TWI836556B - 靶向整合素αⅡｂβ３之含組織纖維溶酶原活化劑或其變異體的融合蛋白質及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提出一種融合蛋白質，含有：一組織纖維溶酶原活化劑或其變異體；一去整合蛋白或其變異體；以及一連接子；連接子連接組織纖維溶酶原活化劑或其變異體以及去整合蛋白或其變異體，且包含一如SEQ ID NOs：1至7中任一所示的胺基酸序列。本發明另提出一種利用上述融合蛋白質於治療或預防血栓形成有關之疾病的方法。
Description
本發明關於一種融合蛋白質，且特別攸關一種靶向整合素αIIbβ3之含組織纖維溶酶原活化劑或其變異體的融合蛋白質及此蛋白質的應用，包含：治療或預防血栓形成有關之疾病的方法。
血栓為血小板與纖維蛋白於血管中不正常積蓄形成的血凝塊，其會於循環系統中妨礙或阻斷血液流動，導致無法正常供應身體各部位血液，進而影響正常的生理功能。心肌梗塞、腦栓塞、肺栓塞、深部靜脈血栓、及周圍血管栓塞為血栓導致的常見疾病，其為嚴重危害人類健康的疾病，發病率、致殘率、與致死率均相當高。根據世界衛生組織統計，全球每年約有2600萬人死於血栓相關疾病，遠高於其他死因。
減少血栓的藥物依機制至少分為：抗血小板藥、抗凝血劑、與溶栓劑。抗血小板藥能阻止血小板凝聚成為血凝塊，常見者如：阿斯匹靈(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、與替格瑞洛(ticagrelor)；抗凝血劑能干擾血液蛋白來延長血凝塊形成的時間，常見者如：華法林(warfarin)、利伐沙班(rivaroxaban)、與肝素(heparin)；溶栓劑能降解血凝塊，常見者如：鏈球菌激酶(streptokinase)、
尿激酶(urokinase)、與組織纖維溶酶原活化劑(tissue plasminogen activator，tPA)。雖然以上藥物可使用於血栓的治療，但卻可能伴隨著出血的副作用發生，反而導致其他與出血有關的嚴重疾病，如：腦出血。因此，相關研究人員目前仍致力於如何於降低血栓與解決出血問題之間找到平衡。
組織纖維溶酶原活化劑屬於絲氨酸蛋白酶(serine protease)，其可與纖維蛋白結合並將纖維蛋白溶酶原(plasminogen)轉化成纖維蛋白溶酶(plasmin)，而纖維蛋白溶酶為分解血凝塊的主要酵素之一。基因工程技術實現於體外生產組織纖維溶酶原活化劑，此種基因工程產物又稱作「重組組織纖維溶酶原活化劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)」。此種重組產物可透過多種不同的序列修飾來提升藥物動力與藥效學，特別提升於循環系統的半衰期，進一步提升對纖維蛋白的特異性，從而避免發生多餘的纖溶(fibrinolysis)狀態。常見的重組藥物如：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、與替奈普酶(tenecteplase，TNK)。
阿替普酶具有與人類血管內皮細胞產生的野生組織纖維溶酶原活化劑相同的序列，其為於中國倉鼠卵巢CHO(Chinese hamster ovary)細胞內表現得到的。阿替普酶的半衰期約5分鐘，可適用於缺血性中風、ST段上升的心肌梗塞、及急性大面積肺栓塞等適應症。另外，也可投予至裝有中央靜脈通路裝置的病患。
瑞替普酶為重組人類組織纖維溶酶原活化劑的非醣基化形式，其含有原始蛋白質中的355個胺基酸，且為於大腸桿菌(E.coli)內合成取得的。相較於阿替普酶，瑞替普酶具備相對長的半衰期，約14至18分鐘，故可採用推注給藥，不須如阿替普酶採用輸注給藥。瑞替普酶目前可適用於急性心肌梗塞適應
症。
替奈普酶為人類組織纖維溶酶原活化劑的另一種修飾形式，其為於哺乳動物細胞(如：CHO細胞)內表達取得的。替奈普酶為具有527個胺基酸的醣蛋白，且於對應人類之野生組織纖維溶酶原活化劑的cDNA進行以下修飾所取得：將位置103的蘇胺酸取代為天門冬醯胺，將位置117的天門冬醯胺取代為麩醯胺酸，將位置296至299的胺基酸置換成4個連續丙胺酸，前兩處修飾發生於三環區域(kringle domain)，最後一處修飾則發生於蛋白酶區域。替奈普酶具有更長的半衰期，約20至24分鐘，並可適用於急性心肌梗塞與肺栓塞等適應症。
職是之故，開發一種新穎的溶栓劑，其可於降低出血發生的風險下來達到減少血栓的目的，確實為本發明所屬技術領域之人士積極解決的課題之一。
本發明乃根據以下發現所完成的：將組織纖維溶酶原活化劑與去整合蛋白透過不同胺基酸序列的連接子連結可使去整合蛋白(disintegrin)抑制血小板凝集的活性降低，並仍保有組織纖維溶酶原活化劑原有的溶解血栓活性。藉此，提供一種可於降低出血發生的風險下來降低血栓的候選溶栓藥物。
依此，本發明提出一種融合蛋白質，其包含：一組織纖維溶酶原活化劑或其變異體；一去整合蛋白或其變異體；以及一連接子，其連接組織纖維溶酶原活化劑或其變異體以及去整合蛋白或其變異體，且包含一如SEQ ID NOs：1至7中任一所示的胺基酸序列。
示例地，組織纖維溶酶原活化劑或其變異體的C端連接連接子的N端，去整合蛋白或其變異體的N端連接連接子的C端。
示例地，去整合蛋白或其變異體的C端連接連接子的N端，組織纖維溶酶原活化劑或其變異體的N端連接連接子的C端。
示例地，組織纖維溶酶原活化劑為阿替普酶、瑞替普酶、或替奈普酶。
示例地，組織纖維溶酶原活化劑為替奈普酶。
示例地，組織纖維溶酶原活化劑包含一如SEQ ID NOs：8至10中任一所示的胺基酸序列。
示例地，組織纖維溶酶原活化劑包含一如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
