CN114746547A - 通过抑制鞘脂类治疗和预防衰老相关疾病和/或衰老 - Google Patents

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J·奥沃克斯
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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防衰老相关疾病和/或衰老的鞘脂类的抑制剂。

Description

通过抑制鞘脂类治疗和预防衰老相关疾病和/或衰老
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防衰老相关疾病和/或衰老的鞘脂类的抑制剂。
背景技术
在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开虽然被认为与本发明的可专利性无关，但通过引用将其全部内容并入本文。更具体地，所有引用的文件都以引用的方式并入，就好像每个单独的文件被具体和单独地指出以引用的方式并入一样。
人口正在老龄化。根据联合国世界人口展望2015年修订版，在2010-2015年，在出生时的平均预期寿命为71岁(男性70岁，女性72岁)。因此，社会中老年人的数量和比例不断增长。目前，世界现有人口的11％以上是60岁及以上的人。
衰老是大多数疾病已知的最大风险因素之一。全世界每天约有150,000人死亡，其中约三分之二死于与年龄有关的因素。已知一些预防和延缓衰老的策略。非限制性实例是热量限制、睡眠不要太多也不要太少(5至7小时之间)、体育锻炼和避免压力。然而，仍需要新的策略来治疗和预防衰老相关疾病和一般衰老。本发明解决了这种需求。
发明内容
因此，本发明涉及用于治疗或预防衰老相关疾病和/或衰老的鞘脂类的抑制剂。
本发明同样涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防衰老相关疾病和/或衰老的方法，包括为所述受试者施用治疗有效量的鞘脂类的抑制剂。
在这方面，优选所述衰老相关疾病和/或衰老的治疗或预防至少部分是通过激活肌肉祖细胞中的成肌分化来实现的。
在这方面，还优选所述衰老相关疾病和/或衰老的治疗或预防导致被治疗受试者的改善的健康(fitness)。作为确定改善的健康的手段，可以使用测力计测试或乳酸测试，比较治疗之前与治疗之后/治疗期间。
所述抑制剂优选特异性抑制鞘脂类，更优选特异性抑制被治疗受试者中鞘脂类的从头合成。特异性结合表明所述抑制剂不抑制或基本上不抑制其它靶，例如其它脂质或蛋白质或肽。鞘脂类的抑制剂的性质不受特别限制，下文将提供合适抑制剂的具体实例。在这方面，“基本上”是指与设定为100％的靶抑制作用相比，当在相同条件下测量抑制作用时，逐渐优选偏离靶抑制作用小于10％、小于5％和小于1％。
被治疗的受试者优选是哺乳动物，最优选是人。
鞘脂类是一类含有鞘氨醇碱基骨架的脂质，这是一组包括鞘氨醇的脂肪族氨基醇。鞘氨醇(2-氨基-4-反式-十八烯-1,3-二醇)是一种具有不饱和烃链的18碳氨基醇。鞘脂类在信号转导和细胞识别中起重要作用。
衰老代表受试者一生中变化的累积，尤其包括身体和心理变化，例如肌肉强度、活动性、耐力和/或记忆能力的降低。这些变化可能导致衰老相关疾病(也称为衰老关联疾病)。
衰老相关疾病是一种最常见的随着逐渐衰老而频率增加的疾病。本质上，衰老关联疾病是由衰老引起的并发症。衰老相关疾病要与衰老过程本身区别开来，因为所有受试者都会变老，但并非所有老年受试者都患有衰老相关疾病。下文将提供衰老相关疾病的实例。
如本文所述的抑制剂可配制成小泡，例如脂质体或外来体，或配制为脂质纳米球。从药物递送的角度来看，脂质体因其特异性和作用持续时间而引起了极大的兴趣。脂质体细胞型递送系统已用于有效地将核酸例如siRNA在体内递送至细胞中(Zimmermann et al.(2006)Nature,441:111-114)。脂质体是单层或多层小泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。水性部分含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优势。非阳离子脂质体虽然不能有效地与细胞壁融合，但在体内被巨噬细胞和其它细胞吞噬。外来体是可以携带包括RNA在内的多种不同分子的脂质包装(Alexander et al.(2015),NatCommun；6:7321)。包括其中包含的分子的外来体可以被受体细胞摄取。因此，外来体是重要的细胞间通讯的介质和细胞微环境(niche)的调节物。外来体可用于诊断和治疗目的，因为其可以用作递送载体，例如用于造影剂或药物的递送。适用于本文的脂质纳米球例如描述于US 2012/040007和WO 2004/039351中。
所述抑制剂可以以合适的剂量和/或治疗有效量施用于受试者。
观察变化所需的治疗时间和治疗后发生反应的时间间隔取决于所需效果。具体的量可以通过本领域技术人员熟知的常规测试来确定。合适的测试例如描述于Tamhane andLogan(2002),“Multiple Test Procedures for Identifying the Minimum Effectiveand Maximum Safe Doses of a Drug”,Journal of the American statisticalassociation,97(457):1-9中。
所述抑制剂可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合以形成药物组合物。根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于施用于受试者、优选人受试者的组合物。本发明的药物组合物包含上述化合物。其可以任选地包含能够改变所述抑制剂的特性从而例如稳定、调节和/或激活其功能的其它分子。所述组合物可以是固体、液体或气体形式，并且尤其可以是粉末、片剂、溶液或气雾剂的形式。本发明的药物组合物可以任选地和另外地包含药学上可接受的载体。合适的药用载体的实例在本领域中是熟知的并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液、包括DMSO的有机溶剂等。包含这种载体的组合物可以是通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者。给药方案将由主治医师和临床因素决定。正如医学领域所熟知的，施用于任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和其它同时施用的药物。给定情况下的治疗有效量将很容易通过常规实验确定并且在临床医生或医师的技能和判断范围内。通常，作为药物组合物的常规给药方案应在每天1μg至5g单位的范围内。然而，更优选的剂量可能在每天0.01mg至100mg、甚至更优选0.01mg至50mg并且最优选0.01mg至10mg的范围内。此外，如果例如所述化合物是iRNA制剂，例如siRNA，则所施用的药物组合物的总药学有效量通常将小于约75mg/kg体重，例如小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重。更优选地，所述量将小于2000nmol iRNA制剂(例如，约4.4×1016拷贝)/kg体重，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmol iRNA制剂/kg体重。观察变化所需的治疗时间和治疗后发生反应的时间间隔取决于所需的效果。具体的量可以通过本领域技术人员熟知的常规测试来确定。
下文所附实施例中的数据建立了鞘脂代谢与衰老相关疾病和衰老之间的关系。鞘脂类与代谢疾病、癌症和心血管疾病有关。所述数据提供了鞘脂类对肌肉再生具有独立影响的证据，并指出衰老相关疾病和衰老通常与肌肉强度的丧失有关。这通过多球壳菌素诱导的新鲜分离的肌肉干细胞(MuSC)以及小鼠和人永生化成肌细胞系的增殖和分化得到验证，证明了鞘脂合成抑制对肌生成的细胞自主作用。这些效应对鞘脂从头合成途径而不是对于多球壳菌素的脱靶效应的特异性，通过遗传失活所述途径的不同成员包括Sptlc1和Cers2的促进肌生成的作用得到证实，Sptlc1和Cers2是骨骼肌中最富集的神经酰胺合酶。这些发现表明，抑制鞘脂从头合成途径有望减轻衰弱症和肌肉减少症。
在小鼠中，阻断鞘脂从头合成会产生多种益处，抵消衰老对MuSC的影响。多球壳菌素处理增加了MuSC的增殖能力，补充了衰老耗竭的MuSC池，并且其似乎促使MuSC加速再生，如表现为在多球壳菌素处理后MYOD(成肌细胞测定蛋白1)和MYOG(肌形成蛋白)蛋白水平增加(图5a-b)，甚至从多球壳菌素处理的小鼠移植MuSC后生理测试性能改善(图4n-p)。增加的生肌潜能不限于MuSC，还延伸到成肌细胞，表明鞘脂耗竭对肌肉祖细胞具有更广泛的生肌作用。
Helsinki出生队列研究的遗传分析表明，靶向鞘脂从头生物合成途径对人具有健康相关的益处。携带SPTLC1和SPTLC2多态性主要等位基因的个体在GTEx数据中均显示出降低的mRNA表达及在HBCS中改善的年龄相关健康，以SFT分数表示。看起来SPTLC1变体显示出与肌肉强度更强的关联，例如握力和二头肌推举，而SPTLC2变体显示出与柔韧性更强的关联，例如抓背、坐姿和伸展。总之，cis-eQTL和QTL信号之间的重叠暗示遗传降低的SPTLC1和SPTLC2水平可能导致改善的健康，这与多球壳菌素的体内治疗一致，表明在人体中通过药理学方法使鞘脂从头合成失活是治疗和预防衰老相关疾病和衰老的手段。
研究结果表明，由于衰老的多球壳菌素处理的小鼠中改善的健康、对肌肉分化的细胞自主影响以及来自人类遗传学的证据，抑制鞘脂类合成是一种治疗手段。
根据本发明的一个优选实施方案，所述衰老相关疾病是衰弱症、年龄相关共患病症或肌肉减少症，优选是衰弱症。
衰弱症(或衰弱综合征)是一种多维度老年综合征，其特征在于多个身体系统或功能的累积衰退，其发病机制涉及身体和社会维度。衰弱症增加了不佳健康状况的脆弱性，例如残疾、住院、生活质量下降甚至死亡(Cruz-Jentoft el al(2019),Age Ageing；48(1):16–31)。衰弱症表型被定义为满足以下五个表型标准中的三个或更多个的独特临床综合征：虚弱、迟钝、低水平的身体活动、自我报告的疲惫和非有意的体重减轻(Chen et al.(2014),Clin Interv Aging.2014；9:433–441)。衰弱症通常也与认知障碍有关。特别地，衰弱症和认知能力下降和痴呆症之间的关联已被证明。此外，衰弱症通常与肌肉萎缩(即肌肉组织的消耗或丧失)和/或肌肉减少症有关。
肌肉减少症是一种肌肉疾病(肌肉衰竭)，其根源在于终生累积的不利肌肉变化；肌肉减少症在老年人中常见，但也可能发生在生命早期(Cruz-Jentoft el al(2019),AgeAgeing；48(1):16–31)。肌肉减少症是一种进行性和全身性骨骼肌疾病，与增加的包括跌倒、骨折、身体残疾和死亡率等不良后果的可能性有关。EWGSOP(Writing Group for theEuropean Working Group on Sarcopenia in Older People)最初对肌肉减少症的操作型定义在当时是一个重大变化，因为其在以前仅基于检测到低肌肉质量的定义的基础上增加了肌肉功能。在其2018年定义中也适用于此，EWGSOP2使用低肌肉强度作为肌肉减少症的主要参数。肌肉强度是目前最可靠的肌肉功能量度。具体来说，当检测到低肌肉强度时，可能是肌肉减少症。存在肌肉数量或质量低可确认肌肉减少症诊断。当低肌肉强度、低肌肉数量/质量和低身体性能均被检测到时，肌肉减少症被认为是严重的。
虽然衰弱症的身体表型与肌肉减少症有一些重叠(例如握力低、缓慢步态速度和体重减轻)，但衰弱症和肌肉减少症仍然是不同的疾病(Cruz-Jentoft el al(2019),AgeAgeing；48(1):16–31)。前者是老年综合征，后者是疾病。虽然肌肉减少症是导致身体衰弱症的一个因素，但衰弱综合征代表了一个更广泛的概念。衰弱症被视为一生中多个生理系统的衰退，从而对身体、认知和社会维度造成负面影响(Cruz-Jentoft el al(2019),AgeAgeing；48(1):16–31)。
衰老相关疾病也可以是衰老相关共患病的部分，注意到共患病通常被定义为个体中存在两种或更多种慢性医学状况。共患病可能会给护理带来一些挑战，特别是在存在更多的共存状况和相关的多种药物治疗的情况下。
下面的实例特别证明了鞘脂类的抑制剂适于治疗和预防衰弱症和肌肉减少症。出于这个原因，这两种疾病是优选的，而衰弱症是最优选的。
根据本发明的一个更优选的实施方案，衰弱症的特征在于(i)肌肉减少症和/或肌肉萎缩，和(ii)认知障碍。
如上文所讨论的，在患有衰弱症的受试者中，经常可以观察到(i)肌肉减少症和/或肌肉萎缩，和(ii)认知障碍。认知障碍通常是与衰老相关的认知障碍。
如还讨论过的，衰弱症通常特征在于由于肌肉减少症和/或肌肉萎缩导致的虚弱以及由于认知障碍导致的记忆丧失。
从实施例9可以看出，令人惊讶地发现鞘脂类的抑制剂特别适于治疗和预防特征在于(i)肌肉减少症和/或肌肉萎缩和(ii)认知障碍的衰弱症。这是因为所述治疗同时改善了(i)肌肉减少症和/或肌肉萎缩以及(ii)认知障碍。更详细地，多球壳菌素处理的小鼠表现出减少的虚弱、增加的步行速度、减少的疲惫、增加的最大耗氧量、更高的身体和肌肉质量以及更高的身体活动。所有这些参数都表明肌肉减少症和/或肌肉萎缩的改善。此外，在物体识别测试中，与DMSO处理的对应小鼠相比，多球壳菌素处理的小鼠在探索熟悉物体和新物体上花费的时间更多，但探索新物体的时间也比未处理的小鼠成比例地更多。因此，抑制鞘脂合成也可以改善记忆。
根据本发明的一个更优选的实施方案，所述认知障碍是老年性痴呆。
老年性痴呆是与老年相关的智力能力的精神丧失。老年性痴呆会导致认知能力下降，例如记忆丧失。
