JP2020536902A - 炎症性疾患を処置するための方法および組成物 - Google Patents

炎症性疾患を処置するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

炎症性疾患の処置または予防を必要とする対象への、マクロファージにおいて発現する長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA)を阻害する作用物質の投与を介した、炎症性疾患の処置または予防に関する方法および組成物が本明細書において説明される。一態様において、lnc-RNAはlnc-FAM164A1である。本明細書における別の局面は、炎症性疾患の処置または予防を必要とする対象への、lnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYを阻害する作用物質の投与を介して炎症性疾患を処置または予防する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.§119(e)の下で、2017年10月10日に出願された米国仮出願第62/570,405号の恩典を主張し、該出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本明細書に記載の技術は、炎症性疾患および癌を処置するための方法および組成物に関する。
背景
長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA、>200ヌクレオチド)は、胚発生、腫瘍成長および転移、心血管代謝障害、ならびに炎症を含む非常に多くの生物学的プロセスおよびヒト疾患において思いもよらない役割を果たしている。数種類のlnc-RNAが免疫細胞、例えば、赤血球細胞、Tリンパ球、樹状細胞、および単球/マクロファージの分化の間で重要な制御因子とみなされてきた6-9。しかしながら、免疫における、これらの生物学的機能は大部分がまだ明らかにされていない。ヒトおよびマウスのマクロファージは数千種類ものlnc-RNAを発現するが、マクロファージ活性化の調節においては数種類のlnc-RNAしか特徴付けられていない15-24。従って、もっと多くのlnc-RNAを特定し、その機能を試験する必要がある。マクロファージ活性化を調節する特定のlnc-RNAは、炎症性疾患、例えば、自己免疫障害を処置および予防する場合には新規の標的として、またはlnc-RNAを癌免疫療法で使用する場合には、これらに影響を及ぼすことによって機能することができる。
概要
ヒトlnc-FAM164A1を用いることでLPS活性化マクロファージにおいてNF-κBシグナル伝達を介して炎症促進性サイトカインの発現が強化され、lnc-FAM164A1が炎症性疾患および癌の治療標的だと明らかになったことを示すデータが本明細書において説明される。詳細に述べると、マウスにおいてlnc-FAM164A1をsiRNA特異的ノックダウンすると炎症関連サイトカイン発現が低減して(例えば、CCL2/MCP-1、IL-6、およびTNF-αなどの炎症促進性サイトカインのLPS誘導性発現が抑制され)、外毒素血症(exotoxemia)マウスモデルの炎症が低減する。本明細書に記載のさらなる研究から、lnc-FAM164A1に結合する3種類のタンパク質:ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);またはスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)が特定された。本明細書に記載の研究からATPクエン酸合成酵素(ACLY)はlnc-FAM164A1結合タンパク質であることが分かる。さらに、インビトロでのACLYサイレンシングによって、lnc-FAM164A1強制発現で誘導されるCCL2およびTNF-αの発現が減少する。
従って、本明細書において提供される一局面は、対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、マクロファージにおいて発現する長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA)を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む方法を提供する。一態様において、lnc-RNAは、AL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);およびRP13-452N2.1からなる群より選択される。
本明細書において提供される別の局面は、対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-FAM164A1を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
任意の局面の一態様において、炎症性疾患は、内毒素血症、アテローム硬化性血管疾患、心臓弁膜症(例えば、大動脈弁疾患または僧帽弁疾患)、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌からなる群より選択される。
任意の局面の一態様において、炎症性疾患は組織移植または細胞移植に応答して発生する。
任意の局面の一態様において、炎症性疾患は急性または慢性である。
任意の局面の一態様において、前記作用物質は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、または阻害性ポリペプチドからなる群より選択される。例示的なRNAiには、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAが含まれるが、これに限定されない。
任意の局面の一態様において、前記作用物質は、該作用物質をコードするベクターである。
任意の局面の一態様において、前記ベクターは非組込み型または組込み型である。
例示的な非組込み型ベクターには、エピソームベクター、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組込み型アデノウイルス、非組込み型RNA、およびセンダイウイルスが含まれるが、これに限定されない。
任意の局面の一態様において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
任意の局面の一態様において、lnc-RNAは標的細胞において阻害される。任意の局面の一態様において、lnc-FAM164A1は標的細胞において阻害される。
任意の局面の一態様において、標的細胞は哺乳動物細胞である。任意の局面の一態様において、標的細胞は、マクロファージ(例えば、不活化マクロファージもしくは活性化マクロファージ)、T細胞、樹状細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または好中球である。一態様において、マクロファージ活性化マクロファージは、制御されていない活性化である。
任意の局面の一態様において、対象は哺乳動物である。任意の局面の一態様において、対象はヒトである。
任意の局面の一態様において、阻害は、レベルおよび/または活性の低減である。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質が、lnc-RNAのレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質は、lnc-RNAの活性を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質は、lnc-FAM164A1のレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質は、lnc-FAM164A1の発現を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
任意の局面の一態様において、対象は、炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがある。
任意の局面の一態様において、対象は、炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがない。
任意の局面の一態様において、対象は、炎症性疾患を発症する少なくとも1つの危険因子を示す。
任意の局面の一態様において、前記方法は、投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると対象を診断する工程をさらに含む。
任意の局面の一態様において、前記方法は、投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると患者を診断するアッセイの結果を受け取る工程をさらに含む。
任意の局面の一態様において、前記作用物質はプラズマ細胞および/または腹膜細胞におけるCCL2およびIL-6の発現を減少させる。
任意の局面の一態様において、前記作用物質はNFkBシグナル伝達を減少させる。
本明細書に記載の別の局面は、対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法を含む。一態様において、lnc-RNAに結合するタンパク質は、ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);またはスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)である。一態様において、lnc-RNAに結合するタンパク質はACLYである。
任意の局面の一態様において、前記作用物質は、対象におけるCCL2およびTNF-αの発現を減少させる。
この局面または任意の局面の様々な態様において、前記作用物質は、前記タンパク質の活性またはレベルを阻害することができる。前記作用物質は、lnc-RNA、例えば、lnc-FAM164A1への前記タンパク質の結合を阻害することができる。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質は、前記タンパク質のレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質は、前記タンパク質の活性を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
任意の局面の一態様において、有効量の前記作用物質は、前記タンパク質とlnc-RNA、例えば、lnc-FAM164A1との結合を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する。
本明細書に記載の別の局面は、対象において炎症性疾患を処置する方法であって、(a)生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定するアッセイの結果を受け取る工程;(b)lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;(c)lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して有意に増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および(d)炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
本明細書に記載の別の局面は、対象において炎症性疾患を処置する方法であって、(a)生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定する工程;(b)lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;(c)lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して有意に増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および(d)炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。任意の局面の一態様において、前記方法は、工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む。
本明細書に記載の別の局面は、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAを阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
本明細書に記載の別の局面は、lnc-FAM164A1を阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
本明細書に記載の別の局面は、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。一態様において、lnc-RNAに結合するタンパク質は、ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);またはスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)である。一態様において、lnc-RNAに結合するタンパク質はACLYである。
本明細書に記載の別の局面は、敗血症を有する対象を同定する方法であって、(a)生物学的試料中のlnc-FAM164A1のレベルを測定する工程;(b)lnc-FAM164A1のレベルを参照レベルと比較する工程;(c)lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して有意に増加していれば、対象を敗血症を有すると同定する工程;および(d)敗血症を有する対象に、敗血症を処置する治療を施す工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記方法は、工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む。一態様において、生物学的試料は血液試料である。
定義
便宜を図って、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用する、いくつかの用語および句の意味が以下で示される。特に定めのない限り、または文脈から暗に示されていない限り、以下の用語および句は、以下で示される意味を含む。定義は特定の態様の説明を助けるために示され、本技術の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるので、請求された本技術を限定することを目的としない。特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本技術が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と、本明細書において示された用語の定義との間に明らかな矛盾があれば、本明細書において示された定義が優先されるものとする。
免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, 発行Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, 発行Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 発行VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, 発行Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, 発行Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005;およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)において見つけることができる。これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用する「処置する(treat)」、「処置」、「処置する(treating)」、または「寛解」という用語は、炎症性疾患、例えば、アテローム硬化性血管疾患、静脈移植不全、動静脈瘻不全、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌に関連する状態の進行または重篤度を逆転させる、緩和する、寛解させる、阻害する、遅くする、または止めることが目的である治療的処置を指す。「処置する」という用語は、炎症性疾患、例えば、発熱、胸痛、息切れ(shorness of breath)、または悪心の少なくとも1つの有害な作用または症状を低減または緩和することを含む。処置は、一般的に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減すれば「有効」である。または、処置は、疾患の進行が減速または停止すれば「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置の非存在下で予想されるものと比較した症状の進行または悪化の休止または少なくとも緩徐化も含む。有益な、または望ましい臨床結果には、1つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の低下、疾患の状態の安定化(すなわち、悪化なし)、疾患進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の軽快もしくは一時的緩和、(部分的か完全かに関係なく)軽快、および/または検出可能か検出不可能に関係なく死亡率の減少が含まれるが、これに限定されない。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用を緩和すること(対症療法を含む)も含む。
本明細書で使用する「予防する」または「予防」とは、方法(例えば、本明細書に記載の作用物質の投与)が働いたために疾患状態が発生しない、あらゆる方法を指す。一局面において、予防はまた、未処置対照において発生する程度まで疾患が確立していないことを意味することがあると理解される。従って、疾患の予防とは、未処置対象(例えば、本明細書に記載の方法または組成物で処置しなかった対象)と比べて対象が疾患を発症する可能性が低下することを含む。
本明細書で使用する「投与する」という用語は、望ましい効果(例えば、マクロファージ活性化および炎症の減少)が生じるように、導入された作用物質を、望ましい部位、例えば、血流またはその領域に少なくとも部分的に局在させる方法または経路によって、本明細書に記載の作用物質を対象または生物学的試料に配置する状況で用いられる。本明細書に記載の作用物質は、対象の望ましい場所に送達する任意の適切な経路によって投与することができる。一部の態様において、「投与する」という用語は、1種類または複数種の作用物質または細胞を含む薬学的組成物の投与を指す。投与は、必要とする対象への直接注射(例えば、標的細胞への直接投与)、皮下注射、筋肉注射、経口送達、または経鼻送達によって行うことができる。投与は局所でもよく全身でもよい。
「患者」、「対象」、および「個体」という用語は本明細書において同義に用いられ、予防療法を含む処置が提供される動物、特に、ヒトを指す。本明細書で使用する「対象」という用語はヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は本明細書において同義に用いられ、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、(特に、高等霊長類)、ヒツジ、イヌ、げっ歯類(例えば、マウスまたはラット)、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、および非哺乳動物、例えば、ニワトリ、両生類、ハ虫類などを含む。一態様において、対象はヒトである。別の態様において、対象は疾患モデルとしての実験動物または動物代用品である。別の態様において、対象は、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ、ラット、モルモット、ハムスターなど)を含む飼い慣らされた動物である。対象には、以前に炎症性疾患に対する処置が与えられたことがあるか、または炎症性疾患に対する処置が与えられたことがない。対象は、以前に、炎症性疾患を有すると診断されたことがあってもよく、炎症性疾患と診断されたことがなくてもよい。対象は炎症性疾患の少なくとも1つの危険因子を示してもよい。
対象は、最初に、免許を持っている医師(physician)および/または許可を受けた医師(medical practitioner)によって診断されてもよく、本明細書に記載の方法を介した予防的処置および/または治療的処置のためのレジメンが示唆、推奨、または処方されてもよい。従って、一部の態様では、前記方法は、対象を炎症性疾患の処置を必要とすると同定する工程を含む。
内毒素血症、アテローム硬化性血管疾患、静脈移植不全、動静脈瘻不全、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌を含むが、これに限定されない、炎症性疾患の信頼性の高い指標である動物モデル。
本明細書で使用する「作用物質」という用語は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、または阻害性ポリペプチドなどあるが、これに限定されない任意の化合物または物質を意味する。ここでのリストなど。「作用物質」は、合成および天然のタンパク質実体および非タンパク質実体を含むが、それに限定されるわけではない任意の化学的実体または化学的部分でもよい。一部の態様において、作用物質は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、または阻害性ポリペプチド、ならびにその改変および組み合わせである。ある特定の態様において、作用物質は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分には、マクロライド、レプトマイシンを含む非置換または置換のアルキル部分、芳香族部分、またはヘテロシクリル部分、およびその関連する天然産物または類似体が含まれた。化合物は望ましい活性および/または特性を有することが知られていてもよく、多種多様な化合物のライブラリーから選択されてもよい。
前記作用物質は、1つまたは複数の化学クラスからの分子、例えば、有機金属分子を含むことがある有機分子、無機分子、遺伝子配列などでもよい。作用物質はまた、1種類または複数種のタンパク質に由来する融合タンパク質、キメラタンパク質(例えば、関連分子または異なる分子の機能的に重要な領域のドメインスイッチングまたは相同組換え)、合成タンパク質、あるいは置換、欠失、挿入を含む他のタンパク質バリエーション、および他の変種でもよい。
「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語は全て、統計的に有意な量だけ減少することを意味するために本明細書において用いられる。一部の態様において、「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」は、典型的には、適切な対照(例えば、ある特定の処理がない)と比較して少なくとも10％減少することを意味し、例えば、適切な対照と比較して少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％減少すること、またはそれを超えて減少することを含んでもよい。本明細書で使用する「低減」または「阻害」は、適切な対照と比較して完全に阻害または低減することを含まない。「完全な阻害」とは、適切な対照と比較して100％阻害することである。
「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は全て、再現性のある統計的に有意な量だけ増加することを意味するために本明細書において用いられる。一部の態様において、「増加」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％増加すること、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、または100％まで(100％を含む)の増加、または10〜100％の任意の増加、あるいは適切な対照と比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、20倍の増加、30倍の増加、40倍の増加、50倍の増加、6倍の増加、75倍の増加、100倍の増加など、または2倍〜10倍もしくはそれより多い任意の増加を意味することがある。マーカーの状況において「増加」は、このようなレベルの再現性のある統計的に有意な増加である。
本明細書で使用する「適切な対照」は、処置されていないが、その他の点では同一の細胞または集団(例えば、非対照細胞と比較して、本明細書に記載の作用物質が投与されなかった患者、または本明細書に記載の作用物質の一部のみが投与された患者)を指す。
本明細書で使用する「参照レベル」とは、正常な、そうでなければ影響を受けていない細胞集団または組織(例えば、健常対象から入手した生物学的試料、または前の時点で対象から入手した生物学的試料、例えば、炎症性疾患と診断される前に対象から入手した生物学的試料、または本明細書において開示された作用物質と接触したことがない生物学的試料)を指す。
本明細書で使用する「長鎖ノンコーディングRNA」または「lnc-RNA」という用語は、タンパク質に翻訳されない、200ヌクレオチドより長いRNA転写物を指す。長鎖ノンコーディングRNAは、多数の細胞機能、例えば、2種類以上のタンパク質の遺伝子調節、クロマチン調節、スキャフォールド、または特定のタンパク質複合体を正しく局在させるためのガイドに関与する(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Rin and Chang et al Annu Rev Biochem.2012を参照されたい)。
本明細書で使用する「lnc-FAM164A1」または「ENSG00000261618.1」または「OTTHUMG00000173421.1」という用語は、タンパク質コーディング遺伝子FAM164Aに近い、第8番染色体(位置79,749,764-79,752,757)に位置する約2994塩基対の長鎖ノンコーディングRNAを指す。マクロファージにおいて、lnc-FAM164A1は炎症性サイトカインの分泌を増強する。多数の種について、lnc-FAM164A1の配列、例えば、ヒトlnc-FAM164A1(名称:AC083837.1-201)、転写物(例えば、TRANSCRIPT ID:ENST00000565297.1またはEnsembl Transcript chromosome:GRCh37:8:1:146364022:1)が知られている。長鎖ノンコーディングRNA、lnc-FAM164A1は、その天然の変種、分子、および対立遺伝子を含むヒトlnc-FAM164A1を指すことがある。長鎖ノンコーディングRNA、lnc-FAM164A1は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物のlnc-FAM164A1を指す。SEQ ID NO:1の核配列は、lnc-FAM164A1をコードする核酸配列を含む。
本明細書で使用する「lnc-FAM164A1活性」という用語はlnc-FAM164A1の細胞機能を指す。例えば、lnc-FAM164A1は、LPS-活性化マクロファージにおいてNF-KBシグナル伝達を介して炎症促進性サイトカインの発現を増強する。例えば、lnc-FAM164A1活性の増加は、細胞による食作用およびサイトカイン分泌の増加を指すことがある。NF-KB経路を介して活性化マクロファージによって分泌されるサイトカインの非限定的な例にはIL-1β、IL-6、およびTNF-αが含まれるが、これに限定されない。しかしながら、lnc-FAM164A1活性レベルを求めるために他のサイトカインも測定できることが意図される。
本明細書に記載の方法および組成物は、ACLYが標的化されることを必要とする。本明細書で使用する「ATPクエン酸リアーゼ(ACLY)」は、多くの組織においてサイトゾルアセチル-CoAの合成を担う主要な酵素を指す。多数の種について、ACL、ATPCL、およびCLATPとも知られるACLYの配列、例えば、ヒトACLY(NCBI Gene ID: 47)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_001087.2)およびmRNA(例えば、NCBI Ref Seq NM_001096.2)が知られている。ACLYは、ヒトACLYを、その天然の変種、分子、および対立遺伝子を含めて指すことがある。ACLYは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物ACLYを指す。SEQ ID NO:3の核酸は、ACLYをコードする核酸を含む。
本明細書に記載の方法および組成物は、Flg2が標的化されることを必要とする。本明細書で使用する「フィラグリンファミリーメンバー2(Flg2)」とは、皮膚の角質化に必要なタンパク質をコードする遺伝子を指す。この遺伝子の変異は皮膚病と関連することが多い。多数の種について、IFPSおよびPSS6とも知られるFlg2の配列、例えば、ヒトFlg2(NCBI Gene ID: 388698)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_001014364.1)およびmRNA(例えば、NCBI Ref Seq NM_001014342.2)が知られている。Flg2は、ヒトFlg2を、その天然の変種、分子、および対立遺伝子を含めて指すことがある。Flg2は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物Flg2を指す。SEQ ID NO:38の核酸配列は、Flg2をコードする核酸配列(NM_001014342.2ヒト(Homo sapiens)フィラグリンファミリーメンバー2(FLG2), mRNA)を含む。