示例地，去整合蛋白為白唇竹葉青素(albolabrin)、食魚複素(applagin)、墨西哥西海岸響尾蛇素(basilicin)、大具窮複蛇素(batroxostatin)、扁頭腹蛇素(bitistatin)、亞利桑那黑響尾蛇素(cereberin)、角響尾蛇素(cerastin)、西部菱背響尾蛇素(crotatroxin)、南美響尾蛇素(durissin)、華剛蛇毒素(elegantin)、扁鼻蝮素(eristicophin)、黃綠竹葉青蛇素(flavoridin)、黃綠竹葉青抑制素(flavostatin)、白眉複素(halysin)、哈裡氏複抑制素(halystatin)、美洲矛頭複蛇素(jararacin)、美洲矛頭複蛇抑制素(jarastatin)、複蛇毒素(kistrin)、葉林腹素(lachesin)、大盆地響尾蛇素(lutosin)、黑尾響尾蛇素(molossin)、馬來亞蝮蛇毒蛋白(rhodostomin)、白眉複蟲它素(salmosin)、哈裡氏複素(saxatilin)、大草原響尾蛇素(tergeminin)、黃綠竹葉青蛇毒素(trimestatin)、原矛頭複素(trimucrin)、原矛頭複素酶(trimutase)、烏蘇裡複蛇素(ussuristatin)、或霍皮響尾蛇素(viridian)。
示例地，去整合蛋白為馬來亞蝮蛇毒蛋白或原矛頭複素。
示例地，去整合蛋白的變異體包含：一連接區域，包含一如SEQ ID NOs：11至15中任一所示的胺基酸序列；一RGD結構基序(RGD motif)，包含一如SEQ ID NOs：16至28中任一所示的胺基酸序列；以及一C端區域，包含一如SEQ ID NOs：29至33中任一所示的胺基酸序列。
示例地，連接區域包含一如SEQ ID NO：11或15所示的胺基酸序列。
示例地，連接區域包含一如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
示例地，RGD結構基序包含一如SEQ ID NOs：17至21、24至26中任一所示的胺基酸序列。
示例地，RGD結構基序包含一如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
示例地，C端區域包含一如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
示例地，去整合蛋白變異體包含一如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
示例地，融合蛋白質包含一如SEQ ID NOs：35至42中任一所示的胺基酸序列。
示例地，融合蛋白質用於結合至整合素αIIbβ3及纖維蛋白。
由於纖維蛋白為血凝塊的主要組成之一，故本發明的融合蛋白質可結合至血栓處的纖維蛋白，並將纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶，使纖維蛋白溶酶將纖維蛋白降解成FDP(fibrin-fibrinogen degradation product)，以達溶解血栓的功效。另外，由於整合素αIIbβ3大量表現於血小板及其前驅細胞(請見J Hematol Oncol.2019 Mar 7；12(1)：26)，故本發明的融合蛋白質同時可結合至血
栓處的血小板整合素αIIbβ3，以抑制血小板凝集，從而避免大塊血栓再形成。此外，本發明之融合蛋白質對血小板凝集的抑制活性低於去整合蛋白或其變異體，故可降低出血發生的風險。藉此，本發明的融合蛋白質可於降低出血發生的風險下來減少血栓，成為一種極具臨床應用潛力的溶栓劑。
本發明另提出一種醫藥組合物，其包含：如上所述的融合蛋白質；以及一醫藥上可接受的載體。
示例地，醫藥組合物為口服投予配製物、注射投予配製物、吸入投予配製物、或局部或經皮投予配製物。
示例地，以醫藥組合物的總體積為基準，融合蛋白質的體積莫爾濃度為1至1400nM。
本發明又提出一種上述醫藥組合物的用途，其為用於製備治療或預防血栓形成有關之病症並降低出血發生之風險的醫藥。
示例地，血栓形成有關的病症為靜脈血栓病症(venous thrombosis)或動脈血栓病症(arterial thrombosis)。
示例地，靜脈血栓病症為分支性視網膜靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion)、巴德-希亞利症候群(Budd-Chiari syndrome)、海棉竇血栓形成(cavernous sinus thrombosis)、中心性視網膜靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、顱內靜脈竇血栓(cerebral venous sinus thrombosis)、深層靜脈栓塞(deep vein thrombosis)、頸內靜脈栓塞(jugular vein thrombosis)、腸繫膜靜脈栓塞(mesenteric vein thrombosis)、培基特-施羅特病症(Paget-Schroetter disease)、反常栓塞(parodoxical embolism)、肝門靜脈栓塞(portal vein thrombosis)、肺栓塞(pulmonary embolism)、腎靜脈栓塞(renal vein thrombosis)、或脾靜脈栓
塞(splenic vein thrombosis)。
示例地，動脈血栓病症為肝動脈栓塞(hepatic artery thrombosis)、肢體缺血(limb ischemia)、心肌梗塞(myocardial infarction)、或中風(stroke)。
本發明更提出一種治療或預防血栓形成有關之病症的方法，其包含：投予如上所述的醫藥組合物至一有此需求的個體，藉此溶解血栓並降低出血發生的風險。
示例地，血栓形成有關的病症為靜脈血栓病症或動脈血栓病症。
示例地，靜脈血栓病症為分支性視網膜靜脈阻塞、巴德-希亞利症候群、海棉竇血栓形成、中心性視網膜靜脈阻塞、顱內靜脈竇血栓、深層靜脈栓塞、頸內靜脈栓塞、腸繫膜靜脈栓塞、培基特-施羅特病症、反常栓塞、肝門靜脈栓塞、肺栓塞、腎靜脈栓塞、或脾靜脈栓塞。
示例地，動脈血栓病症為肝動脈栓塞、肢體缺血、心肌梗塞、或中風。
示例地，投予每公斤個體體重0.1至1000毫克的融合蛋白質至個體。
本發明又提出一種核酸，其包含用於編碼如上所述之融合蛋白質的核苷酸序列。