根据本发明的优选实施方案，所述鞘脂类是二氢神经鞘氨醇类(sphinganines)、鞘氨醇类(sphingosines)、神经酰胺类、二氢神经酰胺类、鞘磷脂类、脱氧鞘脂类(例如1-脱氧鞘氨醇)或其任意组合。
在这组中，优选神经酰胺类，因为下文实施例证明了抑制神经酰胺类合成的直接作用。
二氢神经鞘氨醇，也称为二氢鞘氨醇，是通过丝氨酸与棕榈酰-CoA脱羧缩合形成酮中间体，然后被NADPH还原而生物合成。
鞘氨醇(2-氨基-4-反式-十八烯-1,3-二醇)是一种具有不饱和烃链的18碳氨基醇，其构成鞘脂类的主要部分，所述鞘脂类是一类细胞膜脂质，包括鞘磷脂，这是一种重要的磷脂。
神经酰胺类是一类蜡状脂质分子。神经酰胺由鞘氨醇和脂肪酸组成。
通过将4,5-反式双键插入二氢神经酰胺的鞘脂骨架，可以将二氢神经酰胺转化为神经酰胺。
鞘磷脂通常由磷酸胆碱和神经酰胺或磷酸乙醇胺头基组成。
脱氧鞘脂类是由丝氨酸-棕榈酰转移酶通过交替使用丙氨酸而不是其常规底物丝氨酸而形成的。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述抑制剂是参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的抑制剂。
鞘脂类是在始于ER并在高尔基体中完成的途径中合成的。鞘脂类的代谢过程已被广泛研究，大多数合成和降解的生化途径包括所有涉及的酶均已成功确定(Rao et al(2013),Journal of Lipids,Volume 2013,Article ID 178910)。
根据本发明的一个更优选的实施方案，所述一种或多种酶选自：SPTLC1，SPTLC2，SPTLC3，KDSR，CERS1，CERS2，CERS3，CERS4，CERS5，CERS6，DEGS1，SGMS1，SGMS2，SMPD1，SMPD2，SMPD3，SMPD4，ASAH1，ASAH2，ASAH2B，ASAH2C，ACER1，ACER2，ACER3，SPHK1和SGPP1。
所述酶的全名将在下文提供，所述全名也可以全部取自例如UniPort.org蛋白质数据库。这个数据库为科学界提供了可免费访问的蛋白质序列和功能信息资源。
SPTLC1至3是丝氨酸棕榈酰转移酶，长链碱基亚基1至3。丝氨酸棕榈酰转移酶由两个不同的亚基组成，是鞘脂生物合成中的起始酶。其将L-丝氨酸和棕榈酰CoA转化为3-氧代鞘氨醇，其中5’-磷酸吡哆醛作为辅因子。
KDSR是3-酮二氢鞘氨醇还原酶，催化3-酮二氢鞘氨醇(KDS)还原为二氢鞘氨醇(DHS)。
CERS1至6是神经酰胺合酶1至6。CERS1催化从二氢鞘氨醇和酰基-CoA底物形成神经酰胺，对硬脂酰-CoA(十八烷酰-CoA；C18:0-CoA)具有高选择性。CERS2神经酰胺合酶催化从鞘氨醇和酰基-CoA底物形成神经酰胺，对作为酰基供体的极长(C22:0至C24:0)链具有高选择性。CERS3催化从二氢鞘氨醇和酰基-CoA底物形成神经酰胺，对作为酰基供体的极长链(C22:0至C24:0)和超长链(超过C26:0)具有高选择性。CERS4催化从二氢鞘氨醇和酰基-CoA底物形成神经酰胺，对作为酰基供体的长链和极长链(C18:0至C22:0)具有高选择性。CERS5催化从二氢鞘氨醇和酰基-CoA底物形成神经酰胺，对作为酰基供体的棕榈酰基-CoA(十六酰基-CoA；C16:0-CoA)具有高选择性。最后，CERS6催化从二氢鞘氨醇和酰基-CoA底物形成神经酰胺，对作为酰基供体的棕榈酰基-CoA(十六酰基-CoA；C16:0-CoA)具有高选择性。
DEGS1是鞘脂δ(4)-去饱和酶DES1，具有鞘脂-δ-4-去饱和酶活性。其将D-赤型鞘氨醇转化为D-赤型鞘氨醇(E-鞘氨-4-醇)。
SGMS1和2是磷脂酰胆碱:神经酰胺胆碱磷酸转移酶1和2。这些鞘磷脂合酶通过将磷脂酰头基、磷脂酰胆碱转移到神经酰胺的伯羟基上来合成鞘脂、鞘磷脂。
SMPD1至4是将鞘磷脂转化为神经酰胺的鞘磷脂磷酸二酯酶1至4。
ASAH1、2、2B和2C是神经酰胺酶1、2、2B和2C，其在酸性或中性pH将鞘脂神经酰胺水解为鞘氨醇和游离脂肪酸。
ACER1至3是神经酰胺酶1至3，其在碱性pH催化神经酰胺水解为鞘氨醇和游离脂肪酸。
SPHK1是鞘氨醇激酶1，将鞘氨醇磷酸化为1-磷酸鞘氨醇(S1P)。
SGPP1是1-磷酸鞘氨醇磷酸酶1，特异性地使1-磷酸鞘氨醇(S1P)、二氢-S1P和phyto-S1P去磷酸化。
根据本发明的另一个更优选的实施方案，所述抑制剂抑制(i)编码参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的核酸分子的表达，或(ii)参与鞘脂类生物合成的酶的酶活性。
表达(或基因表达)是将来自基因的信息用于合成功能性基因产物的过程，所述功能性基因产物在本案中是参与鞘脂类生物合成的酶。表达涉及将DNA转录成mRNA和随后将mRNA翻译成蛋白质的步骤。因此，可以通过确定在存在和不存在所述抑制剂的情况下mRNA转录物或蛋白质的数目来确定表达的抑制。
酶活性可以表示为每单位时率转化的底物摩尔数×反应体积。酶活性是存在的活性酶数量的量度。酶活性的SI单位是katal，1katal＝1mol s-1。因此，酶活性可以在存在和不存在所述抑制剂的情况下进行测试。
逐步优选的是所述抑制剂将所述表达或酶活性降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。最优选完全消除所述表达或酶活性。
优选通过能够将功能丧失突变引入编码参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的核酸分子中的抑制剂来抑制编码参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的核酸分子的表达。
一些抑制剂的效力可以以高通量形式同时测定。独立于生化、细胞或其它测定的高通量测定通常可以在微滴定板的孔中进行，其中每个平板可以含96、384或1536个孔。所述平板的处理包括在不同于环境温度的温度下温育以及使测试化合物与测定混合物接触优选通过一种或多种计算机控制的机器人系统(包括移液装置)来实现。如果要筛选大的测试化合物库和/或要在短时间内进行筛选，可以将例如10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物添加到每个孔中。如果孔表现出预期活性，则可以对所述测试化合物的混合物进行去卷积以鉴定所述混合物中产生所述活性的一种或多种测试化合物。
根据本发明的另一个更优选的实施方案，(I)(i)的抑制剂选自小分子、适体、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、反义核酸分子、基于CRISPR-Cas9的构建体、基于CRISPR-Cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(TAL)效应物(TALE)核酸酶，和/或(II)(ii)的抑制剂选自小分子、抗体或抗体模拟物和适体。
如本文所用，“小分子”优选是有机分子。有机分子涉及或属于具有碳基的化合物类别，碳原子通过碳-碳键连接在一起。术语有机的原始定义与化合物的来源有关，有机化合物是从植物或动物或微生物来源获得的那些含碳化合物，而无机化合物是从矿物来源获得的。有机化合物可以是天然的或合成的。有机分子优选为芳族分子，更优选为杂芳族分子。在有机化学中，术语芳香性用于描述具有共振键环的环状(圆形)平面(扁平)分子，其与具有相同原子集的其它几何或连接排列相比表现出更高的稳定性。芳香族分子非常稳定，不易分解而与其它物质反应。在杂芳族分子中，芳环中的至少一个原子是碳以外的原子，例如N、S或O。对于所有上述有机分子，分子量优选在200Da至1500Da的范围内，更优选在300Da至1000Da的范围内。
或者，根据本发明的“小分子”可以是无机化合物。无机化合物来源于矿物来源，包括所有不含碳原子的化合物(除外二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐)。优选地，所述小分子的分子量小于约2000Da，或小于约1000Da，例如小于约500Da，甚至更优选小于约Da。小分子的大小可以通过本领域熟知的方法例如质谱法来确定。例如，可以基于靶分子的晶体结构设计小分子，其中可以在体内测定例如体内高通量筛选(HTS)测定中鉴定和验证可能负责生物学活性的位点。
根据本发明使用的术语“抗体”包括例如多克隆或单克隆抗体。此外，仍然保留对靶的结合特异性的其衍生物或片段也包括在术语“抗体”中。抗体片段或衍生物例如包括Fab或Fab’片段、Fd、F(ab’)2、Fv或scFv片段、单域VH或V-样结构域如VhH或V-NAR-结构域以及多聚体形式如微抗体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(tribodies)或三重抗体(triplebodies)、四抗体(tetrabodies)或化学缀合的Fab’-多聚体(参见例如Harlowand Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,198；Harlow and Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,1999；Altshuler EP,Serebryanaya DV,Katrukha AG.2010,Biochemistry(Mosc).,vol.75(13),1584；Holliger P,Hudson PJ.2005,NatBiotechnol.,vol.23(9),1126)。多聚体形式特别包括可以同时结合两种不同类型抗原的双特异性抗体。双特异性抗体形式的非限制性实例是Biclonics(双特异性、全长人IgG抗体)、DART(双亲和性重新靶向抗体)和BiTE(由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)组成)分子(Kontermann and Brinkmann(2015),Drug Discovery Today,20(7):838-847)。
术语“抗体”还包括诸如嵌合抗体(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化抗体(非人CDR的人抗体)的实施方案。
用于产生抗体的各种技术在本领域中是熟知的并且描述于例如Harlow和Lane(见下文)和Altshuler等人，2010年，同上。因此，多克隆抗体可以在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后从动物的血液中获得，并且可以通过提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术来产生单克隆抗体。这种技术例如描述于Harlow E and Lane D,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1988；Harlow E and Lane D,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999，以及包括由
Figure BDA0003653660980000071
and Milstein,1975最初描述的杂交瘤技术，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(见例如KozborD,1983,Immunology Today,vol.4,7；Li J,et al.2006,PNAS,vol.103(10),3557)以及EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole et al.,1985,Alan R.Liss,Inc,77-96)。此外，重组抗体可以从单克隆抗体获得或可以使用各种展示方法如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示法从头制备。用于表达重组(人源化)抗体的合适系统可以选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见例如美国专利号6,080,560；Holliger P,Hudson PJ.2005,Nat Biotechnol.,vol.23(9),11265)。此外，用于产生单链抗体所描述的技术(尤其参见美国专利号4,946,778)可适用于产生特异于靶的表位的单链抗体。BIAcore系统中采用的表面等离子共振可用于提高噬菌体抗体的效力。
如本文所用，术语“抗体模拟物”是指与抗体一样可以特异性结合抗原的化合物，例如在本案上文描述的酶，但其在结构上与抗体不相关。抗体模拟物通常是摩尔质量约为3至20kDa的人工肽或蛋白质。
适体是结合特定靶分子的核酸分子或肽分子。适体通常通过从大型随机序列库中选择而创建，但天然适体也存在于核糖开关中。适体可作为大分子药物用于基础研究和临床目的。适体可以与核酶结合，在其靶分子存在的情况下进行自切割。这些化合物分子具有额外的研究、工业和临床应用(Osborne et.al.(1997),Current Opinion in ChemicalBiology,1:5-9；Stull&Szoka(1995),Pharmaceutical Research,12,4:465-483)。
核酸适体是通常由寡核苷酸的链(通常是短链)组成的核酸种类。通常，其已经通过重复多轮的体外选择或等效的SELEX(指数富集的配体系统进化)工程化，以结合各种分子靶，如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体。
