CN114159457B - 一种长链非编码rna、其结合蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA、其结合蛋白及应用，属于细胞生物学领域。具体公开了lncENAF及其结合蛋白hnRNPF在制备抑制细胞因子风暴的药物中的应用，以及在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，所述lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hnRNPF的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过基因工程构建能够稳定表达lncENAF和hnRNPF的枯否细胞株，通过外源脂多糖刺激所述枯否细胞株，结果显示该lncENAF和hnRNPF可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞IL‑6等细胞因子的产生，为开发细胞因子风暴和自身免疫性疾病的药物提供了新策略。

Description

一种长链非编码RNA、其结合蛋白及应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种长链非编码RNA、其结合蛋白及应用。

背景技术

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的长链非编码RNA分子，它可以从表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等不同层面进行基因调控。近些年，长链非编码RNA的调控作用正在被越来越多的人关注和研究。

目前已有大量文献报道异常表达的lncRNA可导致多种人类疾病的发生。哺乳动物基因组序列中4％～9％的序列产生的转录本是lncRNAs(相应的蛋白编码RNA的比例是1％)，虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，并且报道和多种人类疾病相关，但是绝大部分的lncRNAs的功能仍然是不清楚的。因此，发现新的IncRNAs，并且研究其作用机制对于研究其相关疾病或者开发新药物具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种长链非编码RNA、其结合蛋白及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该长链非编码RNA-lncENAF及其结合蛋白hnRNPF可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞IL-6等细胞因子的产生，为开发细胞因子风暴和一些相关自身免疫性疾病的药物提供了新策略。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种lncENAF及其结合蛋白hnRNPF在制备抑制细胞因子风暴的药物中的应用，所述lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hnRNPF的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

SEQ ID NO：1即：lncENAF全长序列(NONCODE GENE ID:NONMMUG027912.3)：

ATTGTACACCATGCAGACAAAGCGCTCAAACACTTGCAATGCTGGGCTTTCTCCCAATATCCTCTGCCATCTTTCCTACCCTTATAAAAGTCCAGAAAGAAAATAATCATTCTATCTGGAGGTGGGGGCCACTTCTTTAATCCTGGCACTTGGGAAGCAGAGGTAGGTGTATTGCTTTGAGTTCAAGACCAGACTGGTCTACAAAGTGAGTTCCGGGACAGTCAGGACTGTTGAACTTGGAAGCCTTGTCCTCAAATTTCTGGCAATTTTACTAGCACCAGTCTTCCCGCCTCAGCCTCCAGTGTCTTCCTGAGATGATCTGACTGCATGAAATGCCCTCGCCTCATTTTAGTTGGCTGGCCCTAAGGTCAAGGTAAATCCGCGCCCAAGCTGCCCGGTGGAGGTGGTCTCAGAGGGTGCTGCGGGATCGAGGTAGTGAGGAGACTAGATCGCAAGACGTGATCCTCACATTTATTTGCCTGGAGTTCTCATGCCAGAGAACCTGGCAGATTTTACTATTTCCCAATTGTTTACTCGCCAAGCTTTCAGGTCCACGCGCCTCAGGGCTGCGCCTCTCACTCTGAAACTTCATTCAAAGGCCAGGCAGGGAGGCCCAAGAGGTGGCGAATGGGCTTGAGTATGACCTCAAGGCC

SEQID NO：2即：hnRNPF氨基酸全长序列(NP_598595)

MMLGPEGGEG YVVKLRGLPW SCSIEDVQNF LSDCTIHDGV AGVHFIYTRE GRQSGEAFVELESEDDVKLA LKKDRESMGH RYIEVFKSHR TEMDWVLKHS GPNSADSAND GFVRLRGLPF GCTKEEIVQFFSGLEIVPNG ITLPVDPEGK ITGEAFVQFA SQELAEKALG KHKERIGHRY IEVFKSSQEE VRSYSDPPLKFMSVQRPGPY DRPGTARRYI GIVKQAGLDR MRSGAYSAGY GGYEEYSGLS DGYGFTTDLF GRDLSYCLSGMYDHRYGDSE FTVQSTTGHC VHMRGLPYKA TENDIYNFFS PLNPVRVHIE IGPDGRVTGE ADVEFATHEEAVAAMSKDRA NMQHRYIELF LNSTTGASNG AYSSQVMQGM GVSAAQATYS GLESQSVSGC YGAGYSGQNSMGGYD

本发明还提供一种lncENAF及其结合蛋白hnRNPF在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，所述lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hnRNPF的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

优选的是，所述lncENAF和所述hnRNPF通过抑制脂多糖诱导的巨噬细胞因子的产生，进而实现抑制细胞因子风暴和自身免疫性疾病。

优选的是，所述巨噬细胞因子包括IL-6。

优选的是，所述自身免疫性疾病包括脓毒血症、病毒性肺炎、类风湿性关节炎、脑炎、肺纤维化、脂肪肝炎和多发性硬化症等相关疾病。

本发明还提供一种巨噬细胞，所述巨噬细胞能够稳定表达lncENAF及其结合蛋白hnRNPF，所述lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hnRNPF的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

优选的是，所述巨噬细胞为枯否细胞株。

优选的是，包括以下步骤：

(1)获取lncENAF基因序列，并构建过表达所述lncENAF的慢病毒质粒；

(2)用HEK-293T细胞进行所述慢病毒质粒转染，获取病毒液；

(3)将病毒液与巨噬细胞枯否细胞株混合，筛选稳定表达lncENAF和hnRNPF的枯否细胞株pCDH-ENAF和pLVX-hnRNPF。

优选的是，获取lncENAF基因序列所用的引物为：

上游引物(SEQ ID NO：3)：5’-GGAAGCAGAGGTAGGTGTAT-3’；

下游引物(SEQ ID NO：4)：5’-GGCTTCCAAGTTCAACAGTC-3’。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用高脂饮食诱导的小鼠模型，鉴定出一条在肝脏中显著上调的长链非编码RNA，命名为lncENAF，进一步通过RNA pulldown实验和RNA结合蛋白免疫沉淀技术鉴定出lncENAF可以与核不均一核糖核蛋白F(hnRNPF)结合。然后利用基因工程构建了稳定表达lncENAF和hnRNPF细胞株，通过外源脂多糖刺激稳定表达lncENAF和hnRNPF细胞株，发现lncENAF及其结合蛋白hnRNPF可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞IL-6等细胞因子的产生，为开发细胞因子风暴和一些相关自身免疫性疾病的药物提供了新策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为lncENAF与hnRNPF的结合验证；A：RNA-蛋白下拉的银染图；B：Western blot验证结果；C：RIP实验后，qPCR检测hnRNPF蛋白对lncENAF的富集情况；D：qPCR产物电泳图；

