CN111632062B

CN111632062B - 长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用

Info

Publication number: CN111632062B
Application number: CN202010414478.4A
Authority: CN
Inventors: 王晓刚; 金富军; 刘美静; 孙瑶
Original assignee: Beihang University
Current assignee: BEIJING ZEQIN BIOMEDICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2040-05-15
Also published as: CN111632062A

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种长链非编码RNA Fmnl1‑AS在制备抑制骨吸收药物中的应用。本发明所述长链非编码RNAFmnl1‑AS具有如SEQ ID NO.1所示的人源核苷酸序列，或如SEQ ID NO.2所示的鼠源核苷酸序列。本发明首次通过试验证明了长链非编码RNA Fmnl1‑AS通过抑制其反义链编码基因Fmnl1的表达进而抑制破骨细胞分化；具备在体内防治骨质疏松的作用，为骨吸收异常激活相关疾病如骨质疏松症的防治提供了新的研究方向。

Description

长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用。

背景技术

骨的新陈代谢由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收两个过程构成，骨形成过程和骨吸收过程相互协调，共同维持骨的正常新陈代谢。但随着年龄的增长或由于疾病因素的诱导，会导致骨形成和骨吸收的动态平衡被打破。如随着年龄的增加骨吸收活性逐渐要强于骨形成活性，进而导致骨量逐渐的减少，当骨量减少到一定程度后即发展为骨质疏松，导致骨脆性增加，骨强度降低，骨折风险增加。尤其是在女性绝经后，由于体内雌激素水平的变化，导致骨吸收被显著激活，出现骨量的快速丢失现象。此外骨关节炎，类风湿性关节炎等骨疾病均有骨吸收的异常激活。大量文献报道包括乳腺癌，前列腺癌在内的多种肿瘤在骨转移灶的部位均出现了骨吸收的激活现象。此外多种药物如糖皮质激素也会引起骨吸收的显著激活，导致骨丢失。因而骨吸收的异常激活与多种疾病的发生发展均有直接的关系，抑制骨吸收是治疗骨吸收激活相关疾病的有效策略。目前临床常用的抑制骨吸收的药物如双膦酸盐类，迪诺塞麦等对骨质疏松显示出了较好的疗效，但现有抑制骨吸收的药物所存在的安全隐患和疗效有限的问题仍不容忽略。如双膦酸盐类药物会诱导下颌骨坏死、非典型股骨骨折、胃肠道不良反应、诱导发热、肌肉关节疼痛、肾脏毒性等副作用。而最新批准上市的靶向RANKL的单抗药物迪诺塞麦也存在增加下颌骨坏死的副作用。

破骨细胞作为直接参与骨吸收过程的细胞，已有研究显示破骨细胞的数量和活性在骨质疏松，骨关节炎等多种疾病过程中均显著增强。因此，进一步深入探究破骨细胞分化和活性调控的分子生物学机制，寻找抑制骨吸收激活的靶点并筛选更加安全有效的治疗药物，具有重要的研究价值及临床转化前景。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度在200个碱基以上，一般不具备蛋白质编码功能的RNA分子。人体细胞内的RNA分子，只有2％左右能够翻译成蛋白质，而高达98％的RNA属于非编码RNA，其中lncRNA占到所有非编码RNA的70％以上。现有研究显示，lncRNA能够在基因转录，蛋白翻译及翻译后修饰，表观遗传学等多个层面参与个体的发育、维持生命体的正常生理活动、同时参与到众多疾病的发生发展，如肿瘤、糖尿病、病毒感染等。近年的研究显示，lncRNA在骨骼的生长发育及骨稳态调控中发挥重要功能，部分lncRNA甚至可以作为骨相关疾病的生物学标志。LncRNA在破骨细胞分化和活性调控中的作用也有少量报道，如LINC00311被报道可抑制破骨细胞分化，LncRNA-Jak3和AK077216可促进破骨细胞分化。但目前没有研究报道将lncRNA用于抑制骨吸收药物的开发及在体内评价lncRNA对骨吸收的抑制作用。目前，尚未见关于长链非编码RNA Fmnl1-AS和骨吸收或破骨细胞相关的文献报道，更未见Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物方面的任何报道。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用。这是首次经试验证明Fmnl1-AS具备在体内对抗骨质疏松的潜力，为骨吸收异常激活相关疾病如骨质疏松症的防治提供了新的研究方向。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用，所述长链非编码RNA Fmnl1-AS具有如SEQ ID NO.1所示的人源核苷酸序列，或如SEQ ID NO.2所示的鼠源核苷酸序列。