本明細書に記載の方法および組成物は、SFPQが標的化されることを必要とする。本明細書で使用する「スプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)」は、多くの組織において偏在して発現しているスプライス因子を指す。多数の種について、PSF、POMP100、およびPPP1R140とも知られるSFPQの配列、例えば、ヒトSFPQ(NCBI Gene ID: 6421)ポリペプチド(例えば、NCBI Ref Seq NP_005057.1)およびmRNA(例えば、NCBI Ref Seq NM_005066.2)が知られている。SFPQは、ヒトSFPQを、その天然の変種、分子、および対立遺伝子を含めて指すことがある。SFPQは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物SFPQを指す。SEQ ID NO:39の核酸配列は、SFPQをコードする核酸配列(mRNA(cDNAクローンMGC:57191画像:5262885)、完全cds)を含む。
「炎症性疾患」という用語は、(1)炎症性疾患またはアレルギー性疾患、例えば、全身アナフィラキシーまたは過敏性応答、薬物アレルギー、昆虫刺傷アレルギー;炎症性腸疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、および腸炎;膣炎;乾癬および炎症性皮膚病、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、じんま疹;脈管炎;脊椎関節症;硬皮症;呼吸アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患など、(2)自己免疫疾患、例えば、関節炎(関節リウマチおよび乾癬性関節炎)、変形性関節症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎など、(3)移植片拒絶反応(同種異系移植片拒絶反応および移植片対宿主病を含む)または操作された組織の拒絶反応、ならびに(4)感染症、筋炎、炎症性CNS障害、例えば、脳卒中および閉鎖性頭部外傷、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、類肉腫症、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、ベーチェット症候群、内毒素血症、アテローム硬化性血管疾患、冠動脈疾患、ステント再狭窄、カロチド代謝疾患(carotid metabolic disease)、脳卒中、急性心筋梗塞、心不全、末梢動脈疾患、四肢虚血、静脈移植不全、または動静脈瘻不全を含む、望ましくない炎症応答が阻害される他の疾患を含み得るが、これに限定されない、炎症に関連する疾患および状態を指すために「炎症」と同義で使用することができる。
本明細書で使用する「免疫療法」という用語は、癌または他の点で有害なタンパク質、細胞、もしくは組織に対して適応免疫または自然免疫を(能動的または受動的に)誘発または増幅するための対象の免疫系の刺激、誘導、破壊(subversion)、模倣(mimicry)、増強、増大、または他の任意の調節を介した疾患の処置を指す。既存の癌を処置するように設計されていても、癌の発達を阻止するように設計されていても、癌再発の可能性を小さくするために補助の状況で使用するためのものであっても、免疫療法(すなわち、免疫療法剤)には、癌ワクチン、免疫調節剤、「抗体に基づく免疫療法」もしくはモノクローナル抗体(例えば、ヒト化モノクローナル抗体)、免疫賦活薬、細胞に基づく療法、例えば、養子T細胞療法、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、または樹状細胞免疫療法もしくは樹状細胞ワクチン、およびウイルス療法が含まれる。
本明細書で使用する「小分子」という用語は、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または約10,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物(例えば、ヘテロ有機(heterorganic)化合物および有機金属化合物を含む)、約5,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約1,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約500グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、およびこのような化合物の塩、エステル、および他の形態を含み得るが、これに限定されない化学薬品を指す。
本明細書で使用する「核酸」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド、(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、およびプリン塩基もしくはピリミジン塩基のN-グリコシドまたは修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基(脱塩基部位を含む)である他の任意のタイプのポリヌクレオチドのうちの1つまたは複数のタイプを含む。本明細書で使用する「核酸」という用語はまた、典型的には、サブユニット間のホスホジエステル結合によって、場合によっては、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどによって共有結合したリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーも含む。「核酸」には一本鎖および二本鎖DNAならびに一本鎖および二本鎖RNAが含まれる。例示的な核酸には、gDNA;hnRNA;mRNA;rRNA、tRNA、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、核小体低分子RNA(snORNA)、核低分子RNA(snRNA)、および小分子RNA(stRNA)など、およびその任意の組み合わせが含まれるが、それに限定されるわけではない。
本明細書で使用する「RNAi」という用語は干渉RNAを指すか、またはRNA干渉分子は、遺伝子発現を阻害する核酸分子またはその類似体、例えば、RNAに基づく分子である。RNAiは選択的な転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。RNAiは特定のmRNAを破壊してもよく、mRNAなどのRNAのプロセシングまたは翻訳を阻止してもよい。RNAiの非限定的な例には、サイレンシングRNA(siRNA)、エンドリボヌクレアーゼによって調製されたsiRNA(esiRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、またはマイクロRNA(miRNA)であるRNAiが含まれる。
本明細書で使用する「shRNA」という用語は、RNAi種および/またはsiRNA種として機能するが、安定性を高めるためにshRNA種が二本鎖ヘアピン様構造である点で異なるショートヘアピンRNAを指す。
本明細書で使用する「アプタマー」または「RNAアプタマー」という用語は、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を特異的に認識することができる、一本鎖、部分的に一本鎖、部分的に二本鎖、または二本鎖のヌクレオチド配列を意味する。従って、アプタマーは、関心対象の特定の分子に高い親和性および特異性で結合する核酸またはペプチド分子である(Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990))。大きなタンパク質から小さな有機分子まで多くの異なる実体に結合するDNAアプタマーまたはRNAアプタマーが首尾良く生成されている。Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10-16 (1997), Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999)、およびHermann and Patel, Science 287:820-5(2000)を参照されたい。アプタマーはRNAベースでもよく、DNAベースでもよい。分子に結合するかどうかアプタマーを選択するための方法は当技術分野において広く知られており、当業者が容易に利用することができる。一般的に、アプタマーは、様々な分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸に結合するように、さらには細胞、組織、および臓器にも結合するようにインビトロ選択の繰り返しによって、言い換えるとSELEX(試験管内進化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))によって操作される。アプタマーは、合成方法、組換え方法、および精製方法を含む任意の公知の方法によって調製することができ、単独で使用されてもよく、同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用されてもよい。さらに、本明細書においてさらに完全に説明されるように、「アプタマー」という用語は、具体的には、ある特定の標的に対する2種類以上の公知のアプタマーを比較することから得られたコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。アプタマーには、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、改変されたヌクレオチド、ならびにバックボーン改変、分岐点、および非ヌクレオチド残基、基、または結合(bridge)を含むヌクレオチドを含む定義された配列セグメントおよび配列が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。一部の態様において、前記アプタマーは、ワトソン・クリック塩基対合または三重鎖形成以外の機構によって非オリゴヌクレオチド分子または分子群を認識する。
本明細書で使用する「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって互いにつながった一連のアミノ酸残基を指定するために本明細書において同義に用いられる。本明細書において同義に用いられる「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸(例えば、リン酸化アミノ酸、糖化アミノ酸など)およびアミノ酸類似体を含むタンパク質アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」は比較的大きなポリペプチドに関して用いられることが多く、「ペプチド」は小さなポリペプチドに関して用いられることが多いが、当技術分野における、これらの用語の使い方は重複および変化する。本明細書で使用する「ペプチド」という用語は特に定めのない限りペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびタンパク質の断片を指す。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は遺伝子産物およびその断片を指している時に、本明細書において同義に用いられる。従って、例示的なペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の同等物、前述の変種、断片、および類似体を含む。
本明細書で使用する「多糖」という用語は、グリコシド結合によって互いにつながった多数の単糖分子からなる分子を有する高分子炭水化物を指す。多糖という用語はまたオリゴ糖も含むことも意図される。多糖はホモ多糖またはヘテロ多糖でもよい。ホモ多糖は1種類の単位しか含有しないが、ヘテロ多糖は異なる種類の単量体単位からなる。
「組織」という用語は、ある特定の特殊な機能を一緒になって果たす、同じように分化した細胞の集まり、または層を指す。「組織特異的」という用語は、特定の組織に由来する細胞の供給源または決定的な特徴を指す。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を指し、一般的に、参照レベルから少なくとも2標準偏差(2SD)離れていることを意味する。この用語は、差があるという統計的証拠を指す。この用語は、帰無仮説が本当に真である時に帰無仮説を棄却する決断も下す確率と定義される。
本明細書で使用する「含む(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、本発明に必要不可欠な組成物、方法、およびその各成分に関して用いられるが、必要不可欠であっても必要不可欠でなくても、明記されていない要素の包含を認める。
本明細書で使用する「から本質的になる」という用語は、ある特定の態様に必要な要素を指す。この用語があると、本発明の態様の基本的かつ新規の、または機能的な特徴に大きく影響を及ぼさない、さらなる要素が存在することが可能になる。
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、およびその各成分を指し、態様の説明において列挙されなかった、あらゆる要素を排除する。
実施例(operating example)にあるものを除き、または特に定めのない限り、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語により修飾されていると理解しなければならない。「約」という用語はパーセンテージに関連して用いられる時には±1％を意味することがある。
単数の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」とは、特に文脈によってはっきりと示されていない限り複数の指示物を含む。同様に、「または(or)」という単語は、特に文脈によってはっきりと示されていない限り「および(and)」を含むことが意図される。従って、例えば、「方法」についての記載は、本明細書に記載の、および/または本開示を読めば当業者に明らかになる1つもしくは複数の方法、および/またはタイプの工程などを含む。
さらに、単数の用語は、文脈によって必要とされる場合を除いて複数の用語を含み、複数の用語は単数を含むものとする。
説明されている場合を除いて、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本開示は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、および試薬などに限定されず、従って、変更してもよいことが理解されるはずである。本明細書において用いられる専門用語は特定の態様の説明のみを目的とし、本開示の範囲の限定を目的とせず、本開示の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
特定された全ての特許および他の刊行物は、説明および開示のために、例えば、本開示と共に用いられ得るこのような刊行物に記載の方法の説明および開示のために参照として本明細書にはっきりと組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日前の刊行物の開示のためだけに提供される。この点に関して、先行開示に基づいて、または他の任意の理由により本発明者らがこのような開示に先行する権利がないと認められると解釈されるものは何もない。日付に関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表記は出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付または内容の正確さに関する是認を構成するものではない。
図1A〜1Eは、LPSで処理すると、ヒト化Hu-CD34 NSGマウスのヒトマクロファージ、PBMC、および白血球においてlnc-FAM164A1発現が増加することを示す。ヒトPBMC由来マクロファージ(4人の異なるドナー:A、B、C、およびD)においてLPS刺激によって有意に増加した11種類のlnc-RNA(RP11-79H23.3またはlnc-FAM164A1)のヒートマップ図(図1A)。ヒトPBMC由来マクロファージを10ng/mL LPSによって3時間または6時間刺激した(図1B、P<0.05 LPS対対照; n=5〜6人の異なるドナー)。ヒトPBMCを、エクスビボで、10ng/mL LPSによって6時間刺激して得たクエン酸塩添加全血から単離した(図1C、P<0.05 LPS対対照; n=3〜4人の異なるドナー)。Hu-CD34 NSGマウスを5mg/kg LPSによって6時間刺激した(図1D、P<0.05、NSG対照対NSG+LPS、n=4マウス/群)。lnc-FAM164A1発現の相対倍率変化をRT-PCRによって確かめた(図1B〜1D)。LPSによって3時間刺激したヒトPBMC由来マクロファージ上でのlnc-FAM164A1のRNAscopeインサイチュー染色の代表的な画像(青色:DAPI;赤色:lnc-FAM164A1;緑色:ヒトCD68)(図1E、白色バースケール:20μM)。 図2A〜2Fは、lnc-FAM164A1のアンチセンスまたはsi-RNAオリゴヌクレオチドサイレンシングによって、ヒトPBMC由来マクロファージ上でCCL2、IL-6、およびTNF-αの発現が低減することを示す。ヒトPBMC由来マクロファージをlnc-FAM164A1アンチセンスオリゴヌクレオチド(FAM)(図2A〜2F)、もしくはAxolab siRNAオリゴヌクレオチド(#5および#8)(図2Gおよび2H)、またはこれらの非特異的対照オリゴヌクレオチド(NS)で48時間トランスフェクトした後に、LPSで3〜6時間刺激した。CCL2 mRNA(図2Aおよび2G)、IL-6 mRNA(図2C)、TNF-α mRNA(図2E)のレベルをRT-PCRによって検出した(P<0.05 NS-LPS対FAM-LPS; n=4〜6人の異なるドナー)。培養培地中のCCL2タンパク質(図2Bおよび2H)、IL-6(図2D)、ならびにTNF-αタンパク質(図2F)をELISAで測定した(P<0.05 NS-LPS対FAM-LPS; n=4〜5人の異なるドナー)。 図3A〜3Gは、lnc-FAM164A1を強化発現させると、ヒトPBMC由来マクロファージ上で、LPSによって誘導される炎症促進性TNF-αおよびCCL2の発現が増強することを示す。ヒトPBMC由来マクロファージにLacZ対照アデノウイルス(Ad-lacZ)またはlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-FAM)を48時間感染させ、次いで、10ng/mL LPSによって2時間刺激した。(図3A)LPSによって2時間刺激した、または刺激しなかったアデノウイルス感染ヒトPBMC由来マクロファージ上でのlnc-FAM164A1のRNAscopeインサイチュー染色の代表的な画像(青色:DAPI;赤色:lnc-FAM164A1)。lnc-FAM164A1 RNA(図3Bおよび3E)、TNF-α mRNA、ならびにCCL2 mRNA(図3Cおよび3F)の発現をRT-PCRによって確かめた。培養培地中にあるTNF-αおよびCCL2のタンパク質レベルをELISAによって測定した(図3Dおよび3G)(P<0.05 Ad-LacZ対Ad-FAM;異なるドナーを用いてn=5〜7回の独立した実験)。 図4A〜4Dは、lnc-FAM164A1を強化発現させると、マクロファージにおいてNF-κBシグナル伝達経路活性化が促進されることを示す。(図4A)HEK-293細胞においてlnc-FAM164A1を強化発現させると、NF-κB-ルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価されるNF-κBプロモーター活性化が増強する(P<0.05ベクター対Lnc-FAM164A1、n=9個の試料)。アデノウイルスによるlnc-FAM164A1強化発現によって、THP-1分化マクロファージ(図4B)ならびにヒトPBMC由来マクロファージ(図4Cおよび4D)においてLPSによって15〜60分間誘導されたIκB-α分解とp65核移行が増強する。核抽出物中のIκB-αおよびp65タンパク質はウエスタンブロットによって検出された。β-アクチンおよびラミンA/Cをローディング対照として使用した。 図5A〜5Hは、lnc-FAM164A1を強化発現させると、マウス腹膜マクロファージ上でLPSによって誘導される炎症促進性サイトカイン誘導が増強することを示す。マウス腹膜にLacZ対照アデノウイルス(Ad-lacZ)またはlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-FAM)を48時間感染させ、次いで、10ng/mL LPSによる刺激を3時間行った。lnc-FAM164A1 RNA(図5A)、マウスIL-1β mRNA(図5B)、マウスTNF-α mRNA(図5C)、およびIL-6 mRNA(図5E)の発現をRT-PCRによって確かめた。培養培地中にあるTNF-α(図5D)およびIL-6(図5F)のタンパク質レベルをELISAによって測定した(P<0.05LacZ対FAM;n=6〜9)。内毒素血症マウスモデルにおいてlnc-FAM164A1を強化発現させると、LPSによって誘導される血漿TNF-α誘導が増強する。C57BL/6Jマウスに、LacZ対照アデノウイルス(Ad-lacZ)またはlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-FAM)を3日間感染させ、次いで、LPSによって3時間刺激した。肝臓組織におけるlnc-FAM164A1 RNA発現(図5G)をRT-PCRによって確かめた。マウスTNF-αタンパク質の血漿レベル(図5H)をELISAによって測定した(P<0.05 Ad-LacZ+LPS対Ad-FAM+LPS;n=8〜10匹のマウス/群)。 図6A〜6Fは、単球/マクロファージにおけるlnc-FAM164A1サイレンシングによって、内毒素血症ヒト化マウスモデルにおけるヒトCCL2およびIL-6の発現が減少することを示す。Hu-CD34 NSG-SGM3マウスに脂質ナノ粒子処方si-RNA対照オリゴまたはsi-lnc-FAMオリゴを投与した後に、LPS曝露を3時間行った。精製された単球におけるlnc-FAM164A1 RNAの発現(図6A)と、内毒素血症マウスから単離した腹膜細胞におけるヒトCD68、CCL2、およびIL-6 mRNAの発現(図6B、6D、および6F)をRT-PCRによって調べた。ヒトCCL2およびIL-6タンパク質の血漿レベルがELISAによって検出された(図6Cおよび6E)(P<0.05、si-control+LPS対si-lnc-FAM+LPS、n=6〜7匹のマウス/群)。 図7A〜7Dは、lnc-FAM164A1に結合する3種類のタンパク質が質量分析法によって特定されたことを示す。(図7A)ベン図は、LPS活性化THP-1分化マクロファージからのホールセル溶解産物を用いた3回のlnc-FAM164A1 RNAプルダウン実験(#1、#2、#3)において特定したタンパク質の数を示す。これらのタンパク質の標準化AUCの倍率変化はセンス対アンチセンス(S/AS)またはセンス対ビーズ(S/B)と比較して2倍を超える。3種類のタンパク質(ACLY、FLG2、およびSFPQ)が両比較(S/ASおよびS/B)において上昇を示す。ヒトPBMC由来マクロファージにおいてACLYサイレンシングを行うと、lnc-FAM164A1強化発現によって誘導されるCCL2 mRNA発現が減少する。(図7B)3種類のlnc-FAM164A1結合タンパク質(ACLY、FLG2、およびSFPQ)の疾患関連性。(図7C)LPS活性化ヒトPBMC由来マクロファージに由来するホールセル溶解産物のインプット対照と、ビーズ対照(B)、アンチセンスlnc-FAM164A1(AS)、およびセンスlnc-FAM164A1(S)からの溶出タンパク質が、それぞれ、ヒトACLYおよびhnRNPA1に対する抗体を用いてウエスタンブロットによって検出された。示したデータは3回の実験を表した。(図7D)ACLYサイレンシングとlnc-FAM164A1強化発現の組み合わせをヒトPBMC由来マクロファージに対して行い、その後に、LPSを用いて、またはLPS無しで処理を2時間行った。lnc-FAM164A1、ACLY、およびCCL2のRNA発現をRT-PCRによって評価した(3つの異なる実験からn=6〜9個の試料、一方向ANOVAによりp<0.05)。 図8A〜8Cは、実験スキームを示す(図8A)。相対発現レベルに基づくlnc-RNAのボルケーノ(Volcano)プロット(Log2倍率変化、LPS対対照)。ヒトPBMC由来マクロファージにおいて、LPS処理によって誘導される11種類のlnc-RNA発現(青色の丸)が有意に増加する(n=4、補正p値FDR<0.05および倍率変化≧2)。Lnc-FAM164A1を赤色で強調した(図8B)。ヒトlnc-RNAマイクロアレイ分析における各lnc-RNAの標準化された強度を平均±SDで示した(p<0.05、LPS対対照n=4人の異なるドナー)(図8C)。 図9A〜9Cは、ヒトPBMC由来マクロファージを10ng/mLのヒトIL-6およびTNF-αによって3時間刺激したことを示す。lnc-FAM164A1発現の相対倍率変化をRT-PCRによって確かめた(P<0.05 LPS対対照; n=3〜4人の異なるドナー)(図9A)。Hu-CD34 NSGマウスをLPSによって6時間刺激した。内毒素血症マウスから単離した肝臓、脾臓、および肺におけるlnc-FAM164A1 RNAの発現をRT-PCRによって確かめた(P<0.05、脾臓対肺;n=4マウス/群)(図9B)。(図9C)PBMC由来マクロファージの細胞質および核におけるlnc-FAM164A1の比。ヒトPBMC由来マクロファージを10ng/mL LPSによって3時間刺激した。核RNAおよび細胞質RNAを別々に精製した。lnc-FAM164A1 RNA、IL-1β、およびGAPDH mRNA発現をRT-PCRによって確かめ、未刺激マクロファージ(左パネル)およびLPS処理マクロファージ(右パネル)における核/細胞質(n=2人の異なるドナー)の比として示した。 図10Aおよび18Bは、(図10A)LPSで刺激したPBMC由来マクロファージにおけるlnc-FAM164A1およびサイトカイン発現の時間経過。ヒトPBMC由来マクロファージを10ng/mL LPSによって6時間、12時間、および24時間刺激した。Lnc-FAM164A1 RNA、IL-1β、IL-6、およびTNF-α mRNA発現をRT-PCRによって確かめ、GAPDH発現によって標準化した(2人の異なるドナーの代表的な結果)。(図10B)NF-κB阻害剤(Bay 11-7802)は、LPSで刺激したPBMC由来マクロファージにおけるlnc-FAM164A1およびサイトカインの転写をブロックする。ヒトPBMC由来マクロファージを3〜30μM Bay 11-7802によって30分間前処理した後に、10ng/mL LPSによって6時間刺激した。lnc-FAM164A1 RNA、IL-1β、IL-6、およびTNF-α mRNA発現をRT-PCRによって確かめ、GAPDH発現によって標準化した(2人の異なるドナーからの代表的なデータ)。 図11A〜11Eは、lnc-FAM164A1のアンチセンスまたはsi-RNAオリゴヌクレオチドサイレンシングによって、ヒトPBMC由来マクロファージ上でのCCL2、IL-6、およびTNF-αの発現が低減することを示す。ヒトPBMC由来マクロファージをlnc-FAM164A1アンチセンスオリゴヌクレオチド(FAM、図11Aおよび11B)、もしくはAxolab siRNAオリゴヌクレオチド(#5および#8、図11C〜11F)、またはこれらの非特異的対照オリゴヌクレオチド(NS)で48時間トランスフェクトした後に、LPSで3〜6時間刺激した。lnc-FAM164A1 RNA(図11Aおよび11C)、IL-10 mRNA(図11B)、IL-6(図11D)、ならびにTNF-α mRNA(図11E)のレベルがRT-PCRによって検出された(P<0.05 NS-LPS対FAM-LPS; n=5〜6人の異なるドナー)。培養培地中のIL-6タンパク質(図11F)をELISAによって測定した(P<0.05 NS-LPS対#5+LPSまたは#8+LPS; n=4人の異なるドナー)。 12A〜12Lは、THP-1由来マクロファージおよびヒトPBMC由来マクロファージにおけるTNF-α、CCL2、IL-1β、およびIL-6発現に対するlnc-FAM164A1強化発現の効果を示す。ヒト単球THP-1由来マクロファージ(図12A〜12I)またはヒトPBMC由来マクロファージ(図12J〜12L)にLacZ対照アデノウイルス(Ad-lacZ)またはlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-FAM)を48時間感染させ、次いで、10ng/mL LPSによって2〜3時間刺激した。lnc-FAM164A1 RNA(図12A)ならびにTNF-α、CCL2、IL-1β、およびIL-6 mRNA(図12B、12D、12F、12H、12J、および12K)の発現レベルをRT-PCRによって確かめた。培養培地中にあるTNF-a、CCL2、IL-1β、およびIL-6のタンパク質レベルをELISAによって測定した(図12C、12E、12G、12I、および12L)(P<0.05 Ad-LacZ対Ad-FAM; n=5〜7回の異なる実験)。 図13A〜13Eは、(図13A)マウス腹膜マクロファージにLacZ対照アデノウイルス(Ad-lacZ)またはlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-FAM)を48時間感染させ、次いで、10ng/mL LPSによって3時間刺激した。(図13B〜13E)C57BL/6JマウスにLacZ対照アデノウイルス(Ad-lacZ)またはlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-FAM)を3日間感染させ、次いで、LPSによって3時間刺激した。血漿中にあるマウスIL-6の血漿レベル(図13B)をELISAによって測定した。腹膜マクロファージにおけるCCL2 mRNAの発現レベル(図13A)、ならびに肝臓におけるIL-1β、IL-6、およびTNF-α mRNAの発現レベルをRT-PCRによって確かめた(図13C〜13E)(P<0.05 Ad-LacZ対Ad-FAM; n=9〜10マウス/群)。 図14A〜14Fは、ヒト化Hu-CD34 NSG-SGM3マウスにおけるヒトCD45+WBCおよび単球の計数を示す。Hu-CD34 NSG-SGM3マウスに脂質ナノ粒子処方si-RNA対照オリゴまたはsi-lnc-FAMオリゴを投与した後に、LPS曝露を3時間行った。血液、脾臓、および骨髄におけるヒトCD45+およびマウスCD45+WBCのパーセンテージ(図14A、14C、および14E)ならびにヒトCD45+CD14+単球のパーセンテージ(図14B、14D、および14F)をフローサイトメトリーによって検出した(P<0.05、si-control+LPS対si-lnc-FAM+LPS、n=6〜7匹のマウス/群)。 図15A〜15Fは、質量分析法によって、lnc-FAM164A1に結合する3種類のタンパク質が特定されたことを示す。(図15A)MSによって検出された、ビーズ対照(ビーズ)、アンチセンスlnc-FAM164A1(アンチセンス)、およびセンスlnc-FAM164A1(センス)におけるACLY、FLG2、およびSFPQの相対的な標準化AUC(n=3、t検定によりp<0.05、センス対ビーズ;センス対アンチセンス)。ACLYサイレンシングによって、LPS活性化THP-1分化マクロファージにおいてlnc-FAM164A1強化発現によって誘導されたTNF-α発現が減少する。(図15B)LPS活性化THP-1分化マクロファージからのホールセル溶解産物のインプット対照と、ビーズ対照(ビーズ)、アンチセンスlnc-FAM164A1(アンチセンス)、およびセンスlnc-FAM164A1(センス)からの溶出タンパク質が、それぞれ、ヒトACLYおよびhnRNPA1に対する抗体を用いたウエスタンブロットによって検出された。示したデータは3回の実験を表す。(図15C〜15F)ACLYサイレンシングとlnc-FAM164A1強化発現の組み合わせをTHP-1分化マクロファージに対して行った後に、LPSによって2時間処理したか、または処理しなかった。ACLY、lnc-FAM164A1、およびTNF-αのRNA発現をRT-PCRによって評価した。培養培地中にあるTNF-αタンパク質をELISAによって測定した(3つの異なる実験からn=8〜9個の試料、一方向ANOVAによりp<0.05)。 図16A〜16Hは、活性化RAW細胞から放出したEVはマクロファージ活性化を促進することを示す。EVを、Adeno-lacZまたはAdeno-lnc-FAM164A1ウイルスに感染させたRAW細胞の培養培地から単離した。再懸濁したEVをRAW細胞と1時間インキュベートし、その後に、LPSを用いて2時間さらに刺激した。EV(図16A、16C、16E、および16G、n=3〜4試料)ならびにRAW細胞(図16B、16D、16F、および16H)にあるlnc-FAM164A1 RNAおよびマウスサイトカインmRNAの発現をRT-PCRによって検出し、GAPDH発現によって標準化した(P<0.05、Ad-lacZ+LPS2時間対Ad-FAM+LPS 2時間、2つの独立した実験からn=6個の試料)。 LPSによって24時間刺激したヒトPBMC由来マクロファージの培養培地、またはAdeno-lacZもしくはAdeno-lnc-FAM164A1ウイルスに24時間感染させ、LPSによって12時間刺激したTHP-1細胞から単離したEVを示す。EVの中にあるlnc-FAM164A1 RNAの発現をRT-PCRによって検出し、GAPDH発現によって標準化した(n=3試料)。