本發明再提出一種宿主細胞，其包含如上所述的核酸。
示例地，宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
示例地，原核細胞為大腸桿菌。
示例地，真核細胞為CHO細胞、COS細胞、或HEK293細胞。
本發明尚提出一種製備如上所述之融合蛋白質的方法，其包含培
養如上所述的宿主細胞使其表現如上所述的融合蛋白質。
圖1為流程示意圖，呈現蛋白質TNK-G9-RR之表現構築體的製備。
圖2A為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK的分離純化結果。
圖2B為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-G9-RR的分離純化結果。
圖2C為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-(G4S)3-RR的分離純化結果。
圖2D為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-(PA)3-RR的分離純化結果。
圖2E為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-(PA)5-RR的分離純化結果。
圖2F為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-(PA)7-RR的分離純化結果。
圖2G為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-EA3K(G4S)2-RR的分離純化結果。
圖2H為液相層析結果圖，說明蛋白質TNK-(EA3K)3-RR的分離純化結果。
圖2I為液相層析結果圖，說明蛋白質RR-(PA)5-TNK的分離純化結果。
圖3A與3B各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3C與3D各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-G9-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3E與3F各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-
PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-(G4S)3-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3G與3H各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-(PA)3-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3I與3J各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-(PA)5-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3K與3L各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-(PA)7-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3M與3N各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-EA3K(G4S)2-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3O與3P各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質TNK-(EA3K)3-RR的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，
「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖3Q與3R各為非還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖與還原型Tris-glycine SDS-PAGE照片圖，呈現蛋白質RR-(PA)5-TNK的分離純化結果；其中符號「M」表示蛋白質標誌，「LS」表示載入樣本(20μL)，「FT」表示通流樣本(250μL)，「阿拉伯數字」各表示分液編號。
圖4A為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK於不同濃度下的溶栓率。
圖4B為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-G9-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4C為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-(G4S)3-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4D為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-(PA)3-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4E為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-(PA)5-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4F為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-(PA)7-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4G為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-EA3K(G4S)2-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4H為溶解血栓結果圖，說明蛋白質TNK-(EA3K)3-RR於不同濃度下的溶栓率。
