CN113735952A - 一种地龙蛋白eda-r激活因子 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地龙蛋白EDA‑R激活因子，其特征在于：所述地龙蛋白EDA‑R激活因子为SEQ ID No.6所示氨基酸序列组成的蛋白质，组分是：F‑O‑1‑HM‑23分子量为：1310±100道尔顿。该蛋白质没有直接降解纤维蛋白活力，但在体内通过激活EDA‑R残基而具有显著增强体内纤溶作用、促进血栓溶解。所述地龙蛋白EDA‑R激活因子的制备方法采用蚯蚓经清洗后，纳米粉碎、水解、离心分离、透析、凝胶层析和电泳分离纯化得到活性组分。由于本发明的所述地龙蛋白EDA‑R激活因子的分子量只有蚓激酶的1/20左右，具有强大的药动学优势，口服吸收快，注射起效迅速，具有双向调节作用，无出血和凝血时间延长的副作用，具有广阔的应用前景，具有良好的经济价值和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种生化制药技术领域，尤其涉及一种地龙蛋白EDA-R激活因子。
背景技术
现有技术的地龙蛋白用于治疗和预防血栓，始于1986年，日本科学家美源恒首次应用现代生物技术方法提取蚯蚓中溶栓活性成分。并确认口服蚯蚓粗蛋白提取物对血栓溶解、预防血栓形成以及降低血液粘度等方面有效。并且分离了六种蛋白酶组分，申请了专利-US 4,568,545。认为血栓溶解的活性组分就是这六个组分其中之一或几个的组合。这六个蛋白酶组分分别是：
F-O-HM-45分子量：24,500±2,000道尔顿。
F-I-1-HM-54分子量：27,500±2,000道尔顿。
F-I-2-HM-15分子量：27,000±2,000道尔顿。
F-II-HM-64分子量：27,800±2,000道尔顿。
F-III-1-HM-27分子量：32,400±2,000道尔顿。
F-III-2-HM-89分子量：32,800±2,000道尔顿。
在此基础上，我国科学家在90年代初推出了蚯蚓粗蛋白提取物口服溶栓胶囊，目前在我国有多家大型制药企业生产该类药物，如“江中制药”的“博洛克”、“青岛双龙”的“普恩复”等等。另外中CN139-3453A公开了一种血纤维蛋白溶解系统激活蛋白分子量为16.2kDa，其具有一定的溶解血栓活性。在此之后，对蚯蚓中溶栓活性有效组分的确定方面有大量的研究工作。但是，蚯蚓中溶栓活性组分的最终确定的研究一直没有进一步的进展。使蚯蚓的药用功能进一步应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种地龙蛋白EDA-R激活因子，合理有效地解决了现有技术的六种蚯蚓蛋白酶组分的分子量太大、口服吸收差、注射起效慢、直接溶栓力强、导致出血倾向和凝血时间延长的问题。
本发明采用如下技术方案：
本发明从蚯蚓中分离得到一种小分子的蛋白质，所述地龙蛋白EDA-R激活因子为SEQ ID No.6所示氨基酸序列组成的蛋白质，组分是：F-O-1-HM-23分子量为：1310±100道尔顿。研究表明，该蛋白质没有直接降解纤维蛋白活力，但在体内通过激活EDA-R残基而具有显著增强体内纤溶作用、促进血栓溶解；激活血管内上皮细胞，释放或分泌TPA；对血液流变学指标有明显改善；而且不影响凝血系统和抗凝指标。通过提取的蚯蚓全RNA为模版，按照该蛋白质N端氨基酸序对应的mRNA5-’端基因序列和所有mRNA共有的-3’端polyA序列设计引物，经RT-PCR反应，获得该蛋白质的cDNA，其核苷酸序列如SEQID No.5所示，编码23个氨基酸所组成的蛋白质。经测定，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将第14位的Glu替换为Asp，将第20位的Gln替换为Asn，或者将最后一位氨基酸缺失，或者在N端增加氨基酸。因此，本发明蛋白还包括SEQ ID No.5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，具有同等功能的由SEQID No.6组成的蛋白衍生得到的蛋白质。本发明还包括编码上述蛋白的基因。上述衍生得到的蛋白质，包括但不限于：1)截短的蛋白质或者多肽，其中从地龙蛋白EDA-R激活因子的一端或两端或蛋白质的内部区域除去一个或多个氨基酸，而产生的分子仍然保持原有的活性。2)加长了的蛋白质或多肽。其中在所述地龙蛋白EDA-R激活因子蛋白质的一端或两端或中间位置加入一个或多个氨基酸，而产生的分子仍保持着原有的活性。