肽适体通常是设计为干扰细胞内其它蛋白质相互作用的肽或蛋白质。其由两端连接到蛋白质支架上的可变肽环组成。这种双重结构限制极大地增加了肽适体的结合亲和力至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。所述可变肽环通常包含10至20个氨基酸，并且支架可以是任何具有良好溶解特性的蛋白质。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-A是最常用的支架蛋白，可变肽环插入氧化还原活性位点内，其是野生型蛋白质中的-Cys-Gly-Pro-Cys-环(SEQ IDNO:55)，两条半胱氨酸侧链能够形成二硫键。可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最广泛的是酵母双杂交系统。
适体为生物技术和治疗应用提供了实用性，因为其提供的分子识别特性可与常用的生物分子特别是抗体相媲美。除了其区别性识别之外，适体还提供优于抗体的优势，因为其可以在试管中完全工程化，易于通过化学合成生产，具有理想的储存特性，并且在治疗应用中引起很少或没有免疫原性。未修饰的适体从血流中迅速清除，半衰期为几分钟到几小时，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除，这是适体固有的低分子量的结果。未经修饰的适体应用目前专注于治疗瞬时病症如血液凝固，或治疗可以局部递送的器官如眼。这种快速清除在如体内诊断成像等应用中可能是一个优势。科学家可以使用多种修饰，例如2’-氟取代的嘧啶、聚乙二醇(PEG)键、融合于白蛋白或其它延长半衰期的蛋白质等，从而使适体的半衰期可以延长几天或甚至几周。
根据本发明，术语“小干扰RNA(siRNA)”，也称为短干扰RNA或沉默RNA，是指一类长度为18至30个、优选19至25个、最优选21至23个或甚至更优选21个核苷酸的双链RNA分子，其在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径，其中siRNA干扰特定基因的表达。除了其在RNAi途径中的作用外，siRNA还作用于RNAi相关途径，例如作为一种抗病毒机制或塑造基因组的染色质结构。
天然存在于自然界中的siRNA具有明确定义的结构：短双链RNA(dsRNA)，在每一端均有2-nt的3’突出端。每条链都有5’磷酸基团和3’羟基(-OH)基团。这种结构是dicer加工的结果，dicer是一种将长dsRNA或小发夹RNA转化为siRNA的酶。siRNA也可以外源(人工)引入细胞中，以实现目标基因的特异性敲低。基本上任何序列已知的基因因此可以基于与适当剪裁的siRNA的序列互补性而被靶向。双链RNA分子或其代谢加工产物能够介导靶特异性核酸修饰，特别是RNA干扰和/或DNA甲基化。外源引入的siRNA在其3’和5’末端可能没有突出端，然而，优选至少一条RNA链具有5’-和/或3’-突出端。优选地，双链的一端具有1至5个核苷酸、更优选1至3个核苷酸、最优选2个核苷酸的3’-突出端。另一端可以是平端或具有最多6个核苷酸的3’-突出端。通常，本发明设想了适合充当siRNA的任何RNA分子。2-nt的3’突出端的序列对限制于与第一个碱基对相邻的未配对核苷酸的靶识别的特异性有很小的贡献(Elbashir et al.2001)。3’突出端中的2’-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成成本更低并且可能更耐核酸酶。siRNA的递送可以使用本领域已知的任何方法来完成，例如通过将siRNA与盐水组合并通过静脉内或鼻内施用该组合或通过将siRNA在葡萄糖(例如5％葡萄糖)或阳离子脂质中配制并将聚合物用于通过静脉内(IV)或腹膜内(IP)的全身途径在体内递送siRNA(Fougerolles et al.(2008),Current Opinion in Pharmacology,8:280-285；Lu et al.(2008),Methods in Molecular Biology,vol.437:Drug DeliverySystems–Chapter 3:Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics)。如今，siRNA通常经过大量修饰以延长其有效期。
短发夹RNA(shRNA)是一种RNA序列，可产生紧密的发夹转角，可用于通过RNA干扰沉默基因表达。shRNA使用引入细胞的载体并利用U6启动子来确保shRNA始终被表达。这个载体通常被传递给子细胞，从而使基因沉默得以遗传。shRNA发夹结构被细胞机制切割成siRNA，然后与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。这个复合物结合并切割与其结合的siRNA匹配的mRNA。用于本发明的si/shRNA优选使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成。RNA合成试剂的供应商有Proligo(Hamburg,Germany)、DharmaconResearch(Lafayette,CO,USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的一部分,Rockford,IL,USA)、Glen Research(Sterling,VA,USA)、ChemGenes(Ashland,MA,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。最方便的是，siRNA或shRNA从商业RNA寡核苷酸合成供应商处获得，这些供应商销售不同质量和成本的RNA合成产品。通常，可用于本发明的RNA是常规合成的并且容易以适合RNAi的质量提供。
影响RNAi的其它分子包括例如microRNA(miRNA)。所述RNA种类是单链RNA分子。内源存在的miRNA分子通过与互补mRNA转录物结合并通过类似于RNA干扰的过程触发所述mRNA转录物的降解来调节基因表达。因此，外源miRNA可以在引入相应细胞后用作酶的抑制剂。
核酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化其自身的切割或其它RNA的切割，但也发现其催化核糖体的氨基转移酶活性。充分鉴定的小自切割RNA的非限制性实例是锤头状、发夹状、丁型肝炎病毒和体外选择的铅依赖性核酶，而I组内含子是较大核酶的一个实例。近年来，催化自切割的原理已得到很好的确立。在具有核酶活性的RNA分子中，锤头状核酶是最佳鉴定的。由于显示锤头结构可以整合到异源RNA序列中，因此核酶活性可以转移到这些分子上，似乎可以产生几乎任何靶序列的催化反义序列，只要靶序列包含潜在的匹配切割位点即可。构建锤头状核酶的基本原理如下：选择包含GUC(或CUC)三联体的RNA目标区域。取两条寡核苷酸链，每条链通常具有6至8个核苷酸，并在其之间插入催化锤头序列。最好的结果通常是用短核酶和靶序列获得的。
根据本发明也可用的最近的进展是识别小化合物的适体与锤头状核酶的组合。适体与靶分子结合后诱导的构象变化可以调节核酶的催化功能。
如本文所用，术语“反义核酸分子”是指与靶核酸互补的核酸。根据本发明的反义分子能与靶核酸相互作用，更具体地其能够与靶核酸杂交。由于杂合体的形成，靶基因的转录和/或靶mRNA的翻译被减少或阻断。已经描述了关于反义技术的标准方法(参见例如Melani et al.,Cancer Res.(1991)51:2897-2901)。
CRISPR/Cas9以及CRISPR-Cpf1技术几乎适用于所有细胞/模式生物，可用于敲除突变、染色体缺失、DNA序列编辑和基因表达调节。基因表达调节可以通过使用与转录阻抑物缀合的催化性死亡Cas9酶(dCas9)来操纵，以抑制特定靶基因转录。类似地，催化失活性“死亡”Cpf1核酸酶(来自Prevotella和Francisella-1的CRISPR)可以与合成的转录阻抑物或激活物融合以下调内源性启动子，例如控制靶基因表达的启动子。或者，锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的DNA结合结构域可以设计为特异性识别靶基因或其启动子区域或其5’-UTR，从而抑制靶基因的表达。
根据本发明的一个甚至更优选的实施方案，抗体模拟物选自affibodies、adnectins、anticalins、DARPins、avimers、nanofitins、affilins、Kunitz结构域肽、
Figure BDA0003653660980000101
三特异性结合分子和probodies。
如本文所用，术语“affibody”是指衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域的抗体模拟物家族。在结构上，affibody分子基于三螺旋束结构域，所述结构域也可以掺入融合蛋白质中。affibody本身的分子量约为6kDa，在高温和酸性或碱性条件下是稳定的。通过随机化参与亲本蛋白结构域的结合活性的位于两个α-螺旋中的13个氨基酸而获得靶特异性(Feldwisch J,Tolmachev V.；(2012)Methods Mol Biol.899:103-26)。
如本文所用，术语“adnectin”(也称为“单体(monobody)”)涉及基于人纤连蛋白III的第10个胞外结构域(10Fn3)的分子，其采用94个残基的Ig样β-夹心折叠，具有2至3个暴露的环，但缺少中央二硫键(Gebauer and Skerra(2009)Curr Opinion in ChemicalBiology 13:245-255)。通过在蛋白质的特定环中引入修饰，可以对具有所需靶特异性的Adnectin进行遗传工程化。
如本文所用，术语“anticalin”是指衍生自脂质运载蛋白的工程化蛋白质(BesteG,Schmidt FS,Stibora T,Skerra A.(1999)Proc Natl Acad Sci U S A.96(5):1898-903；Gebauer and Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。Anticalin具有一个八链β桶，其在脂质运载蛋白中形成高度保守的核心单元并通过在开放端的四个结构可变环自然形成配体的结合位点。Anticalin虽然与IgG超家族不同源，但显示出迄今为止被认为典型是抗体结合位点的特征：(i)由于序列变异而导致的高结构可塑性和(ii)提高的构象灵活性，允许诱导拟合不同形状的靶。
如本文所用，术语“DARPin”是指设计的锚蛋白重复结构域(166个残基)，其提供由通常三个重复的β-转角产生的刚性界面。DARPins通常携带与人工共有序列相对应的三个重复，其中每个重复的六个位置是随机化的。因此，DARPins缺乏结构灵活性(Gebauer andSkerra,2009)。
如本文所用，术语“avimer”是指一类抗体模拟物，其由两个或更多个30至35个氨基酸的肽序列组成，其衍生自各种膜受体的A结构域并通过接头肽连接。靶分子的结合通过A-结构域发生并且可以选择具有所需结合特异性的结构域，例如通过噬菌体展示技术选择。avimer中包含的不同A结构域的结合特异性可以但不必相同(Weidle UH,et al.,(2013),Cancer Genomics Proteomics；10(4):155-68)。
“nanofitin”(也称为affitin)是一种抗体模拟蛋白，其衍生自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的DNA结合蛋白Sac7d。Nanofitins通常具有约7kDa的分子量且通过随机化结合表面上的氨基酸而被设计为特异性结合靶分子(Mouratou B,BéharG,Paillard-Laurance L,Colinet S,Pecorari F.,(2012)Methods Mol Biol.；805:315-31)。
如本文所用，术语“affilin”是指通过使用γ-B结晶或遍在蛋白作为支架并通过随机诱变修饰这些蛋白质表面上的氨基酸而开发的抗体模拟物。例如，通过噬菌体展示或核糖体展示技术选择具有所需靶特异性的affilins。根据支架，affilins的分子量约为10或20kDa。如本文所用，术语affilin还指affilin的二聚或多聚形式(Weidle UH,et al.,(2013),Cancer Genomics Proteomics；10(4):155-68)。
“Kunitz结构域肽”衍生自Kunitz型蛋白酶抑制剂如牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、淀粉样前体蛋白(APP)或组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz结构域。Kunitz结构域具有大约6kDA的分子量并且具有所需靶特异性的结构域可以通过展示技术如噬菌体展示来选择(Weidle et al.,(2013),Cancer Genomics Proteomics；10(4):155-68)。
如本文所用，术语
Figure BDA0003653660980000111
是指衍生自人Fyn SH3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽。Fyn SH3衍生的多肽在本领域中是熟知的并且已经描述于例如Grabulovskiet al.(2007)JBC,282,p.3196-3204、WO 2008/022759、Bertschinger et al(2007)Protein Eng Des Sel 20(2):57-68、Gebauer and Skerra(2009)Curr Opinion inChemical Biology 13:245-255或Schlatter et al.(2012),MAbs 4:4,1-12)中。
如本文所用，术语“三特异性结合分子”是指具有三个结合结构域并因此能结合、优选特异性结合三个不同表位的多肽分子。这三个表位中的至少一个表位是本发明第四方面的蛋白质的表位。两个其它表位也可以是本发明第四方面的蛋白质的表位或可以是一种或两种不同抗原的表位。所述三特异性结合分子优选是TriTac。TriTac是实体瘤的T细胞接合物，由三个结合结构域组成，被设计为具有延长的血清半衰期及大小约为单克隆抗体的三分之一。