TAGCTGTTTTTCCAGTTCTGCAATCTTGGCCATGGATTCGTTCTCCGCGTCCCGAAGCCGCTCTGTCAGCTGTAGCACCAGCACATGTTCCTCCATGTGCTCCAGCACAGCGTTCTTGGTCTCTGTGTCCTCCAGCAGCGCCCCCACATCAAAAATATTGTCCAGGTACGCCTGGATCTGCACCTGCAGCTTGTCACTCTCGGTGAGCCGAAGCCTCTGTCCCCCAGATGGAAGGAGTGGGGTGAGGCCTGGTGTGTGTGTGGGGGGGAGTCTTTCCAAACCACCCCCCTGCCACCACTGCCATCCAGAGGAAGGGGCCTGAGCCCTAGCCTACTTTTTCTTTATTTTTTAATATATAATTCACAAATCATAAAATC(SEQ ID NO.1)；

GCAACCCCGCCCCAACCCTTTTCTGGGATGGACCGGGATGTCCAGCGGAGAAGACTCCTTGGGAAGCCTGACCTGTCGCACACCCCCATCGTGGCCCAGCCCACACCAAAGCTTACCCTCAGGGTCTCCAATTCCTTGCGAGCCTGGCTTAGCTGCTTCTCCAGTTCAGCGATCTTGGCCATGGAGTCGTTCTCTGTGTCCCGAAGCCGCTCTGTCAGCTGTGGTACCAGCACATGGCCCAGACCTCCAGCCTGAGCCAGCTCCCCCCTCTGTCCAGTATCTCTGAGTTCCCCATCACCGGCTGAGATCGGAGCATCCGACGGGACTGATGCTCCTGTGTCAAGACCCAGAACCACCTGAGCCTGTTCCAGGACTTCGGTGACAGATGTTATAGTATCCGTCATGTACCAGGGGCTCCTCTACACATCTGGAGTCATTGTCACCTCTGTGATTGAC(SEQ ID NO.2)；

优选地，扩增所述人源核苷酸序列的引物为Human Fmnl1-AS；扩增所述鼠源核苷酸序列的引物为Mouse Fmnl1-AS。

优选地，引物Human Fmnl1-AS的上游引物序列为Human Fmnl1-AS-F，序列信息如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列为Human Fmnl1-AS-R，序列信息如SEQ ID NO.4所示；引物Mouse Fmnl1-AS的上游引物序列为Mouse Fmnl1-AS-F，序列信息如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列为Mouse Fmnl1-AS-R，序列信息如SEQ ID NO.6所示。

GGGGATCCTAGCTGTTTTTCCAG(SEQ ID NO.3)；

CGGAATTCGATTTTATGATTTGTG(SEQ ID NO.4)；

GGGGATCCGCAACCCCGCCCCAACCC(SEQ ID NO.5)；

CGGAATTCGTCAATCACAGAGGTGACAATG(SEQ ID NO.6)；

优选地，所述Fmnl1-AS的作用形式可以包括Fmnl1-AS全长或部分核苷酸序列的质粒或转化体；所述转化体为腺病毒、腺相关病毒，慢病毒。

优选地，所述Fmnl1-AS的作用形式还可以包括体外转录所获得的Fmnl1-AS RNA分子或在Fmnl1-AS RNA分子基础上进行化学修饰改造后所得的RNA分子。