图2为稳定表达lncENAF与hnRNPF的枯否细胞株的构建与鉴定；A：枯否细胞-GFP/lncENAF细胞株的荧光图；B：qPCR检测细胞株内lncENAF的Cq值；C：WB验证hnRNPF稳定表达株内6*histag标记的hnRNPF；

图3为稳定表达lncENAF可抑制LPS诱导的巨噬细胞细胞因子IL-6水平升高；利用100ng/μL的LPS作用枯否-lncENAF细胞4h，分别利用qPCR(A)、ELISA(B)、WB(C)分析IL-6的mRNA水平、分泌到胞外的IL-6以及胞内的IL-6蛋白水平的变化；

图4为稳定表达hnRNPF抑制LPS诱导的巨噬细胞细胞因子IL-6产生；利用100ng/用细的LPS作用枯否-hnRNPF细胞4h，分别利用qPCR(A)、ELISA(B)、WB(C)分析IL-6的mRNA水平、分泌到胞外的IL-6以及胞内的IL-6蛋白水平的变化；

图5为pCDH-lncENAF质粒图谱；

图6为pCDH-GFP-lncENAF质粒菌液PCR后电泳验证结果；

图7为lncEANF全长与重组质粒测序比对结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

在前期研究工作中，利用高脂饮食诱导的小鼠模型，鉴定出一条在肝脏中显著上调的长链非编码RNA(Chen Qian,Xiong Chaoliang,Jia Kunyun et al.Hepatictranscriptome analysis from HFD-fed mice defines a long noncoding RNAregulating cellular cholesterol levels.[J].J Lipid Res,2019,60:341-352.)，我们命名为lncENAF(NONCODE GENE ID：NONMMUG027912.3)，进一步通过RNA下拉(RNApulldown)实验和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP)技术鉴定出lncENAF可以与核不均一核糖核蛋白F(heterogeneous nuclearribonucleoproteins F，hnRNPF)结合。具体试验如下：

一、磁珠法分析RNA-蛋白下拉(RNA-protein pulldown)实验

实验步骤参考Thermo Scientific^TM试剂盒(No:20164)，具体步骤如下：

1、蛋白制备：

(1)准备10-12个10cm细胞培养皿的Hepa1-6细胞，200μL/皿的IP裂解液(含1％PMSF)冰上裂解细胞15min；

(2)14000g 4℃离心15min，将上清液集中于10kDa蛋白超滤管，4000g 4℃离心≥40min；

(3)待超滤管中的蛋白液体≤500μL时，停止离心，收集浓缩管中的蛋白至-30℃贮存；

2、磁珠预处理

(1)从4℃冰箱取出磁珠，低速涡旋混匀；

(2)取50μL磁珠悬液至新的去酶1.5mL EP管中；

(3)把EP管置于磁力架上(磁珠会被吸附至一侧)，吸去废液；

(4)加入100μL的0.1M NaOH、50mM NaCl混合液洗磁珠2次；

(5)再用100μL 100mM NaCl洗磁珠一次，磁珠待后续使用。

3、磁珠与标记的RNA结合(25-100pmol RNA对应20-50μL磁珠)

(1)取预处理好的磁珠50μL，置于磁力架上，吸去上清液；

(2)加入等体积(50μL)的20mM Tris(pH＝7.5)，吹打混匀，重复一次；

(3)将EP管置于磁力架上，磁珠吸附至一侧，吸去上清液；

(4)加入等体积(50μL)1×RNA Capture buffer，吹打重悬；

(5)加入20μL已生物素标记的RNA，轻轻吹打重悬，空白对照可加DEPC水；

(6)混匀后，室温孵育15～30min，每5min搅拌一次(也可旋转孵育15-30min)。

4、生物素标记RNA和蛋白反应及结合蛋白的洗脱

(1)将上一步的EP管置于磁力架上，去除上清液；

(2)加入等体积(50μL)20mM Tris(pH＝7.5)清洗，吹打重悬，放置于磁力架上，去除上清液，重复一次；

(3)稀释10×protein-RNA binding buffer至1×，如10μL 10×protein-RNAbinding buffer加到90μL ddH₂O中；