如本文所用，术语“probody”是指蛋白酶可激活抗体前药。probody由真正的IgG重链和修饰的轻链组成。将掩蔽肽通过可被肿瘤特异性蛋白酶切割的肽接头与轻链融合。所述掩蔽肽防止probody与健康组织结合，从而最小化毒副作用。
根据本发明的另一个更优选的实施方案，(ii)的小分子是多球壳菌素或选自表A的小分子抑制剂，或任何这些抑制剂的盐或酯。
多球壳菌素(2-氨基-3,4-二羟基-2-(羟甲基)-14-二十碳-6-烯酸)，又称抗生素ISP-1和嗜热菌杀酵母素，是衍生自某些嗜热真菌的非典型氨基酸和抗生素。多球壳菌素是一种非常强力的鞘氨醇生物合成的第一步的丝氨酸棕榈酰转移酶的抑制剂。多球壳菌素优选腹膜内施用，因为这避免了口服施用的潜在副作用。多球壳菌素或其盐或酯是最优选的小分子抑制剂，因为其在实施例中使用。
然而，除多球壳菌素外，已知其它几种参与鞘脂类合成的酶的小分子抑制剂。非限制性但优选的实例示于表A中。
表A：参与鞘脂类合成的酶的小分子抑制剂
Figure BDA0003653660980000121
Figure BDA0003653660980000131
Figure BDA0003653660980000141
Figure BDA0003653660980000151
Figure BDA0003653660980000161
Figure BDA0003653660980000171
根据本发明的另一个更优选的实施方案，所述抑制剂在编码参与鞘脂类生物合成的酶的位置编辑基因组。
基因组编辑(或基因组工程，或基因编辑)是一种遗传工程，其中DNA在活生物体的基因组中被插入、缺失、修饰或替换。根据本发明，基因组编辑导致参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的表达的抑制。
因此，本文还设想了作为靶向编码目标酶的基因或参与其表达的调节分子并导致基因组编辑的抑制性核酸分子提供的抑制剂。减少或消除靶基因或调节分子表达的这种抑制剂包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(TAL)效应物(TALE)核酸酶。这种方法描述于Silva et al.,Curr Gene Ther.2011；11(1):11-27；Miller et al.,Nature biotechnology.2011；29(2):143-148和Klug,Annual review ofbiochemistry.2010；79:213-231中。
根据本发明的另一个优选实施方案，衰老相关疾病是阿尔茨海默病、痴呆、帕金森病、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。
阿尔茨海默病是一种不可逆进行性脑部紊乱，其会慢慢破坏记忆和思维能力，并最终破坏执行最简单任务的能力。大多数阿尔茨海默患者的症状首先出现在60多岁时。
痴呆是一类脑部疾病，导致思维和记忆能力长期且通常逐渐下降，严重到足以影响一个人的日常功能。其它常见症状包括情绪问题、语言困难和活动力下降。所述痴呆优选是如上文所述的老年性痴呆。
帕金森病(PD)是一种主要影响运动系统的中枢神经系统的长期退行性紊乱。随着疾病恶化，非运动症状变得更加常见。所述症状通常缓慢出现。
亨廷顿病是一种遗传性紊乱，导致脑细胞死亡。最早的症状通常是情绪或心理能力的不易察觉的问题。随之而来的是普遍缺乏协调和步态不稳。随着疾病进展，不协调的、急促而不流畅的身体运动变得更加明显。身体能力逐渐恶化，直到协调运动变得困难以及患者无法说话。心理能力普遍下降。症状通常在30至50岁之间开始。
肌萎缩侧索硬化症(ALS)(也称为运动神经元病(MND)或Lou Gehrig病)是一种导致控制随意肌的神经元死亡的特定疾病。ALS的特征是肌肉僵硬、肌肉颤搐，以及由于肌肉缩小而逐渐加重的无力。ALS可能始于手臂或腿部无力，或者说话或吞咽困难。大约一半受影响的人在思考和行为方面至少出现轻度困难，大多数人会感到疼痛。大多数人最终会失去行走、用手、说话、吞咽和呼吸的能力。发病高峰年龄对于散发性ALS为58至63岁，对于常见ALS为47至52岁。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述衰老相关疾病是肌肉疾病。
肌肉疾病是一类影响肌肉系统的疾病和紊乱。由肌肉直接异常引起的疾病和紊乱称为原发性肌肉疾病；那些可以追踪为是神经或其它系统紊乱的症状或表现的疾病和紊乱未正确归类为原发性肌肉疾病。因此，所述肌肉疾病优选是原发性肌肉疾病。肌肉疾病可导致虚弱、疼痛甚至瘫痪。
根据本发明更优选的实施方案，所述肌肉疾病是包涵体肌炎或肌营养不良，优选Duchenne肌营养不良。
包涵体肌炎(IBM)(有时称为散发性包涵体肌炎，sIBM)是老年人中最常见的炎症性肌肉疾病。所述疾病的特征是远端和近端肌肉的缓慢进行性无力和消瘦，最明显的是手指屈肌和膝伸肌。
肌营养不良(MD)是一组肌肉疾病，随着时间会导致骨骼肌越来越弱化和破坏。这些紊乱的不同之处在于主要受累的肌肉、无力程度、恶化速度以及症状何时开始。许多人最终会变得无法行走。Duchenne肌营养不良(DMD)是一种严重的肌营养不良。肌肉无力的症状通常在男孩四岁左右开始并迅速恶化。通常，肌肉损失首先发生在大腿和骨盆，然后是手臂肌肉。
根据本发明的又一优选实施方案，所述衰老相关疾病是蛋白质稳态疾病(proteostatic diseases)。
蛋白质稳态或蛋白质内稳态是严格控制蛋白质合成、蛋白质折叠、构象维持和蛋白质降解所必需的细胞网络。根据蛋白质组学需求，蛋白质稳态网络(PN)的表达在细胞和组织中有所不同。
蛋白质稳态疾病的特征是蛋白质稳态受损或甚至丧失。受损的蛋白质稳态导致蛋白质聚集，从而导致侣伴蛋白和共同侣伴蛋白水平的失调。
蛋白质稳态途径的缺陷或改变与许多疾病有关。非限制性但优选的疾病是神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病或肌萎缩侧索硬化症(ALS))、心脏病、认知障碍、遗传性骨骼紊乱(例如1型前胶原基因突变的突变)、营养不良和视紫红质视网膜色素变性(Labbadiaand Morimoto(2015),Annu Rev Biochem.,84:435–46)。
关于在本说明书中特别是在权利要求中为特征的实施方案，意在将从属权利要求中提及的每个实施方案与所述从属权利要求从属的每个权利要求(独立或从属)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1列举3个选项A、B和C、从属权利要求2列举3个选项D、E和F以及权利要求3从属于权利要求1和2并列举3个选项G、H和I的情况中，应当理解本说明书明确地公开了对应于以下组合的实施方案：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I，除非另有特别说明。
类似地，并且在其中独立权利要求和/或从属权利要求没有列举选项的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求引用多个在先权利要求，则由此涵盖的主题的任何组合被认为是明确公开的。例如，在独立权利要求1、引用权利要求1的从属权利要求2和引用权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，权利要求3和1的主题的组合如同权利要求3、2和1的主题的组合一样清楚且明确地公开。在存在引用权利要求1至3中任一项的进一步的从属权利要求4的情况下，则权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题组合被清楚且明确地公开。
附图简述
图1：骨骼肌老化时，鞘脂从头合成被激活。(a)鞘脂从头合成途径的示意图。(b)来自基因组织表达(GTEx)项目中个体(n＝491)的人骨骼肌中鞘脂从头合成途径的酶的转录丰度。(c)年轻的(8周龄，n＝10)和年老的(24月龄，n＝10)C57BL/6JRj小鼠的肝脏、脑、骨骼肌和血浆中的总神经酰胺水平。(d)小鼠四头肌中各个神经酰胺种类的浓度。(e)年轻和年老个体的骨骼肌中鞘脂从头合成途径的酶的转录丰度。(f)人骨骼肌中鞘脂从头合成途径的转录物的相关性(GTEx，n＝491)。(g)42种遗传多样性BXD品系骨骼肌中鞘脂从头合成途径的转录物的相关性。(h)示出鞘脂从头合成途径的酶对人骨骼肌(GTEx)中两个第一主要成分(SphPC1和SphPC2)的影响的因子载荷图(双标图)。(i)由鞘脂从头合成途径的每个主要成分解释的方差比例。(j)每个转录物对人骨骼肌(GTEx)中SphPC1的贡献。(k)骨骼肌中SphPC1与BXD小鼠肌肉质量和功能测量值的相关性。(l)骨骼肌中Sptlc1与BXD小鼠肌肉质量和功能测量值的相关性。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图2：鞘脂从头合成的失活增加了肌肉质量并改善了肌肉功能。年老的(18个月龄)C57BL/6JRj小鼠以每周3次0.4mg/kg腹膜内注射多球壳菌素(MYR)治疗5个月。(a)肝脏、脑、骨骼肌和血浆中的总神经酰胺水平。(b)小鼠四头肌中各个神经酰胺种类的浓度。(c)治疗前后测量的瘦体质及其变化。(d)腓肠肌和胫骨前肌(TA)质量。(e)TA肌肉的苏木精和伊红(H&E)染色。比例尺，50μm。(f)具有集中核的纤维的比例。TA肌肉中的分布(g)、平均纤维最小Feret直径(h)和横截面积(CSA)(i)。比较年老的DMSO和多球壳菌素处理小鼠之间的最大跑动距离和持续时间(j)、有氧代谢能力(k)、握力(l)、疲劳转棒试验的潜伏期和最大速度(m)，以及横梁跨越的潜伏期(n)。对于所有实验，每组n＝6-12。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图3：抑制鞘脂从头合成增加MuSC增殖和组织计数。用DMSO或多球壳菌素处理的年老小鼠四头肌的RNA-seq转录组分析。具有标准化富集分数(NES)和针对每个给定基因集的调整p值的基因集(GO类别)的火山图(a)。“横纹肌收缩”的富集图(b)，通过多球壳菌素上调最多的GO类别。比较转录物Myf5、Myod1和Myog(c)与MuSC标记Pax7(d)的。(e)SphPC1即鞘脂从头合成途径的第一主要成分与人骨骼肌中的PAX7(GTEx，n＝491)的相关性。(f)小鼠骨骼肌中SphPC1与Pax7的相关性(BXD，n＝42)。从全部后肢肌肉组织(g)中新鲜分离的MuSC数量，根据年轻小鼠、年老小鼠和用多球壳菌素处理的年老小鼠的肌肉重量标准化(h)。(i)α7整联蛋白+CD34+Sca-1-CD45-CD31-CD11b-细胞的FACS等值线图，对应于从年老小鼠和用多球壳菌素处理的年老小鼠中分离的MuSC。TA肌肉中PAX7免疫染色细胞的代表性图像(j)和量化(k)。DAPI，4’6-二氨基-2-苯基吲哚。比例尺，50μm。在DMSO或含有多球壳菌素的培养基中温育72小时后，来自年老的C57BL/6JRj小鼠的新鲜分离的MuSC的Ki67阳性细胞的免疫细胞化学(l)和定量(m)。比例尺，50μm。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图4：鞘脂消耗可改善体内MuSC功能和再生能力。(a)用多球壳菌素处理年老C57BL/6JRj小鼠，处死后，将新鲜分离的MuSC移植到心脏毒素损害的年老C57BL/6JRj或mdx接受小鼠的TA中。移植后7天，来自mdx接受者的PAX7(b-c)和肌营养不良蛋白(d-e)免疫染色的TA肌肉的代表性图像和量化。比例尺，50μm。在移植后7天，来自年老C57BL/6JRj小鼠的PAX7(f-g)和胚胎肌球蛋白重链(eMyHC)(h-i)免疫染色的TA肌肉的代表性图像和量化。比例尺，在PAX7染色中为50μm。比例尺，在eMyHC染色中为250μm。移植后7天(j-k)和14天(l-m)，年老C57BL/6JRj接受者的H&E染色的TA的代表性图像和量化。比例尺，50μm。移植前和移植后7天的最大跑动距离(n)、握力(o)和转棒潜伏期(p)。报告了相对于基线的变化。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图5：鞘脂消耗细胞自主激活MuSC和成肌细胞中的肌分化程序。(a)在DMSO或含有多球壳菌素的培养基中温育72小时后，来自年老C57BL/6JRj小鼠的新鲜分离的MuSC的MYOD的免疫细胞化学和定量。(b)来自年老C57BL/6JRj小鼠的新鲜分离的MuSC的MYOG的免疫细胞化学和定量。来自在含有DMSO和多球壳菌素的培养基中生长的C2C12成肌细胞的免疫细胞化学(c)、融合指数(d)、肌管面积(e)和肌生成标志物的表达(f)。来自使用CRISPR-Cas9对Sptlc1沉默的C2C12成肌细胞的免疫细胞化学(g)、融合指数(h)、肌管面积(i)和肌生成标志物的基因表达(j)。来自使用CRISPR-Cas9对Cers2沉默的C2C12成肌细胞的免疫细胞化学(k)、融合指数(l)、肌管面积(m)和肌生成标志物的基因表达(n)。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。比例尺，50μm。
图6：遗传证据表明鞘脂消耗对人的有益影响。用DMSO或多球壳菌素处理的人原代成肌细胞的免疫细胞化学(a)、肌管直径(b)和肌管面积(c)。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，Student’s双尾T检验。比例尺，50μm。人SPTLC1(d)和SPTLC2(e)基因座的单倍型区块(haploblock)结构。(f)SPTLC1和SPTLC2 cis-eQTL rs10820917和rs8013312分别与GTEx中SPTLC1和SPTL2的mRNA水平关联，以及在Helsinki出生队列研究中老人健康测试(SFT)评分及其成分特性。森林图表示具有95％置信区间(CI)的β。(g)骨骼肌mRNA、SFT评分和在6分钟步行测试距离分别作为SPTLC1和SPTLC2cis-eQTL rs10820917和rs8013312的函数的小提琴图。