圖4I為溶解血栓結果圖，說明蛋白質RR-(PA)5-TNK於不同濃度下的溶栓率。
圖5為長條圖，說明不同蛋白質於濃度7.0nM下溶解50%血栓所需的時間。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：
一、術語的定義
本文所指的「蛋白質」若無特殊定義下，包含天然細胞表現的野生蛋白質、利用基因工程技術表達的重組蛋白質、或利用化學方式取得的合成蛋
白質。於不影響原有的活性下，可於蛋白質序列中取代、刪除、且/或插入至少一個胺基酸。
本文所指的「胺基酸」若無特殊定義下，包含D-胺基酸或L-胺基酸。D-與L-表示胺基酸的絕對構型，而非平面偏光的特定旋轉方向。若無特殊情況下，本文採用IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推薦的單字母符號來表示胺基酸。蛋白質序列由多個單字母符號組成的字串表示，單字母符號順序對應胺基酸自蛋白質N端至C端之方向的順序。若單字母符號之前有上標數字，其表示對應胺基酸位於蛋白質自N端起算的位置順序；舉例而言，67PRNGLYG表示脯胺酸位於蛋白質的位置67；其餘以此類推，不再贅述。若單字母符號之後有下標數字，其表示對應胺基酸或對應胺基酸群的重複數目；舉例而言，G9表示9個連續的甘胺酸連接在一起；又舉例而言，(G4S)3表示3組連續之甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸組成的胺基酸群連接在一起；其餘以此類推，不再贅述。
蛋白質序列的取代、刪除、及/或插入可發生於蛋白質的非骨架區域，此通常不影響原有的活性。另外，蛋白質序列的取代可包含保留性胺基酸的取代，保留性取代意指具有相似特性或相關側鏈之胺基酸間的取代。相似特性之胺基酸間的取代，例如：酸性胺基酸可互相替代，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；鹼性胺基酸可互相替代，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、與組胺酸(histidine)；非極性胺基酸可互相替代，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、與色胺酸(tryptophan)；非帶電極性胺基酸可互相替代，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、
麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、與酪胺酸(tyrosine)。相關側鏈之胺基酸間的取代，例如：脂肪羥基類(aliphatic-hydroxy)胺基酸可互相替代，即絲胺酸與蘇胺酸；含醯胺類胺基酸(amide-containing)胺基酸可互相替代，即天門冬醯胺與麩醯胺酸；脂肪類胺基酸可互相替代，即丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、與異白胺酸；芳香類(aromatic)胺基酸可互相替代，即苯丙胺酸、色胺酸、與酪胺酸。
本文所指的「組織纖維溶酶原活化劑」若無特殊定義下，包含野生型或重組型組織纖維溶酶原活化劑，野生型如：由人類血管內皮細胞產生的組織纖維溶酶原活化劑，重組型如：阿替普酶(SEQ ID NO：8)、瑞替普酶(SEQ ID NO：9)、或替奈普酶(SEQ ID NO：10)。
本文所指的「去整合蛋白」若無特殊定義下，係指於毒蛇唾液中找到的血小板凝集抑制劑，通常含有47至84個胺基酸及4至7個雙硫鍵，如：白唇竹葉青素、食魚複素、墨西哥西海岸響尾蛇素、大具窮複蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華剛蛇毒素、扁鼻蝮素、黃綠竹葉青蛇素、黃綠竹葉青抑制素、白眉複素、哈裡氏複抑制素、美洲矛頭複蛇素、美洲矛頭複蛇抑制素、複蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、馬來亞蝮蛇毒蛋白、白眉複蟲它素、哈裡氏複素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭複素、原矛頭複素酶、烏蘇裡複蛇素、或霍皮響尾蛇素。
本文所指的「變異體」若無特殊定義下，係指於不影響原有活性下對參考序列(reference sequence)中取代、刪除、且/或插入至少一個胺基酸得到的修飾蛋白質。舉例而言，去整合蛋白的變異體包含馬來亞蝮蛇毒蛋白的變異
體或原矛頭複素的變異體，其可如野生型去整合蛋白結合至整合素αIIbβ3來抑制血小板凝集。變異體可與參考序列之間具有至少95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、或60%的序列相似度，相似度可依不同條件定義為間隔排除相似度(gap-excluded identity)、BLAST相似度(BLAST identity)、或間隔壓縮相似度(gap-compressed identity)。BLAST相似度可自國家生物技術資訊中心提供的Basic Local Alignment Search Tool計算取得。舉例而言，本文所用之原矛頭複素變異體RR與野生型原矛頭複素之間具有至少95%的BLAST相似度。