(4)加入100μL 1×protein-RNA binding buffer至磁珠中，混匀；

(5)制备如下反应液(Master Mix to RNA-protein binding buffer)：

表1反应液

(6)磁珠置于磁力架上，吸去上清液；

(7)加入100μL Master Mix to RNA-protein binding buffer，混匀；

(8)放置到四维旋转仪中，4℃旋转孵育60min；

(9)将EP管置于磁力架上，将上清液转至新的1.5mL EP管中，待后续分析(记为F1)；

(10)加入100μL的1×Washing buffer，用枪吹洗磁珠大约30次；

(11)重复步骤(9)和(10)一次(如需要，洗脱液转至1.5mL EP管中，待后续分析)；

(12)置于磁力架，将上清液转至1.5mL EP管中，待后续分析(记为F2)；

(13)加入50μL的Elution buffer到磁珠上，涡旋混匀，37℃孵育15-30min，每5min搅拌一次；

(14)磁珠置于磁力架上，磁珠吸附至一侧，转移上清液至1.5mL EP管中(标记为E)，待后续分析；

(15)将F1、F2和E测蛋白浓度，加入1/4体积5×loading buffer，100℃煮沸变性5min；

(16)-30℃保存备用，用于银染或考马斯亮蓝染色。

注：蛋白浓度很低，使用赛默飞的Qubit蛋白试剂盒检测，具体步骤见试剂说明书(Invitrogen,NO:2057447)。

5、银染

参考Thermo Scientific^TM试剂盒(No:24612)，具体步骤如下：

(1)预先配制好SDS-PAGE电泳胶(分离胶浓度为12％)，取大约40μL样品加至上样孔；

(2)电泳：70V 40min，110V 70min；

(3)切去浓缩胶部分，将分离胶用ddH₂O轻轻冲洗后转移至30％乙醇：50mL 10％乙酸溶液中封闭固定15min×2次，也可直接封闭过夜；

(4)将分离胶至10％乙醇(约100mL)中摇晃清洗5min×2次；

(5)弃去10％乙醇，加入ddH₂O(约100mL)摇晃清洗5min×2次；

(6)预配制Sensitizer Working Solution：取100μL Sensitizer加入50mL超纯水；

(7)转移分离胶至第6步配制好的Sensitizer Working Solution中，摇晃孵育1min，超纯水摇晃清洗分离胶1min×2次；

(8)预先配制Stain Working Solution：取1mL Enhancer加入50mL Stain；

(9)转移分离胶至第(8)步配制好的Stain Working Solution中，孵育30min；

(10)预先配制Developer Working Solution：取1mL Enhancer加入50mLDeveloper中；

(11)超纯水摇晃清洗分离胶20sec×2次；

(12)转移分离胶至第(10)步配制好的Developer Working Solution中，摇晃孵育至条带出现，一般为2-3min；

(13)条带出现后，立即将转移到5％冰乙酸溶液中进行终止显色，短暂清洗一遍后，更换5％冰乙酸溶液，摇晃孵育10min，进一步终止显色反应。进行凝胶成像(见图1A)，发现在50kDa左右，lncENAF组较Beads对照组多了一条明显的差异条带，后期将对这一差异蛋白分离后进行质谱鉴定。

6、切胶酶解蛋白

(1)用灭菌的刀片切下银染或考马斯亮蓝染色的目的蛋白置于干净的EP手套上，将蛋白条带切成1.5立方毫米左右的小块，转移到1.5mL EP管中；

(2)用500μL双蒸水洗10min×2次；

(3)考染脱色：50μL 150mM NH₄HCO₃/CH₃CN(1:1)，超声脱色5min或者37℃20min，弃去液体；若为银染胶点，可以不脱色，也可以加15mM K₃Fe(CN)₆/50mM Na₂S₂O₃轻摇至变为淡黄色透明，再用水反复洗至无色；

(4)重复步骤(3)，至蓝色褪去；

(5)加入50μL CH₃CN脱水至胶粒变白；

(6)加入20μL 10mM DTT(25mM NH₄HCO₃)，56℃水浴60min；

(7)冷却至室温，吸干，快速加入20μL 50mM IAA(25mA NH₄HCO₃)，置于暗室45min；

(8)依次用下列溶液进行超声或混悬清洗：25mM NH₄HCO₃(2次)，25mM NH₄HCO₃+50％CH₃CN(2次)，CH₃CN(1次)，每次10min，CH₃CN脱水至胶粒变白；

(9)将0.1μg/μL酶液用25mM NH₄HCO₃稀释10-20倍，每管加入2-3μL，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃冰箱放置30min，待酶液被胶粒完全吸收，加入25mM NH₄HCO₃，至总体积10-15μL，37℃水浴过夜；

(10)加入0.1％TFA或50％CH₃CN+0.1％TFA终止反应，振荡混匀，离心收集酶解液，酶解液可以-20℃保存，也可直接用于点靶。

注：每一次加溶液都要漩涡振荡，胶粒充分浸没在溶液中，进行下一步操作前把沉淀吸走。

7、质谱鉴定蛋白

(1)配制以下溶液：0.1％三氟乙酸(0.1％TFA)，30％乙腈(30％ACN)，TA30(3mL0.1％三氟乙酸和7mL 30％乙腈)，用TA30配制饱和HCCA溶液(向500μL TA30溶解中加入HCCA至出现黄色颗粒)；

(2)-20℃取出酶解产物至冰上融化，吸取1μL酶解产物或者多肽标准品和1μLTA30配制饱和HCCA溶液至200μL的干净EP管中；

(3)吹打混匀后，吸取1μL上述样品至Ground Steel靶板中；

(4)室温静置晾干，可以用洗耳球轻轻吹打晾干；

(5)将Ground Steel靶板正确的载入Bruker Autoflex Speed TOF/TOF质谱仪器中，运行仪器，鉴定与lncENAF相结合的蛋白。

8、Western Blot验证质谱结果

(1)凝胶配制：配制12％分离胶，充分混匀后加至厚薄板之间，上层用水压平，室温放置约30min后，弃去上层水，配制5％的浓缩胶，充分混匀后加入厚薄板之间，插入梳子，避免产生气泡，待浓缩胶凝固后可进行电泳；

(2)电泳：将配好的凝胶放置在电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，竖直将梳子拔出，每孔上样10μg蛋白样品，边缘两孔加入相应体积的蛋白Marker，浓缩胶70V电泳40min，分离胶110V电泳60min；

(3)转膜：剪取合适的PVDF膜，甲醇中活化90s后放入转膜缓冲液中平衡，待电泳结束后，根据蛋白Marker的位置切胶，按照黑色转膜夹在下，海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵的顺序放置凝胶，固定好转膜夹，放置在转膜槽中，接通转膜仪，恒流200mA电泳90min；

(4)封闭：转膜结束后，将PVDF膜放入5％脱脂牛奶中，室温摇床轻摇封闭2h；

(5)孵育一抗：待封闭结束后，弃去封闭液，用1×TBST清洗条带5min，共三次，根据蛋白Marker的位置将蛋白分子量在40-50之间的条带剪下，用滤纸吸干，放入相应稀释好的hnRNPF抗体中，4℃摇床孵育过夜；

(6)孵育二抗：取出孵育过夜的条带，用1×TBST清洗条带5min，共三次，将条带放入HRP-兔抗的二抗中，室温摇床轻摇孵育1h；

(7)显影：从二抗中取出条带，用1×TBST清洗条带5min，共三次，ECL显影液A液和B液按照1:1混合均匀，用滤纸将条带吸干，均匀加上现配的显影液，设置曝光时间，进行曝光分析以此验证质谱结果(结果见图1B所示)，发现与对照组相比，lncENAF组经hnRNPF抗体孵育后出现了一条明显的显影条带，证明了lncENAF与hnRNPF的结合。