詳細な説明
本明細書に記載の発明は、lnc-FAM164A1のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAサイレンシングによって炎症促進性サイトカイン、例えば、CCL2/MCP-1、IL-6、およびTNF-αのLPS誘導性発現が抑制されたことに部分的に基づいている。その反対に、ヒトおよびマウスの初代マクロファージにおけるlnc-FAM164A1強化発現によってLPSによる炎症促進性サイトカインの誘導が強化された。ルシフェラーゼレポーターアッセイからlnc-FAM164A1はNF-κBシグナル伝達経路を調整することが明らかになった。lnc-FAM164A1を強化発現させると、LPSで刺激されたヒト初代マクロファージにおいて迅速なIκB-α分解が誘導され、p65の核移行が強化された。さらに、内毒素血症野生型マウスではlnc-FAM164A1発現によってTNF-αタンパク質の血漿レベルが増加した。内毒素血症のヒト化マウスモデルではLPS曝露によって血液白血球および脾臓においてlnc-FAM164A1発現が増加し、lnc-FAM164A1サイレンシングによって血漿および腹膜細胞においてヒトCCL2およびIL-6の発現が減少した。
さらに、RNAプルダウンと質量分析法の組み合わせによって3種類のタンパク質(ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);およびスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ))がlnc-FAM164A1結合タンパク質だと突き止められた研究が本明細書において説明される。本明細書に記載の研究から、インビトロで、ACLYサイレンシングによって、lnc-FAM164A1強化発現で誘導されるCCL2およびTNF-αの発現が減少することが分かる。本明細書において示された、これらのデータから、ヒトlnc-FAM164A1はACLYとの相互作用およびNF-κBシグナル伝達を介して炎症促進性のマクロファージ活性化を促進し、炎症性疾患の発病に関与する可能性があることが分かる。
非タンパク質コーディング転写物である長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA、>200nt)は、胚発生、腫瘍成長および転移、心血管代謝障害、ならびに炎症を含む非常に多くの生物学的プロセスおよびヒト疾患において思いもよらない役割を果たしている。数種類のlnc-RNAが免疫細胞、例えば、赤血球細胞、Tリンパ球、樹状細胞、および単球/マクロファージの分化の間で重要な制御因子だとみなされている。
炎症性疾患
炎症性疾患または炎症性障害は、免疫細胞、例えばマクロファージ(例えば、活性化マクロファージ)、T細胞、樹状細胞、B細胞、または好中球の活性化によって特徴付けられる。炎症性疾患は急性または慢性でもよい。一態様において、マクロファージ活性化マクロファージは、制御されていない活性化である。
マクロファージは大きな食細胞であり、自然免疫における中心的存在である。マクロファージは病原体、脂質、アポトーシス細胞、傷ついた組織を貪食し、他の免疫細胞と相互作用する能力があるために宿主防御において必要不可欠な役割を果たし、様々な炎症性疾患の発病にも寄与する。マクロファージは非常に可塑性があり、組織微小環境における細胞刺激に応じて表現型を切り替えることができる。または、マクロファージ亜集団の平衡は分子キュー(molecular cue)に応答して変化して、正常組織または病理学的組織の炎症状態を決定することができる。ヒトおよびマウスのマクロファージは数千種類のlnc-RNAを発現するが、マクロファージ活性化の調整では数種類のlnc-RNAしか特徴付けられていない。さらに、マクロファージでは、ならびに糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および内毒素血症のマウスモデルでは炎症遺伝子発現のモジュレーターとして他の数種類のマウスlnc-RNAが特定されている。
本明細書に記載の方法および組成物は対象において炎症性疾患を処置および/または予防するのに用いられる。例示的な炎症性疾患には、内毒素血症、アテローム硬化性血管疾患、冠動脈疾患、ステント再狭窄、カロチド代謝疾患、脳卒中、急性心筋梗塞、心不全、末梢動脈疾患、四肢虚血、静脈移植不全、動静脈瘻不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎;膣炎;乾癬および炎症性皮膚病、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、じんま疹;脈管炎;脊椎関節症;硬皮症;呼吸アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏症肺疾患、関節炎(例えば、関節リウマチおよび乾癬性関節炎)、湿疹、乾癬、変形性関節症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎、移植片拒絶反応(同種異系移植片拒絶反応および移植片対宿主病を含む)もしくは操作された組織の拒絶反応、感染症、筋炎、炎症性CNS障害、脳卒中、閉鎖性頭部外傷、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、肝静脈閉塞症(VOD)、出血性膀胱炎、腎炎、敗血症、類肉腫症、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、ベーチェット症候群、移植片対腫瘍効果、粘膜炎、虫垂炎、破裂性虫垂(ruptured appendix)、腹膜炎、または当技術分野において公知の他の任意の炎症性疾患が含まれるが、これに限定されない。一態様において、心臓弁膜症は大動脈弁疾患または僧帽弁疾患である。
別の態様において、炎症性疾患は組織(例えば、臓器、血管、または血液弁)または細胞の移植に応答して発生する。別の態様において、前記組織は人工組織でもよく、操作された組織でもよい。本明細書で使用する「移植」または「移植片」または「移植された」という用語は、生細胞または生組織をドナーまたは細胞培養物から、必要とする対象に移入することを指す。移植は、細胞および組織(例えば、骨髄移植)の移植および注入における熟練した医師によって行うことができる。移植することができる組織または細胞の非限定的な例には、心臓、心臓弁、血管(静脈または動脈)、骨、骨髄、軟骨、腱、靱帯、骨格筋、末梢神経組織、脳、膵臓、肝臓、腎臓、肺、気管支平滑筋、泌尿器、胃腸管、子宮、精巣、脂肪、皮膚、造血幹細胞、末梢血幹細胞などが含まれる。さらに、組織または細胞は、生存可能であり、必要とする対象への移植を可能にする細胞または組織を提供した健常ドナー対象に由来してもよい。インビトロで操作された組織は、移植する前に固体支持体上、スキャフォールド上、または組織培養プラスチックディッシュの中で培養することができる。必要とする、疾患のある対象に移植するための組織を作製するのに使用することができる、当技術分野において公知の多くの組織工学技法がある。組織移植または細胞移植を必要とする可能性がある疾患および状態には、癌、貧血(例えば、再生不良性貧血)、血液の疾患および障害(例えば、鎌状赤血球性貧血)、骨、骨格筋、皮膚などの再建手術、脊髄損傷、糖尿病、心血管疾患(例えば、弁疾患、狭窄、血管再建)、または新たな組織の移植を必要とする当技術分野において公知の他の任意の状態が含まれるが、これに限定されない。
別の態様において、炎症性疾患は、癌、例えば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫(HL)(再発性、難治性)、非ホジキンリンパ腫(NHL)(再発性、難治性)、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、または神経膠腫の結果として生じることがある。癌のさらなる非限定的な例には、癌腫(例えば、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、および小細胞癌)、肉腫(例えば、骨肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、神経線維肉腫、皮膚線維肉腫など)、リンパ腫、白血病、芽腫(例えば、肝芽腫、髄芽細胞腫、腎芽細胞腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽細胞腫、多形性神経膠芽腫、性腺芽腫)、メラノーマ、精上皮腫、平滑筋腫などが含まれる。
炎症性疾患の処置および/または予防
本明細書において提供される一局面は、対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、マクロファージにおいて発現する長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA)を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む方法である。
一態様において、lnc-RNAは、AL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);またはRP13-452N2.1である。
本明細書において提供される別の局面は、対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-FAM164Aを阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法である。
本明細書において提供される別の局面は、対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-RNA(例えば、lnc-FAM164A1)に結合するタンパク質を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法である。一態様において、前記タンパク質は、ACLY、Flg2、またはSFPQである。一態様において、前記タンパク質はACLYである。
本明細書における様々な局面の一態様において、前記方法は、投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると対象を診断する工程をさらに含む。
本明細書における様々な局面の別の態様において、前記方法は、投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると患者を診断するアッセイの結果を受け取る工程をさらに含む。特定の炎症性疾患の診断において有用なアッセイは当技術分野において公知であり、当業者によって行うことができる。一態様において、前記アッセイは、前記作用物質の少なくとも1分前、1時間前、1日前、1週間前、1ヶ月前、1年前、またはそれより前に行われる。
本明細書において提供されるさらに別の局面は、対象において炎症性疾患を処置する方法であって、(a)生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定するアッセイの結果を受け取る工程;(b)lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;(c)lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して有意に増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および(d)炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程を含む、方法である。
本明細書において提供される別の局面は、対象において炎症性疾患を処置する方法であって、(a)生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定する工程;(b)lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;(c)lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して有意に増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および(d)炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程を含む、方法である。任意の局面の一態様において、前記方法は、工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む。
一態様において、lnc-RNAは標的細胞において阻害される。一態様において、標的細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。一態様において、標的細胞は、血球、マクロファージ、活性化マクロファージ、T細胞、樹状細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または好中球を含むが、これに限定されない例示的な標的細胞でもよい。さらに、標的細胞のさらなる非限定的な例には、幹細胞、癌細胞、血管内皮、心臓細胞、心臓弁細胞、膵臓細胞、脂肪細胞、ニューロン、肝臓細胞、腎臓細胞、破骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞などが含まれ得る。当業者は、例えば、免疫蛍光または配列に基づく分析(例えば、ゲノム配列決定)を介した遺伝子発現パターンに基づいて細胞タイプを特定することができる。例示的な細胞タイプの遺伝子発現パターンは当技術分野において公知である。
マクロファージは、(1)別の細胞、微生物、もしくはその断片を貪食もしくは死滅することができた時に、ならびに/または(2)サイトカイン、例えば、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、もしくは他の任意のマクロファージ分子(例えば、プロテアーゼ、好中球走化性因子;当技術分野において公知の活性酸素種、例えば、一酸化窒素およびスーパーオキシド、エイコサノイドもしくは増殖因子)を発現もしくは放出した時に「活性化」されたとみなされる。活性化マクロファージの産物は組織破壊と炎症をもたらす。
一態様において、阻害によって前記作用物質の標的(例えば、マクロファージ上で発現したlnc-RNA、lnc-FAM164A1、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLY)のレベルまたは活性が低減する。
一態様において、マクロファージ上で発現したlnc-RNAを阻害すると、マクロファージ上で発現したlnc-RNAのレベルまたは活性が阻害される。マクロファージ上で発現したlnc-RNAの活性は、マクロファージ上で発現したlnc-RNAの現在知られている公知の活性でもよく、まだ発見されていない活性でもよい。一態様において、マクロファージ上で発現したlnc-RNAのレベルまたは活性は、適切な対照と比較して、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはそれを超えて阻害される。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質もしくは組成物と接触していないが、その他の点では同一の試料におけるマクロファージ上で発現したlnc-RNAのレベルもしくは活性である、または作用物質もしくは組成物を投与する前の対象におけるマクロファージ上で発現したlnc-RNAのレベルもしくは活性である。当業者は、リアルタイム-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、免疫組織化学、またはフローサイトメトリーによる、マクロファージ上で発現したlnc-RNAの活性、例えば、食作用およびサイトカイン発現の機能読み取り値を用いて、マクロファージ上で発現したlnc-RNAの活性が本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。当業者は、lnc-RNAのレベルを直接測定する目的でPCRに基づくアッセイ(例えば、定量PCR)を用いて、マクロファージ上で発現したlnc-RNAのレベルが本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。
一態様において、lnc-FAM164A1を阻害するとlnc-FAM164A1のレベルまたは活性が阻害される。lnc-FAM164A1活性は、lnc-FAM164A1の現在知られている、どんな活性でもよく、まだ発見されていない活性でもよい。一態様において、lnc-FAM164A1のレベルまたは活性は、適切な対照と比較して少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはそれを超えて阻害される。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質もしくは組成物と接触していないが、その他の点では同一の試料におけるlnc-FAM164A1の活性もしくはレベルである、または作用物質もしくは組成物を投与する前の対象におけるlnc-FAM164A1の活性もしくはレベルである。当業者は、リアルタイム-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、免疫組織化学、またはフローサイトメトリーによる、lnc-FAM164A1活性、例えば、食作用およびサイトカイン発現の機能読み取り値を用いて、lnc-FAM164A1活性が本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。発現の調整を示す例示的なサイトカインには、IL-1β、IL-6、またはTNF-αが含まれるが、これに限定されない。当業者は、lnc-RNAのレベルを直接測定する目的でPCRに基づくアッセイ(例えば、定量PCR)を用いて、lnc-FAM164A1のレベルが本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。
一態様において、lnc-FAM164A1を阻害するとプラズマ細胞および/または腹膜細胞においてCCL2およびIL-6の発現が減少する。当業者は、CCL2とIL-6のmRNAまたはタンパク質レベルを直接測定する目的でそれぞれPCRに基づくアッセイ(例えば、定量PCR)またはウエスタンブロッティングを用いて、適切な対照と比較して、プラズマ細胞および/または腹膜細胞においてCCL2とIL-6のレベルが本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質もしくは組成物と接触していないプラズマ細胞および/もしくは腹膜細胞におけるCCL2とIL-6のレベル、または作用物質もしくは組成物を投与する前のプラズマ細胞および/もしくは腹膜細胞におけるCCL2とIL-6のレベルを指す。当業者は、標準的な技法、例えば、プラズマ細胞および/または腹膜細胞に特異的な特定の細胞表面マーカーを対象にして細胞を選別するフローサイトメトリーを用いてプラズマ細胞および/または腹膜細胞を特定または分離することができる。例えば、プラズマ細胞はCD138、CD78、およびIL-6の発現によって特定することができ、腹膜細胞はB220、CD80、およびCD43の発現によって特定することができる。
一態様において、lnc-FAM164A1を阻害するとNFkBシグナル伝達が減少する。当業者は、NFkB標的の活性化を評価する機能読み取り値を用いて、例えば、NFkBシグナル経路活性化時に発生するp65核移入を評価してNFkBシグナル伝達を評価することができる。
一態様において、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害すると、このタンパク質のレベルまたは活性が阻害される。このタンパク質の活性は、現在知られている公知の活性でもよく、まだ発見されていない活性でもよい。一態様において、このタンパク質のレベルまたは活性は、適切な対照と比較して少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはそれを超えて阻害される。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質もしくは組成物と接触していないが、その他の点では同一の試料における前記タンパク質の活性もしくはレベルである、または作用物質もしくは組成物を投与する前の対象における前記タンパク質のレベルもしくは活性である。当業者は、前記タンパク質の活性の機能読み取り値を用いて、前記タンパク質の活性が本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。当業者は、前記タンパク質のmRNAまたはタンパク質レベルを直接測定する目的でそれぞれPCRに基づくアッセイ(例えば、定量PCR)またはウエスタンブロッティングを用いて、前記タンパク質のレベルが本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。
一態様において、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害すると、前記タンパク質とlnc-RNA、例えば、lnc-FAM164A1との結合が阻害される。一態様において、前記タンパク質とlnc-RNAとの結合は、適切な対照と比較して少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはそれを超えて阻害される。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質もしくは組成物と接触していないが、その他の点では同一の試料における前記タンパク質とlnc-RNAとの結合であるか、または作用物質もしくは組成物を投与する前の対象における前記タンパク質とlnc-RNAとの結合である。当業者は、ACLY結合、例えば、ACLYとlnc-RNAの免疫共沈の機能読み取り値を用いて、前記タンパク質とlnc-RNAとの結合が本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。
一態様において、ACLYを阻害するとACLYのレベルまたは活性が阻害される。ACLY活性はACLYの現在知られている公知の活性でもよく、まだ発見されていない活性でもよい。一態様において、ACLYレベルまたは活性は、適切な対照と比較して、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはそれを超えて阻害される。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質もしくは組成物と接触していないが、その他の点では同一の試料におけるACLYの活性もしくはレベルであろう、または作用物質もしくは組成物を投与する前の対象におけるACLYの活性もしくはレベルである。当業者は、ACLY活性、例えば、クエン酸およびCoAからアセチル-CoAおよびオキサロ酢酸への変換、ならびにATP加水分解を触媒するACLY活性の機能読み取り値を用いて、ACLY活性が本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。当業者は、ACLYのmRNAまたはタンパク質レベルを直接測定する目的でそれぞれPCRに基づくアッセイ(例えば、定量PCR)またはウエスタンブロッティングを用いて、ACLYのレベルが本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。
一態様において、ACLYを阻害すると、ACLYとlnc-RNA、例えば、lnc-FAM164A1との結合が阻害される。一態様において、ACLYとlnc-RNAとの結合は、適切な対照と比較して少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはそれを超えて阻害される。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質または組成物と接触していないが、その他の点では同一の試料におけるACLYとlnc-RNAとの結合であろう、または作用物質もしくは組成物を投与する前の対象におけるACLYとlnc-RNAとの結合である。当業者は、ACLY結合、例えば、ACLYおよびlnc-RNAの免疫共沈の機能読み取り値を用いて、ACLYとlnc-RNAとの結合が本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。
一態様において、ACLYを阻害すると、対象におけるCCL2およびTNF-αの発現が減少する。当業者は、CCL2およびTNF-αのmRNAまたはタンパク質レベルを直接測定する目的でそれぞれPCRに基づくアッセイ(例えば、定量PCR)またはウエスタンブロッティングを用いて、適切な対照と比較して、CCL2およびTNF-αのレベルが本明細書に記載の作用物質または組成物を投与した後に低減したかどうか確かめることができる。本明細書で使用する適切な対照は、本明細書に記載の作用物質または組成物と接触していない生物学的試料におけるCCL2およびTNF-αのレベル、または前記作用物質もしくは組成物を投与する前のプラズマ細胞および/または腹膜細胞におけるCCL2およびTNF-αのレベルを指す。
一態様において、対象は炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがある。一態様において、対象は炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがない。対象には、ある特定の炎症性疾患に対する処置または治療剤が以前に与えられたことがあってもよい。
一態様において、対象は、炎症性疾患を発症する少なくとも1つの危険因子を示す。炎症性疾患の例示的な危険因子は当技術分野において公知であり、当業者によって適切に評価することができる。
敗血症は、命にかかわる可能性のある感染合併症である。敗血症は、感染症と闘うために血流中に放出された化学物質が体全体に炎症応答を誘発する時に発生する。この炎症は、複数の臓器系を傷つけて働かなくすることができる変化のカスケードを誘発することができる。別の局面は、敗血症を有する対象を同定する方法であって、(a)生物学的試料中のlnc-FAM164A1のレベルを測定する工程;(b)lnc-FAM164A1のレベルを参照レベルと比較する工程;(c)lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して有意に増加していれば、対象を敗血症を有すると同定する工程;および(d)敗血症を有する対象に、敗血症を処置する治療を施す工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記方法は、工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む。一態様において、生物学的試料は血液試料である。
作用物質
様々な態様において、炎症性疾患を処置または予防するために対象に投与される作用物質は、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、lnc-FAM164A1、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYを阻害する。