本发明还提供了一种pcDNA3.1-Fmnl1-AS载体，通过将所述的如SEQ ID NO.1所示的人源核苷酸序列，或如SEQ ID NO.2所示的鼠源核苷酸序列克隆至pcDNA3.1⁺真核细胞表达载体获得。

本发明还提供了一种抑制骨吸收的药物组合物，包括所述的pcDNA3.1-Fmnl1-AS载体及药学上可接受的辅料。

所述药物组合物的制备方法为：将1mg ASP8-PU核酸递送系统溶解到1ml生理盐水中，超声10min，随后同1mg质粒载体进行混合均匀，即得。

本发明在试验过程中，首先设计鼠源Fmnl1-AS特异性引物序列，构建老龄小鼠骨质疏松模型和卵巢切除骨质疏松小鼠模型，通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测Fmnl1-AS在骨组织中的表达量，证实Fmnl1-AS在小鼠骨质疏松骨组织样本中低表达，其中，Q-PCR检测时的特异性引物为Mouse Q-PCR，上游引物序列信息如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列信息如SEQ ID NO.8所示；设计人源Fmnl1-AS特异性引物序列，通过Q-PCR检测人源Fmnl1-AS在不同年龄骨组织的表达水平，证实Fmnl1-AS具有随年龄下降的趋势，其中，Q-PCR检测时的特异性引物为Human Q-PCR，上游引物序列信息如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列信息如SEQ ID NO.10所示。

GACTCCTTGGGAAGCCTGAC(SEQ ID NO.7)；

CTGGTACCACAGCTGACAGA(SEQ ID NO.8)；

GCTCTGTCAGCTGTAGCACCA(SEQ ID NO.9)；

TCCTTCCATCTGGGGGACAGAG(SEQ ID NO.10)；

进一步通过设计特异性基因扩增引物，PCR扩增人源和小鼠源Fmnl1-AS序列，并克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体，获得pcDNA3.1-Fmnl1-AS(人源)和pcDNA3.1-Fmnl1-AS(鼠源)质粒，用于后续细胞和动物模型实验。

然后提取小鼠骨髓巨噬细胞，构建体外破骨细胞分化模型，将pcDNA3.1-Fmnl1-AS(鼠源)质粒及对照pcDNA3.1(+)质粒转染至小鼠骨髓巨噬细胞中，或构建THP-1破骨细胞分化模型，将pcDNA3.1-Fmnl1-AS(人源)质粒及对照pcDNA3.1(+)质粒转染至人THP-1细胞中，通过Q-PCR检测破骨分化标志性基因，TRAP染色分析破骨细胞数量，发现Fmnl1-AS可显著抑制破骨细胞的分化；并通过详细的分子机制探究发现Fmnl1-AS通过抑制其反义链编码基因Fmnl1的表达进而抑制破骨细胞分化。

最后，构建小鼠卵巢切除骨质疏松模型，并利用核酸递送系统将pcDNA3.1-Fmnl1-AS质粒及对照pcDNA3.1(+)质粒递送到OVX小鼠体内后，通过microCT检测，发现递送Fmnl1-AS质粒的实验组OVX小鼠骨体积、骨小梁的数量，骨小梁厚度均比对照组OVX小鼠增加，Fmnl1-AS治疗效果和阳性对照药物唑来磷酸盐相当。说明Fmnl1-AS具备在体内对抗骨质疏松的潜力。