图7：年轻小鼠、年老小鼠和用多球壳菌素处理的年老小鼠的四头肌中二氢神经鞘氨醇(SA)(a)和鞘氨醇(SO)(b)水平。详见图10。
图8：抑制鞘脂可消除Duchenne肌营养不良。(a)肌营养不良患者骨骼肌中鞘脂生物合成途径的酶的转录物被上调。在用多球壳菌素处理的mdx小鼠下坡跑动后，跑动距离(b)、跑动时间(c)、握力(d)、转棒上潜伏期(e)和血浆肌酸激酶(f)。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，及***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。$
图9：鞘脂消耗防止衰弱症表型。(a)10分钟内移动的距离。(b)10分钟观察期间的平均速度。(c)葡萄糖耐受试验。(d)探索熟悉和新物体的时间。(e)识别指数。年老(18个月龄)C57BL/6JRj小鼠以每周3次0.4mg/kg腹膜内注射多球壳菌素(MYR)治疗5个月。
图10：在老化和多球壳菌素处理后骨骼肌中的鞘磷脂和脱氧鞘脂水平。年轻(8周龄，n＝10)和年老(24月龄，n＝10)C57BL/6JRj小鼠的肝脏、脑、骨骼肌和血浆中总鞘磷脂(SM)的浓度(a)，及年轻和年老C57BL/6JRj小鼠四头肌中各个鞘磷脂种类的浓度(b)。年轻小鼠、年老小鼠和用多球壳菌素处理的年老小鼠的四头肌中1-脱氧二氢鞘氨醇的浓度(c)。(d)显示鞘脂从头合成途径的酶对BXD小鼠骨骼肌中两个第一主要成分(SphPC1和SphPC2)的影响的因子荷载图(双标图)。(e)由鞘脂从头合成途径的每个主要成分解释的方差比例。(f)每个转录物对小鼠骨骼肌(BXD)中SphPC1的贡献。年老小鼠和用多球壳菌素处理的年老小鼠的肝、脑、肌肉和血浆中总鞘磷脂的浓度(g)，以及四头肌中各个鞘磷脂种类的浓度(h)。所有数据均显示为平均值±SEM。每组n＝6-10。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图11：抑制鞘脂从头合成增加MuSC增殖和组织计数。在RNA测序中，在18个月龄开始用多球壳菌素处理的年老C57BL/6JRj小鼠的四头肌中上调(a)和下调(b)的GO类别。(c)各个基因的火山图，示出多球壳菌素处理的小鼠的四头肌中名义p值(垂直轴)和log2倍数变化(水平轴)的对数。(d)四头肌中每个切片的PAX7阳性细胞的定量。所有数据均显示为平均值±SEM。***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图12：鞘脂消耗改善体内MuSC功能和肌肉再生。用多球壳菌素处理18个月龄的年老C57BL/6JRj小鼠，处死后，将新鲜分离的MuSC移植到年老C57BL/6JRj小鼠或mdx小鼠中。移植后7天和14天，来自mdx接受者的H&E染色TA的代表性图像(a)和炎症区域的量化(b)。比例尺，50μm。(c)对年老C57BL/6JRj小鼠和mdx接受小鼠中每个切片的PAX7阳性细胞的定量。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图13：单克隆CRISPR介导的Sptlc1敲除以剂量依赖性方式促进C2C12成肌细胞中的肌细胞分化。(a)Sptlc1中对两种不同gRNA即gRNA1和gRNA2的位置向导RNA(gRNA)结合位点。(b)C2C12成肌细胞中由gRNA1和gRNA2诱导的DNA变化。gRNA1转染诱导两条同源染色体中的缺失，导致纯合Sptlc1敲除(Sptlc1-/-)。gRNA2在一条同源染色体中诱导长插入，另一条染色体保持完整，导致杂合敲除(Sptlc1+/-)。(c)使用Western印迹验证Sptlc1+/-和Sptlc1-/-敲除C2C12细胞系。来自使用单克隆CRISPR-Cas9的具有Sptlc1的杂合和纯合功能丧失的C2C12成肌细胞的融合指数(d)、肌管直径(e)、肌生成标志物的转录物表达(f)和免疫细胞化学(g)。比例尺，50μm。(h)Sptlc1和Cers2的多克隆沉默。使用Western印迹验证敲除。所有数据均显示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，采用Student’s双尾T检验。
图14：人SPTLC1和SPTLC2的cis-eQTL的连锁不平衡(LD)结构。(a)SPTLC1(a)和SPTLC2(b)cis-eQTL的LD结构，由千人基因组计划(1000Genomes Project)第3阶段(第5版)的r2测量值表示。
图15：抑制神经酰胺合酶可改善衰老时的握力。用适合口服施用的神经酰胺合酶的抑制剂P053治疗老年C57BL/6JRj雄性小鼠(20月龄)。P053恢复了老年小鼠的握力损失。
图16：在相对于用30μM MYR处理24小时后，来自IBM供体(上)和表达APPSwe的C2C12成肌细胞(下)的人原代成肌细胞中细胞数量进行标准化的定量Proteostat信号减少。数值表示为平均值±s.e.m。***P≤0.001；****P≤0.0001。使用Student’s双尾T检验评估两组之间的差异(误差线：95％置信区间)。
图17：多球壳菌素改善老年小鼠的蛋白质稳态。数值表示为平均值±s.e.m。*P≤0.05。使用Student’s双尾T检验评估两组之间的差异(误差线：95％置信区间)。
实施例示例说明了本发明。
实施例1：在衰老时神经酰胺在骨骼肌中积累
鞘脂从头合成途径通过使用脂肪酸和氨基酸作为底物产生神经酰胺和其它鞘脂类(图1a)。SPT将L-丝氨酸和棕榈酰-CoA转化为3-酮二氢鞘氨醇，其迅速被转化为二氢鞘氨醇。二氢鞘氨醇与长链脂肪酸的偶联是通过6种不同的哺乳动物神经酰胺合酶之一完成的，其中CERS2在骨骼肌中含量最高(图1b)。为研究衰老如何影响体内骨骼肌中鞘脂从头合成途径的活性，比较了年轻(2个月龄)和年老(2岁)小鼠的不同器官的总神经酰胺含量。我们观察到骨骼肌神经酰胺的增加(图1c)。这里的关注点是骨骼肌鞘脂类及其减少后的潜在益处。
骨骼肌神经酰胺的年龄依赖性增加趋势是全球性的，包括具有不同酰基长度的神经酰胺种类(图1d)。Cer(d18:1/24:1)在衰老时增加最为显着，肌肉中最丰富的神经酰胺Cer(d18:1/18:0)在衰老时增加20％(图1d)。骨骼肌鞘磷脂(SM)是一种由磷酸胆碱和神经酰胺组成的鞘脂，其在年轻和年老小鼠之间的差异不太一致(图10a-b)。脱氧鞘脂类由SPT通过L-丙氨酸而不是L-丝氨酸与脂肪酸的缀合来合成，并且与糖尿病等疾病有关。与典型鞘脂类类似，在衰老时骨骼肌中存在脱氧二氢鞘氨醇(doxSA)积累的趋势(图10c)。
接下来比较了公开可得数据集(GSE25941)中年轻和老年人类个体之间鞘脂从头生物合成途径的酶的转录丰度。与增加的肌肉神经酰胺一致，这些酶的许多转录物在衰老时上调，包括SPTLC1、KDSR、CERS2和CERS5(图1e)。唯一下调的酶是CERS1(图1e)，其在人基因型组织表达(GTEx)数据库中在骨骼肌中的表达相对较低(图1B)。一般来说，人GTEx数据集(n＝491)中死后骨骼肌活检中鞘脂从头生物合成途径的不同转录物之间存在很强的正相关性(图1f)。只有CERS1转录物与其它酶呈负相关。类似地，在小鼠BXD品系中，这是一种具有显著遗传异质性的重组近交小鼠群体，转录物彼此直接相关(图1g)。这些结果表明鞘脂从头生物合成途径处于紧密协调的转录控制之下。
根据该途径的转录物之间的强相关性，对人(图1h)和小鼠(图10d-f)中的鞘脂从头生物合成途径进行了主成分分析。鞘脂从头合成途径的不同酶的表达的第一主要成分(SphPC1)解释了人骨骼肌表达中30.6％的差异(图1i)。在该途径的转录物中，Sptlc1贡献最大，占SphPC1变异性的21％(图1j)。在BXD小鼠中，检查了SphPC1和不同肌肉健康参数之间的参考群体相关性，包括肌肉质量和功能的测量，这是肌肉减少症的成分。在SphPC1与腓肠肌和比目鱼肌肌肉质量以及在跑步机上的表现和最大有氧运动能力之间观察到负相关(图1k)。Sptlc1骨骼肌表达显示出与这些表型的相似相关性(图1l)。这些发现表明鞘脂从头生物合成的表达与肌肉质量和功能负相关，并表明其与肌肉减少症有关。
实施例2：抑制鞘脂从头合成防止衰老时肌肉质量和功能的损失
为检查因果关系是否可以成为SphPC1与肌肉质量和功能之间相关性的基础，测试了抑制鞘脂从头生物合成途径是否可以防止与年龄相关肌肉功能障碍。将年老(18个月龄)C57Bl/6JRj小鼠在饲料中用多球壳菌素处理5个月，多球壳菌素是SPT的特异性抑制剂，SPT是鞘脂从头合成途径的第一和限速酶，其在骨骼肌中的表达与BXD的肌肉健康负相关。多球壳菌素处理以整体方式降低了骨骼肌的总神经酰胺含量(图2a)以及各个神经酰胺种类(图2b)，证实了该化合物在骨骼肌中的功效。除了神经酰胺，多球壳菌素处理降低了骨骼肌脱氧鞘脂含量，但效果小于L-丝氨酸衍生的经典鞘脂类(图10c)。
重要的是，多球壳菌素处理改善了年老小鼠的身体组分。多球壳菌素延迟了瘦体质的年龄依赖性下降(图2c)，并增加了肌肉质量。与DMSO处理的对照相比，多球壳菌素处理的小鼠显示出更大的腓肠肌和TA质量(图2d)。在多球壳菌素处理的小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉的组织学分析中，肌肉形态改善明显(图2e)，表现为肌肉老化的标志的集中核数量减少(图2f)，以及更大横截面积的肌肉纤维(图2g-i)。多球壳菌素处理还消除了年龄相关肌肉功能障碍。用多球壳菌素处理的年老小鼠表现出改善的运动表现和肌肉力量，这可以通过在跑步机上增加的跑动距离和时间(图2j)、改善的有氧运动能力(图2k)和握力(图2l)来证明。多球壳菌素处理的小鼠也表现出更好的肌肉协调性，如它们在转棒试验中改进的表现(图2m)和更快的跨越横梁(图2n)所示。总体而言，多球壳菌素处理改善了肌肉形态并消除了年龄相关的肌肉质量、力量、耐力和协调性的损失，表明可以防止年龄相关肌肉减少症。
实施例3：鞘脂消耗增强肌肉干细胞的增殖能力
为鉴定其调节可以解释多球壳菌素处理后肌肉功能改善的生物学途径，使用RNA测序比较了多球壳菌素和DMSO处理的年老小鼠的四头肌的转录组。进行了基于其倍数变化排序转录物的基因集富集分析(GSEA)。通过多球壳菌素处理而最下调的途径与广泛研究的鞘脂类在脂质代谢和炎症中的作用有关，而上调的途径与肌肉收缩和分化有关(图3a-b，11a-c)，表明再生改善。事实上，在对调节肌生成的经典转录因子的靶向分析中，Myog和Myf5在多球壳菌素处理时在骨骼肌中上调(图3c)。
肌肉干细胞(MuSC)能够产生成熟的肌肉纤维，据报道其再生能力在衰老时会受损。Pax7(MuSC的特异性标志物)的表达在多球壳菌素处理的小鼠的四头肌中上调(图3d)。与此一致，PAX7表达与人(图3e)和小鼠(图3f)骨骼肌中神经酰胺合成途径的第一PC负相关。为研究骨骼肌中Pax7转录物丰度的增加是否反映了MuSC计数升高，使用荧光激活细胞分选术(FACS)从后肢分离α7整联蛋白/CD34双阳性细胞。与之前报道一致，与年轻小鼠相比，年老小鼠后肢的MuSC数量减少，并且多球壳菌素处理使年老小鼠的MuSC池恢复到接近年轻小鼠的MuSC池(图3g-i)。来自多球壳菌素处理的小鼠的TA组织切片显示PAX7+肌肉细胞数量增加(图3j-k，图11d)，表明MuSC增殖增加，并且从未处理的年老小鼠分离并在含有多球壳菌素的培养基中离体培养的MuSC导致更高的Ki67+MuSC计数(图3l-m)，表明多球壳菌素处理增强了MuSC增殖。随着年龄增长，MuSC的自我更新和增殖潜力下降，我们的研究结果表明鞘脂消耗可以抵消这些缺陷。
实施例4：多球壳菌素引发MuSC加速再生
包括骨骼肌的组织再生潜力的下降是哺乳动物衰老的主要标志。接下来被问到的问题是多球壳菌素处理是否会诱导MuSC的功能改善，提高其再生能力。从用多球壳菌素处理5个月或未处理的年老小鼠分离MuSC，并移植到接受小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉中。接受小鼠是年老(20个月龄)C57Bl/6JRj小鼠或年老(1岁)mdx小鼠，mdx小鼠是一种缺乏肌营养不良蛋白的Duchenne肌营养不良小鼠模型(图4a)。在移植MuSC之前，通过向所有接受小鼠的TA注射心脏毒素来诱导损伤。移植7天后，mdx小鼠显示PAX7+细胞计数升高，表明更有效的MuSC增殖(图4b-c和12c)。从多球壳菌素处理的小鼠分离的MuSC刺激了肌营养不良蛋白阳性纤维的肌生成，验证了新移植的MuSC的功能性(图4d-e)。在移植后第7天和第14天，在从多球壳菌素处理的小鼠分离的MuSC的mdx接受者中，炎症区域也更小(图12a-b)。从多球壳菌素处理的小鼠分离的MuSC的年老C57Bl/6JRj接受者在肌肉中表现出与mdx接受者相似的形态学变化，表现为每个视野(图4f-g)和每个切片(图12c)的PAX7+细胞计数增加，胚胎肌球蛋白重链(eMyHC)阳性区域更高(图4h-i)，表明在受伤后7天和14天肌肉再生增加、炎症区域缩小(图4j-m)。因此，移植衍生自多球壳菌素处理的供体的MuSC可在心脏毒素引起的肌肉损伤后诱导主要形态学改善。
为测试多球壳菌素处理后MuSC的功能改善是否也转化为接受小鼠更好的肌肉功能，在MuSC移植前和移植后7天进行了肌肉功能测试。在MuSC移植7天后，已接受来自多球壳菌素处理的小鼠的MuSC的年老C57Bl/6JRj小鼠表现出改善的运动能力(图4n)、握力(图4o)和转棒试验潜伏期增加(图4p)。这些发现表明，多球壳菌素诱导的MuSC功能改善也转化为更好的肌肉功能。
实施例5：鞘脂消耗激活肌肉祖细胞中的生肌分化