一態様において、炎症性疾患を処置または予防するために、対象には、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAを阻害する作用物質が投与される。一態様において、lnc-RNAは、AL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);またはRP13-452N2.1である。本明細書に記載の作用物質は、例えば、投与された時にマクロファージにおいて発現するlnc-RNAの存在、量、活性、および/またはレベルを阻害すれば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAを阻害するのに有効だとみなされる。
一態様において、炎症性疾患を処置または予防するために、対象には、lnc-FAM164A1を阻害する作用物質が投与される。本明細書に記載の作用物質は、例えば、投与された時に細胞中にあるlnc-FAM164A1の存在、量、活性、および/またはレベルを阻害すれば、lnc-FAM164A1を阻害するのに有効だとみなされる。
さらに別の態様において、炎症性疾患を処置または予防するために、対象には、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する作用物質が投与される。本明細書に記載の作用物質は、例えば、投与された時に細胞中にあるタンパク質の存在、量、結合、活性、および/またはレベルを阻害すれば、lnc-RNAに結合するタンパク質に対して有効だとみなされる。
さらに別の態様において、炎症性疾患を処置または予防するために、対象には、ACLYを阻害する作用物質が投与される。本明細書に記載の作用物質は、例えば、投与された時に細胞におけるACLYの存在、量、結合、活性、および/またはレベルを阻害すれば、ACLYを阻害するのに有効だとみなされる。
一態様において、前記作用物質は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、および阻害性ポリペプチドである。一態様において、RNAiはマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである。
作用物質は、例えば、細胞において、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAまたはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYの転写を阻害することができる。作用物質は、(例えば、活性がもはや生じないように、(例えば、野生型lnc-RNAもしくはlnc-FAM164A1活性と比較して)もはや適切に生じないように、または(例えば、マクロファージでのlnc-RNA発現もしくはACLY発現を)細胞において低速で生じるように)活性を阻害してもよく、活性を変えてもよい。
前記作用物質は、直接、投与された形で機能してもよい。または、前記作用物質は、例えば、マクロファージにおけるlnc-RNAまたはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYを阻害する何かを生じるように細胞内で改変または利用することができる。例えば、細胞への核酸配列の導入と、その転写によってマクロファーではlnc-RNA、または細胞内ではACLYの核酸阻害剤および/またはタンパク質阻害剤が生じる。一部の態様において、前記作用物質は、合成および天然の非タンパク質実体を含むが、それに限定されるわけではない任意の化学的実体または化学的部分である。ある特定の態様において、前記作用物質は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分には、マクロライド、レプトマイシン、およびその関連する天然産物または類似体を含む非置換または置換のアルキル部分、芳香族部分、またはヘテロシクリル部分が含まれた。作用物質は、望ましい活性および/または特性を有することが分かっていてもよく、多種多様な化合物のライブラリーから特定されてもよい。
様々な態様において、前記作用物質は、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAまたはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYを阻害する小分子である。本明細書で使用する「小分子」という用語は、約10,000グラム/モル未満の分子量を有するペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物、または無機化合物(例えば、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、約5,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約1,000グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約500グラム/モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を含み得るが、これに限定されない化学薬品を指す。小分子をスクリーニングするための方法は当技術分野において公知であり、例えば、lnc-RNA(例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA)もしくはACLYの活性もしくはレベルの阻害において効率的な、または望ましい標的(例えば、lnc-FAM164A1)が与えられたらACLYとlnc-RNAとの結合において効率的な小分子を特定するのに使用することができる。
一態様において、ACLYの小分子阻害剤は、SB204990、BMS303141、およびMEDICA16(例えば、Tocris;Minneapolis, MNから入手可能)、ならびにベンペド酸(Bempedoic acid)である。ACLY阻害剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Granchi, C. European Journal of Medicial Chemistry. (2018) 157: 1276-1291においてさらに説明される。
一態様において、lnc-FAM164A1を阻害する小分子はNFkBシグナル伝達経路阻害剤である。一態様において、lnc-FAM164A1を阻害する小分子はNFkBシグナル伝達経路阻害剤Bay11-7802である。
一態様において、前記作用物質は、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAまたはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYに特異的な抗体もしくはその抗原結合断片または抗体試薬である。本明細書で使用する「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ある特定の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含んでもよい。任意の局面の一部の態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含んでもよい。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)と、軽(L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)を含んでもよい。別の例では、抗体は2つの重(H)鎖可変領域および2つの軽(L)鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片(例えば、単鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、CDR、ならびにドメイン抗体(dAb)断片(例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照されたい;これはその全体が本明細書において参照により組み入れられる))ならびに完全抗体を含む。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、またはIgM(ならびにそのサブタイプおよび組み合わせ)の構造特徴を有してもよい。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、ならびに霊長類(ヒトおよび非ヒト霊長類)ならびに霊長類化抗体を含む任意の供給源に由来してもよい。抗体はまた、ミディボディ(midibody)、ナノボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含む。
一態様において、前記作用物質は、ヒト化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または抗体試薬である。本明細書で使用する「ヒト化」とは、ヒトにおいて天然に産生する抗体変種との類似性を高めるように、タンパク質配列が改変されている、非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ヒツジなど)に由来する抗体を指す。一態様において、ヒト化抗体はヒト化モノクローナル抗体である。一態様において、ヒト化抗体はヒト化ポリクローナル抗体である。一態様において、ヒト化抗体は治療用である。
一態様において、マクロファージ上で発現したlnc-RNAを阻害する抗lnc-RNA抗体は、当技術分野において任意の公知の抗lnc-RNA抗体、またはまだ発見されていない任意の抗lnc-FAM164A1抗体である。一態様において、抗lnc-FAM164A1抗体は、任意の公知の、またはまだ発見されていない非ヒト抗lnc-FAM164A1抗体に由来するヒト化抗lnc-FAM164A1抗体である。
一態様において、抗lnc-FAM164A1抗体は、当技術分野において任意の公知の抗lnc-FAM164A1抗体、またはまだ発見されていない任意の抗lnc-FAM164A1抗体である。一態様において、抗lnc-FAM164A1抗体は、任意の公知の非ヒト抗lnc-FAM164A1抗体、またはまだ発見されていない非ヒト抗lnc-FAM164A1抗体に由来するヒト化抗lnc-FAM164A1抗体である。
別の態様において、抗LNC-FAM164A1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:1の配列を含むヌクレオチド配列に結合するか、またはSEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくはそれより大きな配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列に結合する。一態様において、抗lnc-FAM164A1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:1の全配列を含むヌクレオチド配列に結合する。別の態様において、前記抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:1の配列の断片を含むヌクレオチド配列に結合し、前記断片は、その標的、例えば、lnc-FAM164A1に結合し、lnc-FAM164A1のレベルおよび/または活性を阻害するのに十分なものである。
SEQ ID NO:1は、lnc-FAM64A1のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
一態様において、抗ACLY抗体は、当技術分野において任意の公知の抗ACLY抗体、またはまだ発見されていない任意の抗ACLY抗体である。一態様において、抗ACLY抗体は、任意の公知の、またはまだ発見されていない非ヒト抗ACLY抗体に由来するヒト化抗ACLY抗体である。抗ACLYモノクローナル抗体クローン、例えば、抗ACLY抗体クローンOTI3G8、4H6L2、5F8D11、および4D11は当技術分野において公知である。これらの抗ACLYモノクローナル抗体クローンの構造、配列、および機能は当技術分野において公知である。
別の態様において、抗ACLY抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:2の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、またはSEQ ID NO:2の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくはそれより大きな配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一態様において、抗ACLY抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:2の全配列を含むアミノ酸配列に結合する。別の態様において、抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:2の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、断片は、その標的、例えば、ACLYに結合するのに十分であり、ACLYのレベルおよび/または活性を阻害する。
SEQ ID NO:2は、ACLYをコードするアミノ酸配列である。
Figure 2020536902
一態様において、前記作用物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、DNA配列またはmRNA配列に相補的な合成核酸配列、例えば、マイクロRNAの合成核酸配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、DNA標的またはRNA標的に結合し、転写、翻訳、またはスプライシングのレベルで発現を止めることで標的の発現をブロックするように設計されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で、遺伝子、例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYにハイブリダイズするように設計された相補的核酸配列である。従って、標的に十分に相補的な、すなわち、望ましい効果を生じるように十分に良好にハイブリダイズし、細胞環境の状況において十分な特異性を有するオリゴヌクレオチドが選択される。
一態様において、lnc-FAM164A1を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトlnc-FAM164A1遺伝子のコード配列の一部に相補的な、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、またはそれより多くの塩基を含んでもよい。一態様において、lnc-FAM164A1遺伝子のコード配列はSEQ ID NO:1の配列である。
一態様において、ACLYを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトACLY遺伝子のコード配列の一部に相補的な少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、またはそれより多くの塩基を含んでもよい。一態様において、ACLY遺伝子のコード配列はSEQ ID NO:3の配列である。
SEQ ID NO:3は、ACLYのヌクレオチド配列、例えば、アイソフォーム1のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
一態様において、FGL2を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトFGL2遺伝子のコード配列の一部に相補的な少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、またはそれより多くの塩基を含んでもよい。一態様において、FGL2遺伝子のコード配列はSEQ ID NO:38の配列である。
SEQ ID NO:38は、FGL2遺伝子のヌクレオチド配列(NM_001014342.2ヒトフィラグリンファミリーメンバー2(FLG2)、mRNA)である。
Figure 2020536902
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一態様において、SFPQを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトSFPQ遺伝子のコード配列の一部に相補的な少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、またはそれより多くの塩基を含んでもよい。一態様において、SFPQ遺伝子のコード配列はSEQ ID NO:39の配列である。
SEQ ID NO:39は、SFPQ遺伝子のヌクレオチド配列(mRNA(cDNAクローンMGC:57191 IMAGE:5262885)、完全cds)である。
Figure 2020536902
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一態様において、望ましい標的(例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLY)は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、メガヌクレアーゼ、およびCRISPR/Cas系を含むが、これに限定されない任意のゲノム編集系を用いて細胞ゲノムから欠失される。一態様において、1つまたは複数のガイドRNAをコードする核酸を細胞ゲノムに組み込むのに用いられるゲノム編集系はCRISPR/Cas系ではない。これは、少量のCas酵素/タンパク質を保持している細胞において望ましくない細胞死を阻止することができる。Cas酵素またはsgRNAがそれぞれ、異なる誘導性プロモーターの制御下で発現され、それによって、このような介入を阻止するために、それぞれの一過的発現が可能になることも本明細書において意図される。
1つまたは複数のsgRNAをコードする核酸と、RNAガイドエンドヌクレアーゼをコードする核酸がそれぞれインビボで投与される必要がある時に、アデノウイルス関連ベクター(AAV)の使用が特に意図される。核酸をゲノム編集/断片化系の両成分(例えば、sgRNA、RNAガイドエンドヌクレアーゼ)に同時送達するための他のベクターには、レンチウイルスベクター、例えば、エプスタインバー、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、およびB型肝炎ウイルス(HBV)が含まれる。RNAガイドゲノム編集系の各成分(例えば、sgRNAおよびエンドヌクレアーゼ)は、当技術分野において公知のように、または本明細書に記載のように別々のベクターの中に入れて送達されてもよい。
一態様において、望ましい標的(例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLY)はRNA阻害によって阻害される。一態様において、核酸分子は、アンチセンスRNA、RNA干渉(RNAi)分子、RNAデコイ分子、またはRNAアプタマーである。ある特定の遺伝子の発現の阻害剤は阻害性核酸でもよい。任意の局面の一部の態様において、阻害性核酸は阻害性RNA(iRNA)である。RNAiは一本鎖でも二本鎖でもよい。
iRNAは、siRNA、shRNA、内因性マイクロRNA(miRNA)、または人工miRNAでもよい。一態様において、本明細書に記載のiRNAは、標的、例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYの発現および/または活性の阻害をもたらす。
当業者は、望ましい標的、例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはACLYに対するsiRNA、shRNA、またはmiRNAを、例えば、公的に入手可能な設計ツールを用いて設計することができるだろう。siRNA、shRNA、またはmiRNAは、一般的に、Dharmacon(Layfayette, CO)またはSigma Aldrich(St. Louis, MO)などの会社を利用して作られる。
一態様において、lnc-FAM164A1を阻害するsiRNAオリゴはSEQ ID NO:5または7の配列を有する。
一態様において、FLG2を阻害するsiRNAオリゴはSEQ ID NO:40-45の配列を有する。
Figure 2020536902
一態様において、SFPQを阻害するsiRNAオリゴはSEQ ID NO:46-51の配列を有する。
Figure 2020536902
任意の局面の一部の態様において、iRNAはdsRNAでもよい。dsRNAは、dsRNAが用いられる条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な2本のRNA鎖を含む。dsRNAのうちの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に実質的に相補的であり、一般的には完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されるmRNAの配列に由来してもよい。他方の鎖(センス鎖)は、2本の鎖がハイブリダイズし、適切な条件下で組み合わされた時に二重鎖構造を形成するような、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。
iRNAのRNAは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に改変することができる。本発明において特徴付けられる核酸は、当技術分野において十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、「Current protocols in nucleic acid chemistry」, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載の方法によって合成および/または改変されてもよい。
一態様において、前記作用物質は、望ましい標的、例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYを阻害するmiRNAである。マイクロRNAは、平均の長さが22ヌクレオチドである小さなノンコーディングRNAである。これらの分子は、通常、3′非翻訳(3′UTR)領域にある、mRNA分子内の相補配列に結合することによって作用し、それによって、標的mRNA分解が促進されるか、またはmRNA翻訳が阻害される。マイクロRNAとmRNAの間の相互作用は、不完全なワトソン・クリック塩基対合を介してmRNAとの配列特異的結合を誘導するマイクロRNAの6〜8ヌクレオチド領域である「シード配列(seed sequence)」として知られるものによって媒介される。900種類を超えるマイクロRNAが哺乳動物において発現することが知られている。これらの多くはシード配列に基づいてファミリーに分類することができ、それによって、類似するマイクロRNAの「クラスター」が特定されている。miRNAは細胞内で、例えば、裸のDNAとして発現されてもよい。miRNAは細胞内で、例えば、裸のDNAとして、発現された核酸によってコードされてもよく、ベクター内に含まれる核酸によってコードされてもよい。
一態様において、前記作用物質、例えば、miRNAは、SEQ ID NO:1の配列に対応する配列を有するか、SEQ ID NO:1の配列を含むか、またはSEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の配列同一性を有し、SEQ ID NO:1の配列と同じ活性を有する(例えば、lnc-FAM164A1を阻害する)配列を含む。
一態様において、前記作用物質、例えば、miRNAは、SEQ ID NO:2の配列に対応する配列を有するか、SEQ ID NO:2の配列を含むか、またはSEQ ID NO:2の配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の配列同一性を有し、SEQ ID NO:2の配列と同じ活性を有する(例えば、ACLYを阻害する)配列を含む。
前記作用物質は、例えば、RNAi分子(例えば、siRNAまたはmiRNA)と共に、標的遺伝子(例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLY)の遺伝子サイレンシングをもたらす可能性がある。これは、細胞内の標的のmRNAレベルを、前記作用物質が存在しない細胞において見出されるmRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％分だけ減少させることを伴う。好ましい一態様において、mRNAレベルは、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約99％、少なくとも約100％分だけ減少する。当業者は、siRNA、shRNA、またはmiRNAが、例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNAまたはACLYをダウンレギュレートするために効果的に標的化しているかどうかを、例えば、トランスフェクションによってsiRNA、shRNA、またはmiRNAを細胞に導入し、細胞内で見出される遺伝子(例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、またはACLY)のレベルを、PCRに基づくアッセイを介して適切な対照と比較して検出することによって容易に評価することができる。本明細書で使用する適切な対照は、iRNAもしくはRNAi分子で処理されていない細胞、または非標的iRNAもしくはRNAi分子(例えば、対照iRNAもしくはRNAi分子)で処理された細胞である。
前記作用物質はベクターに含まれてもよく、従って、ベクターをさらに含む。外因性遺伝子を標的哺乳動物細胞に移入するのに有用な多くのこのようなベクターが利用可能である。ベクターは、エピソーム、例えば、プラスミド、ウイルス由来ベクター、例えば、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどでもよく、相同組換えまたはランダム組込み、例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えば、MMLV、HIV-1、ALVなどによって標的細胞ゲノムに組み込まれてもよい。一部の態様では、レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株の組み合わせも用いられることがあり、この場合、標的細胞に感染するためにキャプシドタンパク質が機能する。通常、細胞およびウイルスは培養培地中で少なくとも約24時間インキュベートされる。次いで、細胞は、ある用途では短い期間にわたって、例えば、24〜73時間、または少なくとも2週間にわたって培養培地中で増殖され、分析前に5週間以上にわたって増殖されることがある。一般的に用いられるレトロウイルスベクターは「欠損」している、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製はパッケージング細胞株における増殖を必要とする。
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、宿主細胞に送達するように設計された、または異なる宿主細胞間で移動するように設計された核酸構築物を指す。本明細書で使用するベクターはウイルスベクターでもよく、非ウイルスベクターでもよい。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと結合した時に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移入することができる任意の遺伝因子を含む。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ得るが、これに限定されない。
本明細書で使用する「発現ベクター」という用語は、ベクター上で転写調節配列と連結された、ベクターの中に含まれる核酸配列から、本明細書に記載のRNAまたはポリペプチドの発現を誘導するベクターを指す。発現される配列は細胞に対して異種であることが多いが、必ずそうであるとは限らない。発現ベクターはさらなるエレメントを含んでもよく、例えば、発現ベクターは2つの複製系を有し、従って、発現ベクターを2種類の生物において、例えば、発現用にヒト細胞において、クローニング用および増幅用に原核生物宿主において維持することが可能になる。「発現」という用語は、該当する場合は、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳およびタンパク質フォールディング、修飾、ならびにプロセシングを含むが、これに限定されない、RNAおよびタンパク質の産生に関与し、適宜、タンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適切な制御配列と機能的に連結された時に、インビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列(DNA)を意味する。遺伝子は、コード領域の前後にある領域、例えば、5’非翻訳(5’UTR)または「リーダー」配列および3’UTRまたは「トレイラー(trailer)」配列、ならびに個々のコードセグメント(エキソン)間の介在配列(イントロン)を含んでもよく、含まなくてもよい。
組込み型ベクターによって、送達されたRNA/DNAは宿主細胞染色体に永久に組み込まれる。非組込み型ベクターはエピソームのままである。エピソームとは、ベクターに含まれる核酸が宿主細胞染色体に決して組み込まれないことを意味する。組込み型ベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。