与现有技术相比，本发明提供的长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用具有如下优点：

(1)本发明通过体内外系列实验证实Fmnl1-AS可抑制破骨细胞分化，并揭示了其通过抑制Fmnl1的表达进而抑制破骨细胞分化的分子机制；

(2)本发明通过在骨质疏松小鼠模型的体内药效评价，证实Fmnl1-AS具备在体内防治骨质疏松的作用；

(3)本发明首次证明了Fmnl1-AS具备在体内对抗骨质疏松的潜力，为骨吸收异常激活相关疾病如骨质疏松症的防治提供了新的研究方向。

附图说明

图1为不同来源的Fmnl1-AS在骨质疏松模型中的表达水平；

图2为不同来源的Fmnl1-AS在骨髓破骨细胞分化过程中的表达水平；

图3为过表达不同来源的Fmnl1-AS在抑制骨髓破骨细胞分化标志基因的表达、降低破骨细胞数量中的作用结果；

图4为过表达不同来源的Fmnl1-AS对破骨细胞Fmnl1基因表达水平及Fmnl1蛋白表达水平的影响；

图5为Fmnl1-AS治疗后，对抗骨质疏松的潜力的结果图。

具体实施方式

以下通过公开一些实施例来进一步阐明本发明的疗效特点。所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但是，实施例的介绍不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。此外需要说明的是，本发明所述Fmnl1-AS可以为质粒或腺病毒、慢病毒、腺相关病毒等转化体或Fmnl1-AS转录获得的RNA分子，只要其包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列片段或序列相似度大于80％的核酸序列片段即在本发明保护范围内。

实施例1基因克隆构建Fmnl1-AS真核表达载体

以人或小鼠细胞的cDNA为模板，用SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.6所示的引物序列，PCR扩增人和小鼠Fmnl1-AS基因，并克隆至pcDNA3.1(+)载体的BamHI/EcoRI克隆位点。挑取细菌转化的克隆，进行测序鉴定。将测序鉴定正确的克隆保存菌种，并用无内毒素质粒提取试剂盒(天根生物，货号DP117)提取质粒用于后续实验。

实施例2构建小鼠卵巢切除模型

取同窝12周龄C57BL/6J雌性未孕小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠/水合氯醛深度麻醉小鼠，进行卵巢摘除。侧卧放置小鼠，并用75％酒精棉球消毒小鼠背侧、腹侧皮肤。在小鼠大腿根部稍上方水平，脊柱侧方不到1cm的地方，用眼科剪剪开一个与脊柱平行的约5mm长的皮肤切口，仔细剪开下方腰肌，仔细寻找包绕卵巢的脂肪组织，见到粉红色的卵巢后，在卵巢两侧结扎，摘除卵巢。假手术组为同上方法进行手术操作但不摘除小鼠卵巢的对照组。于术后3个月取模型组和假手术小鼠后肢骨和腰椎骨标本进行micro-CT扫描并分析骨参数。

实施例3人和小鼠骨组织样本的处理

不同年龄段人骨组织：经过医院伦理委员会的批准及取得病人的知情同意书，从医院收集不同年龄段(60-69岁，70-79岁，80-89岁)临床病人髋关节置换术中废弃的股骨头组织。取股骨头松质骨，并去除骨髓用于组织RNA的提取。人骨组织总RNA采用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)进行，将人骨组织用液氮研磨后，用试剂盒配套试剂进行组织裂解，并参考说明书进行RNA提取操作。

小鼠骨组织的处理：按照实施例2的操作方法，收集假手术组小鼠和卵巢切除小鼠骨组织。同时收集3月龄年轻小鼠骨组织，和18月龄年老小鼠骨组织。所取骨组织均为后肢股骨和胫骨，去除肌肉和骨髓，余下组织用于组织RNA的提取。小鼠人骨组织总RNA采用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)进行，将小鼠组织用液氮研磨后，用试剂盒配套试剂进行组织裂解，并参考说明书进行RNA提取操作。

实施例4破骨细胞分化诱导模型

人THP-1诱导模型：将人THP-1细胞(购买自中国科学院细胞库，货号SCSP-567)饲养于含10％FBS的1640培养液中用于破骨细胞分化诱导，将THP-1细胞以5×10⁵细胞/mL的密度铺板，并加入100ng/mL PMA刺激1天，随后更换为1640+10％FBS+50ng/mL M-CSF+100ng/mL RANKL的分化诱导培养基，隔天给细胞换液，分别于细胞培养7天、14天后，进行后续的分子检测和TRAP染色。