之前已将抑制鞘脂从头合成途径与代谢益处关联，包括改善可影响肌肉功能的胰岛素敏感性。为研究鞘脂消耗是否对肌生成和肌再生具有细胞自主作用，在含有30μM多球壳菌素的培养基中培养新鲜分离的MuSC。多球壳菌素提高了MYOD和MYOG蛋白水平(图5a-b)，表明鞘脂耗竭引发了MuSC的生肌分化。然后使用小鼠C2C12成肌细胞检验成肌细胞中多球壳菌素的作用，成肌细胞是后期成肌祖细胞。多球壳菌素加速成肌细胞分化(图5c)，如更大的融合指数(图5d)和肌管面积(图5e)所示，并诱导以生肌转录因子如Myog以及包括肌球蛋白重链亚基Myh4和Myh1在内的成熟肌管的标记物上调为特征的生肌转录物特征(图5f)。
为证实鞘脂从头合成途径对肌生成的影响，使用多克隆CRISPR-Cas9基因组编辑使该途径的成员沉默。敲除Sptlc1诱导成肌细胞分化(图5g)，通过量化融合指数(图5h)、肌管面积(图5i)和类似于多球壳菌素处理细胞的生肌转录物特征(图5j)确定。Cers2也被沉默，其是骨骼肌中最丰富的神经酰胺合酶，位于SPT下游。Cers2的失活导致肌生成加速(图5k-m)，具有与多球壳菌素处理后观察到的相似的基因表达特征(图5n)。因此，SPT下游的酶以细胞自主方式参与生肌编程。
为进一步验证我们的发现，在C2C12成肌细胞中使用CRISPR-Cas9产生了纯合(Sptlc1-/-)和杂合(Sptlc1+/-)的Sptlc1单克隆敲除(图13a-c)。单克隆敲除以等位基因剂量依赖性方式促进肌生成，Sptlc1-/-成肌细胞显示出比Sptlc1+/-或EV细胞更大的肌管面积(图13d-g)。虽然多克隆Sptlc1和Cers2敲除对基因表达特征的影响比多球壳菌素更温和(图5j，n)，但Sptlc1-/-单克隆敲除诱导的幅度与多球壳菌素相似(图13f)。因此，SPT丰度剂量依赖性地影响肌肉分化。
实施例6：降低SPT表达的遗传变体与老年人改善的健康有关
为确定鞘脂消耗是否可以刺激人细胞系中的肌分化，用多球壳菌素处理人原代成肌细胞。与小鼠成肌细胞一致，多球壳菌素加速了人成肌细胞分化，显示出更大的肌管面积(图6a-c)。因此，SPT抑制可以增强人体肌肉的肌肉维持。
通过从人遗传研究中收集证据，最终研究了鞘脂从头合成途径是否与人年龄相关肌肉功能障碍有关。目的是首先检查SPTLC1和SPTLC2附近的区域，以鉴定与骨骼肌中这些基因表达相关的基因座(顺式表达数量性状基因座(cis-eQTL))，然后测试这些cis-eQTL与老年个体的肌肉健康是否相关。SPTLC1和SPTLC2附近的区域均由4个单倍型区块(r2>0.2)跨越(图6d)。使用来自GTEx项目的骨骼肌基因表达数据，在基因内的紧密连锁不平衡(图14a-b)中鉴定了SPTLC1和SPTLC2的cis-eQTL(表1-2)。
表1：骨骼肌中SPTLC1的Cis-eQTL
Figure BDA0003653660980000251
表2：骨骼肌中SPTLC2的Cis-eQTL
Figure BDA0003653660980000252
对SPTLC1影响最大的cis-eQTL，rs10820917，位于SPTLC1与其相邻ROR2之间跨越250kb区域的单倍型区块内(单倍型区块1)，而对SPTLC2最显著的cis-eQTL位于基因上游680kb处(图6d)。rs10820917和rs8013312的主要等位基因(C)以剂量依赖性方式分别与SPTLC1和SPTLC2的转录物丰度降低相关(图6e-f)。它们仅与SPT转录物水平相关，与任何邻近基因无关(表3-4)。
表3：邻近基因的骨骼肌转录物与SPTLC1 cis-eQTL rs10820917的关联
Figure BDA0003653660980000253
Figure BDA0003653660980000261
表4：邻近基因的骨骼肌转录物与SPTLC2 cis-eQTL rs8013312的关联
Figure BDA0003653660980000262
SPT蛋白复合物由SPTLC1和SPTLC2编码的亚基组成，为建模整个蛋白质复合物对其基因表达的遗传影响，构建了一个双基因座遗传评分，表明SPTLC1 rs10820917和SPTLC2rs8013312基因座内C等位基因的总数。SPTLC1和SPTLC2的平均基因表达与C等位基因评分呈剂量依赖性相关，在SPTLC1 rs10820917和SPTLC2 rs8013312基因座中C等位基因纯合的个体显示出最低的SPTLC1-SPTLC2表达(图6e-f)。
为测试已鉴定的cis-eQTL对衰老时肌肉健康的影响，对Helsinki出生队列研究(N＝2,003)的个体进行检验，其中大约700名年龄在70至80岁的人接受了密集标记基因分型和广泛的体能测试。客观测量的健康测试包括曲臂、椅子站立数、椅子坐位体前屈、抓背和6分钟步行测试，共同构成老人健康测试(SFT)评分。首先测试了SPTLC1-SPTLC2双基因座遗传评分与SFT评分的关联，并观察到C等位基因计数的增加与SFT评分的提高呈剂量依赖性相关(P＝0.01)(图6e-f)。在SFT成分特性中，6分钟步行距离和椅子坐位体前屈与SPTLC C等位基因计数相关(P＝0.03和P＝0.04)，以及与握力的提高相关，这是SFT测试组中未包括的特性(P＝0.006)(图6e)。然后单独分析SPTLC1和SPTLC2最显著的cis-eQTL。SPTLC1和SPTLC2中rs10820917和rs8013312的C等位基因表达减少与更高的SFT相关(P＝0.04和P＝0.004)(图6e-f)。在成分特性中，SPTLC1 rs10820917的主要C等位基因与改善的6分钟步行测试(P＝0.03)、曲臂(P＝0.01)和握力(P＝0.004)相关，而SPTLC2 rs8013312的主要C等位基因与增加的6分钟步行距离(P＝0.0003)、坐位体前屈(P＝0.02)和抓背(P＝0.01)相关(图6e-f)。这些遗传数据表明SPT转录物减少遗传变异改善年龄相关健康，与我们在年老小鼠中的药理学方法的结果一致，意味着在人衰老中抑制SPT可以带来显著的健康益处。
实施例7：多球壳菌素处理降低骨骼肌中的二氢鞘氨醇和鞘氨醇水平
在多球壳菌素处理后还测量了肌肉二氢鞘氨醇(SA)和鞘氨醇(SO)水平。多球壳菌素处理的年老小鼠在骨骼肌中显示出较低水平的SA和SO(图10a-b)。这些发现表明多球壳菌素诱导该途径的每种代谢物的减少。因此，抑制二氢鞘氨醇或鞘氨醇产生可以带来健康益处。
作为年龄相关肌肉功能障碍和肌分化的抑制剂的二氢神经酰胺的鉴定
此外，使用DEGS1 CRISPR-Cas9基因组编辑使C2C12成肌细胞中的Degs1沉默。与Sptlc1和Cers2的沉默不同，Degs1沉默导致肌生成减少，如肌管融合指数、面积和肌肉相关基因表达减少所示(图5o-r)。
在人体中，Helsinki出生队列研究表明，与GTEx骨骼肌表达数据库中DEGS1的mRNA表达降低相关的SNP等位基因与老年人健康指标缺损有关，包括在6分钟步行测试中步行距离缩短以及更差的灵活性，如通过坐位体前屈衡量。这一发现与Sptlc1和Cers2沉默导致肌生成增强的观察结果形成对比。
这些发现表明，通过DEGS1抑制积累的二氢神经酰胺会损害肌肉生长和年龄相关肌肉健康。
实施例8：mdx小鼠中的鞘脂消耗减轻Duchenne肌营养不良
使用来自患有肌营养不良的人的肌肉活检组织，观察到肌营养不良患者的鞘脂从头生物合成途径的转录物上调，包括SPTLC1、SPTLC2、KDSR、CERS2、CERS5、CERS6和DEGS1(图8a)。观察到在Duchenne肌营养不良中最显著的上调。
接下来，在Duchenne肌营养不良小鼠模型中抑制鞘脂合成的活性。Mdx是一种肌营养不良蛋白缺陷小鼠模型，用多球壳菌素(0.4mg/kg/每周3次腹膜内注射)处理2个月。在经多球壳菌素处理后，这些小鼠表现出改善的上坡跑测试性能(图8b-c)、改善的握力(图8d)和改善的转棒试验性能(图8e)。此外，在下坡跑后，与对照相比，多球壳菌素处理的小鼠中肌酸激酶(CK)的血浆水平较低(图8f)。这些发现表明，抑制鞘脂合成可以防止肌肉营养不良。
实施例9：鞘脂耗竭减轻衰弱综合征
人衰弱综合征的特征是虚弱、步行速度减慢、疲惫、体重减轻和体力活动不足。多球壳菌素处理的小鼠表现出虚弱减少，如握力增加(图21)、随意步行速度增加(图9b)、疲劳减少如跑步机上改善的表现和最大耗氧量增加所示(图2j-k)、更高的瘦体质和肌肉质量(图2c-d)和更高的体力活动如在10分钟内随意行驶的距离更长所示(图9a)。衰弱症预示老年人的跌倒。多球壳菌素处理的小鼠在从转棒上掉下来之前达到了更高的速度(图2m)，并且在穿过横梁时更快(图2n)，表明它们的协调性改善。在物体识别测试中，与DMSO处理的小鼠相比，多球壳菌素处理的小鼠在探索熟悉的物体和新物体方面花费了更多时间(图9d)。尽管这可能部分归因于多球壳菌素处理的小鼠的较高体力活动，但与未处理的小鼠相比，经处理的小鼠对新物体比熟悉物体更感兴趣。因此，鞘脂合成抑制提高了记忆力，这由较高的识别指数证明(图9e)。总的来说，我们的发现表明，多球壳菌素处理可以预防年老小鼠的身体和认知衰弱。
衰弱症与包括糖尿病在内的多种疾病有关。在口服葡萄糖耐受试验中，多球壳菌素处理的年老小鼠表现出改善的葡萄糖耐受(图9c)。重要的是，多球壳菌素处理是经饲料喂养的，表明不是高脂饮食引起的胰岛素抵抗，多球壳菌素防止年龄相关葡萄糖耐受不良。我们的发现表明，抑制鞘脂合成可以防止年龄相关慢性疾病，而靶向鞘脂合成途径可以防止年龄相关多重病症并减少多重用药。
实施例10：抑制神经酰胺合酶1提高衰老时的握力
通过P053(一种CERS1的口服抑制剂)抑制产生18:0鞘脂类的神经酰胺合酶1最近已被证明会产生有益的代谢作用(Turner et.al.,2018)。然而，尚未探索其在年龄相关肌肉减少症中的作用。
将小鼠在食物(饲料)中用3.6mg/kg/天的P053处理1个月。然后测量握力。处理1个月后，经P053处理的小鼠握力得到改善，表明抑制CERS1可减轻衰弱症和肌肉减少症(图15)。这些发现表明，抑制鞘脂途径的其它酶可以提供有益的健康结果，以及鞘脂途径对一般药理学方法的适用性。
实施例11：蛋白质稳态
线粒体功能障碍和细胞蛋白质内稳态(蛋白质稳态)崩溃是一些神经肌肉疾病的标志，例如衰老和营养不良(Wattin et al.(2018),Int J Mol Sci.；19(1):178)。包涵体肌炎(IBM)是一种肌肉疾病，除炎症外还具有蛋白质稳态受损的特征(Weihl and Pestronk(2010),Curr Opin Neurol.；23(5):482–488)。
获得了来自具有受损蛋白质稳态的IBM患者的细胞系。使用Proteostat染色验证了这一点，该染色靶向蛋白质稳态的一般破坏。多球壳菌素处理改善了IBM细胞系的表型，从而清除了这些细胞中的蛋白质聚集体(图16)。
多球壳菌素还促进年老小鼠骨骼肌中的蛋白质稳态(图17)。A11染色表明在β淀粉样蛋白形成中寡聚体的沉积增加，表明多球壳菌素在这些小鼠中清除了β淀粉样蛋白聚集体。
连同用多球壳菌素处理的IBM细胞中淀粉样蛋白的清除率提高，这些数据表明抑制鞘脂途径改善了蛋白质稳态并可用作蛋白质稳态疾病的治疗策略。
实施例12：材料和方法
体内研究
动物：年轻(2个月龄)和年老(18个月龄)的C57Bl/6JRj小鼠购自Janvier Labs。EchoMRI测量脂肪和瘦体质，在处理前后进行测量。多球壳菌素的剂量为0.4mg/kg/每周3次。首先将多球壳菌素(Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY)溶解在DMSO中，然后与PBS混合，这样每只小鼠每次注射1.5μL DMSO。以标准饲料喂养动物。所有动物都被安置在一个房间的微型隔离笼中，从7:00AM至7:00PM照明，随意获取饮食和水。所有动物实验均获得Canton of Vaud,Switzerland的动物许可证2890.1和3341的授权。
鞘脂类的测量：将血浆(100μL)和称重的组织样本(20-60mg)移至2ml Safe-LockPP管中，然后提取。简言之，将样品在每个样品含有500pmol丁基化苯甲醇、1％乙酸和200pmol内标(IS，d18:1/17:0神经酰胺，d18:1/17:0鞘磷脂，Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA)的700μL MTBE/MeOH(3/1，v/v)中使用两个6mm钢珠在Mixer Mill(Retsch，Haan，GER；2×10秒，频率30/s)中均质化。在室温持续摇动30分钟进行总脂质提取。加入140μL dH2O并在RT进一步温育30分钟后，将样品在1,000×g离心15分钟以建立相分离。收集500μL上层有机相并在氮气流下干燥。将脂质在700μL 2-丙醇/甲醇/水(7/2.5/1，v/v/v)中溶解用于UPLC-MS分析。将剩余组织干燥，在65℃在NaOH(0.3N)中溶解4小时并使用PierceTMBCA试剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)和BSA作为标准测定蛋白质含量。
在Knittelfelder等人之后对色谱分离技术进行修改，使用ACQUITY-UPLC系统(Waters Corporation)，配备Luna omega C18柱(2.1×50mm，1.6μm；Phenomenex)，使用80％溶剂A(MeOH/H2O，1/1，v/v；10mM乙酸铵，0.1％甲酸，8μM磷酸)开始20分钟线性梯度。柱温箱保持在50℃。配备ESI源的EVOQ EliteTM三重四极杆质谱仪(Bruker)用于在正离子模式下检测脂质。通过选择的反应监测(神经酰胺，[M+H]+至m/z 264.3，22eV，60ms；鞘磷脂，[M+H]+至m/z 184.1，20eV，40ms；分辨率0.7Q1/Q3)分析脂质种类。数据采集由MSWorkstation(Bruker)完成。通过计算分析物/IS比率(AU)将数据相对回收、提取和电离效率进行标准化，并表示为AU/g组织或AU/mL血浆。