9、RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RNAbinding protein immunoprecipitation，RIP)

RIP是运用抗体和蛋白相互作用，用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质内的相对应的蛋白，与这个蛋白相关作用的RNA也会被捕获下来。被捕获的RNA通过定量RT-qPCR方法来鉴定。RIP是目前验证蛋白和lncRNA结合的主要方法之一。

步骤参考EMD Millipore Corp，(NO:289118)，具体过程如下：

9.1收集和裂解细胞

(1)10cm的细胞培养皿中Hepa1-6细胞生长至80％以上后(大约共需要6皿细胞)，弃去培养基，用10mL PBS洗两次；

(2)弃去PBS，加入新的6mL PBS，用无菌的细胞刮刮下细胞，吹打成悬液；

(3)2000rpm 4℃离心5min，弃上清，用150μL完全RIP Lysis buffer裂解细胞，裂解液配方表如表2：

表2裂解液配方

(4)重悬细胞，冰上放置5min，200μL分装后-80℃保存。

9.2免疫共沉淀(IP)和沉淀RNA

(1)取出4℃放置的RIP Wash buffer，吹打混匀；

(2)EP管放置磁力架，吸去上清，重复步骤(1)；

(3)弃上清，加入100μL Wash buffer，5μg相应抗体混匀，实验组anti-hnRNPF、阳性对照组anti-SNRNP70和阴性对照组IgG(兔源)；

(4)放置到四维旋转仪中，室温孵育30min；

(5)点离，置于磁力架上，吸去上清，加入500μL RIP Wash buffer洗两次；

(6)弃上清，加入500μL RIP Wash buffer，混匀后冰上放置备用；

(7)配制IP buffer，组分如下表：

表3 IP buffer

(8)取出-80℃保存的RIP Lysis buffer裂解产物，迅速融化，14000rpm 4℃离心10min；

(9)EP管置于磁力架上，弃上清，加入900μL IP缓冲液和100μL细胞裂解上清液，涡旋混匀；

(10)放置到四维旋转仪上，4℃涡旋孵育过夜；

(11)吸取10μL细胞裂解上清，记为Input，-80℃保存备用；

(12)从4℃中取回EP管，置于磁力架上，弃上清；

(13)加入500μL RIP Wash buffer，洗6次；

(14)置于磁力架上，弃上清，加入500μL RIP Wash buffer，涡旋混匀，冰上放置；

(15)配制蛋白酶K酶解缓冲液，组分如下：

表4蛋白酶K酶解缓冲液

(16)置于磁力架上，弃上清，加入150μL蛋白酶K酶解缓冲液，吹打混匀；

(17)取出-80℃中保存的Input，加入117μL Wash buffer、15μL 10％SDS和18μLProteinase K，吹打混匀；

(18)55℃震荡(250rpm)孵育30min，每5min涡旋一次；

(19)点离，置于磁力架上，吸上清至新EP管中；

(20)加入250μL RIP Wash buffer，混匀；

(21)加入400μL苯酚：氯仿：异戊醇(125:24:1)混合液，涡旋15sec；

(22)14000rpm 4℃离心10min，吸取400μL上层水相至新EP管中；

(23)加入450μL氯仿，涡旋15s，14000rpm 4℃离心10min；

(24)吸上层水相350μL至新EP管中，加入50μL solutionI、15μL solutionII、5μLEnhancer和850μL无水乙醇混匀，-80℃沉淀过夜。

9.3提取RNA和qPCR

(1)从-80℃冰箱取出沉淀过夜的RNA，冰上放置，待融化；

(2)14000rpm 4℃离心30min，小心弃去上清；

(3)加入80％乙醇(DEPC水配制)清洗沉淀，14000rpm 4℃离心15min，小心弃去上清，42℃烘干沉淀，约3分钟；

(4)加入10μL DEPC水溶解RNA；

(5)逆转录和qPCR步骤参考南京诺唯赞试剂盒(NO:R223-01)如下：

Ⅰ、逆转录

①去除基因组DNA

表5去除基因组DNA的试剂

用移液枪轻轻吹打混匀后，将EP管放入PCR仪器中，设置程序运行42℃，2min。

②配制逆转录反应体系

表6逆转录反应体系

用移液枪轻轻吹打混匀混合液，再将EP管短暂离心，2000rpm，离心10sec，放置PCR仪器进行下一步。

③逆转录反应

表7逆转录反应条件

PCR程序结束后，cDNA样本放置在-20℃冰箱保存。

Ⅱ、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

参考南京诺唯赞试剂盒(NO：Q311-02)步骤如下：

表8引物序列

①配制反应体系

表9反应体系

在八联管中做好标记，按顺序加入上述混合液20μL/孔。将八联管放入离心机配平后，短暂离心收集反应液。

②PCR反应(在CFX96 Real-Time PCR System仪器操作)

表10 PCR反应程序

反应后基因的相对表达水平按照2^-△△Ct(^△Ct值＝Ct_目的-Ct_内参，^△△Ct值＝^△Ct_实验组－^△Ct_对照组)进行计算，求得基因的相对表达水平，以Actin基因作为对照基因，以检测hnRNPF蛋白对lncENAF的富集情况(结果见图1C所示)，qPCR结果表明，与IgG阴性对照组相比，hnRNPF对lncENAF的富集量是对照组的21倍，RIP实验进一步验证了hnRNPF蛋白与lncENAF的结合。

9.4qPCR产物的琼脂糖电泳

(1)配制1％的琼脂糖凝胶：琼脂糖粉末0.25g，1×TAE 25mL。倒入锥形瓶内，放至微波炉中加热煮沸。待锥形瓶外侧降温至60℃后，加入1.75μL的GoldViewⅠ型核酸染料。充分混匀后，将液体倾斜倒至干净的胶槽中，并插上梳子。室温放置30min至凝胶完全凝固。