本文所指的「RGD結構基序」若無特殊定義下，係指去整合蛋白中精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸構成的撓性環頂部，其為整合素結合區域。舉例而言，野生型原矛頭複素的RGD結構基序包含50ARGDNP，野生型馬來亞蝮蛇毒蛋白的RGD結構基序包含48PRGDMP。參照前文，原矛頭複素變異體的RGD結構基序可相對於野生型原矛頭複素的RGD結構基序序列50ARGDNP具有至少一個胺基酸的突變，且不影響功能，如：SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26；馬來亞蝮蛇毒蛋白變異體的RGD結構基序可相對於野生型馬來亞蝮蛇毒蛋白的RGD結構基序序列48PRGDMP具有至少一個胺基酸的突變，且不影響功能，如：SEQ ID NO：27或28。
本文所指的「連接區域」若無特殊定義下，係指去整合蛋白中緊鄰RGD結構基序之N端的區域，通常為位置38至47之胺基酸的任意連續片段。舉例而言，野生型原矛頭複素的連接區域包含41KKKRT(SEQ ID NO：11)，野生型馬來亞蝮蛇毒蛋白的連接區域包含39SRAGK(SEQ ID NO：12)。參照前文，原矛頭複素變異體的連接區域可相對於野生型原矛頭複素的連接區域序列41KKKRT具有至少一個胺基酸的突變，且不影響功能，如：SEQ ID NO：13、14、
或15。
本文所指的「C端區域」若無特殊定義下，係指去整合蛋白中緊鄰RGD結構基序之C端的區域。舉例而言，野生型原矛頭複素的C端區域包含67PRNGLYG(SEQ ID NO：29)，野生型馬來亞蝮蛇毒蛋白的C端區域包含65PRYH(SEQ ID NO：30)。參照前文，原矛頭複素變異體的C端區域可相對於野生型原矛頭複素的C端區域67PRNGLYG具有至少一個胺基酸的突變，且不影響功能，如：SEQ ID NO：31、32、或33。
本文所指的「去整合蛋白變異體」若無特殊定義下，包含相對於野生型RGD結構基序中至少一胺基酸突變得到的序列、相對於野生型連接區域中至少一胺基酸突變得到的序列、及/或相對於野生型C端區域中至少一胺基酸突變得到的序列，如：SEQ ID NO：34。
本文所指的「治療」若無特殊定義下，係指治療性介入以治癒或改善血栓病症，即包含完全或局部治癒或改善。
本文所指的「預防」若無特殊定義下，係指完全地或近乎完全地防止血栓病症。舉例而言，於未有血栓或有輕微血栓但尚未造成病症時，可預防性介入以避免病症發生。
本文所指的「醫藥上可接受的載體」若無特殊定義下，係指於健全的醫療判斷範圍內，適合與個體接觸且無過量毒性、刺激性、過敏反應、或其他問題或併發症，並具有合理利弊比例的添加物，如：填充劑、稀釋劑、凝集劑、接合劑、潤滑劑、助流劑、穩定劑、著色劑、潤濕劑、或崩解劑。
二、融合蛋白質
本發明的第一實施方式提供一種融合蛋白質，其可同時結合至血
栓處的纖維蛋白與血小板整合素αIIbβ3。與纖維蛋白的結合可將纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶，使纖維蛋白溶酶將纖維蛋白降解成FDP，以達到溶解血栓的效果。另外，與整合素αIIbβ3的結合可抑制血小板凝集，以達到避免大塊血栓再形成的效果；然而，本實施方式之融合蛋白質與整合素αIIbβ3結合造成的抑制血小板凝集活性低於僅含去整合蛋白或其變異體的蛋白質，以達到降低出血發生的風險。基於以上特性，本實施方式的融合蛋白質可用於溶解血栓並降低出血發生的風險；申言之，其可用於治療血栓疾病且降低出血發生的風險。
本實施方式的融合蛋白質包含：一組織纖維溶酶原活化劑或其變異體、一去整合蛋白或其變異體、以及一連接子；連接子連接組織纖維溶酶原活化劑或其變異體以及去整合蛋白或其變異體，且包含一如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、或7所示的胺基酸序列。融合蛋白質自N端至C端依序可包含組織纖維溶酶原活化劑或其變異體、連接子、以及去整合蛋白或其變異體，或可包含去整合蛋白或其變異體、連接子、以及組織纖維溶酶原活化劑或其變異體。具體而言，組織纖維溶酶原活化劑或其變異體的C端可連接連接子的N端，去整合蛋白或其變異體的N端可連接連接子的C端；或是，去整合蛋白或其變異體的C端可連接連接子的N端，組織纖維溶酶原活化劑或其變異體的N端可連接連接子的C端。此處「連接」不限直接或間接連接，亦即連接在一起的蛋白質之間可有或可沒有其他的連接片段。較佳地，融合蛋白質包含一如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、或42所示的胺基酸序列。
組織纖維溶酶原活化劑依種類而言可為阿替普酶、瑞替普酶、或替奈普酶，較佳地為替奈普酶。
組織纖維溶酶原活化劑依序列而言可包含一如SEQ ID NO：8、9、
或10所示的胺基酸序列，較佳地包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
去整合蛋白依種類而言可為白唇竹葉青素、食魚複素、墨西哥西海岸響尾蛇素、大具窮複蛇素、扁頭腹蛇素、亞利桑那黑響尾蛇素、角響尾蛇素、西部菱背響尾蛇素、南美響尾蛇素、華剛蛇毒素、扁鼻蝮素、黃綠竹葉青蛇素、黃綠竹葉青抑制素、白眉複素、哈裡氏複抑制素、美洲矛頭複蛇素、美洲矛頭複蛇抑制素、複蛇毒素、葉林腹素、大盆地響尾蛇素、黑尾響尾蛇素、馬來亞蝮蛇毒蛋白、白眉複蟲它素、哈裡氏複素、大草原響尾蛇素、黃綠竹葉青蛇毒素、原矛頭複素、原矛頭複素酶、烏蘇裡複蛇素、或霍皮響尾蛇素。較佳地，去整合蛋白為馬來亞蝮蛇毒蛋白或原矛頭複素。
去整合蛋白變異體依序列而言可包含：一連接區域、一RGD結構基序、以及一C端區域；連接區域包含一如SEQ ID NO：11、12、13、14、或15所示的胺基酸序列，RGD結構基序包含一如SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28所示的胺基酸序列，C端區域包含一如SEQ ID NO：29、30、31、32、或33所示的胺基酸序列。
較佳地，連接區域包含如SEQ ID NO：11或15所示的胺基酸序列。更佳地，連接區域包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
