CN116023462A - 一种纤维蛋白溶酶原活化蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维蛋白溶酶原活化蛋白，是从蚯蚓中分离提取的生物大分子，构成纤维蛋白溶酶原活化蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1序列具有同源性。本发明通过提供的纤维蛋白溶酶原活化蛋白能够促进体内在纤溶作用、促进血栓溶解；不影响凝血和抗凝指标；对血液流变学指标有明显改善。

Description

一种纤维蛋白溶酶原活化蛋白

技术领域

本发明涉及生物药物领域，特别涉及一种纤维蛋白溶酶原活化蛋白。

背景技术

心脑血管疾病占据全世界死亡原因首位已经至少有20年了，2016年，造成最多死亡人数的前三类疾病为：心脑血管疾病—1760万；肿瘤—893万；慢性呼吸系统疾病—354万。

为此，科学家为寻求治疗血栓疾病的药物付出了极大的努力。目前应用于治疗血栓疾病主要有：链激酶、尿激酶、蛇毒蛋白、t-PA。但未能改变这个现状。甚至2006年到2016年，全球心脑血管疾病造成的死亡人数还增加了 14.5％。由此可见尚未有合适的产品应对严峻现实。

市场中针对心脑血管疾病的药物和保健品甚多，但是距离人类抵抗这类疾病的要求还远远不够。

1986年，日本科学家美源恒首次应用现代生物技术方法提取蚯蚓中溶栓活性成分。确认口服蚯蚓粗蛋白提取物对血栓溶解、预防血栓形成以及降低血液粘度等方面有效。并且分离了六种蛋白酶组分，申请了专利——US 4,568,545。认为血栓溶解的活性组分就是这六个组分其中之一或几个的组合。这六个蛋白酶组分分别是：

F-O-HM-45分子量：24,500±2,000道尔顿

F-I-1-HM-54分子量：27,500±2,000道尔顿

F-I-2-HM-15分子量：27,000±2,000道尔顿

F-II-HM-64分子量：27,800±2,000道尔顿

F-III-1-HM-27分子量：32,400±2,000道尔顿

F-III-2-HM-89分子量：32,800±2,000道尔顿

在此基础上，我国科学家在90年代初推出了蚯蚓粗蛋白提取物口服溶栓胶囊，目前在我国有多家大型制药企业生产该类药物，如“江中制药”的“博洛克”、“青岛双龙”的“普恩复”等等。

在此之后，对蚯蚓中溶栓活性有效组分的确定方面有大量的研究工作。但是，蚯蚓中溶栓活性组分的最终确定的研究一直没有进一步的进展。使蚯蚓的药用功能进一步应用受到限制。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种新的纤维蛋白溶酶原活化蛋白和该纤维蛋白溶酶原活化蛋白的应用。

本发明从蚯蚓中分离得到一种新的蛋白质，研究表明此蛋白没有直接降解纤维蛋白活力，该蛋白没有直接降解纤维蛋白活力，也没有蛋白酶的活性，但在体内有明显增强体内纤溶作用、促进血栓溶解；对血液流变学指标有明显改善；而且不影响凝血系统和抗凝指标。使用该蛋白酶用于全身治疗可以溶解已生成的血栓和抑制血栓的生成，显示出强大的抗血栓活性。同时，该蛋白有改善微循环的作用。提供治疗由血栓形成引起的疾病和微循环障碍有关疾病的方法。

将这种蛋白酶命名为纤维蛋白溶酶原活化蛋白(Plasminogen ActivatorProtein)。此蛋白的特征还在于氨基酸序列与SEQ ID No:1具有实质上的同源性，其氨基酸序列为：

术语纤维蛋白溶酶原活化蛋白也包括具有实质上与所说的蛋白同源的氨基酸序列并且能够促进体内在纤溶作用、促进血栓溶解；不影响凝血和抗凝指标；对血液流变学指标有明显改善的多肽的片段、修饰的多肽和肽。例如，氨基酸的沉默取代。其中所说的用结构上或化学上类似的氨基酸进行取代没有明显地改变多肽的结构、构象或活性，这是本领域公知的。

术语“纤维蛋白溶酶原活化蛋白”包括截短的多肽或者肽，其中从纤维蛋白溶酶原活化蛋白的一端或两端或多肽的内部区域除去一个或多个氨基酸，而产生的分子仍然保持原有的全部或部分作用活性，这一点也是公知的。

术语“纤维蛋白溶酶原活化蛋白”也包括加长了的多肽或肽。其中在纤维蛋白溶酶原活化蛋白多肽的一端或两至或中间位置加入一个或多个氨基酸，而产生的分子仍保持着原有的全部或部分作用活性。