非組込み型ベクターの一例は非組込み型ウイルスベクターである。非組込み型ウイルスベクターはゲノムを宿主DNAに組み込まないので、組込み型レトロウイルスがもたらすリスクを無くす。一例は、限られた自己複製が可能であり、哺乳動物細胞において機能することが知られているエプスタインバーoriP/核抗原-1(「EBNA1」)ベクターである。エプスタイン-バーウイルスに由来する2つのエレメントであるoriPおよびEBNA1を含有するので、EBNA1タンパク質とウイルスレプリコン領域oriPが結合すると、哺乳動物細胞においてプラスミドが比較的長期間わたってエピソームで存在することが維持される。この独特のoriP/EBNA1ベクター特徴のために、oriP/EBNA1ベクターは、組込みが無い細胞を作製するのに理想的である。別の非組込み型ウイルスベクターはアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
別の非組込み型ウイルスベクターは、感染細胞の核に入ることなくタンパク質を産生することができるRNAセンダイウイルスベクターである。F欠損センダイウイルスベクターは数継代にわたって感染細胞の細胞質に残るが、素早く希釈され、数継代(例えば、10継代)の後に完全に失われる。
非組込み型ベクターの別の例はミニサークルベクターである。ミニサークルベクターは、プラスミドバックボーンが放出されて、真核生物プロモーターと、発現させようとするcDNAしか残っていない環状化ベクターである。
本明細書で使用する「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス由来の少なくとも1つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。このウイルスベクターは、必須でないウイルス遺伝子に代わりに、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。このベクターおよび/または粒子はインビトロまたはインビボで核酸を細胞に移入する目的で利用されてもよい。非常に多くの形態のウイルスベクターが当技術分野において公知である。
さらに、本明細書に記載の様々な態様では、説明されたあらゆる特定のポリペプチドの変種(天然もしくはそれ以外)、対立遺伝子、ホモログ、保存的に改変された変種、および/または保存的置換変種が包含されることが意図される。アミノ酸配列について、当業者は、開示された配列において１個のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変える、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、変化によってアミノ酸と化学的に類似するアミノ酸が置換され、ポリペプチドの望ましい活性が保持されている「保存的に改変された変種」であることを認識する。このような保存的に改変された変種は、本開示と一致する多型変種、種間ホモログ、および対立遺伝子に加わり、これらを排除しない。
ある特定のアミノ酸は、類似する物理化学的特徴を有する残基と交換することができる、例えば、ある脂肪族残基を別のもので(例えば、Ile、Val、Leu、もしくはAlaを別のもので)置換することができる、またはある極性残基を別のもので(例えば、LysとArgの間で;GluとAspの間で;またはGlnとAsnの間で)置換することができる。他のこのような保存的置換、例えば、類似する疎水性特徴を有する全領域の置換が周知である。天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドの望ましい活性、例えば、リガンドを介した受容体活性および特異性が保持されていることを確認するために、保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを、本明細書に記載のアッセイのいずれか1つにおいて試験することができる。
アミノ酸は側鎖の特性の類似性に従って分類することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)無電荷極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性:Asp(D)、Glu(E);(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。または、天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて、(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖方向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;(6)芳香族:Trp、Tyr、Pheに分類することができる。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。特定の保存的置換には、例えば、Ala→GlyまたはSer;Arg→Lys;Asn→Glnまたは→His;Asp→Glu;Cys→Ser;Gln→Asn;Glu→Asp;Gly→Alaまたは→Pro;His→Asnまたは→Gln;Ile→Leuまたは→Val;Leu→Ileまたは→Val;Lys→Arg、→Glnまたは→Glu;Met→Leu、→Tyrまたは→Ile;Phe→Met、→Leuまたは→Tyr;Ser→Thr;Thr→Ser;Trp→Tyr;Tyr→Trp;および/またはPhe→Val、→Ileまたは→Leuが含まれる。
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチド(またはこのようなポリペプチドをコードする核酸)は、本明細書に記載のアミノ酸配列の1つの機能的断片でもよい。本明細書で使用する「機能的断片」は、当技術分野において公知の、または本明細書の下記のアッセイに従って野生型参照ポリペプチド活性の少なくとも50％を保持しているペプチドの断片またはセグメントである。機能的断片は、本明細書において開示される配列の保存的置換を含んでもよい。
一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドまたは分子の変種でもよい。一部の態様において、変種は、保存的に修飾された変種である。保存的置換変種は、例えば、天然ヌクレオチド配列の変異によって得られてもよい。本明細書において言及される「変種」は、天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドに実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入、または置換があるために天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種ポリペプチドをコードするDNA配列は、天然DNA配列または参照DNA配列と比較した場合に、ヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、非変種ポリペプチドの活性を保持している変種タンパク質またはその断片をコードする配列を含む。多種多様なPCRベース部位特異的変異誘発アプローチが当技術分野において公知であり、当業者によって適用することができる。
変種アミノ酸配列または変種DNA配列は、天然配列または参照配列と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％同一でもよい。天然配列と変異配列の間の相同性の程度(パーセント同一性)は、例えば、ワールドワイドウェブ上で、この目的で一般的に用いられる無料公開されているコンピュータプログラム(例えば、BLASTpまたはBLASTnとデフォルト設定)を用いて2つの配列を比較することによって決定することができる。
天然アミノ酸配列の変化は、当技術分野において公知の多数の技法のどれでも成し遂げることができる。変異は、例えば、天然配列の断片との連結を可能にする制限部位が隣接した、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入することができる。連結後に、結果として生じた、再構築された配列は、望ましいアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。または、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的な変異誘発手順を用いて、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って変化した特定のコドンを有する変化したヌクレオチド配列を提供することができる。このような変化を加える技法は十分に確立されており、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981);ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号によって開示された技法を含む。ポリペプチドの酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止するために、この分子の適切なコンホメーションの維持に関与しない、あらゆるシステイン残基も一般的にセリンを用いて置換することもできる。その反対に、ポリペプチドの安定性を改善するか、またはオリゴマー化を容易にするためにシステイン結合をポリペプチドに付加することができる。
薬学的組成物
一局面は、本明細書に記載の任意の作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。一態様において、前記組成物は、本明細書に記載の少なくとも1種類の作用物質を含む。
一態様において、前記組成物は炎症性疾患を処置または予防するために処方される。
別の態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物を必要とする、炎症性疾患がある対象に投与され、薬学的組成物は疾患の少なくとも1つの症状を50％減少させる。
一態様において、薬学的組成物は、炎症性疾患を有するリスクがある対象に投与される。
薬学的組成物は脂質ビヒクルをさらに含んでもよい。例示的な脂質ビヒクルには、リポソーム、ミセル、エキソソーム、脂質エマルジョン、および脂質-薬物複合体が含まれるが、これに限定されない。
一態様において、前記組成物は粒子またはポリマーベースのビヒクルをさらに含む。例示的な粒子またはポリマーベースのビヒクルには、ナノ粒子、微粒子、ポリマーマイクロスフェア、またはポリマー-薬物結合体が含まれるが、これに限定されない。
投与
一部の態様において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のように、標的、例えば、マクロファージにおいて発現するlnc-RNA、lnc-FAM164A1、またはlnc-RNAに結合するタンパク質、例えば、ACLYを阻害する作用物質を投与する工程を含む、炎症性疾患を有する対象または炎症性疾患を有すると診断された対象を処置する工程に関する。炎症性疾患を有する対象は、状態を診断する現行の方法を用いて医師によって特定することができる。この疾患を特徴付け、診断を助ける炎症性疾患の症状および/または合併症は当技術分野において周知であり、発熱、疲労、疼痛、発疹、嘔吐、息切れ、胃腸不快感、心血管合併症、または血圧の上昇もしくは低下を含むが、これに限定されない。診断、例えば、炎症性疾患の診断を助けることができる検査には、例として、血液検査、非侵襲的画像化、および/または組織生検が含まれるが、これに限定されない。炎症性疾患の家族歴も、対象が状態を有する可能性が高いかどうかの決定または炎症性疾患の診断も助ける。
(例えば、本明細書に記載の標的を阻害する)本明細書に記載の作用物質および組成物は、炎症性疾患を有する対象または炎症性疾患を有すると診断された対象に投与することができる。一部の態様において、本明細書に記載の方法は、炎症性疾患の少なくとも1つの症状を緩和するために有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む。本明細書で使用する「炎症性疾患の少なくとも1つの症状を緩和する」とは、この疾患に関連する任意の状態または症状(例えば、発熱、疲労、疼痛、発疹、嘔吐、息切れなど)を寛解することである。同等の未処置対照と比較した場合に、このような低減は、任意の標準技法によって測定された時に少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％、またはそれより多く低減することである。本明細書に記載の作用物質および組成物を対象に投与するための様々な手段が当業者に公知である。
一態様において、前記作用物質は全身に投与されるか、または局所に(例えば、標的臓器に)投与される。一態様において、前記作用物質は静脈内投与される。一態様において、前記作用物質は連続して、間隔を開けて、または散発的に投与される。前記作用物質の投与経路は、送達されている作用物質のタイプ(例えば、miRNA、小分子、またはRNAi)に最適化され、当業者によって決定することができる。
本明細書で使用する「有効量」という用語は、疾患の少なくとも1つまたは複数の症状を緩和するのに必要な本明細書に記載の作用物質またはその組成物の量を、炎症性疾患を有する対象または炎症性疾患を有すると診断された対象に投与できることを指す。従って、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与された時に特定の抗炎症性疾患効果をもたらすのに十分な、作用物質または組成物の量を指す。様々な文脈において本明細書で使用する有効量は、疾患の症状の発症を遅らせる、疾患の症状の経過を変える(例えば、炎症性疾患の進行を減速させる)、または疾患の症状を逆転させる(例えば、炎症性疾患の症状を治すか、もしくは止める)のに十分な作用物質の量も含むだろう。従って、一般的に、正確な「有効量」を明記することは実現不可能である。しかしながら、どのような場合についても、当業者は日常的な実験しか用いずに適切な「有効量」を決定することができる。
一態様において、前記作用物質または組成物は連続して(例えば、ある期間にわたって一定レベルで)投与される。作用物質の連続投与は、例えば、表皮パッチ、連続放出製剤、またはオンボディインジェクタ(on-body injector)によって成し遂げることができる。
一態様において、前記作用物質または組成物は間隔を開けて(例えば、ある期間にわたって様々なレベルで)投与される。
有効量、毒性、および治療効力は細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順によって評価することができる。投与量は、使用されている剤形および利用されている投与経路に応じて変化することがある。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、比LD50/ED50で表すことができる。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療的に有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイから評価することができる。同様に、用量は、細胞培養または適切な動物モデルにおいて求められたIC50を含む循環血漿中濃度範囲(すなわち、症状の最大半量阻害に達する前記作用物質の濃度)に達するように動物モデルにおいて処方することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、特に、適切なバイオアッセイ、例えば、神経学的機能を測定するバイオアッセイによって、または血液検査によってモニタリングすることができる。投与量は医師によって決定し、必要に応じて、処置の観察された効果に合うように調節することができる。
投与量
「単位剤形」は、この用語が本明細書において用いられる時には、適切な1回の投与のための投与量を指す。例として、単位剤形は、送達装置、例えば、注射器または静脈ドリップバッグ(intravenous drip bag)に配置される治療剤の量の場合がある。一態様において、単位剤形は単回投与で投与される。別の態様において、複数の単位剤形が同時に投与されてもよい。
本明細書に記載の作用物質の投与量は医師によって決定し、必要に応じて、処置の観察された効果に合うように調節することができる。処置の期間および頻度に関して、処置によって治療利益が得られている時を確かめるために、およびさらなる細胞を投与するか、処置を中断するか、処置を再開するか、または処置レジメンに他の変更を加えるかどうか決定するために、技量のある臨床家が対象をモニタリングすることはよくある。投与量は、サイトカイン放出症候群などの有害な副作用を引き起こすほどの量であってはならない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別によって変化し、当業者によって決定することができる。投与量はまた、任意の合併症が起きた場合には1人1人の医師によって調整することもできる。
組み合わせ療法
一態様において、本明細書に記載の作用物質または組成物は単独療法として用いられる。一態様において、本明細書に記載の作用物質は、炎症性疾患のための他の公知の作用物質および療法と組み合わせて使用することができる。本明細書で使用する「組み合わせて」投与されるとは、対象が障害に苦しんでいる間に2つの(またはそれより多い)異なる処置が対象に送達されることを意味する、例えば、対象が障害(炎症性疾患)と診断された後に、および障害が治癒もしくは排除される前に、または他の処置が他の理由で止まる前に2つ以上の処置が送達されることを意味する。一部の態様において、投与期間に重複があるように、第2の送達が開始する時に、ある処置の送達が依然として行われている。これは本明細書において「同時の」または「同時発生的送達」と呼ばれる時がある。他の態様では、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が開始する前に終了する。どちらの場合の一部の態様でも、組み合わされた投与のために処置の効果が高まる。例えば、第2の処置の方が効果が高い。例えば、第1の処置の非存在下で第2の処置が投与された場合に見られる効果と等価な効果が第2の処置では見られないか、もしくは第1の処置の非存在下で第2の処置が投与された場合に見られる効果よりも大きな程度で第2の処置が症状を低減するか、または同様の状況が第1の処置で見られる。一部の態様において、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメータの低減が、他方の処置の非存在下で送達された一方の処置で観察されたものよりも大きくなるような送達である。2つの処置の効果は部分的に相加的でもよく、全体的に相加的でもよく、相加効果より大きくてもよい。送達は、第2の処置が送達された時に、送達された第1の処置の効果が依然として検出可能になるようなものでもよい。本明細書に記載の作用物質と、少なくとも1つのさらなる療法が同じ組成物に入れて、または別々の組成物に入れて同時に投与されてもよく、連続して投与されてもよい。連続投与の場合、最初に本明細書に記載の作用物質が投与されてもよく、2番目に、さらなる作用物質が投与されてもよく、または投与の順序が反対になってもよい。前記作用物質および/または他の治療剤、手順、もしくはモダリティーは活動性障害の間に投与されてもよく、軽快、もしくは活動性でない疾患の間に投与されてもよい。前記作用物質は別の処置の前に投与されてもよく、処置と同時発生的に投与されてもよく、処置後に投与されてもよく、障害の軽快中に投与されてもよい。
炎症性疾患を処置するのに現在用いられる治療剤には、非ステロイド性抗炎症性薬物(例えば、アセトアミノフェン、アスプリリン、イブプロフェン、ナプロキセン)、トルメチン、ケトロラック、ジクロフェナク、エノール酸(enolic acid)(例えば、ピロキシカム、メロキシカム、ヌブメトン)、ピラゾロン誘導体(例えば、フェニルブタゾン)、シクロオキシゲナーゼ-2選択阻害剤(例えば、ロフェコキシブ、パレコキシブ、セレコキシブ、ルマリコキシブ、エトリコキシブ)、アパゾン、金、ステロイド(例えば、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン)、疾患修飾性抗リウマチ薬(例えば、抗TNFα、抗環状シトルリン化ペプチド)が含まれるが、これに限定されない。さらに、炎症性疾患は微生物感染またはウイルス感染の結果である場合がある。感染症を処置するための治療剤には、抗ウイルス剤(例えば、ロピナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、リトナビル、エルビテグラビル、ドルテグラビル、マラビロク、エンフビリチド、プレコナリル、アマンタジン、リマンタジン)、抗菌剤(ペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、ゲンタマイシン、セフォテタン、セフプロジル)、および抗真菌剤(例えば、ナイスタチン、アンホテリシンB)が含まれる。
本明細書に記載の方法は、癌を処置するための免疫療法に適用できることが意図される。なぜなら、同じ薬物が自己免疫疾患(例えば、関節リウマチまたは臓器移植)の処置に用いられることが多いからである。癌を処置するのに用いられる例示的な治療剤には、免疫療法、例えば、樹状細胞ワクチン、細胞療法、抗体、インターフェロン、または古典的な化学療法剤、例えば、メトトレキセート、シクロホスファミド、5-アザシタジン、アザチオプリン、トリメトレキセート、ロイコボリン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ボルテゾミブ、5-フルオロウラシル、マイトマイシン、シスプラチン、テモゾラミド、メルファレン、イホスファミド、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、カルボプラチン、および当技術分野において公知の他の任意の化学療法剤が含まれるが、これに限定されない。
組み合わせて投与された時に、前記作用物質もしくは組成物およびさらなる作用物質(例えば、第2または第3の作用物質)または全てを、例えば、単独療法として個々に用いられる各作用物質の量または投与量よりも多いか、少ないか、または同じ量または用量で投与することができる。ある特定の態様では、前記作用物質、さらなる作用物質(例えば、第2もしくは第3の作用物質)、または全ての投与される量または投与量は、個々に用いられる各作用物質の量または投与量よりも(例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％)少ない。他の態様では、望ましい効果(例えば、炎症性疾患の処置)をもたらす、作用物質、さらなる作用物質(例えば、第2もしくは第3の作用物質)、または全ての量または投与量は、同じ治療効果を生じるのに個々に必要な各作用物質の量または投与量よりも少ない(例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％少ない)。
非経口剤形
本明細書に記載の作用物質の非経口剤形は、皮下、静脈内(大量瞬時投与を含む)、筋肉内、および動脈内を含むが、これに限定されない様々な経路によって対象に投与することができる。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の天然防御を迂回するので、非経口剤形は好ましくは無菌であるか、または患者に投与する前に滅菌することができる。非経口剤形の例には、注射する用意が整った溶液、注射のために薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁する用意が整った乾燥製品、注射する用意が整った懸濁液、徐放性非経口剤形、およびエマルジョンが含まれるが、これに限定されない。
本開示の非経口剤形を提供するために使用することができる適切なビヒクルは当業者に周知である。例には、滅菌水;注射用水USP;食塩水;グルコース溶液;塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸リンゲル注射液などあるがこれに限定されない水性ビヒクル;エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどあるがこれに限定されない水混和性ビヒクル;ならびにトウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどあるがこれに限定されない非水性ビヒクルが含まれるが、それに限定されるわけではない。
制御剤形および遅延剤形
本明細書に記載の局面の一部の態様では、作用物質または組成物は管理放出手段または遅延放出手段によって対象に投与される。理想をいえば、医学的処置における最適に設計された徐放製剤の使用は、最低限の原薬が最低限の時間で状態を治癒または管理するのに用いられることを特徴とする。制御放出製剤の利点には、1)長期間のわたる薬物活性;2)投与頻度の低下;3)患者の服薬遵守の向上;4)少ない総薬物量の使用;5)局所副作用または全身副作用の低下;6)薬物蓄積の最小化;7)血中濃度変動の低下;8)処置効力の改善;9)相乗作用の低下または薬物活性の消失;および10)疾患または状態を管理する速度の改善が含まれる(Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000))。制御放出製剤は、式(I)の化合物の作用開始、作用期間、治療可能時間域(therapeutic window)内での血漿レベル、およびピーク血中濃度を制御するのに使用することができる。特に、制御放出または長期放出(extended-release)の剤形または製剤は、薬物を過少量投与すること(すなわち、最小治療レベルを下回ること)と、薬物の毒性レベルを上回ることの両方から生じ得る潜在的な副作用と安全問題を最小限にしながら作用物質の最大有効性が得られることを確かなものにするために使用することができる。
様々な公知の制御放出性または長期放出性の剤形、製剤、および装置は、任意の本明細書に記載の作用物質と使用するように適合させることができる。例には、米国特許第3,845,770号;同第3,916,899号;同第3,536,809号;同第3,598,123号;同第4,008,719号;同第5674,533号;同第5,059,595号;同第5,591,767号;同第5,120,548号;同第5,073,543号;同第5,639,476号;同第5,354,556号;同第5,733,566号;および同第6,365,185号に記載のものが含まれるが、これに限定されない。これらの米国特許はそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの剤形は、様々な割合で望ましい放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透析膜、浸透圧システム(例えば、OROS(登録商標)(Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA))、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはその組み合わせを用いて1種類または複数種の活性成分の徐放または制御放出を提供するのに使用することができる。さらに、イオン交換材料は、開示された化合物の固定化され吸着された塩形態を調製し、従って、この薬物の制御送達をもたらすのに使用することができる。具体的なアニオン交換体の例には、DUOLITE(登録商標)A568およびDUOLITE(登録商標)AP143(Rohm&Haas, Spring House, Pa. USA)が含まれるが、これに限定されない。
効力
本明細書に記載の作用物質、例えば、炎症性疾患を処置するための本明細書に記載の作用物質の効力は当業者によって確かめることができる。しかしながら、「有効な処置」という用語が本明細書において用いられる時、本明細書に記載の方法に従う処置後に、炎症性疾患の徴候または症状の1つまたは複数が有益なやり方で変えられるか、他の臨床上認められている症状が改善されるか、もしくは寛解されるか、または望ましい応答が、例えば、少なくとも10％誘導されれば、処置は「有効な処置」とみなされる。効力は、例えば、本明細書に記載の方法に従って処置される状態のマーカー、指標、症状、および/もしくは発生率、または他の任意の適切な測定可能なパラメータ、例えば、発熱、疲労、疼痛、息切れなどによって評価することができる。効力はまた、入院、または医療介入の必要性(すなわち、症状の進行)によって評価された時に個体が悪化しないことでも測定することができる。これらの指標を測定する方法は当業者に公知である、および/または本明細書において説明される。
効力は、本明細書に記載の状態の動物モデル、例えば、炎症性疾患、例えば、場合によっては、内毒素血症のマウスモデルまたは適切な動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルが用いられた時には、マーカー、例えば、マクロファージ活性化、温度、血球数、腫瘍サイズ、または腫瘍体積の統計的に有意な変化が観察された時に処置の効力が証明される。
本発明は、番号の付いた以下の段落のいずれかにおいて定義することができる。
１．対象において炎症状態を処置する方法であって、Inc-FAM164A1の発現を阻害するために調整剤を投与する工程を含む、方法。
２．lnc-FAM164A1の発現の調整剤が核酸分子、小分子、タンパク質、多糖、または抗体である、段落1記載の方法。
３．核酸分子がアンチセンスRNA、RNA干渉(RNAi)分子、RNAデコイ分子、またはRNAアプタマーである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４．RNAi分子がsiRNA分子、esiRNA分子、shRNA分子、またはmiRNA分子である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
５．タンパク質がペプチド、ポリペプチド、またはグリコシル化タンパク質である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
６．炎症状態が免疫細胞の活性化を特徴とする、前段落のいずれか1つに記載の方法。
７．免疫細胞の活性化が急性または慢性である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
８．免疫細胞がマクロファージ、T細胞、樹状細胞、B細胞、または好中球を含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