較佳地，RGD結構基序包含如SEQ ID NO：17、18、19、20、21、24、25、或26所示的胺基酸序列。更佳地，RGD結構基序包含如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
較佳地，C端區域包含如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
較佳地，去整合蛋白變異體包含一如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
本實施方式的融合蛋白質可透過基因工程技術或化學方式製備，化學方式如：固相合成或溶液合成。可於後續採用硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、離子交換層析、親和層析、或凝集素層析等方法分離取得或純化本實施方式的融合蛋白質，較佳地採用高效液相層析。
本實施方式的融合蛋白質更可具有一親水性基團，藉以提升水溶性或循環半衰期。親水性基團可連接融合蛋白質的N端。較佳地，親水性基團為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、或聚葡萄醣。更佳地，親水性基團為2至20個乙二醇重複單元組成的聚乙二醇。
本實施方式的融合蛋白質更可含有一純化標籤，藉以協助純化。純化標籤可連接融合蛋白質的N端或C端。較佳地，純化標籤為組胺酸標籤(His-tag)、谷胱甘肽S-轉移酶標籤(GST-tag)、麥芽糖結合蛋白標籤(MBP-tag)、轉錄終止/抗終止蛋白(NusA-tag)、或小泛素相關修飾物標籤(SUMO-tag)。
三、醫藥組合物
本發明的第二實施方式提供一種醫藥組合物，其含有第一實施方式的融合蛋白質，故可投予至有溶栓需求的個體，以於溶解血栓的同時可降低出血發生的風險。本實施方式的醫藥組合物包含：第一實施方式的融合蛋白質、以及一醫藥上可接受的載體。
一般而言，醫藥上可接受的載體可使醫藥組合物整體呈現不同型態或適用於不同投藥途徑。較佳地，醫藥組合物為口服投予配製物、注射投予配製物、吸入投予配製物、或局部或經皮投予配製物，以使用於不同投藥途徑。較佳地，醫藥組合物為錠劑、膠囊、顆粒劑、散劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、或乳劑。本實施方式的醫藥組合物也可塗覆於如支架或導管等植入式醫療裝置，以
於植入裝置避免血管再狹窄、或支持、強化血管的功效時一併進行溶解血栓的作用。本實施方式的醫藥組合物更可含有其他減少血栓的藥劑，如：抗血小板藥或抗凝血劑。抗血小板藥的實例可為阿斯匹靈、氯吡格雷、或替格瑞洛，抗凝血劑的實例可為華法林、利伐沙班、或肝素。
醫藥上可接受的載體可為賦形劑、填充劑、稀釋劑、凝集劑、接合劑、潤滑劑、助流劑、穩定劑、著色劑、潤濕劑、或崩解劑。賦形劑的實例可為檸檬酸鈉、碳酸鈣、或磷酸鈣，填充劑的實例可為乳糖或高分子量聚乙二醇，稀釋劑的實例可為水、乙醇、丙二醇、或甘油，接合劑的實例可為蔗糖、明膠、或阿拉伯膠，潤滑劑的實例可為硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸鈉、硬脂酸、硬脂酸鋁、白胺酸、山嵛酸甘油酯、或氫化植物油，助流劑的實例可為鋁矽酸鈉、矽酸鈣、微晶纖維素、玉米澱粉、苯甲酸鈉、碳酸鈣、碳酸鎂、滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、月桂基硫酸鎂、或氧化鎂，穩定劑的實例可為檸檬酸或抗壞血酸，著色劑的實例可為二氧化鈦或氧化鐵，潤濕劑的實例可為普朗尼克F68(Pluronic F68)、吐溫20(Tween 20)、或吐溫80(Tween 80)，崩解劑的實例可為馬鈴薯澱粉、樹薯澱粉、或矽酸鹽。
以醫藥組合物的總體積為基準，融合蛋白質的體積莫爾濃度可為1至1400nM。較佳地，以醫藥組合物的總體積為基準，融合蛋白質的體積莫爾濃度為7至1370.7nM。
四、醫藥用途
本發明的第三實施方式提供一種第二實施方式之醫藥組合物的用途，其為用於製備治療或預防血栓形成有關之病症而降低出血發生之風險的醫藥。可投予製備的醫藥至有溶解血栓需求的個體，以於溶解血栓的同時降低出
血發生的風險；亦即，可投予製備的醫藥至有治療或預防血栓形成有關之病症需求的個體，以於達到治療或預防效果的同時降低出血發生的風險。
可採用不同的方式投藥，如：口服給藥、注射給藥、吸入給藥、或局部或經皮給藥。另外，可用每公斤個體體重0.1至1000毫克的融合蛋白質為有效劑量投予至個體。
血栓形成有關的病症可分為靜脈血栓病症或動脈血栓病症。靜脈血栓病症的實例可為分支性視網膜靜脈阻塞、巴德-希亞利症候群、海棉竇血栓形成、中心性視網膜靜脈阻塞、顱內靜脈竇血栓、深層靜脈栓塞、頸內靜脈栓塞、腸繫膜靜脈栓塞、培基特-施羅特病症、反常栓塞、肝門靜脈栓塞、肺栓塞、腎靜脈栓塞、或脾靜脈栓塞，動脈血栓病症的實例可為肝動脈栓塞、肢體缺血、心肌梗塞、或中風。
本發明的第四實施方式提供一種治療或預防血栓形成有關之病症的方法，其包含：投予第二實施方式的醫藥組合物至一有此治療或預防需求的個體，藉此溶解血栓並降低出血發生的風險。
可採用不同方式投藥，如：口服給藥、注射給藥、吸入給藥、或局部或經皮給藥。另外，可用每公斤個體體重0.1至1000毫克的融合蛋白質為有效劑量投予至個體。
血栓形成有關的病症可分為靜脈血栓病症或動脈血栓病症。靜脈血栓病症的實例可為分支性視網膜靜脈阻塞、巴德-希亞利症候群、海棉竇血栓形成、中心性視網膜靜脈阻塞、顱內靜脈竇血栓、深層靜脈栓塞、頸內靜脈栓塞、腸繫膜靜脈栓塞、培基特-施羅特病症、反常栓塞、肝門靜脈栓塞、肺栓塞、腎靜脈栓塞、或脾靜脈栓塞，動脈血栓病症的實例可為肝動脈栓塞、肢體缺血、心
肌梗塞、或中風。
五、其他事項
本發明的第五實施方式提供一種核酸，其包含用於編碼第一實施方式之融合蛋白質的核苷酸序列。為調控蛋白質的表現，核酸更可含有一啟動子，其為可操作地連接編碼融合蛋白質的核苷酸序列。此處「可操作地連接」係指二個或二個以上核酸序列彼此間呈功能關係。