纤维蛋白溶酶原活化蛋白多肽和肽片段的修饰也包含在术语纤维蛋白溶酶原活化蛋白的定义中。这样的修饰包括其它分子(包括但不限于天然和非天然存在的氨基酸)在特异性位点天然发生的氨基酸的取代。这样的取代可以改变纤维蛋白溶酶原活化蛋白的生物活性和产生生物或者药理上的激活剂或者抑制剂。(例如，经修饰后，多肽保持它的专一性，其酶活性丧失，被用于抑制纤维蛋白溶酶原活化蛋白的目标物活性)术语纤维蛋白溶酶原活化蛋白也包括纤维蛋白溶酶原活化蛋白的N末端片段或末端的片段。

可以从蚯蚓中分离获得纤维蛋白溶酶原活化蛋白、可以从重组来源、从植入到动物或植物中的遗传上改变的细胞、肿瘤、细胞培养物和其它途径产生纤维蛋白溶酶原活化蛋白。或者通过化学或者生物合成方法(例如细胞培养、重组基因表达，肽合成和体外酶催化前体分子以产生具有活性的纤维蛋白溶酶原活化蛋白)产生纤维蛋白溶酶原活化蛋白。重组技术包括但不限于利用聚合酶链式反应(PCR)由DNA进行基因扩增和利用反转录酶/PCR的RNA 的基因扩增等。

可以通过本领域技术人员公知的自动多肽合成方法产生本发明的促进体内在纤溶作用多肽。

可以根据已知的氨基酸序列、密码子(三个核酸碱基的序列)与氨基酸的对应关系知识制备对应于(编码)纤维蛋白溶酶原活化蛋白和纤维蛋白溶酶原活化蛋白类似物核酸序列。由于遗传密码的简并性，在密码子中的三个碱基发生变化仍可能编码同一氨基酸，对于任何特殊的多肽或者肽片段都可以得到多种不同的碱基序列的核酸。

使用本领域公知的自动系统合成核酸序列，可以合成整个序列，或者合成一系列较短寡核苷酸，然后将这些寡核苷酸连接到一起产生全长序列。

此外，可以使用以N-末端氨基酸序列为基础设计的寡核苷酸探针和公知的用于克隆物质的技术从基金库得到所说的核酸序列。

实验表明，可以通过向患有因血栓生成及微循环障碍有关疾病的患者，以足以溶解血栓的量包含纤维蛋白溶酶原活化蛋白或纤维蛋白溶酶原活化蛋白的组合物，用来治疗血管闭塞性疾病。包括脑血栓的形成，脑栓塞；心绞痛，心肌埂死；肺栓塞；高凝血症；周围动、静脉栓塞症。血栓形成引起的疾病或改善微循环的方法。本发明对急性缺血性心脑血管病、慢性动脉闭塞症、微循环障碍特别有用。

由此可见，本发明纤维蛋白溶酶原活化蛋白可以用于制备治疗血栓生成及微循环障碍有关的疾病的药物。

进一步，本发明提供一种用于治疗血栓生成及微循环障碍有关的疾病的药物，其含有有效剂量的上述纤维蛋白溶酶原活化蛋白。

本发明也包括治疗和预防血栓生成及微循环障碍有关疾病的方法，包括 (但不限于)通过或向患者施用纤维蛋白溶酶原活化蛋白、或者纤维蛋白溶酶原活化蛋白激活剂与抑制剂、和/或纤维蛋白溶酶原活化蛋白抗体(抗血清)。另外的治疗方法包括施用纤维蛋白溶酶原活化蛋白、纤维蛋白溶酶原活化蛋白片段、纤维蛋白溶酶原活化蛋白抗体(抗血清)。应该理解所说的纤维蛋白溶酶原活化蛋白可以来源于蚯蚓或纤维蛋白溶酶原活化蛋白可以是经化学反应或与表达系统结合的重组技术通过合成的方法产生的。也可以通过酶促切割不同的分子(包括包含纤维蛋白溶酶原活化蛋白片段同源或者等同性序列的前体，以便产生具有抗血血栓生成作用的肽)。

作为本发明的一部分，纤维蛋白溶酶原活化蛋白可以从蚯蚓中分离，或者通过本领域合适技术人员公知的重组表达方法或者合成肽化学方法产生所说的纤维蛋白溶酶原活化蛋白。

本发明可以使用标准方法将纤维蛋白溶酶原活化蛋白和纤维蛋白溶酶原活化蛋白衍生肽与其它分子结合。这些结合技术对本领域技术人员是公知的。

本发明将纤维蛋白溶酶原活化蛋白肽与同位素、酶、载体多肽、细胞毒性剂、荧先分子和其它具有多种用途的化合物通过化学方法结合。

进一步，按照本发明，纤维蛋白溶酶原活化蛋白可以与其它治疗疾病的组合物及方法组合使用。

所说的纤维蛋白溶酶原活化蛋白制剂包括适用于口服、肌内、静脉内、真皮内、颅内、气管内、眼房内、鼻、局部(包括口腔和舌下)、腹膜内等等给药的纤维蛋白溶酶原活化蛋白。

适用于肠胃外施用的制剂包括含水或不含水的无菌注射液(包括抗氧化剂、缓冲液、制菌剂和能够使此制剂与将要治疗的患者的血液达到等渗的溶质)；含水或不含水的无菌悬液(包括延缓剂和增厚剂)。此制剂可以存放在单位剂量或多剂量的容器(如安培瓶和药水瓶)中，并储存在了浓干燥(冻干)条件下，在使用前加入无菌液体再提(如注射用水)。可以从上文描述的无菌粉末、颗粒剂和丸剂制备临时使用的注射液和悬液。