９．免疫細胞の活性化がマクロファージ活性化である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１０．マクロファージ活性化が、管理されていないマクロファージ活性化および持続的な炎症によって特徴付けられる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１１．炎症状態がアテローム硬化性血管疾患、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌を含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１２．アテローム硬化性血管疾患が冠状動脈疾患、ステント再狭窄、カロチド代謝疾患、脳卒中、急性心筋梗塞、心不全、末梢動脈疾患、四肢虚血、静脈移植不全、動静脈瘻不全である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１３．心臓弁膜症が大動脈弁疾患または僧帽弁疾患である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１４．炎症状態が人工組織または組織工学で作製された組織において生じる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１７．組織が臓器である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１８．組織が血管または弁である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１９．細胞において免疫活性化を調整する方法であって、細胞におけるInc-FAM164A1の発現の有効量の調整剤を細胞に投与する工程を含む、方法。
２０．有効量の調整剤がlnc-FAM164A1の発現を阻害する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２１．lnc-FAM164A1の発現の調整剤が核酸分子、小分子、タンパク質、多糖、または抗体である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２２．核酸分子がアンチセンスRNA、RNA干渉(RNAi)分子、デコイ分子、またはRNAアプタマーである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２３．RNAi分子がsiRNA分子、esiRNA分子、shRNA分子、またはmiRNA分子である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２４．タンパク質がペプチド、ポリペプチド、またはグリコシル化タンパク質である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２５．タンパク質調整剤がATPクエン酸合成酵素(ACLY)、フィラグリン-2(FLG2)、またはスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２６．タンパク質調整剤が、lnc-FAM164A1の活性を増強するための相互作用パートナーとしてlnc-FAM164A1と相互作用する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２７．細胞における免疫活性化が急性または慢性である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２８．細胞がマクロファージ、T細胞、樹状細胞、B細胞、または好中球を含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２９．マクロファージが活性化マクロファージである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３０．細胞における免疫活性化の調整が、炎症状態を有する対象における細胞を含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３１．炎症状態がアテローム硬化性血管疾患、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌を含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３２．アテローム硬化性血管疾患が冠状動脈疾患、ステント再狭窄、カロチド代謝疾患、脳卒中、急性心筋梗塞、心不全、末梢動脈疾患、四肢虚血、静脈移植不全、動静脈瘻不全である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３３．心臓弁膜症が大動脈弁疾患または僧帽弁疾患である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３４．炎症状態が人工組織または組織工学で作製された組織において生じる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３５．組織が臓器である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３６．組織が血管または弁である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３７．lnc-FAM164A1の発現を阻害するために調整剤を含む、薬学的組成物。
３８．lnc-FAM164A1の発現の調整剤が核酸分子、小分子、タンパク質、多糖、または抗体である、前段落のいずれか1つに記載の組成物。
３９．核酸分子がアンチセンスRNA、RNA干渉(RNAi)分子、デコイ分子、またはRNAアプタマーである、前段落のいずれか1つに記載の組成物。
４０．RNAi分子がsiRNA分子、esiRNA分子、shRNA分子、またはmiRNA分子である、前段落のいずれか1つに記載の組成物。
４１．タンパク質がペプチド、ポリペプチド、またはグリコシル化タンパク質である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４２．タンパク質調整剤がATPクエン酸合成酵素(ACLY)、フィラグリン-2(FLG2)、またはスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４３．タンパク質調整剤が、lnc-FAM164A1の活性を増強するための相互作用パートナーとしてlnc-FAM164A1と相互作用する、前段落のいずれか1つに記載の組成物。
４４．調整剤が薬学的に許容される製剤の中にある、前段落のいずれか1つに記載の組成物。
４５．調整剤が、炎症状態を有する対象に投与される、前段落のいずれか1つに記載の組成物。
４６．炎症状態がアテローム硬化性血管疾患、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌を含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４７．アテローム硬化性血管疾患が冠状動脈疾患、ステント再狭窄、カロチド代謝疾患、脳卒中、急性心筋梗塞、心不全、末梢動脈疾患、四肢虚血、静脈移植不全、動静脈瘻不全である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
MGH24231ドラフト段落
４８．心臓弁膜症が大動脈弁疾患または僧帽弁疾患である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４９．炎症状態が人工組織または組織工学で作製された組織において生じる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
５０．組織が臓器である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
５１．組織が血管または弁である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
本発明は、番号の付いた以下の段落のいずれかにおいてさらに定義することができる。
１．対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、マクロファージにおいて発現する長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA)を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法。
２．lnc-RNAが、AL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);およびRP13-452N2.1からなる群より選択される、段落1記載の方法。
３．対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-FAM164A1を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法。
４．炎症性疾患が、内毒素血症、アテローム硬化性血管疾患、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、ステント内再狭窄、静脈移植片疾患、動静脈瘻疾患、血管石灰化、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌からなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
５．心臓弁膜症が大動脈弁疾患または僧帽弁疾患である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
６．炎症性疾患が組織移植または細胞移植に応答して発生する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
７．炎症性疾患が急性または慢性である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
８．前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、ならびに阻害性ポリペプチドからなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
９．RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１０．前記作用物質が、該作用物質をコードするベクターである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１１．ベクターが非組込み型または組込み型である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１２．非組込み型ベクターが、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組込み型アデノウイルス、非組込み型RNA、およびセンダイウイルスからなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１３．ベクターがエピソームベクターである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１４．ベクターがレンチウイルスベクターである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１５．lnc-RNAが標的細胞において阻害される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１６．lnc-FAM164A1が標的細胞において阻害される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１７．標的細胞が哺乳動物細胞である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１８．標的細胞が、マクロファージ、T細胞、樹状細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または好中球である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
１９．マクロファージが活性化マクロファージである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２０．対象が哺乳動物である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２１．対象がヒトである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２２．阻害が、レベルおよび/または活性の低減である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２３．有効量の前記作用物質が、lnc-RNAのレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２４．有効量の前記作用物質が、lnc-RNAの活性を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２５．有効量の前記作用物質が、lnc-FAM164A1のレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２６．有効量の前記作用物質が、lnc-FAM164A1の発現を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２７．対象が、炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがある、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２８．対象が、炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがない、前段落のいずれか1つに記載の方法。
２９．対象が、炎症性疾患を発症する少なくとも1つの危険因子を示す、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３０．投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると対象を診断する工程をさらに含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３１．投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると患者を診断するアッセイの結果を受け取る工程をさらに含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３２．前記作用物質が、プラズマ細胞および/または腹膜細胞におけるCCL2およびIL-6の発現を減少させる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３３．前記作用物質がNFkBシグナル伝達を減少させる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３４．対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法。
３５．lnc-RNAに結合するタンパク質が、ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);およびスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)からなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３６．lnc-RNAに結合するタンパク質がACLYである、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３７．前記作用物質が対象においてCCL2およびTNF-αの発現を減少させる、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３８．阻害によって前記タンパク質のレベルまたは活性が低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
３９．阻害によって前記タンパク質とlnc-RNAとの結合が低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４０．lnc-RNAがlnc-FAM164A1である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４１．有効量の前記作用物質が、前記タンパク質のレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４２．有効量の前記作用物質が、前記タンパク質の活性を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４３．有効量の前記作用物質が、前記タンパク質とlnc-RNAとの結合を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４４．対象において炎症性疾患を処置する方法であって、以下の工程を含む方法:
a．生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定するアッセイの結果を受け取る工程;
b．lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;
c．lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および
d．炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程。
４５．対象において炎症性疾患を処置する方法であって、以下の工程を含む方法:
a．生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定する工程;
b．lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;
c．lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および
d．炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程。
４６．lnc-RNAがAL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);およびRP13-452N2.1からなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４７．lnc-RNAがlnc-FAM164A1である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４８．工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
４９．マクロファージにおいて発現するlnc-RNAを阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
５０．lnc-FAM164A1を阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
５１．lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
５２．lnc-RNAに結合するタンパク質が、ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);およびスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)からなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の薬学的組成物。
５３．前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、または阻害性ポリペプチドからなる群より選択される、前段落のいずれか1つに記載の薬学的組成物。
５４．RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、前段落のいずれか1つに記載の薬学的組成物。
５５．敗血症を有する対象を同定する方法であって、以下の工程を含む方法:
a．生物学的試料中のlnc-FAM164A1のレベルを測定する工程;
b．lnc-FAM164A1のレベルを参照レベルと比較する工程;
c．lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して増加していれば、対象を敗血症を有すると同定する工程;および
d．敗血症を有する対象に、敗血症を処置する治療を施す工程。
５６．工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む、前段落のいずれか1つに記載の方法。
５７．生物学的試料が血液試料である、前段落のいずれか1つに記載の方法。
実施例1
序論
ゲノムの「暗黒物質(dark matter)」として知られる非タンパク質コーディング転写物である長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA、>200nt)は、胚発生、腫瘍成長、転移、心血管代謝障害、および炎症を含む非常に多くの生物学的プロセスおよびヒト疾患において思いもよらない役割を果たしている。隣接するタンパク質コーディング遺伝子と比べた場所に基づいて、lnc-RNAは、アンチセンスlnc-RNA、イントロンlnc-RNA、分岐(divergent)lnc-RNA、および遺伝子間lnc-RNAと分類される1。タンパク質コーティング遺伝子よりも比較的進化していない保存があるが2、遺伝子間lnc-RNAは、組織特異的、細胞タイプ特異的、または疾患段階依存的に遺伝子転写を調節することができる3-5。数種類のlnc-RNAが免疫細胞、例えば、赤血球細胞、Tリンパ球、樹状細胞、および単球/マクロファージの分化の間で重要な制御因子とみなされてきた6-9。ENREF 5。しかしながら、免疫における、これらの生物学的機能は大部分がまだ明らかにされていない。
マクロファージは大きな食細胞であり、自然免疫における中心的存在である。マクロファージは病原体、脂質、アポトーシス細胞、傷ついた組織を貪食し、他の免疫細胞と相互作用する能力があるために宿主防御において必要不可欠な役割を果たし、様々な炎症性疾患の発病にも寄与する。マクロファージは非常に可塑性があり、組織微小環境における細胞刺激に応じて表現型を切り替えることができる。または、マクロファージ亜集団の平衡は分子キューに応答して変化して、正常組織または病理学的組織における炎症状態を決定することがある10-13。インビトロで培養マクロファージを細菌LPSもしくはIFN-γを用いて炎症促進性表現型に変えることができる、またはIL-4もしくはIL-13によって誘導して抗炎症性表現型に変えることができる。LPSはToll様受容体4(TLR4)を認識し、マクロファージを活性化する。LPSによって誘導されたシグナル伝達はIκBタンパク質のリン酸化およびユビキチン依存性分解を誘発し、その結果、細胞質から核へのNF-κB二量体(例えば、p65/p50)が移動し、炎症促進性メディエーター(例えば、IL-1β、IL-6、TNF-α)が産生される。
ヒトおよびマウスのマクロファージは数千種類のlnc-RNAを発現するが、マクロファージ活性化の調整では限られた数のlnc-RNAが特徴付けられている15-29。ヒトおよびマウスのマクロファージでは数種類のlnc-RNAしか発現が保存されていない26-28。パターン認識受容体(例えば、TLR)が連結すると、PG-エンドペルオキシド合成酵素2(Ptgs2/Cox2)に近接して位置する長鎖遺伝子間ノンコーディングRNA(lincRNA)-Cox2の発現が増加することが最初に報告された15。lincRNA-Cox2は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(hnRNP)A/BおよびA2/B1との相互作用によって媒介されるマウス骨髄由来マクロファージにおける免疫応答遺伝子発現の調整、Mi-2/NuRDを介したエピジェネティックヒストン修飾と、SWI/SNF結合クロマチンリモデリングの調整において二重の役割を果たしている15-17。さらに、マクロファージにおいて、ならびに糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および内毒素血症のマウスモデルにおいて、炎症遺伝子発現モジュレーターとして他の数種類のマウスlnc-RNAが特定されている18-21,25。ヒトマクロファージ様細胞株THP-1において発見されたlnc-RNA-THRIL(Linc1992)はhnRNP-Lと特異的に相互作用し、TLR2アゴニスト(Pam3CSK4)によって誘導されたTNF-αサイトカインの転写を調節する22。2つの最近の報告から、LPSおよびIFN-γによって誘発されたヒト初代マクロファージにおいてマクロファージ極性化と、IFN-γ/JAK2/STAT1シグナル伝達経路を調節する後期応答lnc-RNA-TCONS_00019715およびlnc-MacORISの発現が増加することが証明された23,29。
炎症性疾患においてマクロファージ活性化を調節する遺伝子間lnc-RNAを特定するために、LPSによって3時間活性化したヒトPBMC由来マクロファージのlnc-RNAマイクロアレイ分析を行った。不偏バイオインフォマティクス分析(unbiased bioinformatic analysis)から、LPS刺激によって有意に増加した11種類のlnc-RNAが選択された。タンパク質コーディング遺伝子FAM164A(family with sequence similarity 164, member A)の近くに位置する遺伝子間lnc-RNA-FAM164A1-1(lnc-FAM164A1)を、本明細書に記載のシステムアプローチの検証研究のために選択した。機構研究から、LPS活性化マクロファージにおいてヒトlnc-FAM164A1は、部分的にNF-κBシグナル伝達を介して炎症促進分子の発現を増強することが明らかになった。
方法および材料
試薬
リンパ球分離培地(LSM)をMP Biomedicalsから入手した。Ultrapure LPS(S.ミネソタ(S.minnesota)R595に由来するtlrl-smlps)をInvivoGenから入手した。Bay11-7082をSigma-Aldrichから入手した。ウエスタンブロットに使用した抗体は以下の通りであった:β-アクチンに対するマウスモノクローナル抗体(Novus Biologicals, NB600-501)およびラミンA/Cに対するマウスモノクローナル抗体(Active motif, 39288)、p65に対するウサギ抗体(Santa Cruz Biotechnology, sc-372)、IκB-αに対するウサギ抗体(Cell Signaling, 9242)、ACLYに対するウサギ抗体(Abcam, ab40793)、およびhn RNP A1に対するウサギ抗体(ThermoFisher Scientific, PA5-19431)。pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]VectorをPromega(E8491)から購入し、Dual-Glo Luciferase Assay SystemをVWR(PAE2920)から購入した。Lipofectamine(登録商標)3000 Reagent(L3000015)をLife Technologiesから購入した。Pierce RIPA Buffer (PI-89900)、Pierce IP Lysis Buffer (87787)、Pierce(商標) RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit, Pierce(商標) Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit、およびHalt Combined Protease、およびPhosphatase Inhibitor Cocktails (PI-78441)をThermoFisher Scientificから購入した。
細胞培養
THP-1細胞
ヒト単球性白血病細胞株(THP-1)をATCC(TIB-202)から購入し、10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン加えたRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地を用いて細胞培養インキュベーター内で37℃(5％CO2)で培養した。THP-1細胞を12ウェルプレート中で1.0x106/ウェルでプレートし、100ng/mLのPMA(Sigma-Aldrich P8139)を添加することでマクロファージ様細胞に48時間分化させた。
末梢血単核球(PBMC)に由来するヒト初代マクロファージ
以前に述べられたように30、リンパ球分離培地(LSM)を用いて、PBMCを血液バフィーコート(Research Blood Components, Brighton, MA)から単離した。PBMC(5×106個の細胞/ウェル)を6ウェル培養プレートにプレートし、使用する前に、5％ヒト血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを加えたRPMI-1640の中で37℃(5％CO2)で7〜10日間維持した。
マウス腹膜マクロファージ
2.5mlの4％Brewerチオグリコール酸培地(BD Diagnostic Systems, Sparks, MD)をC57BL/6Jマウス(8〜10週齢, 雄, Jackson Laboratory)に腹腔内注射した4日後に腹膜マクロファージを収集した31。1x106個の細胞を、10％FBSおよび抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンB)を加えたRPMI1640培地を含む12ウェルプレート(Corning)において培養した。1時間培養した後に非付着細胞をPBSで洗浄した。