本發明的第六實施方式提供一種宿主細胞，其包含第五實施方式的核酸。由於本實施方式的宿主細胞含有編碼融合蛋白質的核苷酸序列，故可透過培養宿主細胞來生成融合蛋白質。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。原核細胞的實例可為大腸桿菌，真核細胞的實例可為CHO細胞、COS細胞、或HEK293細胞。
本發明的第七實施方式提供一種製備第一實施方式之融合蛋白質的方法，其包含培養第六實施方式的宿主細胞使其表現融合蛋白質。可依啟動子來選擇適當的誘導子誘導細胞表現蛋白質。
茲以下列實施例，例示說明本發明：
實施例1：製備蛋白質
將表現構築體轉染至CHO細胞或酵母菌細胞來表現重組蛋白質。取細胞培養上層液，並以液相層析純化取得重組蛋白質。
以圖1所示之蛋白質TNK-G9-RR的表現構築體為例。利用引子對TNK-F與TNK-G9-R對含TNK核苷酸片段的質體pcDNA3.1進行聚合酶連鎖反應取得含TNK-G9核苷酸片段的質體pcDNA3.1；利用引子對RR-G9-F與RR-R對含RR核苷酸片段的質體pPICZαA進行聚合酶連鎖反應取得含RR核苷酸片段的插
入體；最後，先利用DpnI限制酶處理含TNK-G9核苷酸片段的質體pcDNA3.1與含RR核苷酸片段的插入體，再進行黏合以取得含TNK-G9-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-G9-RR的表現構築體。
依據上述流程進行，除了以引子TNK-(G4S)3-R取代TNK-G9-R且以引子RR-(G4S)3-F取代RR-G9-F外，來取得含TNK-(G4S)3-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-(G4S)3-RR的表現構築體。
依據上述流程進行，除了以引子TNK-(PA)3-R取代TNK-G9-R且以引子RR-(PA)3-F取代RR-G9-F外，來取得含TNK-(PA)3-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-(PA)3-RR的表現構築體。
依據上述流程進行，除了以引子TNK-(PA)5-R取代TNK-G9-R且以引子RR-(PA)5-F取代RR-G9-F外，來取得含TNK-(PA)5-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-(PA)5-RR的表現構築體。
依據上述流程進行，除了以引子TNK-(PA)7-R取代TNK-G9-R且以引子RR-(PA)7-F取代RR-G9-F外，來取得含TNK-(PA)7-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-(PA)7-RR的表現構築體。
依據上述流程進行，除了以引子TNK-EA3K(G4S)2-R取代TNK-G9-R且以引子RR-EA3K(G4S)2-F取代RR-G9-F外，來取得含TNK-EA3K(G4S)2-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-EA3K(G4S)2-RR的表現構築體。
依據上述流程進行，除了以引子TNK-(EA3K)3-R取代TNK-G9-R且以引子RR-(EA3K)3-F取代RR-G9-F外，來取得含TNK-(EA3K)3-RR核苷酸片段的質體pcDNA3.1作為蛋白質TNK-(EA3K)3-RR的表現構築體。
上述所提之引子的核苷酸序列列於表1。
蛋白質TNK的液相層析分析結果呈現於圖2A，圖3A與3B進一步佐證蛋白質TNK自分液27、28、29、30、33、34取得。
蛋白質TNK-G9-RR的液相層析分析結果呈現於圖2B，圖3C與3D進一步佐證蛋白質TNK-G9-RR自分液9、10、11取得。
蛋白質TNK-(G4S)3-RR的液相層析分析結果呈現於圖2C，圖3E與3F進一步佐證蛋白質TNK-(G4S)3-RR自分液15取得。
蛋白質TNK-(PA)3-RR的液相層析分析結果呈現於圖2D，圖3G與3H進一步佐證蛋白質TNK-(PA)3-RR自分液12、13、21、22取得。
蛋白質TNK-(PA)5-RR的液相層析分析結果呈現於圖2E，圖3I與3J進一步佐證蛋白質TNK-(PA)5-RR自分液27、28、29取得。
蛋白質TNK-(PA)7-RR的液相層析分析結果呈現於圖2F，圖3K與3L進一步佐證蛋白質TNK-(PA)7-RR自分液33、34、35、36、37、39取得。
蛋白質TNK-EA3K(G4S)2-RR的液相層析分析結果呈現於圖2G，圖
3M與3N進一步佐證蛋白質TNK-EA3K(G4S)2-RR自分液27、28、29、30、31取得。
蛋白質TNK-(EA3K)3-RR的液相層析分析結果呈現於圖2H，圖3O與3P進一步佐證蛋白質TNK-(EA3K)3-RR自分液28、29、30、31、32取得。
蛋白質RR-(PA)5-TNK的液相層析分析結果呈現於圖2I，圖3Q與3R進一步佐證蛋白質RR-(PA)5-TNK自分液21、22、23、24取得。
上述所提之蛋白質的胺基酸序列列於表2，各蛋白質的產率列於表3。可知蛋白質TNK、蛋白質RR與其他含TNK的融合蛋白質均可達到一定產量。
實施例2：溶解血栓測試
進行全血血栓溶解盤分析。自健康個體收集血液，並將血液與3.8%檸檬酸三鈉以9：1的比例混合。於HEPES緩衝液(25mM HEPES、137mM氯化鈉)中加入凝血酶(6.25×10-3U)與氯化鈣(250mM)，以得到凝血混合物。將5μL凝血混合物沉積至96孔微孔盤的孔底邊緣，然後添加25μL血液混合液。將微孔盤密封，並於37℃下作用30分鐘，使血栓形成於孔底邊緣。
將各個蛋白質依不同目標濃度配置成為70μL HEPES溶液。於室溫下將蛋白質溶液加入至含有血栓的孔中並放入37℃恆溫ELISA測讀儀反應120分鐘。於反應過程中，每分鐘震動1次(200rpm)，並利用ELISA測讀儀每隔3分鐘測量波長510nm吸光值1次。由於反應時溶解的血栓會流動覆蓋孔的中心位置，故透過510nm吸光值可決定溶解50%血栓所需的時間(T0.5，分鐘)。藉此，可