本发明包括完整的纤维蛋白溶酶原活化蛋白多肽、所说的纤维蛋白溶酶原活化蛋白多肽的衍生物和纤维蛋白溶酶原活化蛋白蛋白的生物活性多肽段。这些多肽包括具有纤维蛋白溶酶原活化蛋白活性且发生氨基酸取代或包含与氨基酸功能基团结合的糖或者其它分子的多肽。本发明也包括编码纤维蛋白溶酶原活化蛋白基因，和由这些基因表达的多肽

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过提供的纤维蛋白溶酶原活化蛋白能够促进体内在纤溶作用、促进血栓溶解；不影响凝血和抗凝指标；对血液流变学指标有明显改善；本发明的蛋白分子作为溶栓药物治疗对血栓生成及微循环障碍有关的疾病是有用的；所说的蛋白分子对预防血栓的生成、改善微循环也是有用的；这些新型化合物治疗和预防血栓的生成而不影响凝血系统，解决了困扰医学界很长时间的问题，这是极为突出的优点，提供了非常大的益处；另外纤维蛋白溶酶原活化蛋白分子量小，稳定性高，这对于纤维蛋白溶酶原活化蛋白的应用是极为有用利。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的序列表示意图；

图2A、2B是本发明的实施例中实验数据图其一；

图3A、3B是本发明的实施例中实验数据图其二；

图4A、4B是本发明的实施例中实验数据图其三。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

含纤维蛋白溶酶原活化蛋白的地龙蛋白压片(食品)应用观察

选取三名颈动脉狭窄的病患，每日两片口服，早饭后十点左右一片，晚上睡前一片。医院进行多普勒彩色超声检查作为实验数值。每3个月采集一次，数值信息如图2所示，比较使用本发明产品的效果。

本发明通过提供的纤维蛋白溶酶原活化蛋白能够促进体内在纤溶作用、促进血栓溶解；不影响凝血和抗凝指标；对血液流变学指标有明显改善；本发明的蛋白分子作为溶栓药物治疗对血栓生成及微循环障碍有关的疾病是有用的；所说的蛋白分子对预防血栓的生成、改善微循环也是有用的；这些新型化合物治疗和预防血栓的生成而不影响凝血系统，解决了困扰医学界很长时间的问题，这是极为突出的优点，提供了非常大的益处；另外纤维蛋白溶酶原活化蛋白分子量小，稳定性高，这对于纤维蛋白溶酶原活化蛋白的应用是极为有用利。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.纤维蛋白溶酶原活化蛋白，其特征在于，所述纤维蛋白溶酶原活化蛋白为从蚯蚓中分离提取的生物大分子，构成纤维蛋白溶酶原活化蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1序列具有同源性。

2.根据权利要求1所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白，其特征在于，所述纤维蛋白溶酶原活化蛋白是通过重组表达系统中重组表达产生。

3.根据权利要求1所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白，其特征在于，还包括对所述纤维蛋白溶酶原活化蛋白的氨基酸序列中的部分氨基酸残基，采用替代、添加、消减、或者修饰方式中的一种或多种手段，在序列中的一处或多处进行处理，所获得的衍生物。

4.根据权利要求3所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列的片段为拥有全部或部分纤维蛋白溶酶原活化蛋白活性的多肽，包括处理所获得的所述衍生物。

5.权利要求1至4中任一项所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白的制备方法，其特征在于，在纤维蛋白溶酶原活化蛋白的N端或C端或中间插入其它氨基酸序列构成的重组融合蛋白，所述纤维蛋白溶酶原活化蛋白包括权利要求3所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白的衍生物和/或权利要求4所述的片段。

6.根据权利要求5所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白的制备方法，其特征在于，所述氨基酸序列对应编码的核苷酸序列包括权利要求3、权利要求4所述蛋白质或多肽的氨基酸序列对应编码的核苷酸序列。

7.权利要求1所述的纤维蛋白溶酶原活化蛋白在制备治疗血栓生成及微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，使用纤维蛋白溶酶原活化蛋白进行治疗时，向患者施用以足以溶解生成的血栓或改善微循环的量的纤维蛋白溶酶原活化蛋白制剂。

9.权利要求1所述纤维蛋白溶酶原活化蛋白在鉴定纤维蛋白溶酶原活化蛋白作用的特异性目标物的方法和由此鉴定和分离的目标物分子中的应用。

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