类标准。

3、骨组织中TMEM16A以及破骨细胞功能基因的检测

人骨组织样本的RNA和蛋白提取、检测以及结果分析如实验例3。

人相关基因的引物序列：

结果如图8所示，

图8a为骨组织TMEM16A(ANO1)mRNA表达图，表明TMEM16A(ANO1) 在骨质疏松骨组织样本中的表达水平明显高于非骨质疏松的骨组织；

图8b为TMEM16A蛋白水平图，表明骨质疏松骨组织样本中TMEM16A 的蛋白水平升高。

为了确定TMEM16A的表达变化与破骨细胞的关系，本申请分析了骨质疏松和非骨质疏松骨组织样本中TMEM16A的表达和破骨细胞功能基因表达的相关性，结果如图9显示。

图9为骨质疏松病人骨组织TMEM16A表达水平与破骨细胞功能基因表达水平的相关性分析图，经过对图9的分析得出，骨质疏松骨组织样本中 TMEM16A的表达升高则破骨细胞功能基因表达随之升高，说明TMEM16A的表达与骨组织破骨细胞功能基因的表达呈正相关。

Claims

1.一种TMEM16A通道蛋白在预防或治疗骨质疏松症中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是指TMEM16A通道蛋白，在制备预防或治疗骨质疏松症的试剂或药物中的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物中含有TMEM16A通道蛋白。