決定血栓的溶解程度。
請參照圖4A至4I，呈現各個蛋白質於不同濃度下的溶解血栓活性。此外，表4呈現不同濃度下各個蛋白質溶解50%血栓所需的時間。
請進一步參照圖5與表5，呈現濃度7.0nM下各個蛋白質溶解50%血栓所需的時間。由上可知，已知的溶栓劑TNK與各個含有TNK的融合蛋白質均可溶解血栓。
實施例3：血小板凝集抑制測試
收集至少兩星期未接受任何藥物治療之個體的靜脈血液10ml，將靜脈血液與3.13%檸檬酸鈉(pH7.4)以9：1的比例混合。轉速1000rpm離心血液樣本10分鐘，收集上清液取得富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)。剩下部
分再以轉速4000rpm離心10分鐘，收集上清液取得血小板稀少血漿(platelet-poor plasma，PPP)。另外，將蛋白質依不同目標濃度溶解於R+E緩衝液(含2.5mM Tris、1.5mM氯化鈉、50mM精胺酸、與50mM麩胺酸)。然後，將190μL PRP與10μL PBS緩衝液或10μL蛋白質溶液混合，並於37℃下使用凝集儀(HTracer 601，Nikoh Bioscience，Tokyo，Japan)作用1分鐘。進一步添加10μL 200μM二磷酸腺苷以經光透射監測血小板凝集反應。得到的血小板凝集數據表示相對於對照值之抑制百分比的平均值。
請參照表6，呈現不同蛋白質抑制血小板凝集的能力。相對已知的血小板凝集抑制劑原矛頭複素變異體RR，各融合蛋白質均具有較低的抑制血小板凝集能力。
綜上所述，證實本發明的融合蛋白質可於降低出血發生的風險下來達到減少血栓，故具有作為候選溶栓藥物的潛力。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
Claims (10)
- 一種融合蛋白質，係包括：一組織纖維溶酶原活化劑，係由一如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列所組成；一去整合蛋白變異體，係由一如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列所組成；以及一連接子，係連接該組織纖維溶酶原活化劑以及該去整合蛋白變異體，且該連接子係由一如SEQ ID NOs：1至7中任一所示的胺基酸序列所組成。
- 如請求項1所述之融合蛋白質，其中該組織纖維溶酶原活化劑的C端連接該連接子的N端，該去整合蛋白變異體的N端連接該連接子的C端；或該去整合蛋白變異體的C端連接該連接子的N端，該組織纖維溶酶原活化劑的N端連接該連接子的C端。
- 如請求項1所述之融合蛋白質，其中該組織纖維溶酶原活化劑為替奈普酶。
- 如請求項1所述之融合蛋白質，其係用於結合至整合素αIIbβ3及纖維蛋白。
- 如請求項1所述之融合蛋白質，其中該去整合蛋白變異體為原矛頭複素(trimucrin)變異體。
- 如請求項1所述之融合蛋白質，係由一如SEQ ID NOs：35至42中任一所示的胺基酸序列所組成。
- 一種醫藥組合物，係包括：一如請求項1至6中任一所述的融合蛋白質；以及 一醫藥上可接受的載體。
- 一種如請求項7所述之醫藥組合物的用途，其係用於製備治療或預防血栓形成有關之病症並降低出血發生之風險的醫藥。
- 如請求項8所述之用途，其中該血栓形成有關之病症為靜脈血栓病症(venous thrombosis)或動脈血栓病症(arterial thrombosis)。
- 如請求項9所述之用途，其中該靜脈血栓病症為分支性視網膜靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion)、巴德-希亞利症候群(Budd-Chiari syndrome)、海棉竇血栓形成(cavernous sinus thrombosis)、中心性視網膜靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、顱內靜脈竇血栓(cerebral venous sinus thrombosis)、深層靜脈栓塞(deep vein thrombosis)、頸內靜脈栓塞(jugular vein thrombosis)、腸繫膜靜脈栓塞(mesenteric vein thrombosis)、培基特-施羅特病症(Paget-Schroetter disease)、反常栓塞(parodoxical embolism)、肝門靜脈栓塞(portal vein thrombosis)、肺栓塞(pulmonary embolism)、腎靜脈栓塞(renal vein thrombosis)、或脾靜脈栓塞(splenic vein thrombosis)，該動脈血栓病症為肝動脈栓塞(hepatic artery thrombosis)、肢體缺血(limb ischemia)、心肌梗塞(myocardial infarction)、或中風(stroke)。
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Patent Citations (3)
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| Title |
|---|
| 期刊 Yan et al., "Design and characterization of a platelet-targeted plasminogen activator with enhanced thrombolytic and antithrombotic potency" Biotechnol. Appl. Biochem., 46, John Wiley & Son, 2007, p. 115–125 * |
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