(2)上样。拔去梳子，将琼脂糖凝胶浸泡在1×TAE缓冲液中。取1μL的6×Loadingbuffer与5μL qPCR产物吹打混匀加在胶孔中。

(3)电泳。设置110V，25min。

(4)曝光(结果见图1D所示)qPCR产物电泳图表明hnRNPF结合的lncENAF显著高于IgG阴性对照组，其中Input为阳性对照组。

二、质粒提取和慢病毒包装质粒

课题组保存有pMD-T18-lncENAF质粒和菌株，前期通过设计同源臂引物(酶切位点为：XbaⅠ和SalⅠ)，将lncENAF(lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)连接到pCDH-GFP质粒构成pCDH-GFP-lncENAF质粒(质粒图谱见图5，pCDH-GFP-lncENAF的核苷酸序列如SEQID NO：5所示)，同源臂引物见附图(见表11)，具体构建步骤如下：

表11同源臂引物序列

(1)PCR扩增lncEANF：使用PCR进行lncEANF的扩增，扩增模板为pMD-T18-lncENAF，扩增体系如下：

表12扩增体系

(2)称取0.5g琼脂糖粉至干净的锥形瓶，加入50mL TAE缓冲液，微波炉加热融化摇匀，流水冲洗锥形瓶降温至大约40℃后，加入0.5μL的Gold ViewⅠ型核酸染料，混匀后倒入胶槽，插入梳子，室温放置30min，待琼脂糖胶凝固后，拔去梳子，将胶转移到含适量1×TAE的电泳槽；

(3)PCR结束后，每个PCR反应体系中加入1μL 10×Loading Buffer，加样枪混匀后加入到凝胶中的加样孔中，120V电泳25min；

(4)电泳完成后把凝胶放置在凝胶成像系统，在紫外光照射下切下目标条带，称取重量(0.2g)后放至到无菌1.5ml EP管中；

(5)加入200μL Binding Buffer，50℃水浴融化凝胶，每2min震荡一次；

(6)将上述液体转移到HiBindMini Column收集柱，20000g室温离心1min，弃废液；

(7)加入300μL Binding Buffer，20000g室温离心1min，弃废液；

(8)加入700μL Washing Buffer，20000g室温离心1min，弃废液，重复此步骤一次；

(9)20000g室温离心1min，把HiBindMini Column收集柱转移至一个干净1.5mL EP管，开盖室温静置2min；

(10)加入30μL ddH₂0，室温静置2min，然后20000g室温离心1min，EP管中收集到的即为lncENAF，采用DeNovix DS-11+Spectrophotometer检测lncENAF浓度和纯度，记录后进行后续操作；

(11)pCDH-GFP质粒双酶切回收，双酶切体系如下：

表13双酶切体系

混匀后37℃反应2h；

(12)反应结束后进行电泳以及切胶回收，步骤同上；

(13)配制如下无缝克隆体系(使用和元无缝克隆试剂盒)：

表14无缝克隆体系

混匀后37℃反应30min；

(14)-80℃取出DH-5α感受态，冰上融化后取50μL至干净1.5mL EP管，加入10μL无缝克隆体系，冰上放置30min，然后立刻42℃水浴45s，再放回冰上，静置3min，加入940μL LB培养基，37℃震荡培养2h；

(15)培养结束后，3000g室温离心5min，弃去900μL上清液，用加样枪混匀剩余100μL，加到Amp抗性平板中央，用无菌涂布棒均匀涂抹菌液，37℃培养过夜；

(16)培养过夜后，使用接种环挑取单个菌落至400μL含Amp抗性的LB细菌培养基中，37℃震荡培养2h；

(17)培养2h后，取1μL菌液作为模板进行菌液PCR鉴定pCDH-GFP-lncENAF质粒是否成功构建，体系如下：

表15 PCR鉴定体系

混匀后放入PCR仪反应；

(18)PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，步骤同上，电泳结束后进行曝光鉴定，电泳结果显示第7管和第11管菌液PCR产物片段大小在600bp-800bp，且条带清晰透亮(见图6)，随后挑取第7管菌液送至上海桑尼公司进行Sanger测序，测序比对结果显示lncEANF全长与重组质粒100％配对(见图7)，表明pCDH-GFP-lncENAF质粒被成功构建(质粒图谱见图5)。

慢病毒包装质粒分别为psPAX、pMD2.G，质粒提取参考OMEGA内毒素去除质粒提取试剂盒(D6948-01)，步骤如下：

(1)打开紫外超净台紫外灯，照射30min；

(2)取50mL EP管，倒入30mL LB培养基，添加30μL氨苄青霉素(Amp+)(1:1000稀释)，最后加入50μL菌液，37℃，250rpm培养16h；

(3)取出菌液，10000g离心1min，弃去上清；

(4)加入600μL的SolutionⅠ，吹悬细菌沉淀后转移至2mL EP管，涡旋仪剧烈震荡1min；

(5)加入600μL的SolutionⅡ，轻柔颠倒6次，室温静置2min；

(6)加入300μL提前预冷的N3 Buffer，颠倒混匀至白色浑浊沉淀形成，室温静置2min；

(7)20000g室温离心5min，吸取上清至新的2mL EP管，加入1/10体积的ETRSolution，颠倒混匀后，冰上静置10min(期间每过2min颠倒3次)，再42℃放置5min后，20000g室温离心5min；

(8)取上清液至新的2mL EP管，加入1/2体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置2min；

(9)取出DNA Mini Column，加入700μL步骤(8)中液体，室温20000g离心1min；

(10)弃去收集柱液体，重复步骤(9)直至步骤(8)液体全部离心；

(11)弃去收集柱液体，加入500μL HBC Buffer，20000g室温离心1min；

(12)弃去收集柱，转移DNA Mini Column至一新的1.5mL EP管，室温静置3min；

(13)加入50μL DEPC水，室温静置3min后，20000g室温离心1min；弃去DNAMini Column，收集质粒，使用Nano Drop微量分光光度计检测质粒的浓度与纯度，做好标记，-20℃保存。

三、慢病毒的包装

(1)取出培养的HEK-293T细胞，接种100×10⁴个细胞至6cm培养皿，共计两个皿，采用十字交叉法摇动培养皿使细胞均匀贴壁生长；

(2)观察细胞生长密度至70％时，进行慢病毒质粒转染；

(3)取两个1.5mL EP管，标记为A、B两管，每管加入500μLOpti-MEM培养基；

(4)A管加入10μL lipofectamine3000，吹打混匀，室温静置1min；

(5)B管加入10μL P3000，4μg pCDH-lncENAF质粒(对照组加入pCDH-GFP质粒)、3μgpsPAX2质粒和1μg的pMD2.G质粒，吹打混匀，室温静置1min；