脱氧鞘脂类的测量：使用改编的方法处理血浆和肌鞘脂类。简言之，用500μL的-20℃甲醇、400μL冰冷盐水、100μL冰冷水提取10-15mg肌肉样品并加入内标脱氧二氢鞘氨醇d3(Avanti lipids)。将等份(50μL)匀浆在空气中干燥并重悬于RIPA缓冲液中，用于使用BCA测定法(BCA Protein Assay,Lambda,Biotech Inc.,US)进行蛋白质定量。向剩余的匀浆中加入1mL氯仿并将样品涡旋5分钟，然后在4℃以15000×G离心5分钟。收集有机相并将2μL甲酸加入到剩余的极性相中，将其用1mL氯仿重新提取。将合并的有机相干燥并将沉淀重悬浮在500μL甲醇中，随后的提取步骤与针对血浆描述的相同。
将50μL血浆与500μL甲醇混合并加入脱氧二氢鞘氨醇d3(Avanti lipids)内标。将样品在37℃置于混合器上1小时，以2800×G离心，收集上清液并用75μL甲醇HCl(1N HCl，10M H2O的甲醇溶液)在65℃酸水解过夜。接下来，加入100μL的10M KOH进行中和。加入625μL氯仿、100μL的2N NH4OH和500μL碱性水，将样品涡旋混合并在16000g离心5分钟。将下层有机相用碱性水洗涤3次并在空气中干燥。在Agilent 6460QQQ LC-MS/MS上进行LCMS分析。使用C18柱(Luna 100×2.1mm，3μm，Phenomenex)实现代谢物分离。流动相A的组成为60:40比例的甲醇:水以及流动相B的组成为100％甲醇和0.1％甲酸以及加入两个流动相中的5mM甲酸铵。梯度洗脱程序包括在40％B下保持0.5分钟，在15分钟内线性增加到100％B，并保持9分钟，然后重新平衡至初始条件进行10分钟。毛细管电压设置为3.5kV，干燥气体温度为350℃，干燥气体流速为10L/min，雾化器压力为60psi。在相关的优化碰撞能量和碎裂电压下，通过SRM分析鞘氨醇类碱从前体到产物离子的转变(下表)。然后从已知浓度的加标内标定量鞘氨醇类碱。
Figure BDA0003653660980000301
耐力跑测试：跑步机上的运动方案以9cm/s的速度开始。由于小鼠年老，使用0度的倾斜度。如果小鼠连续两分钟每分钟接受7次或更多电击(0.2mA)，则认为小鼠已筋疲力尽，并从跑步机上移走。将跑完的距离和筋疲力尽前的时间记录为最大跑动距离和时间。
握力：通过握力测试评估肌肉力量。在连接到握力计(Columbus Instruments)的下拉网格组件上测量每只小鼠的握力。将小鼠沿着平行于手柄的直线拖拉，提供峰值力。实验重复3次，以最高值计入分析。
转棒测试：转棒测试测量肌肉力量、协调性和耐力。小鼠在房间内不受干扰地放置30分钟。旋转圆筒(转棒)的速度在5分钟内从0转增加到40rpm。每只小鼠每天进行3次试验，连续3天。记录小鼠被动旋转或从转子上落下的潜伏期和速度，并给出第二天最佳试验的潜伏期和速度。
横杆测试：横杆测试通过在沿着高架梁行走到达能够隐藏的黑暗端时保持平衡的能力来评估主动平衡。由于所有的小鼠都能轻松穿过方形(3cm)横梁，而直径为1.5cm的圆形横梁对它们来说太难了，因此记录了穿过3cm圆形横梁的潜伏期。在记录实际试验之前对小鼠进行了一天的训练，并给出了每只小鼠三次试验的平均潜伏期。
干细胞分离：切除两个后肢的腓肠肌、比目鱼肌和四头肌并转移到冰上的PBS中。将所有肌肉修剪、切碎并用2.5U/ml Dispase II(Roche)和0.2％胶原酶B(Roche)在PBS中在37℃消化30分钟。然后将样品以50g离心5分钟，然后去除上清液并在37℃进一步消化20分钟两次。将肌肉浆液依次通过100μm和40μm细胞过滤器过滤。然后将分离的细胞在洗涤缓冲液(PBS+2.5％BSA)中洗涤并重悬浮在800μL洗涤缓冲液中。将其立即用抗体在4℃染色45分钟，所述抗体包括：CD31(1:800，eBioscience，eFluor450缀合的)，CD45(1:200，eBioscience，eFluor450缀合的)，Sca-1(1:1000，eBioscience，PE-Cy7缀合的)，CD11b(1:100，eBioscience，eFluor450)和CD34(1:100，BD Pharmingen，FITC缀合的)，α-7整联蛋白(1:50，RD system，eFluor700缀合的)。用碘化丙啶(PI，Sigma)在黑暗中在4℃进行15分钟的二次染色。对染色的细胞使用FACSAria II仪器(BD Biosciences)进行分析和分选。通过前向散射、侧向散射和PI门控排除碎片和死细胞。
心脏毒素诱导的肌肉损伤和MuSC移植：将MuSC从供体小鼠移植到接受小鼠。供体小鼠是年老雄性C57Bl/6JRj小鼠，在18个月龄时开始用多球壳菌素处理。接受小鼠是年老(18个月龄)雄性C57Bl/6JRj小鼠或1岁雄性mdx小鼠。在移植前，将50μL的20μM Najemossambica mossambica心脏毒素(Sigma)肌肉注射到接受小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉中。CTX注射后24小时，将等量(1500)新鲜分离自供体小鼠的MuSC经肌肉注射到TA肌肉中。在移植后第7天和第14天处死接受小鼠。
组织学：从麻醉的小鼠收获TA肌肉，立即包埋入Thermo ScientificTMShandonTMCryomatrixTM中并在异戊烷中冷冻，在液氮中冷却1分钟，然后转移到干冰中并在-80℃储存。将8μm冷冻切片在4％PFA中温育15分钟，用PBS洗涤3次，每次10分钟，在95℃的pH6.0柠檬酸盐缓冲液中温育以抗原修复10分钟(对于PAX7抗体)，用DAPI、层粘连蛋白(1:200，Sigma)、PAX7(1:200，DSHB，University of Iowa)、肌营养不良蛋白(1:100，SpringBioscience)或eMyHC(1:50，DSHB，University of Iowa)复染，与Alexa-488或Alexa-568荧光染料(Life Technology)偶联并使用Dako封固剂封固。使用ImageJ软件分析来自肌肉纤维的荧光显微镜图像。使用ImageJ软件量化来自VS120-S6-W载玻片扫描仪(Olympus)的层粘连蛋白、肌营养不良蛋白和DAPI染色的肌肉图像，确定TA肌肉中的集中核百分比、最小Feret直径和横截面积。每个条件和测量至少使用2,000根纤维。最小Feret直径定义为肌纤维相对边界处两条平行切线之间的最小距离。已发现这种测量可防止在切片过程中偏离最佳横截面轮廓。肌肉纤维的平均横截面积计算为每个样品2,000根纤维的平均横截面积。每种条件使用7至8个小鼠样品进行供体小鼠的组织学量化。eMyHC量化表示为eMyHC阳性信号与总TA横截面积的比例。在注射了CTX的接受小鼠中注射MuSC后，代表肌肉再生阶段的炎症通过ImageJ软件量化为炎症区域与TA肌肉横截面总面积的比例。PAX7阳性细胞被量化为来自小鼠TA的30个以上随机选择的视野中每个视野的平均细胞数。对于每次量化，使用3只或更多小鼠。
MuSC的离体分析。如上所述分离MuSC，并接种在96或48孔板中。将细胞在含有30μM多球壳菌素的培养基(Ham'sF-10营养混合物、FBS 20％、碱性成纤维细胞生长因子2.5ng/mL、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)中培养72小时。将PFA 4％应用15分钟，将细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，并在具有2％BSA的PBS中封闭。然后将细胞在一抗MYOD(1:50，LabForce)和MYOG(1:50，SantaCruz)中于4℃温育过夜。将二抗与Alexa-488或Alexa-568荧光染料(Life Technology)偶联并使用Dako封固剂封固。使用Leica DMI4000显微镜对细胞成像。在每种条件中MYOD+和MYOG+细胞数目的量化使用超过500个细胞进行。
新物体识别：新物体识别任务用于评估小鼠的识别记忆。其基于啮齿动物通过与熟悉物体进行比较来探索新物体的自然倾向。实现习惯阶段以使动物熟悉试验场环境。24小时后，在获取阶段(学习阶段)，将两个相同物体放置在试验场中并呈现给小鼠。在记忆阶段(获取阶段后3小时)，将两个熟悉物体之一替换为一个新物体。在获取和记忆阶段都实现了对每个物体的探索持续时间和探索次数的测量，并计算了识别指数。
c.严重等级
级别0
体外研究
细胞培养和细胞转染：C2C12小鼠成肌细胞系得自美国典型培养物保藏中心(CRL-1772TM)。将C2C12细胞或克隆在由Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco，41966-029)、20％胎牛血清(Gibco，10270-106)和100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Gibco，15140-122)组成的生长培养基中培养。为诱导分化，用2％马血清(Gibco，16050-122)代替FBS。使用胰蛋白酶-EDTA 0.05％(GIBCO，25300-062)分离细胞。人骨骼肌细胞得自Lonza(SkMC，#CC-2561)并将其在由DMEM/F12(Gibco，10565018)、20％胎牛血清(Gibco，10270-106)和100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Gibco，15140-122)组成的生长培养基中培养。为诱导分化，将FBS减少到2％并保持在培养物中。所有细胞均保持在37℃及含5％CO2条件下。根据制造商的方案，使用TransIT(Mirus)进行细胞转染，转染剂与DNA的比例为3:1。使C2C12细胞生长汇合，加入30μM多球壳菌素或DMSO并将细胞在生长培养基中再保持3天。将Sptlc1克隆铺板以同时达到汇合并在生长培养基中保持3天，然后将其用于免疫细胞化学或RNA分离。所有实验的培养基中多球壳菌素的浓度为30μM。使用DMSO中的20mM多球壳菌素原液溶解多球壳菌素，并使用相应体积的不含多球壳菌素的DMSO作为对照。
CRISPR向导RNA设计和克隆：借助于在线GPP门户网站工具(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)使用酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)PAM序列(NGG)设计每个基因两个向导RNA。选择具有最佳预测的在靶和脱靶评分的向导RNA。所述向导RNA序列列于表2。合成寡核苷酸(Microsynth，Switzerland)并使用BsmBI限制酶克隆到CRISPRv2质粒(addgene#52961)中。通过Sanger测序(Microsynth，Switzerland)验证通过克隆的插入。为测试向导RNA的效力，将克隆的载体在C2C12细胞中瞬时转染(TransIT，Mirus)，转染48小时后分离RNA，将其逆转录并通过RT-qPCR测量基因表达。
在C2C12成肌细胞中产生单克隆Sptlc1敲除。将C2C12细胞用含有靶向Sptlc1外显子1的gRNA的lentiCRISPR v2质粒或用作为对照的空白载体lentiCRISPR v2质粒转染。转染36小时后，用2μg/mL嘌呤霉素(Invivo gene；QLL3803A)选择细胞3天并分选单细胞。将每个gRNA的5到10个不同克隆在没有选择标记的情况下生长。分离来自这些克隆的DNA(Macherey-Nagel，740952)并进行PCR扩增(参见表2)。将PCR产物经凝胶纯化(Machery-Nagel，740609)并进行Sanger测序以验证具有缺失或插入的克隆。在其中一个克隆中，Sptlc1 gRNA1导致Sptlc1的纯合敲除(Sptlc1-/-)，而在另一个克隆中gRNA2导致Sptlc1的杂合敲除(Sptlc+/-)。
在C2C12成肌细胞中产生多克隆Sptlc1或Cers2敲除。通过使用lipofectamine2000在HEK 293T细胞中通过与质粒pMD2G和psPAX2的包装共转染，从不含gRNA(空白载体)、含Sptlc1 gRNA2或Cers2 gRNA2(表3)的lentiCRISPRv2质粒产生慢病毒。在转染后36至48小时收获病毒上清。将C2C12用病毒上清液转导20小时。24小时后，用3μg/mL嘌呤霉素选择细胞3天。通过Western印迹证实靶蛋白的减少。
Western印迹：将C2C12细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)由Tris HCl50mM、NaCl 5M、EDTA 5mM、SFS 0.1％、NAF 100mM、脱氧胆酸钠5mg/mL和NP401％组成的RIPA缓冲液中裂解。使用Bradford方法测定蛋白质浓度，将23μg蛋白质加载到12％SDS-PAGE凝胶上。电泳后，通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜上。在5％牛奶-TBST中封闭膜1小时，洗涤后，将膜与一抗抗SPTLC1(Proteintech)在5％BSA-TBST中1:1000或抗CERS2(Sigma)在3％BSA-TBST中1:1000温育过夜。在5％BSA-TBST 1:2000中与二抗抗兔多克隆抗体温育。通过增强化学发光法(Advansta)揭示抗体检测反应，并使用c300成像系统(Azure Biosystems)成像。
体外成肌细胞增殖试验：为测量CRISPR介导的Sptlc1敲除或多球菌素处理的细胞中的细胞增殖，以每孔3000个细胞接种在96孔板(Greinerbio-one，CELLSTAR，655180)中，在生长培养基中培养并在接种24小时后将其用含有向导RNA(表2)的30ng lentiCRISPR v2质粒(addgene#52961)转染(TransIT，Mirus)或用在DMSO中稀释的30μM多球壳菌素处理，或用DMSO处理作为对照。根据制造商的方案(Cell proliferation ELISA BrdU，Roche)测量细胞增殖。简言之，将增殖的成肌细胞在37℃用10μL/孔BrdU标记2小时，在室温用200μL/孔固定30分钟，并在室温与提供的BrdU抗体温育90分钟。用PBS洗涤3次后，将细胞在100μL/孔底物溶液中温育10分钟，然后使用ELISA读板器(Perkin Elmer，VictorTM X4)测量在370nm的吸光度。