小鼠骨髓巨噬细胞诱导模型：取3月龄的C57BL/6J小鼠的骨髓用无血清α-MEM培养基冲出，用含10％FBS的α-MEM培养液重悬细胞，在5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养24小时。随后离心收集悬浮细胞，按照3×10⁶细胞/mL的细胞密度接种培养板，加入50ng/mL M-CSF诱导3天得到小鼠骨髓巨噬细胞，3天后加入50ng/mL M-CSF和100ng/mL RANKL诱导细胞，隔天给细胞换液，分别于细胞培养2天、4天后进行后续的分子检测和TRAP染色。

利用实施例2、实施例3及实施例4构建的模型进行试验，试验结果分别如图1、图2所示：图1中，A图为鼠源Fmnl1-AS在老龄小鼠骨质疏松模型中的表达水平，结果显示Fmnl1-AS在18月龄老龄小鼠骨组织表达显著下降；B图为鼠源Fmnl1-AS在卵巢切除骨质疏松小鼠模型中的表达水平，结果显示Fmnl1-AS在卵巢切除小鼠骨组织表达显著下降；C图为人源Fmnl1-AS在不同年龄段人骨组织表达水平，结果显示Fmnl1-AS有随年龄下降的趋势；图2中，A图为鼠源Fmnl1-AS在小鼠骨髓破骨细胞分化过程中的表达水平。B图为人源Fmnl1-AS在人THP-1破骨细胞分化过程中的表达水平。结果显示Fmnl1-AS在破骨细胞分化过程中显著下调。

实施例5细胞转染

利用Lipo2000转染Fmnl1-AS表达载体至小鼠骨髓巨噬细胞或THP-1细胞，转染按照说明书进行，取2000ng质粒加入含125μL opti-MEM培养基的EP管中吹打混匀，取5μLLipo2000转染试剂加入含125μL opti-MEM培养基的EP管中吹打混匀，将2个含有试剂的EP管室温静置5min，随后1：1混合2个EP管内的试剂，室温静置20min，此后将转染混合物加入至培养板内。转染2天后进行基因和蛋白表达水平的分析。

实施例6破骨细胞TRAP染色分析

按照TRAP染色试剂盒(Sigma-Aldrich，#387)说明书进行：

配置染色液：取1.5mL EP管，将试剂①Fast garnet GBC Base solution和②Sodium Nitrite Solution各50μL混匀静置2min；另取15mL离心管，加入试剂③NaphtholAS-BI phosphate solution 50μL，试剂④Acetate solution 200μL，试剂⑤Tartratesolution 100μL，加入4.5mL 37℃蒸馏水和配好的试剂①和②的混合液，混合均匀后37℃温浴备用。

细胞固定与染色：取分化成功后的细胞(96孔板为例)，吸弃培养基，加入50μL 4％多聚甲醛室温固定15min，弃掉多聚甲醛，50μL 37℃蒸馏水洗2次后，加入30μL染色剂37℃染色1h，50μL蒸馏水洗1次，加入20μL蒸馏水，显微镜下观察破骨细胞并计数。注意：加液过程中要缓慢加入，避免细胞脱落。

试验结果如图3所示，其中，A图显示过表达鼠源Fmnl1-AS抑制小鼠骨髓破骨细胞分化标志基因的表达；B图显示过表达鼠源Fmnl1-AS降低破骨细胞数量；C图显示过表达人源Fmnl1-AS抑制人THP-1破骨细胞分化标志基因的表达；D图显示过表达人源Fmnl1-AS抑制破骨细胞的生产数量。

实施例7总RNA提取

细胞总RNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司TRNzol Universal总RNA提取试剂(DP424)进行。6孔板每个孔加入1mL Trizol裂解细胞并用枪头反复吹打，室温作用5分钟。将裂解液移入1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，盖紧管盖，涡旋混匀室温静置3分钟，4℃，12000g/min离心15分钟。将上层水相液体转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，涡旋混匀室温静置10分钟，4℃，12000g/min离心10分钟。将上清用移液器吸取，丢弃，保留底部白色沉淀。加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，用手轻轻将白色沉淀弹起，然后在4℃条件下，7500g/min离心5分钟。弃上清，室温干燥15分钟，加入30-40μL DEPC水重新溶解，RNA置于-80℃冰箱中保存或直接使用。