(6)将B管全部液体转移至A管，吹打混匀，室温静置15min；

(7)将步骤(6)的混合物均匀滴加至HEK-293T细胞中，培养箱中培养12h，更换DMEM培养基，继续培养24h和48h，收取病毒上清；

(8)使用0.45μm孔径的过滤器过滤收取的病毒液，分装至1.5mL EP管，每管1mL，-80℃保存。

四、枯否细胞致死嘌呤霉素浓度筛选和枯否-lncENAF和枯否-hnRNPF细胞株构建

(1)将枯否细胞接种至6孔板内，每孔25×10⁴个细胞；

(2)待细胞汇合度至50％时，把普通1640培养基更换为含嘌呤霉素的1640培养基，嘌呤霉素浓度进行梯度稀释，分别为0μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL共10个浓度梯度；

(3)继续培养72h后，观察细胞存活率，观察细胞死亡比例，筛出使细胞全部死亡最低的嘌呤霉素浓度，即为稳定细胞株的嘌呤霉素培养浓度，枯否细胞最大致死嘌呤霉素浓度为2.4μg/mL。

(4)确定好最适嘌呤霉素浓度后，将枯否细胞接种到6孔板内，每孔25×10⁴个细胞，培养12h至细胞贴壁；

(5)每孔加入300μL病毒液，感染细胞12h后更换新鲜的1640培养基进行培养72h；

(6)病毒感染72h后，病毒携带的基因将会随机整合进枯否细胞，连续培养7天，每天更换一次新鲜含嘌呤霉素的1640培养基，使用嘌呤霉素筛选7天后，存活下来的细胞即为稳定表达lncENAF和hnRNPF的枯否细胞株，分别命名为pCDH-ENAF、pLVX-hnRNPF-6*histag-puro(简写为pLVX-hnRNPF)。

(7)显微成像：在倒置荧光显微镜下观察pCDH-ENAF细胞株的绿色荧光(见图2A)，且利用qPCR检测细胞株中lncENAF的Cq值差异以验证pCDH-ENAF稳转株的表达效率(见图2B)pLVX-hnRNPF稳转株则利用WB验证hnRNPF高表株内6*histag标记的hnRNPF(见图2C)。

结果如图2所示，图2A GFP绿色荧光通道处可见均匀分布的绿色荧光，表明病毒感染的成功；图2B qPCR结果表明pCDH-ENAF稳转株中lncENAF的相对表达量较对照株下降了11个循环，即稳转株中lncENAF的表达量远远高于对照株细胞，也说明pCDH-ENAF稳转株细胞的构建成功；图2C WB结果可见hnRNPF高表株内6*histag标记的hnRNPF明显增加，表明pLVX-hnRNPF稳转株构建成功。

五、脂多糖诱导巨噬细胞中细胞因子产生

(1)将高表细胞株以及对照细胞株接种至12孔板中，每孔接种15×10⁴个细胞；

(2)12h待细胞贴壁后，每孔加入终浓度为100μg/mL的脂多糖刺激枯否细胞，于4h后使用qPCR检测枯否稳转株细胞内IL-6的mRNA表达变化(见图3A、图4A)；于24h后收集细胞培养上清，使用酶联免疫法(见“六、酶联免疫法检测细胞因子IL-6”)检测上清中IL-6的浓度(结果见图3B、图4B)；LPS刺激4h的同时加布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)阻断剂阻断4h，使用WB检测胞内蛋白中IL-6的表达水平(见图3C、图4C)。

结果如图3-图4所示，图3结果表明：在枯否细胞中高表lncENAF可以抑制IL-6的mRNA(A)、胞内蛋白(C)及分泌至胞外的蛋白(B)水平。

图4结果表明：在枯否细胞中高表hnRNPF可以抑制IL-6的mRNA(A)、胞内蛋白(C)及分泌至胞外的蛋白(B)水平。

六、酶联免疫法检测细胞因子IL-6

参考IL-6试剂盒(MuitiSciences：小鼠白介素6ELISA试剂盒(70-EK206/3)，具体步骤如下：

(1)细胞培养上清：300g室温离心10min，离心结束后取上清；

(2)稀释标准品：标准品开盖前短暂离心，用蒸馏水重溶小鼠IL-6标准品，重溶体积标注于标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为1000pg/mL。重溶后静置20min。

(3)细胞培养上清样本标准曲线的制备：取230μL浓缩标准品，加入230μL细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度(500pg/mL)。在每一个试管中加入230μL细胞培养基。使用高浓度标准品做1：1系列稀释。每次移液时，确保充分混匀，以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。

(4)检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温，准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品；

(5)将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口；

(6)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗液静置浸泡30s，弃掉洗液，在吸水纸上将微孔板拍干(洗板完成之后，立即使用微孔板，不要让微孔板干燥)；

(7)加样：标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL培养基，样本孔加入100μL细胞培养上清；

(8)加检测抗体：每孔加入50μL稀释的检测抗体(1:100稀释)。步骤(7)、(8)连续加样，不要间断，加样过程在15min内完成。

(9)孵育：使用封板膜封板，300rpm/min振荡，室温孵育1.5h；

(10)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次，每次洗板，在吸水纸上拍干；

(11)加酶孵育：每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；

(12)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm/min振荡，室温孵育30min；

(13)洗涤：重复步骤(10)；

(14)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，室温孵育5-30min；

(15)加终止液：每孔加入100μL终止液，颜色由蓝色变为黄色(如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，轻轻叩击板框，充分混匀)；