3)氨基酸残基经取代的蛋白质或多肽，包括其它分子在特异性位点发生的氨基酸的取代，这种取代后的分子仍然保持着原有的活性。此外，本发明地龙蛋白EDA-R激活因子还包括上述蛋白质经修饰的衍生物，包括使用化学方法将所述地龙蛋白EDA-R激活因子与其它分子结合。包括基于可以存在于氨基酸上的功能基团(氨基、巯基、羧基，酰胺、苯酚、咪唑)选择所述的结合技术。其它的对这些基团结合有效的各种试剂包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。将所述地龙蛋白EDA-R激活因子与同位素、酶、载体蛋白质、细胞毒性剂、荧光分子和其它具有多种用途的化合物通过化学方法结合。这些结合技术对本领域技术人员是公知的。此外，还可以通过对本发明地龙蛋白EDA-R激活因子进行修饰，或取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得该蛋白的衍生物，该衍生物够专一性结合所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白受体，但不具备激活纤维蛋白溶解系统的功能。从而，这种衍生物可以作为血纤维蛋白溶解系统抑制剂进行使用。当然，这种衍生物可以改变所述地龙蛋白EDA-R激活因子的生物活性和产生生物或者药理上的激活剂或者抑制剂(如经修饰后，蛋白质保持它的专一性，其活性丧失，被用于抑制所述地龙蛋白EDA-R激活因子的目标物活性)。所述地龙蛋白EDA-R激活因子来源于蚯蚓中分离纯化所得，所述地龙蛋白EDA-R激活因子的制备方法采用蚯蚓经清洗后，纳米粉碎、水解、离心分离、透析、凝胶层析和电泳分离纯化得到活性组分。在获知所述地龙蛋白EDA-R激活因子的氨基酸序列SEQ ID No：5后可以来源于其他许多途径。包括来源于重组微生物表达；来源于植入相关基因遗传上改变的动物或植物；来源于基因重组的细胞、肿瘤、细胞培养物以及其它生物途径；来源于酶促切割不同的分子(包括包含所述地龙蛋白EDA-R激活因子片段同源或者等同性序列的前体)；来源于化学(肽化学合成和体外酶催化前体分子)方法产生的所述地龙蛋白EDA-R激活因子。例如在重组大肠杆菌、昆虫、酵母以及其它表达系统中产生所述地龙蛋白EDA-R激活因子，并用柱层析进行纯化。在本发明实施例中将编码所述地龙蛋白EDA-R激活因子的基因导入表达载体，进而转化宿主细胞，通过培养、诱导表达，最后分离纯化获得所述地龙蛋白EDA-R激活因子。
可以用在特定位置的氨基酸取代，进行这些肽片段的合成以便体外和体内检测激活和抑制活性。可以使用与组织具有高度亲和性的肽片段在亲和性柱上分离所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物。对于阐明所述地龙蛋白EDA-R激活因子活性机理，所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物的分离和纯化是根本步骤，这种方法有利于产生调节所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物活性的药物。最终产生生物活性。这种目标物的分离使得可以构建使用原位和溶液杂交技术监测目标物位置及合成的核苷酸探针。所述地龙蛋白EDA-R激活因子的合成肽片段具有多种功能。将与所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物以高度特异性和亲合力结合的肽进行放射性或其他化学标记，可用于定量结合物及显现结合位置。本发明提供了重要诊断和研究工具。所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物的定量和位置的知识有利于研究与纤溶系统激活相关的传导机制和缺陷存在位置。在这些合成的肽中进行氨基酸的系统取代产生与所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物具有高亲和性的激活剂和抑制剂，它们可以促进或减弱所述地龙蛋白EDA-R激活因子目标物的功能。这种处理可能具有治疗作用。所述地龙蛋白EDA-R激活因子片断及衍生物也可以作为所述地龙蛋白EDA-R激活因子作用目标物的抑制剂，由此阻断目标物的生物活性。这些肽也可用于分离所述地龙蛋白EDA-R激活因子作用目标物。