实施例8总RNA的反转录实验

使用反转录试剂盒(TaKaRa，货号RR047A)，根据试剂盒的操作流程，将提取的1000ng总RNA反转录成cDNA。具体过程如下：

(1)RNA测定浓度后，按照10μL反转录体系加入500ng总RNA的量计算需要加入的RNA和DEPC水的体积；

(2)向PCR管中依次加入DEPC水，总RNA和5×PrimeScriptTM RT Master Mix(TaKaRa，货号RR047A)，并混合均匀；

(3)于PCR仪上按照37℃反应15min，85℃反应5s，4℃保存的程序进行反转录扩增；

(4)扩增后的cDNA用灭菌的三蒸水稀释30-50倍后用于荧光定量PCR扩增，或于-20℃长期保存。

实施例9荧光定量PCR扩增(Q-PCR)

参考试剂盒说明书(TaKaRa，货号RR820A)使用实时荧光定量PCR技术以GAPDH为内参基因进行Q-PCR实验检测基因的表达水平。具体过程如下：

(1)实验前准备好检测引物，灭菌三蒸水，96孔PCR板，荧光定量试剂；

(2)根据待检测基因的数目分配反应产物在96孔PCR板中的具体位置；

(3)按照每个待检测基因每个样品三个复孔的比例配制反应液：20μL反应体系中含cDNA模板2μL，

Premix Ex TaqTM II(TAKARA)试剂10μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，三蒸水6μL；

(4)将全部反应液加入相应孔后，用专用封口膜封闭96孔PCR板，并于2500rpm下离心3min；

(5)离心完成后，于BIO-RAD公司CFX96TouchTM荧光定量PCR检测系统上机检测，反应程序为：A、预变性95℃30sec；B、PCR反应：95℃5sec，60℃30sec，读板，循环40次；C、拟合曲线并读板；

(6)反应完成后，用系统自带分析软件进行数据分析，排除3个复孔中CT值差异大于0.5的数值，并根据内参基因计算各检测基因的相对表达水平。Q-PCR引物列表如下：

实施例10破骨细胞蛋白表达水平分析

用SDS裂解液提取细胞总蛋白，BCA比色法调节蛋白浓度达到一致。SDS-PAGE电泳对蛋白样品进行分离，转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，洗膜，孵一抗(Fmnl1Abcam公司货号ab97456，GAPDH CST公司货号2118)，4℃冰箱孵育过夜，洗膜，室温孵育荧光二抗1h，洗膜，采用ECL化学发光法显影得到目的条带，用Bandscan软件对条带进行灰度扫描，以GAPDH内参进行校正。

实施例9中基因表达水平及实施例10中蛋白表达水平分析结果如图4所示，A图显示过表达鼠源Fmnl1-AS对破骨细胞Fmnl1基因表达水平的影响；B图显示过表达鼠源Fmnl1-AS对破骨细胞Fmnl1蛋白表达水平的影响；C图显示过表达人源Fmnl1-AS对破骨细胞Fmnl1基因表达水平的影响；D图显示过表达人源Fmnl1-AS对破骨细胞Fmnl1蛋白表达水平的影响。

实施例11ASP8-PU核酸递送系统的构建

ASP8-PU核酸递送系统的合成方法按照申请人前期发表的论文进行(Cai M.,YangL.,Zhang S.,Liu J.,Sun Y.,Wang X.A bone-resorption surface-targetingnanoparticle to deliver anti-miR214for osteoporosis therapy.Internationaljournal of nanomedicine.2017；12:7469-7482.)。具体过程如下：将1mg D8-PEG-COOH溶于去离子水中，与1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-盐酸碳二亚胺和1mg N-羟基琥珀酰亚胺在4℃下反应10分钟。在D8多肽溶液中加入PU胶束，混合物在4℃条件下反应一夜，然后用PBS溶液透析(分子量截止3,500da)三次反应液，用500μL PBS(含10μL 0.5M EDTA溶液，pH7.4)一次，将获得的ASP8-PU冷冻干燥，保存在-20℃。