(16)检测读数：在30min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm的测定值，仅使用450nm测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种长链非编码RNA、其结合蛋白及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgtacacc atgcagacaa agcgctcaaa cacttgcaat gctgggcttt ctcccaatat 60

cctctgccat ctttcctacc cttataaaag tccagaaaga aaataatcat tctatctgga 120

ggtgggggcc acttctttaa tcctggcact tgggaagcag aggtaggtgt attgctttga 180

gttcaagacc agactggtct acaaagtgag ttccgggaca gtcaggactg ttgaacttgg 240

aagccttgtc ctcaaatttc tggcaatttt actagcacca gtcttcccgc ctcagcctcc 300

agtgtcttcc tgagatgatc tgactgcatg aaatgccctc gcctcatttt agttggctgg 360

ccctaaggtc aaggtaaatc cgcgcccaag ctgcccggtg gaggtggtct cagagggtgc 420

tgcgggatcg aggtagtgag gagactagat cgcaagacgt gatcctcaca tttatttgcc 480

tggagttctc atgccagaga acctggcaga ttttactatt tcccaattgt ttactcgcca 540

agctttcagg tccacgcgcc tcagggctgc gcctctcact ctgaaacttc attcaaaggc 600

caggcaggga ggcccaagag gtggcgaatg ggcttgagta tgacctcaag gcc 653

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Leu Gly Pro Glu Gly Gly Glu Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg

1 5 10 15

Gly Leu Pro Trp Ser Cys Ser Ile Glu Asp Val Gln Asn Phe Leu Ser

20 25 30

Asp Cys Thr Ile His Asp Gly Val Ala Gly Val His Phe Ile Tyr Thr

35 40 45

Arg Glu Gly Arg Gln Ser Gly Glu Ala Phe Val Glu Leu Glu Ser Glu

50 55 60

Asp Asp Val Lys Leu Ala Leu Lys Lys Asp Arg Glu Ser Met Gly His

65 70 75 80

Arg Tyr Ile Glu Val Phe Lys Ser His Arg Thr Glu Met Asp Trp Val

85 90 95

Leu Lys His Ser Gly Pro Asn Ser Ala Asp Ser Ala Asn Asp Gly Phe

100 105 110

Val Arg Leu Arg Gly Leu Pro Phe Gly Cys Thr Lys Glu Glu Ile Val

115 120 125

Gln Phe Phe Ser Gly Leu Glu Ile Val Pro Asn Gly Ile Thr Leu Pro

130 135 140

Val Asp Pro Glu Gly Lys Ile Thr Gly Glu Ala Phe Val Gln Phe Ala

145 150 155 160

Ser Gln Glu Leu Ala Glu Lys Ala Leu Gly Lys His Lys Glu Arg Ile

165 170 175

Gly His Arg Tyr Ile Glu Val Phe Lys Ser Ser Gln Glu Glu Val Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Asp Pro Pro Leu Lys Phe Met Ser Val Gln Arg Pro Gly

195 200 205

Pro Tyr Asp Arg Pro Gly Thr Ala Arg Arg Tyr Ile Gly Ile Val Lys

210 215 220

Gln Ala Gly Leu Asp Arg Met Arg Ser Gly Ala Tyr Ser Ala Gly Tyr

225 230 235 240

Gly Gly Tyr Glu Glu Tyr Ser Gly Leu Ser Asp Gly Tyr Gly Phe Thr

245 250 255

Thr Asp Leu Phe Gly Arg Asp Leu Ser Tyr Cys Leu Ser Gly Met Tyr

260 265 270

Asp His Arg Tyr Gly Asp Ser Glu Phe Thr Val Gln Ser Thr Thr Gly

275 280 285

His Cys Val His Met Arg Gly Leu Pro Tyr Lys Ala Thr Glu Asn Asp

290 295 300

Ile Tyr Asn Phe Phe Ser Pro Leu Asn Pro Val Arg Val His Ile Glu

305 310 315 320

Ile Gly Pro Asp Gly Arg Val Thr Gly Glu Ala Asp Val Glu Phe Ala

325 330 335

Thr His Glu Glu Ala Val Ala Ala Met Ser Lys Asp Arg Ala Asn Met

340 345 350

Gln His Arg Tyr Ile Glu Leu Phe Leu Asn Ser Thr Thr Gly Ala Ser

355 360 365

Asn Gly Ala Tyr Ser Ser Gln Val Met Gln Gly Met Gly Val Ser Ala

370 375 380

Ala Gln Ala Thr Tyr Ser Gly Leu Glu Ser Gln Ser Val Ser Gly Cys

385 390 395 400

Tyr Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Gln Asn Ser Met Gly Gly Tyr Asp

405 410 415

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaagcagag gtaggtgtat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcttccaag ttcaacagtc 20