ヒトPBMC由来マクロファージ上でのアンチセンスおよびsi-RNAオリゴヌクレオチドによるlnc-FAM164A1のサイレンシング
ヒトPBMC由来マクロファージに対してlnc-FAM164A1 RNAサイレンシングを、SilenceMag(BOCA Scientific, Boca Raton, FL)を用いて50〜100nMの最終濃度で行った32。トランスフェクションの36〜48時間後に、マクロファージを10ng/mL LPSで2〜6時間刺激した後に、マクロファージおよび細胞培養培地を収集した。Antisense LNA(商標)long RNA GepmeRオリゴヌクレオチド標的lnc-FAM164A1
Figure 2020536902
および非特異的な負の対照オリゴヌクレオチド
Figure 2020536902
をExiqon A/S(Vedbaek, Denmark)によって設計した。lnc-FAM164A1を標的とするsi-RNAオリゴヌクレオチドおよびルシフェラーゼ対照siRNAオリゴはAxolabs(Kulmback, Germany)によって設計された。これらの配列および化学修飾は以下の通りである(A、G、U、C:RNAヌクレオチド;a、g、u、c:2’-O-メチル-ヌクレオチド、s:ホスホロチオエート、dT:デスオキシ-T残基):ルシフェラーゼ対照siRNA(XD-00194):
Figure 2020536902
。Lnc-FAM164A1特異的siRNAオリゴ#5(XD-05325):
Figure 2020536902
。Lnc-FAM164A1特異的siRNAオリゴ#8(XD-05328):
Figure 2020536902
。lnc-FAM164A1を阻害するのに使用した、さらなるオリゴを図18に示した。
RNA抽出およびRT-PCR
全RNAを、Illustra RNAspin Miniキット(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いて抽出し、ゲノムDNAをオンカラムDNアーゼI消化によってRTで15分間除去した。cDNAを、high capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)を用いて合成した。リアルタイムPCRを、7900HT fast real-time PCR system(Applied Biosystems)によって行った。lnc-FAM164A1のTaqmanプローブおよびプライマーは、Integrated DNA Technologiesによって設計され、以下に列挙される:
Figure 2020536902
。IL-1β、IL-6、IL-10、CCL2、TNF-α、およびGAPDHの他のTaqmanプローブをLife Technologiesから購入した。各遺伝子の相対的発現をGAPDHによって標準化した。
RNAscopeを用いたインサイチューハイブリダイゼーション
インサイチューでのLnc-FAM164A1 RNAをRNAscope 2.5 Red Chromogenicアッセイ(Advanced Cell Diagnostics, Inc., Catalog 322360)を用いて製造業者のマニュアルに従って検出した。lnc-FAM164A-1:1の412-1623を検出するために、Hs-lnc-FAM164A-1(Catalog 475881)と名付けた20ZZプローブを設計した。簡単に述べると、ヒトPBMC由来マクロファージをMillicell EZスライド(Millipore)の上で培養した。一定時間の間に10ng/mL LPSで刺激した後に、マクロファージ単層を10％中性緩衝ホルマリンでRTで30分間固定し、次いで、過酸化水素およびプロテアーゼIIIで処理した後にRNAscopeアッセイを行った。RNAscope染色後に、マクロファージをマウス抗ヒトCD68(クローンPG-M1, DAKO)で4℃で一晩染色し、FITC標識ヤギ抗マウスIgGでRTで1時間染色した。スライドに、DAPI(VECTASHIELD)(Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA)を含む封入剤を添加した後に、カバーガラスを配置した。スライドを、共焦点顕微鏡A1(Nikon)を用いて調べ、画像をElements 3.20ソフトウェア(Nikon)で処理した。
ELISA
Duoset ELISAキット(R&D systems, Minneapolis, MN)を用いて、マクロファージまたはマウス血漿からの培養培地中のサイトカイン(ヒトおよびマウスCCL2、IL-6、TNF-α)のレベルを検出した。
Lnc-FAM164A1 RNAプルダウンアッセイ
Lnc-FAM164A1センスおよびアンチセンスRNAを、T7 RNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いてインビトロ転写し、RNA Clean & Concentrator(商標)-5(Zymo Research)によって精製した。RNA(10μg)の3'末端を、Pierce(商標) RNA 3’End Desthiobiotinylation Kitを用いてビオチン標識した。THP-1分化マクロファージ溶解産物を、抗RNaseとプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテルを加えたPierce IP Lysis Bufferを用いて調製した。RNAプルダウンを、Pierce(商標)Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kitを用いることによって行った。最初に、ストレプトアビジン磁気ビーズを製造業者に説明書に従って調製し、次いで、すぐに、撹拌しながら、RNA捕獲緩衝液中でのビオチン標識RNAの捕獲にRTで30分間供した。回転させながら、RNA捕獲ビーズを、タンパク質-RNA結合緩衝液で希釈した細胞溶解産物200μgと4℃で1時間インキュベートした。RNA結合タンパク質複合体を洗浄緩衝液で3回洗浄し、次いで、D-ビオチン溶出緩衝液で37℃で30分間溶出させた。溶出したタンパク質複合体を変成し、還元し、7.5％Mini-PROTEAN TGX(商標)Precast Protein Gels(Bio-Rad)と、ゲル長の25％のランニング(running)を用いて分離した。Bio-Safe Coomassie Stain(Bio-Rad)の後に、ゲルに含まれる染色されたタンパク質を収集し、洗浄し、アルキル化し、MS分析のためにトリプシンで37℃で一晩消化した。溶出タンパク質をSDS-試料緩衝液(Boston Bioproducts)の中で変成および還元し、ウエスタンブロットに使用した。
質量分析法
RNAプルダウン試料を、前面にEASYスプレー源を付け、Easy-nLC1000 HPLCポンプと連結した高分解能/精度Orbitrap Fusion Lumos質量分析計(Thermo Scientific)を用いて分析した。ペプチドを、デュアルカラムセットアップ: Acclaim PepMap RSLC C18トラップカラム、75μmx20mm;およびEASYスプレーLC加熱済(45℃)カラム、75μmx250mmを用いて分離した。300nL/minで5〜21％溶媒B(アセトニトリル/0.1％ギ酸)の勾配を50分間、21〜30％溶媒Bの勾配を10分間、その後に95％溶媒Bを5分間流した。溶媒Aは0.1％ギ酸であった。計器を120K分解能で設定し、ペプチド配列決定(MS/MS)のために3秒サイクル時間で(375〜1500m/zのスキャン範囲内で)上位N個の前駆イオンを衝突誘起解離(衝突エネルギー30％)に供した。
ウエスタンブロット
マクロファージホールセル溶解産物を、プロテアーゼインヒビター(Roche)を含有するRIPA緩衝液を用いて調製した。総タンパク質を4〜20％Mini-PROTEAN(登録商標)TGX(商標)Precastゲルによって分離し、iBlotウェスタンブロッティングシステム(Life Technologies)を用いて転写した。IκB-a、p65、ACLY、LaminA/C、およびβ-アクチンに対する一次抗体を使用した。タンパク質発現を、Pierce ECL Western Blotting substrate reagent(ThermoFisher Scientific)およびImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)を用いて検出した。
マクロファージに対する組換えアデノウイルスおよびトランスフェクション
ヒトPBMC由来マクロファージから単離したLnc-FAM164A1 cDNAをPCR増幅し、次いで、pcDNA3.1ベクターにクローニングした。最初に、Lnc-FAM164A1オリゴヌクレオチドをpcDNA3.1-lnc-FAM164A1から増幅し、pENTR11エントリーベクターにサブクローニングし、次いで、Gateway LR Clonase II Enzyme Mixを用いてLR組換えを介してpAd-CMV-V5アデノウイルスベクターに移して、pAd/CMV/lnc-FAM164A1(Ad-lnc-FAM164A1)(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)を作製した。pAd/CMV/V5-GW/lacZを対照ベクターとして使用した33。アデノウイルスを、HEK293A細胞におけるPacI消化ベクターのトランスフェクションによって増幅し、その後、Fast Trap Adenovirus Purification and Concentration(EMD Millipore)を用いて精製し、10％(v/v)グリセロールを含む10mM Tris(pH7.4)緩衝液中で透析し、-70℃で保管した。ウイルス力価を、Adeno-XTM rapid titer kit(Clontech, Mountain View, CA, USA)を用いて293細胞上でのプラークアッセイによって確かめ、感染単位(ifu)で表した。インビトロで培養した初代マクロファージおよびTHP-1分化細胞の場合、Ad-lacZおよびAd-lnc-FAM164A1ウイルスを1000ifu/マクロファージで細胞に添加し、48時間インキュベートした。培地交換後に、マクロファージを10ng/mL LPSで0〜3時間刺激した後に、ウエスタンブロットのためにタンパク質を抽出し、RT-PCRのためにmRNAを抽出した。
NF-κB-ルシフェラーゼレポーターアッセイ
HEK-293細胞を24ウェルプレート(0.5x105/ウェル)にプレートした。翌日、Lipofectamine 3000を用いて、細胞を、pGL4.32ベクター[luc2p/NF-κB-RE/Hygro](Promega, E8491)とpcDNA3.1空のベクターまたはpcDNA3.1-lnc-FAM164A1でコトランスフェクトした。24時間後に細胞を10ng/mL LPSでもう6時間刺激した。ホタルルシフェラーゼ活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて測定した。
質量分析データ分析
全てのMS/MSデータを求めて、Proteome Discoverer(PD)Package(version 2.1, Thermo Scientific)を介してHT-SEQUEST検索アルゴリズムを用いてヒトUniProtデータベース(2014年8月1日にダウンロードした)に照会した。メチオニン酸化を可変修飾(variable modification)として設定し、システイン残基のカルバミドメチル化を固定修飾(fixed modification)として設定した。1％FDRに基づいてペプチドをフィルタリングした。ProteomeDiscovererによって、ある特定のタンパク質群(マスタータンパク質(Master Protein))に割り当てられ、他のどのタンパク質群に存在しなかったペプチドがユニークだとみなされ、定量に用いられた。最低2つのユニークなペプチドを含めた。定量は、1種類のタンパク質につき最も豊富にある上位3つまでのペプチドの曲線下面積(AUC)を用いて行った。
ネットワーク分析
lnc-FAM164A1相互作用候補タンパク質であるACLY、FLG2、およびSFPQの疾患関連性を定量するために、これらのモジュールと疾患関連タンパク質との間の平均最短ネットワーク距離(average shortest network distance)を測定した。ここで、ネットワーク距離は、2つのノード間のエッジ数によって測定した非ユークリッド距離と定義される。ACLY、FLG2、およびSFPQモジュールは、インタラクトームにおける、それぞれの候補タンパク質と、その第一隣接(first neighbors)、すなわち、直接相互作用パートナーからなるサブグラフ(subgraph)と定義される。
Figure 2020536902
になるように、それぞれの候補モジュール遺伝子sと、全ての疾患遺伝子tとの間の最短距離を計算し、次いで、全ての候補モジュールモジュール遺伝子sの平均をとることによって、候補モジュールと疾患遺伝子との平均最短距離Dを測定する。式中、dstはsとtとの間の最短距離であり、Sは、ACLY、FLG2、およびSFPQ第一隣接モジュールの中にある遺伝子セットであり、Tは疾患遺伝子である。平均最短距離値をランダム期待値(random expectation)と比較するために、N=250の実現(realization)について同じ数のランダムに選択された遺伝子と疾患遺伝子との平均最短距離を計算した。結合度(degree)(すなわち、遺伝子のつながりの数)を調整するために、これらの結合度に従って全遺伝子がビン分割(bin)され、ランダム遺伝子が、これらの対応する結合度ビンから一様に無作為に選択される、結合度を保った手法でランダム選択を行った。経験的なp値を、Pemp=P(Dr<D)によって計算した。式中、Drは、ランダム化事例の平均最短距離である。ACLY、FLG2、およびSFPQモジュールと疾患遺伝子がマッピングされたインタラクトームは、以前に説明されたように、文献からの二成分相互作用、タンパク質複合体、酵素と連結した反応、シグナル伝達相互作用、キナーゼ-基質対、調節性相互作用、および手作業で精選された相互作用を含む、実験的確証のある精選された物理的なタンパク質間相互作用からなる34。疾患遺伝子を、(ゲノムワイド関連解析(GWAS)およびOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)(例えば、ワールドワイドウェブ上にあるwww.omim.org/で入手可能)およびMalaCards(例えば、ワールドワイドウェブ上にあるwww.malacards.org/で入手可能)36データベースからの証拠があるエントリを用いて)DiseaseConnect(http://disease-connect.org)35から入手した。
内毒素血症マウスモデルにおけるアデノウイルスによる機能獲得研究
C57BL/6Jマウス(8〜10週齢、雄)をJackson Laboratoryから購入した。全ての動物実験が、Beth Israel Deaconess Medical CenterにあるInstitutional Animal Care and Use Committeeの認可を受けた。5x109ifuのAd-lacZまたはAd-lnc-FAM164A1ウイルス(0.2mL)を尾静脈を通してマウスに静脈内注射した。3日後に、マウスの腹膜に4mg/kg LPSを投与した37。次いで、全マウスをLPS曝露の3時間後に安楽死させた。全血を下大静脈(IVC)から収集してクエン酸ナトリウム(最終濃度:0.38％)に入れた。マウス血漿を4000ｘgで15分間回転させることによって調製した。組織を収集するか、またはO.C.T.化合物(Tissue-Tek)に包埋し、次いで液体窒素で凍結し、さらに使用するまで-80℃で保管した。
内毒素血症のヒト化マウスモデル
Hu-CD34 NSGマウスまたはHu-CD34 NSG-SGM3マウス(4〜5ヶ月齢, 雌)をJackson Laboratoryから購入した。NSG(NOD scidγ)マウス系統を宿主とし、ヒトCD34+造血幹細胞(HSC)を移植した。Hu-CD34 NSGマウスから少量の血液を眼窩内出血によって収集した。翌日、これらのHu-CD34 NSGマウスに5mg/kgのLPSを腹腔内投与し、次いで、LPS曝露の6時間後に安楽死させた。機能喪失研究では、NSG-SGM3マウスに、lnc-FAM164A1に対する0.5mg/kg脂質ナノ粒子処方si-RNAを静脈内投与し(5日に2回)、その後に5mg/kg LPSをボーラスi.p.注射した。全血をIVCからクエン酸ナトリウムに収集した。4000xgで15分間回転させることによってマウス血漿を調製した。肝臓、脾臓、および肺組織を収集し、さらに使用するまで-80℃で保管した。総白血球(WBC)を、ACK(Ammonium-Chloride-Potassium)Lysing Bufferを用いることによって調製した。脾細胞を、以前に説明されたように単離した32。Fc受容体をブロックするために抗マウスCD16/CD32 mAb(BioLegend)とインキュベートした後に、次いで、細胞を、ウシ血清アルブミン、EDTA、PBS、および0.09％アジド(Miltenyl Biotec)を含有するautoMACSランニングバッファーに溶解したAlexa Fluor488結合ヒトCD45、APC-Cy7結合抗マウスCD45(BioLegend)で30分間染色した。染色された細胞をFACSAria2(BD Bioscience)およびFlowjoソフトウェアによって分析した。
統計解析
データを平均±標準偏差(SD)で示した。そして、「n」は、独立した実験の回数または動物/試料の数を示す。群間の差をスチューデントt検定または一方向ANOVAとダン多重比較検定(Dunn’s Multiple Comparison Test)(GraphPad prism 5, Prism Software Inc. La Jolla, CA)を用いて分析した。確率値p<0.05が統計的に有意だとみなされた。
結果
グローバルマイクロアレイスクリーニングおよび不偏バイオインフォマティクス分析によってLPS活性化ヒト初代マクロファージにおいてlnc-FAM164A1が特定された
可能性のある重要なマクロファージ活性化制御因子を特定するために、LPS誘発性ヒト初代マクロファージにおける初期応答性非タンパク質コーディング転写物を探索した。LPS刺激の3時間後に4人の異なるドナーから単離したPBMC由来ヒト初代マクロファージから精製したRNA試料のヒトlnc-RNAマイクロアレイ分析を行った(実験デザインについては図8A)。データには、「limma」R packageによる不偏バイオインフォマティクス分析が行われた38。ボルケーノプロットにも示したように(図8B)、LPS処理によって、11種類のlnc-RNAの発現が統計的に有意に増加した(補正p値FDR<0.05および倍率変化≧2)(図1Aおよび図8C)。これらの11種類のlnc-RNA候補には、7種類の遺伝子間lnc-RNA、2種類のアンチセンスlnc-RNA、1種類のイントロ-センス(intro-sense)重複lnc-RNA、および1種類のエキソン-センス重複lnc-RNAが含まれた。システムアプローチを検証するための一例として、以下の要因に基づいてlnc-RNA RP11-79H23.3を選択した:1)遺伝子間lnc-RNAとして分類される;2)2994塩基対の1種類の転写物しかない;および3)その生物学的機能が未知であること。lnc-RNA RP11-79H23.3はLNCipediaではLnc-FAM164A-1(lnc-ZC2HC1A-1)としてアノテートされ39、タンパク質コーディング遺伝子FAM164A(family with sequence similarity 164, member A)に近い第8番染色体(位置79749764-79752757)に位置する。その別の遺伝子名にはENSG00000261618.1およびOTTHUMG00000173421.1が含まれる。lnc-FAM164A-1のコーディング能力をCoding Potential Assessment Tool(CPAT)を用いて分析した。CPAT粗得点(raw score)0.0059はノンコーディングRNAを示す(<0.364コーディング確率カットオフ)39。
ヒト初代マクロファージにおいて、LPS刺激は3時間および6時間でそれぞれ67倍および41倍のlnc-FAM164A1発現増加を誘導した(リアルタイムPCR、図1B)。炎症促進性サイトカインIL-6およびTNF-αもPBMC由来マクロファージにおいてlnc-FAM164A1発現を増加させた(図9A)。エクスビボではLPSで刺激した全血から単離したヒトPBMCでも約7倍のlnc-FAM164A1発現増加が検出された(図1C)。さらに、エクスビボでlnc-FAM164A1発現はLPS活性化ヒト全血から単離したリンパ球および単球の両方において増加することが見出された(データは示されない)。lnc-FAM164A1は、UCSC Genome Browser(例えば、ワールドワイドウェブ上にあるhttp://genome.ucsc.edu/index.htmlで見つかる)を用いて分析した時にヒト霊長類(例えば、アカゲザル)間で保存されていた。実際に、LPSは、アカゲザル全血から単離したPBMCから分化させたマクロファージにおいて数倍のlnc-FAM164A1増加を誘導することが見出された(データは示されない)。
lnc-FAM164A1にはマウスのホモログが無いので、インビボ有意性をさらに探求するために内毒素血症のヒト化NSGマウスモデルを確立した。ヒトCD34+造血幹細胞(HSC)を移植した3ヶ月後に、これらのヒト化NSGマウスは、血液および脾臓に60〜80％のヒトCD45+白血球を含有する(データは示されない)。ヒト化NSGマウス白血球ではLPS曝露によってヒトlnc-FAM164A1発現が増加することが見出された(図1D)。内毒素血症マウスの脾臓では肺より高いレベルのヒトlnc-FAM164A1発現が見出された(図9B)。これらのマウスの血漿は豊富なヒトTNF-αおよびIL-6タンパク質を含有した(データは示されない)。このことから、移植されたヒトCD34+HSCはNSGマウスにおいて機能的な白血球に分化できることが分かる。
LPSによって誘導されたLnc-FAM164A1は細胞質および核内にある
次いで、マクロファージにおけるlnc-FAM164A1の局在を調べた。RNAscope(Advanced Cell Diagnostics)を用いたインサイチューハイブリダイゼーションによって、マクロファージ内にあるlnc-FAM164A1 RNAの発現が視覚化された。低レベルのlnc-FAM164A1が未刺激マクロファージの核内にあり、LPS刺激によって、新規lnc-FAM164A1発現が1時間と早い時間に急速に誘導され(データは示されない)、3時間でピークに達した(図1E)。一般的に、LPSによって誘導されたlnc-FAM164A1は細胞質と核内にあった。
核RNAおよび細胞質RNAを分離し、RT-PCRを用いてlnc-FAM164A1レベルを分析することによって、未刺激マクロファージおよびLPS活性化マクロファージにおいてそれぞれ、約100％および35％の核/細胞質lnc-FAM164A1比が見出された。対照的に、タンパク質コーディング遺伝子(IL-1βおよびGAPDH)の核/細胞質比は5％未満である(図9C)。LPS処理マクロファージにおけるlnc-FAM164A1と炎症促進性サイトカインの同時誘導。
述べたように、LPSによってNF-κBシグナル伝達が誘発される。時間経過実験から、lnc-FAM164A1発現はヒト初代マクロファージにLPSを添加して6時間後に高くなり、12時間後および24時間後に弱まることが分かった。これは既知のNF-κB経路標的である炎症促進性サイトカインIL-1β、IL-6、およびTNF-αのmRNA発現の動態に似ていた(図10A)。特異的なNF-κBシグナル伝達阻害剤(Bay11-7802)はlnc-FAM164A1とサイトカインの転写を用量依存的(3〜30μM)にブロックする(図10B)。これらのデータから、lnc-FAM164A1はNF-κBの標的遺伝子であり、LPS活性化マクロファージにおいて類似するか、またはかかわり合う調節機構をIL-1β、IL-6、およびTNF-αと共有する可能性があることが分かる。
LPS活性化ヒトマクロファージにおいてlnc-FAM164A1サイレンシングを行うと炎症促進分子の発現が抑制される
次いで、LPS活性化ヒト初代マクロファージでは、サイトカインおよびケモカインの誘導によって判断されるようにlnc-FAM164A1は炎症促進性のマクロファージ活性化において原因となる役割を果たすことが確かめられた。これを成し遂げるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド(LNA(商標)long RNA GepmeR, Exiqon)を用いて機能喪失実験を行った。これは、ヒトマクロファージではlnc-FAM164A1は少なくとも50％のサイレンシング効力があることを示した(図11A)。lnc-FAM164A1サイレンシングによって対照およびLPS処理マクロファージにおいて抗炎症性サイトカインIL-10の発現は変化しなかったが(図11B)、同じ処理によって炎症促進性ケモカインCCL2ならびにサイトカインIL-6およびTNF-αのLPS誘導性mRNA発現およびタンパク質放出が有意に抑制された(図2A〜2F)。lnc-FAM164A1が細胞質に位置したことに触発されて、lnc-FAM164A1を標的とする10の異なるsiRNAオリゴヌクレオチドも設計し、これらのサイレンシング効力をヒトマクロファージにおいて確かめた(Axolabs, Kulmback, Germany)。オリゴヌクレオチド#5および#8は他のオリゴヌクレオチドよりも高いサイレンシング効力を示した。これらのオリゴヌクレオチドを用いたlnc-FAM164A1のsiRNAサイレンシングによって、LPS刺激ヒトマクロファージ上でのCCL2(図2G、2H)およびIL-6(図11D、11F)の発現もmRNAレベルおよびタンパク質レベルで減少した。TNF-α mRNAの有意な変化は検出されなかった(図11E)。
マクロファージにおいてlnc-FAM164A1を強制発現させると、LPSによって誘導されるTNF-α発現が増強する
炎症促進性のマクロファージ活性化におけるlnc-FAM164A1の原因となる役割をさらに確かめるために、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1およびヒトPBMC由来マクロファージにおいてlnc-FAM164A1発現アデノウイルス(Ad-lnc-FAM164A1)またはlacZ対照発現アデノウイルスを用いて機能獲得実験を行った22。未刺激THP-1細胞と比較して、Ad-lnc-FAM164A1を用いると、LacZ対照と比較して20倍のlnc-FAM164A1誘導が生じた(図12A)。LacZ対照はTNF-α(図12Bおよび12C)ならびにCCL2(図12Fおよび12I)の基底値に重大な影響を及ぼさなかった。Ad-lnc-FAM164A1に感染させたTHP-1細胞ではLPS処理によってlnc-FAM164A1発現が増強した(図12A)。このことは、CCL2およびTNF-α mRNA発現と、培養培地中のTNF-αタンパク質放出の有意な増加と同時に結びついた(図12B〜12E)。IL-1β発現の有意な変化は観察されず、培養培地中のIL-6タンパク質放出の発現は減少した(図13F〜13I)。同様に、ヒトPBMC由来マクロファージでもlnc-FAM164A1を強化発現させると、LPSで誘発されたCCL2発現(図3Fおよび3G)と、LPS処理によって活性化された初代マクロファージからの培地中のTNF-αタンパク質(図3D)放出が増強したが(2時間の時点)、TNF-α mRNA発現の有意な変化は見出されなかった(図3C)。IL-6およびIL-1βの有意な発現変化は観察されなかった(図12J〜12L)。
LPS活性化マクロファージにおいてLnc-FAM164A1はNF-κBシグナル伝達を誘発する
NF-κB経路はLPS誘発性マクロファージにおけるIL-1β、IL-6、およびTNF-αなどの炎症促進性因子の転写活性化において重要な役割を果たしている。TLR4と細菌LPSが連結することで、IκBタンパク質のリン酸化および分解を誘導するシグナル伝達が誘発され、それに続いてNF-□B二量体が細胞質から核に移動する。本明細書に記載の機能喪失データおよび機能獲得データから、lnc-FAM164A1はNF-κB経路と相互作用することでTNF-α発現を促進する可能性があることが分かる。最初に、これを、HEK-293細胞においてルシフェラーゼレポーターアッセイを用いることで試験した。HEK-293細胞を、空のベクターまたはlnc-FAM164A1発現ベクターと、ルシフェラーゼレポーター遺伝子(luc2P)転写を動かす5コピーのNF-κB応答エレメント(NF-κB-RE)を含有するpGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]ベクターの組み合わせによってコトランスフェクトした。lnc-FAM164A1を過剰発現させると未刺激細胞またはLPS活性化細胞においてルシフェラーゼ活性が増加した(図4A)。次いで、ホールセル溶解産物中のIκB-αおよび核抽出物中のp65転写因子のタンパク質レベルを検出するためにウエスタンブロット分析を行った。アデノウイルス感染によるlnc-FAM164A1発現によって、THP-1細胞(図4B)およびヒトPBMC由来マクロファージ(図4C)の両方においてLPSによって誘導される急速なIκB-α分解が誘導された。さらに、ヒトPBMC由来マクロファージにおけるLPS刺激の30分後に、lnc-FAM164A1を強化発現させるとp65の移動および核での蓄積が増加した(図4D)。これらの結果から、lnc-FAM164A1はNF-κBシグナル伝達を介して炎症促進分子発現を調節する可能性があることが分かる。
lnc-FAM164A1を強化発現させるとインビボで内毒素血症マウスモデルにおいてTNF-α発現が増強する