实施例12卵巢切除小鼠的药物治疗

将小鼠分为5组，每组4只小鼠，其中OVX模型组4组，Sham对照组1组。Sham组和OVX组每三天静脉注射200μL生理盐水，共给药30天。载体递送治疗组，将1mg ASP8-PU核酸递送系统溶解到1mL生理盐水中，超声10min，随后同1mg质粒载体进行混合均匀后备用。OVX空载体组，OVX-Fmnl1-AS组每三天静脉注射200μL包含载体的核酸递送系统，共给药30天。阳性对照药物唑来磷酸盐组OVX小鼠按照80μg/kg剂量腹腔注射一次药物。给药30天后，用4％多聚甲醛心脏灌流固定小鼠。取出小鼠的股骨、胫骨、椎骨。4％多聚甲醛固定1周，microCT(μCT 50,Scanco Medical)对骨样本进行扫描，并分析骨小梁的体积比、骨小梁的厚度，骨小梁的数量和骨小梁分离度，并进行统计学分析。

试验结果如图5所示，Fmnl1-AS治疗后microCT定量分析OVX小鼠股骨骨体积(A图)、骨小梁数量(B图)，骨小梁厚度(C图)和骨小梁分离度(D图)，结果显示Fmnl1-AS治疗效果与阳性对照药物唑来磷酸盐相当。由此说明Fmnl1-AS具有对抗骨质疏松的潜力。

最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 北京航空航天大学

<120> 长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备抑制骨吸收药物中的应用

<130> 2020.5.9

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 377

<212> DNA

<213> 人源Fmn1l核苷酸序列(Human Fmn1l nucleotide sequence)

<400> 1

tagctgtttt tccagttctg caatcttggc catggattcg ttctccgcgt cccgaagccg 60

ctctgtcagc tgtagcacca gcacatgttc ctccatgtgc tccagcacag cgttcttggt 120

ctctgtgtcc tccagcagcg cccccacatc aaaaatattg tccaggtacg cctggatctg 180

cacctgcagc ttgtcactct cggtgagccg aagcctctgt cccccagatg gaaggagtgg 240

ggtgaggcct ggtgtgtgtg tgggggggag tctttccaaa ccacccccct gccaccactg 300

ccatccagag gaaggggcct gagccctagc ctactttttc tttatttttt aatatataat 360

tcacaaatca taaaatc 377

<210> 2

<211> 456

<212> DNA

<213> 鼠源Fmnl1-AS核苷酸序列(Mouse-derived Fmn1l nucleotide sequence)

<400> 2

gcaaccccgc cccaaccctt ttctgggatg gaccgggatg tccagcggag aagactcctt 60

gggaagcctg acctgtcgca cacccccatc gtggcccagc ccacaccaaa gcttaccctc 120

agggtctcca attccttgcg agcctggctt agctgcttct ccagttcagc gatcttggcc 180

atggagtcgt tctctgtgtc ccgaagccgc tctgtcagct gtggtaccag cacatggccc 240

agacctccag cctgagccag ctcccccctc tgtccagtat ctctgagttc cccatcaccg 300

gctgagatcg gagcatccga cgggactgat gctcctgtgt caagacccag aaccacctga 360

gcctgttcca ggacttcggt gacagatgtt atagtatccg tcatgtacca ggggctcctc 420

tacacatctg gagtcattgt cacctctgtg attgac 456

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Human Fmnl1-AS-F

<400> 3

ggggatccta gctgtttttc cag 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Human Fmnl1-AS-R

<400> 4

cggaattcga ttttatgatt tgtg 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Mouse Fmnl1-AS-F