<210> 5

<211> 9863

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840

gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900

taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960

acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020

cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140

tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200

gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260

aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320

gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380

aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt 1920

tatctcgagc catagagccc accgcatccc cagcatgcct gctattgtct tcccaatcct 1980

cccccttgct gtcctgcccc accccacccc ccagaataga atgacaccta ctcagacaat 2040

gcgatgcaat ttcctcattt tattaggaaa ggacagtggg agtggcacct tccagggtca 2100

aggaaggcac gggggagggg caaacaacag atggctggca actagaaggc acagtcgctc 2160

gagtcaggca ccgggcttgc gggtcatgca ccaggtgcgc ggtccttcgg gcacctcgac 2220

gtcggcggtg acggtgaagc cgagccgctc gtagaagggg aggttgcggg gcgcggaggt 2280

ctccaggaag gcgggcaccc cggcgcgctc ggccgcctcc actccgggga gcacgacggc 2340

gctgcccaga cccttgccct ggtggtcggg cgagacgccg acggtggcca ggaaccacgc 2400

gggctccttg ggccggtgcg gcgccaggag gccttccatc tgttgctgcg cggccagccg 2460

ggaaccgctc aactcggcca tgcgcgggcc gatctcggcg aacaccgccc ccgcttcgac 2520

gctctccggc gtggtccaga ccgccaccgc ggcgccgtcg tccgcgaccc acaccttgcc 2580

gatgtcgagc ccgacgcgcg tgaggaagag ttcttgcagc tcggtgaccc gctcgatgtg 2640

gcggtccgga tcgacggtgt ggcgcgtggc ggggtagtcg gcgaacgcgg cggcgagggt 2700

gcgtacggcc ctggggacgt cgtcgcgggt ggcgaggcgc accgtgggct tgtactcggt 2760

catagggccg ggattctcct ccacgtcacc gcatgttaga agacttcctc tgccctcgcg 2820

agatccggtg gagccgggtc cggcggtgcc gtccacggca gaattggacg actgagcgcg 2880

ggatctggcg aaggcgatgg gggtcttgaa ggcgtgctgg tactccacga tgcccagctc 2940

ggtgttgctg tgcagctcct ccacgcggcg gaaggcgaac atggggcccc cgttctgcag 3000

gatgctgggg tggatggcgc tcttgaagtg catgtggctg tccaccacga agctgtagta 3060

gccgccgtcg cgcaggctga aggtgcgggc gaagctgccc accagcacgt tatcgcccat 3120

ggggtgcagg tgctccacgg tggcgttgct gcggatgatc ttgtcggtga agatcacgct 3180

gtcctcgggg aagccggtgc ccaccacctt gaagtcgccg atcacgcggc cggcctcgta 3240

gcggtagctg aagctcacgt gcagcacgcc gccgtcctcg tacttctcga tgcgggtgtt 3300

ggtgtagccg ccgttgttga tggcgtgcag gaaggggttc tcgtagccgc tggggtaggt 3360

gccgaagtgg tagaagccgt agcccatcac gtggctcagc aggtaggggc tgaaggtcag 3420

ggcgcctttg gtgctcttca tcttgttggt catgcggccc tgcttggggg tgccctctcc 3480

gccgcccacc agctcgaact ccacgccgtt cagggtgccg gtgatgcggc actcgatctc 3540

catggcgggc aggccgctct cgtcgctctc catggtaagc ttgggctgca ggtcgaaagg 3600

cccggagatg aggaagagga gaacagcgcg gcagacgtgc gcttttgaag cgtgcagaat 3660

gccgggcctc cggaggacct tcgggcgccc gccccgcccc tgagcccgcc cctgagcccg 3720

cccccggacc caccccttcc cagcctctga gcccagaaag cgaaggagca aagctgctat 3780

tggccgctgc cccaaaggcc tacccgcttc cattgctcag cggtgctgtc catctgcacg 3840

agactagtga gacgtgctac ttccatttgt cacgtcctgc acgacgcgag ctgcggggcg 3900

ggggggaact tcctgactag gggaggagta gaaggtggcg cgaaggggcc accaaagaac 3960

ggagccggtt ggcgcctacc ggtggatgtg gaatgtgtgc gaggccagag gccacttgtg 4020

tagcgccaag tgcccagcgg ggctgctaaa gcgcatgctc cagactgcct tgggaaaagc 4080

gcctccccta cccggtagaa gctagcggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat 4140

cgcccacagt ccccgagaag ttgtggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa 4200

ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg 4260

gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt 4320

ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg 4380

gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc 4440

ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt 4500

cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt 4560

ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat 4620

gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc 4680

acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca 4740

catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc 4800

aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg 4860

cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc 4920

ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac 4980

ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt 5040

accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgacctt ttggagtacg tcgtctttag 5100

gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag 5160

ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat 5220

cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt 5280

cgtgatctag agctagaatt gtacaccatg cagacaaagc gctcaaacac ttgcaatgct 5340

gggctttccc caatatcctc tgccatcttt cctaccctta taaaagtcca gaaagaaaat 5400

aatcattcta tctggaggtg ggggccactt ctttaatcct ggcacttggg aagcagaggt 5460

aggtgtattg ctttgagttc aagaccagac tggtctacaa agtgagttcc gggacagtca 5520

ggactgttga acttggaagc cttgtcctca aatttctggc aattttacta gcaccagtct 5580

tcccgcctca gcctccagtg tcttcctgag atgatctgac tgcatgaaat gccctcgcct 5640

cattttagtt ggctggccct aaggtcaagg taaatccgcg cccaagctgc ccggtggagg 5700

tggtctcaga gggtgctgcg ggatcgaggt agtgaggaga ctagatcgca agacgtgatc 5760

ctcacattta tttgcctgga gttctcatgc cagagaacct ggcagatttt actatttccc 5820

aattgtttac tcgccaagct ttcaggtcca cgcgcctcag ggctgcgcct ctcactctga 5880

aacttcattc aaaggccagg cagggaggcc caagaggtgg cgaatgggct tgagtatgac 5940

ctcaaggccg cgtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta 6000

ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc 6060

atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt 6120

ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg 6180

ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt 6240

tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct 6300

ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt 6360

cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct 6420

acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc 6480

ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct 6540

ccccgcctgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 6600

ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaaaata agatctgctt 6660

tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 6720

ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt 6780

gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg 6840

aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata acttgcaaag 6900

aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 6960

agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 7020

ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg cccctaactc 7080

cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 7140

ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 7200

tagacttttg cagagacggc ccaaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 7260

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 7320

ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 7380

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 7440

gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 7500

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 7560

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 7620

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 7680

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 7740

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 7800

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 7860

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 7920

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 7980

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 8040

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 8100

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 8160

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 8220

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 8280

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 8340

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 8400

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 8460

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 8520

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 8580

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 8640

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 8700

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 8760

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 8820

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 8880

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 8940

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 9000

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 9060

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 9120

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 9180

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 9240

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 9300

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 9360

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 9420

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 9480

gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 9540

ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 9600

ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 9660

cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca 9720

actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 9780

gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 9840

aaacgacggc cagtgccaag ctg 9863

Claims (5)

1.一种lncENAF或其结合蛋白hnRNPF在制备治疗脓毒血症的药物中的应用，其特征在于，所述lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hnRNPF的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

2.一种巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞能够稳定表达lncENAF，所述lncENAF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求2所述的巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞为枯否细胞株。

4.一种如权利要求2或3所述的巨噬细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取lncENAF基因序列，并构建过表达所述lncENAF的慢病毒质粒；

(2)用HEK 293T细胞进行所述慢病毒质粒转染，获取病毒液；

(3)将病毒液与巨噬细胞枯否细胞株混合，筛选稳定表达lncENAF的枯否细胞株pCDHENAF。

5.如权利要求4所述的巨噬细胞的构建方法，其特征在于，获取lncENAF基因序列所用的引物为：

上游引物：5’GGAAGCAGAGGTAGGTGTAT 3’；

下游引物：5’GGCTTCCAAGTTCAACAGTC 3’。