RNA分离和实时qPCR：使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，74106)分离RNA并用High-Capacity-RNA-to-cDNA试剂盒(Thermo Fisher，4387406)进行逆转录。使用PowerSybrGreen Master mix(Thermo Fisher，4367659)通过qPCR测量基因表达。所有定量聚合酶链反应(PCR)结果均相对于管家基因Gapdh的平均值计算。每个生物学数据点使用两次技术重复的平均值。用于定量逆转录PCR(q-RT-PCR)分析的引物组如表1所示。
免疫细胞化学：将在6孔板(Greinerbio-one，CELLSTAR，657160)中的无菌盖玻片上培养的C2C12细胞在室温在Fixx溶液(Thermo Scientific，9990244)中固定15分钟并在0.1％Triton X-100(Amresco，0694)溶液中透化15分钟。将细胞在室温在3％BSA中封闭1小时以避免非特异性抗体结合，然后在4℃与一抗一起轻轻摇动温育过夜。对于C2C12细胞，将MyHC使用MF20一抗(1:200，Invitrogen，14-6503-82)染色，在Lonza肌细胞中使用MYL2抗体(1:140，Abcam，ab79935)染色。次日将细胞与二抗(对于MF20使用Thermo Fisher#A10037，对于MYL2使用#A-21206)在室温温育1小时并用DAPI标记细胞核。使用荧光或共聚焦显微术获得免疫荧光图像。肌融合指数计算为肌管内的细胞核与总细胞核的比率。使用ImageJ测量每个图像8个肌管的肌管直径。肌管面积计算为肌管覆盖的总面积。
BXD小鼠群体中的基因表达和表型分析：使用R软件分析来自BXD小鼠遗传参考群体的四头肌微阵列数据(Affymetrix Mouse Gene 1.0ST)和表型数据的Pearson相关性。通过包括以下基因来计算代表其在肌肉中的表达的神经酰胺生物合成途径的第一主要成分：SPTLC1、SPTLC2、KDSR、CERS1、CERS2、CERS3、CERS4、CERS5、CERS6、DEGS1。
使用RNA测序分析四头肌转录物谱：从18个月龄开始以饲料喂养的经腹膜内多球壳菌素处理10周的C57Bl/6JRj小鼠收集四头肌肌肉并在液氮中速冻。使用Direct-zol RNA试剂盒(Zymo，Irvine，CA)分离RNA。使用Agilent 2100BioAnalyzer(Agilent，SantaClara，CA)评估RNA质量。分析中包括RIN≥8、28S/18S≥1.0和c≥20ng/μL的样品。使用这些标准，9个(4个DMSO和5个多球壳菌素)样品通过了质量控制标准，2个样品未通过。测序文库由BGIgenomics使用DNBseqTM技术制备。使用BGISEQ-500仪器进行100个循环的配对末端测序。在去除连接物序列和低质量读取后，每个样品获得至少5600万个读取。SOAPnuke用于获得干净读取(参数-l 15，-q 0.2，-n 0.05)。使用小鼠GRCm38基因组组装和来自Ensembl的release 91GTF注释，使用STAR aligner版本2.5.2b对读取作图。Htseq-count版本0.6.0用于计数映射至基因的读取次数(模式＝联合，类型＝外显子，idattr＝gene_id)。在至少3个样品中显示比log2(CPM+1)＞0.5更高表达的转录物包括在分析中。使用voom(观测水平的方差建模)进行差异基因表达分析和表达标准化，根据处死日期加以调整。在单个基因水平上，没有基因通过多重测试校正阈值。使用了用于多重测试的Benjamini-Hochberg校正。对于使用基因本体(GO)类别的基因集富集分析，转录物根据其log2转换倍数变化进行排序，使用了100,000个排列。调整后的p值＜0.05被认为是显著的。
人体研究
年轻与老年骨骼肌微阵列：年轻与老年人肌肉活检的基因表达分析得自公开可用的数据集GSE25941。简言之，共有36名受试者被纳入研究。年轻(n＝15，25±1y)参与者包括7名男性和8名女性。老年(n＝21，78±1y)参与者包括10名男性和11名女性。所有受试者都是健康的，从未参加过任何正式的锻炼。骨骼肌活检取自基础状态的股外侧肌。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0Array平台进行微阵列分析。
基因型-组织表达(GTEx)项目中人骨骼肌的基因表达分析。对于RNA基因表达分析，使用了来自收集的GTEx基因表达的491个死后骨骼肌活检组织。作为基因表达的测量，使用针对已发表的GTEx v7协变量调整的转录物的残余表达水平。对于eQTL分析，使用GTExv7基因型(dbGAP，批准的请求#10143-AgingX)。对于SPTLC1和SPTLC2的组合表达，使用残余表达的平均值。
Helsinki出生队列研究(HBCS)：HBCS包括1934至1944年间在Helsinki出生的13,435人。对695人进行了描述参与者身体表现的老人健康测试(SFT)。在此，使用了一个改进的测试组合，由SFT的五个组成部分组成：30秒内双臂交叉在胸前全臂站立数，以评估下肢力量；30秒内的二头肌卷曲次数，同时手握重量(男性3公斤，女性2公斤)，以评估上身力量；椅子坐位体前屈以评估下半身柔韧性(从坐姿，腿伸到椅子前面，手伸向脚趾，从伸直的手指到脚趾尖的厘米数(加/减))；6分钟内步行的米数，以测量有氧运动耐力；和抓背以评估上半身柔韧性(一只手伸过肩膀，另一只手向上伸到背部中间，伸出的中指之间的距离(厘米)(加/减)。每个测试的结果均表示为年龄(每5岁一组)和性别标准化百分位分数。通过总结5个SFT成分的标准化分数来计算总体测试分数。通过Newtest Grip Force测力计(NewtestOy，Oulu，Finland)测试主导手的等长握力。分析中使用了三次挤压的最大值。
根据标准方案，从血液样本中提取DNA并使用英国剑桥Wellcome Trust SangerInstitute改进的Illumina 610k芯片进行基因分型。使用1000Genomes Phase I集成变体集(v3/April 2012；NCBI build 37/hg19)作为参考样本和IMPUTE2软件，通过填补(imputation)扩展了基因组覆盖。在填补之前应用了以下QC过滤器：每个基因型的SNP聚类概率>95％，调用率(Call rate)>95％个体和标记(99％用于标记，MAF<5％)，MAF>1％，HWEP>1×10-6。此外，还进行了杂合性、性别检查和相关性检查，并消除了任何差异。
为鉴定cis-eQTL，将eQTL±1Mb从SPTLC1和SPTLC2的开始和结束进行分析。包括具有次要等位基因频率＞10％的SNP。r2＞0.2的SNP被整合到同一个单倍型区块中。由于SPTLC1和SPTLC2区域(300kb)内有4个单倍型区块，Bonferroni校正用于研究2Mb区域内的25个单倍型区块(P＜0.002)以鉴定cis-eQTL。假设加性遗传模型，使用SNPtest进行线性回归。所有模型都针对年龄、性别、所获得的最高教育(基础或更低/高中/低级高等教育/高级高等教育)和吸烟(是/否)进行了调整。
序列表
<110> 洛桑联邦政府综合工科学校（EPFL)
<120> 通过抑制鞘脂类治疗和预防衰老相关疾病和/或衰老
<130> AC2934 PCT
<160> 9
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
Met Ala Thr Val Ala
1 5
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 2
cccgcctgcc ggaagtcggc tgcctgacca tggcgacagt ggcggagca 49
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 3
cccgcctgcc ggaagtcggc tgcctgacca tggcgacagt ggcggagca 49
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA1
<400> 4
tgcctgacca tggcgacag 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA2
<400> 5
ggaagtcggc tgcctgacca 20
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sptcl1-/- gRNA1
<400> 6
cccgcctgcc ggaagtcggc tgcctgacca tggcgacagt ggcggagca 49
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sptcl1+/- gRNA2
<400> 7
cccgcctgcc ggaagtcggc tgcctgacca tggcgacagt ggcggagca 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sptcl1+/- gRNA2
<400> 8
cccgcctgcc ggaagtcggc tgcctgacca tggcgacagt ggcggagca 49
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sptcl1+/- gRNA2
<400> 9
cccgcctgcc ggaagtcggc tgcctgacca tggcgacagt ggcggagca 49

Claims (13)

1.一种鞘脂类的抑制剂，其用于治疗或预防肌肉疾病的用途。
2.根据权利要求1所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述肌肉疾病是以肌肉减少症和/或肌肉萎缩为特征的衰弱症，或者是肌肉减少症并且优选是以肌肉减少症和/或肌肉萎缩为特征的衰弱症。
3.根据权利要求2所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述衰弱症的特征在于
(i)肌肉减少症和/或肌肉萎缩，和
(ii)认知障碍。
4.根据权利要求3所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述认知障碍是老年性痴呆。
5.根据权利要求1至4任一项所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述鞘脂类是二氢神经鞘氨醇类、鞘氨醇类、神经酰胺类、二氢神经酰胺类、鞘磷脂类、脱氧鞘脂类(例如1-脱氧二氢鞘氨醇)或其任意组合。
6.根据权利要求1至5任一项所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述抑制剂是参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的抑制剂。
7.根据权利要求6所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述一种或多种酶选自SPTLC1、SPTLC2、SPTLC3、KDSR、CERS1、CERS2、CERS3、CERS4、CERS5、CERS6、SGMS1、SGMS2、SMPD1、SMPD2、SMPD3、SMPD4、ASAH1、ASAH2、ASAH2B、ASAH2C、ACER1、ACER2、ACER3、SPHK1和SGPP1。
8.根据权利要求6或7所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述抑制剂抑制
(i)编码参与鞘脂类生物合成的一种或多种酶的核酸分子的表达，或
(ii)参与鞘脂类生物合成的酶的酶活性。
9.根据权利要求8所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中
(I)(i)的抑制剂选自小分子、适体、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、反义核酸分子、基于CRISPR-Cas9的构建体、基于CRISPR-Cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(TAL)效应物(TALE)核酸酶，和/或
(II)(ii)的抑制剂选自小分子、抗体或抗体模拟物和适体。
10.根据权利要求9所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述抗体模拟物选自affibodies、adnectins、anticalins、DARPins、avimers、nanofitins、affilins、Kunitz结构域肽、
Figure FDA0003653660970000011
三特异性结合分子和probodies。
11.根据权利要求9所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中(ii)的小分子是多球壳菌素或选自表A的小分子抑制剂，或任何这些抑制剂的盐或酯。
12.根据权利要求6至9任一项所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述抑制剂在编码参与鞘脂类生物合成的酶的位置编辑基因组。
13.根据权利要求1至12任一项所述的用于所述用途的鞘脂类的抑制剂，其中所述肌肉疾病是包涵体肌炎或肌营养不良，优选Duchenne肌营养不良。
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