<400> 5

ggggatccgc aaccccgccc caaccc 26

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Mouse Fmnl1-AS-R

<400> 6

cggaattcgt caatcacaga ggtgacaatg 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Mouse Q-PCR-F

<400> 7

gactccttgg gaagcctgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Mouse Q-PCR-R

<400> 8

ctggtaccac agctgacaga 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Human Q-PCR-F

<400> 9

gctctgtcag ctgtagcacc a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Human Q-PCR-R

<400> 10

tccttccatc tgggggacag ag 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Fmnl1-F

<400> 11

aaggtggagg agcttgagga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Q-PCR-Mouse Fmnl1-R

<400> 12

tgctgtgcta ggggaatcag 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Ctsk-F

<400> 13

gaagaagact caccagaagc ag 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> qpcr-Mouse Ctsk-R

<400> 14

tccaggttat gggcagagat t 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Trap-F

<400> 15

acggctactt gcggtttca 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Trap-R

<400> 16

tccttgggag gctggtctt 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Nfatc1-F

<400> 17

acgctacagc tgttcattgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Nfatc1-R

<400> 18

ctttggtgtt ggacaggatg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Gapdh-F

<400> 19

tgtgtccgtc gtggatctga 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> QPCR-Mouse Gapdh-R

<400> 20

cctgcttcac caccttcttg a 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Human FMNL1-F

<400> 21

atgaagagaa ccgtggcctg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Human FMNL1-R

<400> 22

tcagcttgat ggtcaggtgg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Human CTSK-F

<400> 23

ccctgtctca ttcccgcagt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Human CTSK-R

<400> 24

agcccaacag gaaccacact 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> QPCR-Human TRAP-F

<400> 25

ccacgatcac aatctgcagt acct 24

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> QPCR-Human TRAP-R

<400> 26

gcagatagcc gttggggacc 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> QPCR-Human NFATC1-F

<400> 27

agaggtgcat gaggacggta gt 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> QPCR-Human NFATC1-R

<400> 28

cgtgctggag aggtcatttc gt 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> QPCR-Human GAPDH-F

<400> 29

agcctcaaga tcatcagcaa tg 22

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> QPCR-Human GAPDH-R

<400> 30

cacgatacca aagttgtcat ggat 24

Claims

1.一种长链非编码RNA Fmnl1-AS在制备治疗骨质疏松药物中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA Fmnl1-AS具有如SEQ ID NO.1所示的人源核苷酸序列，或如SEQ ID NO.2所示的鼠源核苷酸序列；所述长链非编码RNA Fmnl1-AS的作用形式可以包括长链非编码RNA Fmnl1-AS全长核苷酸序列的质粒或转化体；所述转化体为腺病毒、腺相关病毒，慢病毒；所述长链非编码RNA Fmnl1-AS的作用形式还可以包括体外转录所获得的长链非编码RNA Fmnl1-AS分子或在长链非编码RNA Fmnl1-AS分子基础上进行化学修饰改造后所得的RNA分子。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，扩增人源核苷酸序列的引物为Human Fmnl1-AS；扩增鼠源核苷酸序列的引物为Mouse Fmnl1-AS。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，引物Human Fmnl1-AS的上游引物序列为Human Fmnl1-AS-F，序列信息如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列为Human Fmnl1-AS-R，序列信息如SEQ ID NO.4所示；引物Mouse Fmnl1-AS的上游引物序列为Mouse Fmnl1-AS-F，序列信息如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列为Mouse Fmnl1-AS-R，序列信息如SEQ ID NO.6所示。

4.一种pcDNA3.1-Fmnl1-AS载体，其特征在于，通过将权利要求1所述的如SEQ ID NO.1所示的人源核苷酸序列，或如SEQ ID NO.2所示的鼠源核苷酸序列克隆至pcDNA3.1+真核细胞表达载体获得。

5.一种抑制骨吸收的药物组合物，其特征在于，包括权利要求4所述的 pcDNA3 .1-Fmnl1-AS载体及药学上可接受的辅料。