lnc-FAM164A1にはマウスのホモログが無いが、lnc-FAM164A1の相互作用タンパク質がヒトとマウスの間で保存されている可能性が高い。このことは、野生型C57BL6マウスから単離した腹膜マクロファージにおいて機能獲得研究を行う合理的根拠となった。Ad-lnc-FAM164A1によってマウス腹膜マクロファージにおいて高レベルのlnc-FAM164A1発現が誘導された(図5A)。ヒトマクロファージにおいて見出された結果と一致して(図3)、LPS誘発性腹膜マクロファージにおいてヒトlnc-FAM164A1を強化発現させると、IL-1β、IL-6、およびTNF-α mRNA(図5B、5C、および5E)とTNF-αタンパク質(図5D)の発現が増強したが、未刺激細胞では、これらの分子の基底値は影響を受けなかった。CCL2 mRNA(図13A)およびIL-6タンパク質(図5F)の変化は観察されなかった。
lnc-FAM164A1がインビボで炎症促進遺伝子の発現を調節するかどうか確かめるために、機能獲得実験を、十分に確立した内毒素血症マウスモデルを用いて行った。アデノウイルスを投与して3日後に、RT-PCRによって肝臓におけるlnc-FAM164A1強化発現が検出された(図5A)。炎症促進性サイトカインTNF-αおよびIL-6の血漿レベルはアデノウイルス感染だけでは影響を受けないことが見出された(ELISA、図5Hおよび13B)。しかしながら、LPSで3時間刺激した後に、Ad-lnc-FAM164A1に感染した内毒素血症マウスの血漿中ではTNF-αレベルの有意な上昇が検出された(図5H)。血漿IL-6タンパク質の有意な変化はELISAによって検出されなかった(図13B)。Ad-lnc-FAM164A1に感染した内毒素血症マウスのサイトカインmRNAレベルの方が肝臓において有意に高かった(図13C、13D、13E)。
ヒト単球/マクロファージにおけるlnc-FAM164A1のsiRNAサイレンシングによって、内毒素血症ヒト化マウスモデルでのヒトCCL2およびIL-6の発現が減少する
ヒト単球/マクロファージにおけるlnc-FAM164A1のインビボ有意性を確かめるために、ヒトCD34+HSCを移植した後に血液、脾臓、および骨髄の中に30〜80％のヒトCD45+WBCと2〜12％の単球を有する最近開発されたヒト化NSG-SGM3マウスにおいて機能喪失研究を探索した(図14A〜14F)。単球/マクロファージ標的化脂質ナノ粒子C12-200の中に包まれたlnc-FAM164A1 siRNAオリゴまたは対照siRNAオリゴをヒト化NSG-SGM3マウスに投与した。lnc-FAM siRNAで処置したマウスに由来する精製ヒト単球ではlnc-FAM164A1発現が対照マウスと比較して30％減少することが見出された(図6A)。Lnc-FAM164A1 siRNAで処置したマウスの血漿中ではヒトCCL2およびIL-6タンパク質レベルは有意に低く(図6Cおよび6E)、腹膜細胞ではヒトCCL2およびIL-6 mRNAの発現は減少した(図6Dおよび6F)。ヒトCD68 mRNAの変化は腹膜細胞において検出されなかった(図6B)。このことから、同様の数のヒトマクロファージがLPS刺激性腹膜炎において蓄積したことが分かる。
RNAプルダウンと質量分析法の組み合わせによって、lnc-FAM164A1に結合する3種類のタンパク質が特定された
LPS活性化THP-1分化マクロファージにおいて、どのタンパク質がlnc-FAM164A1と相互作用するのかを扱うために、lnc-FAM164A1 RNAプルダウンアッセイを実施し、MSによる3回の独立した実験において溶出タンパク質を分析した。3種類のユニークなタンパク質(ATPクエン酸合成酵素:ACLY;フィラグリン-2:FLG2;スプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ:SFPQ)の標準化AUCはlnc-FAM164A1センスRNA対アンチセンスRNA(S/AS)およびセンスRNA対ビーズ対照(S/B)の比較において2倍を超えている(図7Aのベン図に示した)。さらに、lnc-FAM164A1センスRNAから溶出した、これらの3種類のタンパク質の標準化AUCはアンチセンスRNAおよびビーズ対照と比較して有意に高い(図15A、n=3、t検定によりp<0.05、センス対ビーズ;センス対アンチセンス)。
ネットワーク分析によってlnc-FAM164A1とヒト炎症性疾患が結び付けられた
次いで、ヒト疾患におけるlnc-FAM164A1の役割を計算により予測するために、相互作用タンパク質ACLY、FLG2、およびSFPQの疾患関連性を、これらのモジュールと疾患関連タンパク質との間の平均最短ネットワーク距離のネットワーク分析によって調べた。ACLYは、代謝障害および炎症障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、肥満、2型糖尿病、および関節リウマチと重大な関連性があった(図7B)。
ACLYのサイレンシングによって、LPS活性化細胞上でのlnc-FAM164A1強制発現によって誘導されるCCL2およびTNF-αの発現が減少する
RNAプルダウンとウエスタンブロットの組み合わせによって、ヒトPBMC由来マクロファージ(図7C)およびTHP-1分化マクロファージ(図15B)においてACLYとlnc-FAM164A1センスRNAとの相互作用が確かめられた。対照的に、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質A1(hnRNPA1)がlnc-FAM164A1のアンチセンスRNAおよびセンスRNAの両方でプルダウンされた(図7Cおよび15B)。LPS活性化マクロファージ様細胞THP-1においてlnc-FAM164A1を強化発現させるとACLYタンパク質発現が増加し、ACLY mRNAレベルは変化しなかった(データは示されない)。最後に、ACLYサイレンシングによって、ヒト初代マクロファージ上でのlnc-FAM164A1強化発現によって誘導されたCCL2 mRNA発現が有意に減少し(図7D)、THP-1細胞上でのlnc-FAM164A1強化発現によって誘導されたTNF-α発現が有意に減少する(図15D〜15F)。
考察
本研究は、炎症促進性のヒトマクロファージ活性化の可能性のある重要な制御因子として初期応答lnc-RNAを特定することを目標とした。ヒトlnc-RNAマイクロアレイを用いたLPS誘発性ヒト初代マクロファージの不偏スクリーニングによって、lnc-FAM164A1を含む11種類のlnc-RNAが特定された。lnc-FAM164A1については限られた情報しか利用できない。2件の最近の研究から、高齢のヒトドナーのアキレス腱、およびグラム陰性細菌カンピロバクター・コンサイサス(Campylobacter concisus)に感染したTHP-1細胞においてlnc-FAM164A1発現が上昇することが証明された40,41。卵巣癌に対するlnc-RNA-lnc-RNAネットワーク分析はlnc-FAM164A1と細胞増殖との潜在的な関連性を示している42。膀胱癌においてlnc-FAM164A1(RP11-79H23.3)はインビボで細胞増殖、遊走、ならびに腫瘍形成および肺転移を調節する43。しかしながら、ヒトマクロファージにおけるlnc-FAM164A1の生物学的機能はまだ分かっていない。本研究における機能喪失(lnc-FAM164A1発現のサイレンシング)および機能獲得(アデノウイルスによって誘導される強化発現)実験から、lnc-FAM164A1はインビトロではLPS活性化ヒトマクロファージにおいて、インビボでは内毒素血症マウスモデルにおいて炎症応答を促進することが明らかになった。ACLYはlnc-FAM164A1結合タンパク質の1つとして特定され、lnc-FAM164A1/ACLY相互作用はインビトロではlnc-FAM164A1強化発現によって誘導されるCCL2およびTNF-αの発現に寄与する。
lnc-FAM164A1はNF-κBシグナル伝達の標的であり、その発現レベルは、ヒト初代マクロファージではLPS、IL-6、またはTNF-αによる刺激によって増加することが本明細書において示された。そして次に、誘導性lnc-FAM164A1は、いくつかの証拠によって支持されるNF-κBシグナル伝達カスケードを誘発する。従って、本明細書において提供されるデータから、lnc-FAM164A1はNF-κB活性化の正のフィードバックループを加速することによって炎症を増強する可能性があることが分かる。マウスおよびヒトのマクロファージにおいて複数のlnc-RNA(lincRNA-Tnfaips、lincRNA-Cox2およびMALAT1、FIRRE、Carlr)がNF-κBシグナル伝達調節および炎症遺伝子転写において役割を果たすことが証明されている16,21,24,26,27。これらの知見から、NF-κB活性は負の調節エレメントまたは正の調節エレメントによって複数のレベルで正確に制御されるという考えがさらに裏付けられる。
lnc-FAM164A1を強化発現させると未刺激HEK293細胞ではNF-κB活性が増加し、未刺激THP-1細胞および初代マクロファージではIκB-α分解が誘導された(図4)。しかしながら、LPSを用いないlnc-FAM164A1強化発現では、インビトロでは培養マクロファージ上で、インビボでは血漿試料中で、TNF-α発現はmRNAレベルおよびタンパク質レベルで増加しなかった(図5)。これらの一組のデータは、LPS刺激マクロファージではNF-κB標的遺伝子の活性化を同時制御するためにlnc-FAM164A1とNF-κBシグナル伝達との間でクロストークがあることを示しているかもしれない。
lnc-FAM164A1結合タンパク質であるACLYはインビトロではlnc-FAM164A1強化発現によって誘導されるCCL2およびTNF-αの発現に有意に寄与することが本明細書において証明される(図7および図15A〜15F)。THP-1分化マクロファージ細胞ではlnc-FAM164A1強化発現によってACLY mRNAが変化することなくACLYのタンパク質発現が増加することも見出された(データは示されない)。LPS活性化マクロファージではクエン酸キャリア(Slc25a1)の発現が上昇してミトコンドリアからのクエン酸輸送が増加する。クエン酸はACLYによって代謝されて、オキサロ酢酸とアセチル-CoAを生じる。後者は、NF-κBのp50およびp65サブユニットを含むヒストンタンパク質および転写因子のアセチル化のためにアセチル基を提供する44。従って、lnc-FAM164A1強化発現によってサイトゾルアセチル-CoAレベルとp65/p50アセチル化が増加する可能性があり、これによってNF-κB活性化が促進され45、LPS活性化ヒトマクロファージにおいて炎症性サイトカインの発現が上昇する。
膀胱癌における最近の知見から、lnc-FAM164A1(RP11-79H23.3)は、保存されたmiR-107標的部位を、PI3K/Aktシグナル伝達経路の負の制御因子であるPTENと共有することが証明された43。従って、ヒトマクロファージにおいてlnc-FAM164A1を強化発現すると、PTEN発現と、LPS活性化単球/マクロファージにおいてNF-κB活性化を負に調節するPI3K/AKTシグナル伝達経路の不活性化が増加するかもしれない46,47。従って、lnc-FAM164A1は、miR-107がヒトマクロファージにおいてNF-κBシグナル伝達を調節するためのスポンジ(sponge)としても働く可能性がある。
以前の研究から、lnc-RNA-THRIL、Lnc-RNA-TCONS_00019715、およびlnc-MacORISを含む数種類のヒトlnc-RNAがサイトカイン発現およびマクロファージ活性化/極性化を調節すると報告された22,23 29。広範な刺激で処理したマクロファージにおける新規の炎症応答制御因子として現れた興味深いlnc-RNAリストから、これらの別個のlnc-RNAが、炎症性疾患および心血管代謝疾患において重大な役割を果たしている可能性があることが分かる。しかしながら、lnc-FAM164A1を含むヒトlnc-RNAの大半にはマウスのホモログが無く、このため、マウスモデルにおいてlnc-RNAの生物学的有意性を確かめることは難題となっている。
本明細書では、lnc-FAM164A1のインビボでの重要性を確かめるために内毒素血症ヒト化マウスモデルを確立した。CD34+HSCまたはPBMCを移植したヒト化NSGマウスは、インビボでのヒト生物学的プロセスを研究するだけでなく、感染症、自己免疫、癌、およびアテローム性動脈硬化症を含むヒト疾患を研究するのにも広く用いられてきた48-51。内毒素血症のヒト化NSGマウスモデルでは50、LPS曝露によって白血球のlnc-FAM164A1発現が増加した(図1D)。内毒素血症NSGマウスにおけるlnc-FAM164A1発現レベルは肺よりも脾臓の方が高い(図9B)。これは脾臓にヒト単球/マクロファージが蓄積していることで説明が付くかもしれない52。単球/マクロファージを特異的に標的化する脂質ナノ粒子によるlnc-FAM164A1のsi-RNAサイレンシングによって、内毒素血症NSG-SGM3マウスから単離した血漿および腹膜細胞においてヒトCCL2およびIL-6の発現が有意に減少することがさらに証明された(図6)。様々な臓器におけるヒトサイトカインmRNAのさらなる分析から、lnc-FAM164A1サイレンシングによって肺では炎症性サイトカインのmRNAが減少するが、肝臓および脾臓では変化しないことが見出された(データは示されない)。このことは、肺胞マクロファージが全身炎症と敗血性肺損傷に有意に寄与することを示しているのかもしれない。エクスビボでは、LPSで刺激したクエン酸塩添加ヒト全血から単離したPBMCにおけるlnc-FAM164A1発現の増加も見出された(図1C)。これらの全てデータから敗血症患者に由来する循環PBMCにおいてlnc-FAM164A1発現が増加することが分かった。血中のLnc-FAM164A1発現レベルは、さらなる研究を保証する有用な敗血症バイオマーカーとなるかもしれない。
参考文献
Figure 2020536902
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実施例2
細胞外小胞を作製するための方法
培養培地をアデノウイルス感染RAW264.7細胞から24時間にわたって収集したか、またはLPS活性化ヒトPBMC由来マクロファージもしくはTHP-1分化マクロファージ細胞から収集した。細胞および細胞破片を除去するために1500gで15分間、2回遠心分離した後に、細胞外小胞(EV)を100,000gで1時間の超遠心によってペレット化し、10倍の濃縮(enrichment)で通常の増殖培地に再懸濁した。RAW細胞由来EVをRAW264.7細胞に添加し、1時間インキュベートした後に、10ng/mL LPSを2時間添加した。全RNAをEV細胞またはRAW細胞から抽出し、cDNA合成に使用した。マウスサイトカインのlnc-FAM164A1 RNAおよびmRNAの発現をRT-PCRによって確かめ、GAPDHで標準化した。図17は、細胞外小胞中にあるlnc-FAM164A1を示したデータを表す。
実施例3
LPSによってアップレギュレートされることが見出されたlnc-RNAの配列が本明細書において説明される。lnc-RNAには、AL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);およびRP13-452N2.1が含まれるが、これに限定されない。SEQ ID NO:1はlnc-FAM164A1のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:28はD63785のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:29はRP11-56023.5のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:30はRP11-143M1.3のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:31はLOC440896のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
Figure 2020536902
SEQ ID NO:32はP2RX7(NR_033950とも知られる)のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
Figure 2020536902
Figure 2020536902
SEQ ID NO:33はAC010980.2のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:34はRP11-536K7.5のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:35はRP11-58A12.2のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:36はAL078621.3のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
SEQ ID NO:37はRP13-452N2.1のヌクレオチド配列である。
Figure 2020536902
ヒトPBMC由来マクロファージ上でのアンチセンスおよびsi-RNAオリゴヌクレオチドによるlnc-FAM164A1のサイレンシング
ヒトPBMC由来マクロファージに対してlnc-FAM164A1 RNAサイレンシングを、SilenceMag(BOCA Scientific, Boca Raton, FL)を用いて50〜100nMの最終濃度で行った32。トランスフェクションの36〜48時間後に、マクロファージを10ng/mL LPSで2〜6時間刺激した後に、マクロファージおよび細胞培養培地を収集した。Antisense LNA(商標)long RNA GepmeRオリゴヌクレオチド標的lnc-FAM164A1
Figure 2020536902
および非特異的な負の対照オリゴヌクレオチド
Figure 2020536902
をExiqon A/S(Vedbaek, Denmark)によって設計した。lnc-FAM164A1を標的とするsi-RNAオリゴヌクレオチドおよびルシフェラーゼ対照siRNAオリゴはAxolabs(Kulmback, Germany)によって設計された。これらの配列および化学修飾は以下の通りである(A、G、U、C:RNAヌクレオチド;a、g、u、c:2’-O-メチル-ヌクレオチド、s:ホスホロチオエート、dT:デスオキシ-T残基):ルシフェラーゼ対照siRNA(XD-00194):
Figure 2020536902
。Lnc-FAM164A1特異的siRNAオリゴ#5(XD-05325):
Figure 2020536902
。Lnc-FAM164A1特異的siRNAオリゴ#8(XD-05328):
Figure 2020536902
。lnc-FAM164A1を阻害するのに使用した、さらなるオリゴを図18に示した。

Claims (57)

  1. 対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、マクロファージにおいて発現する長鎖ノンコーディングRNA(lnc-RNA)を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法。
  2. lnc-RNAが、AL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);およびRP13-452N2.1からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  3. 対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-FAM164A1を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法。
  4. 炎症性疾患が、内毒素血症、アテローム硬化性血管疾患、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、ステント内再狭窄、静脈移植片疾患、動静脈瘻疾患、血管石灰化、心臓弁膜症、心不全、自己免疫疾患、骨粗鬆症、異所性石灰化、脳卒中後の脳損傷、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病、ゴーシェ病、敗血症、腎機能障害、腎不全、および癌からなる群より選択される、請求項1または3記載の方法。
  5. 心臓弁膜症が大動脈弁疾患または僧帽弁疾患である、請求項4記載の方法。
  6. 炎症性疾患が組織移植または細胞移植に応答して発生する、請求項1または3記載の方法。
  7. 炎症性疾患が急性または慢性である、請求項1または3記載の方法。
  8. 前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、ならびに阻害性ポリペプチドからなる群より選択される、請求項1または3記載の方法。
  9. RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、請求項8記載の方法。
  10. 前記作用物質が、該作用物質をコードするベクターである、請求項8記載の方法。
  11. ベクターが非組込み型または組込み型である、請求項10記載の方法。
  12. 非組込み型ベクターが、EBNA1ベクター、ミニサークルベクター、非組込み型アデノウイルス、非組込み型RNA、およびセンダイウイルスからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
  13. ベクターがエピソームベクターである、請求項10記載の方法。
  14. ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項11記載の方法。
  15. lnc-RNAが標的細胞において阻害される、請求項1記載の方法。
  16. lnc-FAM164A1が標的細胞において阻害される、請求項3記載の方法。
  17. 標的細胞が哺乳動物細胞である、請求項15または16記載の方法。
  18. 標的細胞が、マクロファージ、T細胞、樹状細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または好中球である、請求項15または16記載の方法。
  19. マクロファージが活性化マクロファージである、請求項15または16記載の方法。
  20. 対象が哺乳動物である、請求項1または3記載の方法。
  21. 対象がヒトである、請求項20記載の方法。
  22. 阻害が、レベルおよび/または活性の低減である、請求項1または3記載の方法。
  23. 有効量の前記作用物質が、lnc-RNAのレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項1記載の方法。
  24. 有効量の前記作用物質が、lnc-RNAの活性を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項1記載の方法。
  25. 有効量の前記作用物質が、lnc-FAM164A1のレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項3記載の方法。
  26. 有効量の前記作用物質が、lnc-FAM164A1の発現を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項3記載の方法。
  27. 対象が、炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがある、請求項1または3記載の方法。
  28. 対象が、炎症性疾患を有すると以前に診断されたことがない、請求項1または3記載の方法。
  29. 対象が、炎症性疾患を発症する少なくとも1つの危険因子を示す、請求項1または3記載の方法。
  30. 投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると対象を診断する工程をさらに含む、請求項1または3記載の方法。
  31. 投与する工程の前に、炎症性疾患を有すると患者を診断するアッセイの結果を受け取る工程をさらに含む、請求項1または3記載の方法。
  32. 前記作用物質が、プラズマ細胞および/または腹膜細胞におけるCCL2およびIL-6の発現を減少させる、請求項1または3記載の方法。
  33. 前記作用物質がNFkBシグナル伝達を減少させる、請求項1または3記載の方法。
  34. 対象において炎症性疾患を処置または予防する方法であって、lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する有効量の作用物質を対象に投与する工程を含む、方法。
  35. lnc-RNAに結合するタンパク質が、ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);およびスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)からなる群より選択される、請求項34記載の方法。
  36. lnc-RNAに結合するタンパク質がACLYである、請求項34〜35のいずれか一項記載の方法。
  37. 前記作用物質が対象においてCCL2およびTNF-αの発現を減少させる、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
  38. 阻害によって前記タンパク質のレベルまたは活性が低減する、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
  39. 阻害によって前記タンパク質とlnc-RNAとの結合が低減する、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
  40. lnc-RNAがlnc-FAM164A1である、請求項39記載の方法。
  41. 有効量の前記作用物質が、前記タンパク質のレベルを、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項34記載の方法。
  42. 有効量の前記作用物質が、前記タンパク質の活性を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項34記載の方法。
  43. 有効量の前記作用物質が、前記タンパク質とlnc-RNAとの結合を、適切な対照と比較して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれを超えて低減する、請求項34記載の方法。
  44. 対象において炎症性疾患を処置する方法であって、以下の工程を含む方法:
    a．生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定するアッセイの結果を受け取る工程;
    b．lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;
    c．lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および
    d．炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程。
  45. 対象において炎症性疾患を処置する方法であって、以下の工程を含む方法:
    a．生物学的試料中のマクロファージにおいて発現しているlnc-RNAのレベルを測定する工程;
    b．lnc-RNAのレベルを参照レベルと比較する工程;
    c．lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して増加していれば、対象を炎症性疾患を有すると同定する工程;および
    d．炎症性疾患を有する対象に、lnc-RNAを阻害する作用物質、またはlnc-RNAを阻害する作用物質を含む組成物を投与する工程。
  46. lnc-RNAがAL078621.3;RP11-536K7.5;RP11-143M1.3;RP11-561O23.5;AC10980.2;P2RX7;LOC440896;D63785;RP11-58A12.2;RP11-79H23.3(lnc-FAM164A1);およびRP13-452N2.1からなる群より選択される、請求項44または45記載の方法。
  47. lnc-RNAがlnc-FAM164A1である、請求項46記載の方法。
  48. 工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む、請求項45記載の方法。
  49. マクロファージにおいて発現するlnc-RNAを阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  50. lnc-FAM164A1を阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  51. lnc-RNAに結合するタンパク質を阻害する作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  52. lnc-RNAに結合するタンパク質が、ATPクエン酸合成酵素(ACLY);フィラグリン-2(Flg2);およびスプライシング因子プロリン-アンド-グルタミン-リッチ(SFPQ)からなる群より選択される、請求項51記載の薬学的組成物。
  53. 前記作用物質が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNA干渉(RNAi)、アンチセンスRNA、RNAデコイ分子、RNAアプタマー、または阻害性ポリペプチドからなる群より選択される、請求項49〜52のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  54. RNAiがマイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、請求項53記載の薬学的組成物。
  55. 敗血症を有する対象を同定する方法であって、以下の工程を含む方法:
    a．生物学的試料中のlnc-FAM164A1のレベルを測定する工程;
    b．lnc-FAM164A1のレベルを参照レベルと比較する工程;
    c．lnc-RNAのレベルが参照レベルと比較して増加していれば、対象を敗血症を有すると同定する工程;および
    d．敗血症を有する対象に、敗血症を処置する治療を施す工程。
  56. 工程(a)の前に、対象から生物学的試料を入手する工程をさらに含む、請求項55記載の方法。
  57. 生物学的試料が血液試料である、請求項55記載の方法。
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