所述地龙蛋白EDA-R激活因子在体内作用的目标物所述地龙蛋白EDA-R激活因子的作用机理是：在体内所述地龙蛋白EDA-R激活因子特异性作用于特定目标物，该目标物属于纤维蛋白溶解系统或可以进一步作用于可以纤维蛋白溶解系统。所以本发明还包括应用所述地龙蛋白EDA-R激活因子鉴定其作用的特异性目标物的方法和由此鉴定和分离的目标物分子。相关技术对本领域技术人员是公知的。例如：用同位素或其它分子或蛋白质标记的所述地龙蛋白EDA-R激活因子，所说的标记用分子或蛋白质在现有技术(包括但不限于：正电子发射断层摄影术、放射自显影术、流动细胞计量术、放射受体结合测定和免疫组织化学)中用于检测和显示所述地龙蛋白EDA-R激活因子的作用目标物的存在数量和位置。实验表明，可以通过向患有因血栓生成及微循环障碍有关疾病的患者，以足以溶解血栓的量的地龙蛋白EDA-R激活因子或所述地龙蛋白EDA-R激活因子的组合物，用来治疗血管闭塞性疾病。包括脑血栓的形成、脑栓塞、心绞痛、心肌埂死、肺栓塞、高凝血症、周围动静脉栓塞症。血栓形成引起的疾病或改善微循环的方法。本发明对急性缺血性心脑血管病、慢性动脉闭塞症、微循环障碍特别有用。由此可见，本发明地龙蛋白EDA-R激活因子可以用于制备治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍药物。
本发明地龙蛋白EDA-R激活因子可以与药学上可接受的载体或赋形剂制备成各种剂型，包括适用于口服、肌内、静脉内、真皮内、颅内、气管内、眼房内、鼻、局部(包括口腔和舌下)、腹膜内等等给药的所述地龙蛋白EDA-R激活因子。所述地龙蛋白EDA-R激活因子制剂可以以方便的单位剂量的形式存在，并且可以通过常规的药物技术制备。由于本发明的所述地龙蛋白EDA-R激活因子的分子量只有蚓激酶的1/20左右，具有强大的药动学优势，口服吸收快，注射起效迅速，具有双向调节作用，无出血和凝血时间延长的副作用，具有广阔的应用前景，具有良好的经济价值和社会效益。
具体实施方式
通过下面对实施例的描述，将更加有助于公众理解本发明，但不能也不应当将申请人所给出的具体的实施例视为对本发明技术方案的限制，任何对部件或技术特征的定义进行改变和/或对整体结构作形式的而非实质的变换都应视为本发明的技术方案所限定的保护范围。
实施例:
一种地龙蛋白EDA-R激活因子，其特征在于：所述地龙蛋白EDA-R激活因子为SEQID No.6所示氨基酸序列组成的蛋白质，组分是：F-O-1-HM-23分子量为：1310±100道尔顿。
进一步地，所述地龙蛋白EDA-R激活因子用于制备治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍。
进一步地，编码权利要求1所述地龙蛋白EDA-R激活因子的基因。
进一步地，所述地龙蛋白EDA-R激活因子的基因具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
进一步地，所述地龙蛋白EDA-R激活因子的制备方法采用蚯蚓经清洗后，纳米粉碎、水解、离心分离、透析、凝胶层析和电泳分离纯化得到活性组分。完成所述一种地龙蛋白EDA-R激活因子的实施。
当然，本发明还可以有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可以根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种地龙蛋白EDA-R激活因子，其特征在于：所述地龙蛋白EDA-R激活因子为SEQ IDNo.6所示氨基酸序列组成的蛋白质，组分是：F-O-1-HM-23分子量为：1310±100道尔顿。
2.根据权利要求1所述一种地龙蛋白EDA-R激活因子，其特征在于，所述地龙蛋白EDA-R激活因子用于制备治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍。
3.编码权利要求1所述地龙蛋白EDA-R激活因子的基因。
4.根据权利要求3所述一种地龙蛋白EDA-R激活因子，其特征在于，所述地龙蛋白EDA-R激活因子的基因具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述一种地龙蛋白EDA-R激活因子，其特征在于，所述地龙蛋白EDA-R激活因子的制备方法采用蚯蚓经清洗后，纳米粉碎、水解、离心分离、透析、凝胶层析和电泳分离纯化得到活性组分。
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