JP2003511034A - フィブリン溶解活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インビボでの血餅溶解に有用なフィブリン溶解活性メタロプロティナーゼポリペプチド（「新規作用性血栓溶解性物質」と呼ぶ）、および組換え発現によってそれを生産する方法および材料を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、非自然発生配列のフィブリン溶解活性メタロプロティナーゼ、それ
を製造するための組換え法、およびインビボでの血栓症治療におけるその使用に
関する。

【０００２】 （発明の背景） フィブロラーゼは、２０３のアミノ酸残基から成る酵素活性ポリペプチド（特
に、メタロプロティナーゼ）であり、元々、サザンカパーヘッドスネーク（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ Ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ ｓｎａｋｅ）の毒液から精製により分離
されたものである；１９８６年９月９日発行の米国特許第４，６１０，８７９号
（Ｍａｒｋｌａｎｄら；およびＧｕａｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２８９巻，２号，１９７〜
２０７頁（１９９１）。この酵素は、出血活性をほとんどまたはまったく伴わな
いフィブリン溶解活性を指示し、またフィブリノーゲンまたは全血のいずれかか
ら造られた血餅を溶解する。

【０００３】 フィブロラーゼのアミノ酸配列は、酵母での組換え生産について述べられた方
法およびインビボでの血栓塞栓症状態の治療のための使用と共に決定されている
。；Ｒａｎｄｏｌｏｐｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２），５９０〜６００頁、お
よび１９８９年７月１２日に公開された欧州特許出願第０ ３２３ ７２２号（
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら）。

【０００４】 （発明の開示）判断 本発明は、配列番号１に示すアミノ酸の非自然発生線状配列を有する、本明細
書中では「新規作用性血栓溶解性物質」（または、「ＮＡＴ」）とも呼ぶ繊維素
溶解性メタロプロティナーゼを提供する。配列番号２の中の一つなどの核酸分子
およびＮＡＴをコードするその変異体も提供する。

【０００５】 用語「成熟」は、通常の意味で用いられる、宿主細胞内にてインシトゥーで酵
素処理されて、プレプロ領域から開裂された生物学的に活性なポリペプチドにつ
い言う。

【０００６】 そのフィブリン溶解活性のために、ＮＡＴは、動物（ラット、ブタおよびヒト
を含む）の血栓症を治療するための血餅溶解薬としてインビボで有用である。

【０００７】 本発明のＮＡＴポリペプチドは、治療薬として自然発生フィブロラーゼ（すな
わち、蛇毒において見られるフィブリン溶解性ポリペプチド）を超える利点を提
供する。天然フィブロラーゼは、いくつかの代替的Ｎ−末端、すなわち、ＱＱＲ
ＦＰ、ＥＱＲＦＰおよびＥＲＦＰ（ここで、「Ｅ」は、環化グルタミン、または
ピログルタミン酸を示す）、を含むことが知られている。より詳細には、ＱＱＲ
ＦＰから成るＮ−末端で始まり、フィブロラーゼ分子が分解されて、ＥＱＲＦＰ
およびＥＲＦＰのＮ−末端配列をそれぞれ有する二つの異性体を生じる。酵母内
で生産されるような組換えフィブロラーゼは、典型的に、これら３つすべての型
の混合物を生じ、従って、均質ではない。Ｌｏａｙｚａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｂ ６２２，２２７〜２４３頁（１９９４
）を参照のこと。さらに、環化グルタミン残基によって、配列決定することを不
可能にする「ブロックされた」Ｎ−末端が生じる。

【０００８】 これに反し、本発明の組換えＮＡＴは、単一種を提供する。すなわち典型的に
は、ただ一つのＮ−末端が生産される。その結果、組換えフィブロラーゼと比較
して、最終製品の均質性が非常に優れており、これは、目的とする最終使用が医
療用途である時、有益である。

【０００９】 （図の簡単な説明） 図１は、「シグナル」ペプチドを含む「プレプロ」領域（下線あり）、および
成熟ポリペプチド（下線なし）から成るＮＡＴの完全アミノ酸配列（配列番号３
）を線状型で示す。

【００１０】 （発明の詳細な説明） ＮＡＴは、ヌクレオチド１〜７８３のプレプロ領域およびヌクレオチド７８４
〜１３８６の成熟ポリペプチドを含むＮＡＴの完全アミノ酸配列（配列番号３）
をコードする配列番号４の核酸分子を、適する宿主内で組換え発現することによ
って生産することができる。発現に続いて、プレプロ領域は宿主細胞内で酵素処
理されて、成熟活性ポリペプチド（配列番号１）を生じる。

【００１１】 さらに以下でより詳細に説明するように、好ましくは、ＮＡＴは、酵母内での
組換えによって生産される。

【００１２】 このようにして生産される成熟ポリペプチド（配列番号１）は、それを調製す
る方法に依存してアミノ末端メチオニンを有することもあるし、有さないことも
ある。典型的には、宿主としての非分泌型細菌（例えば、大腸菌）株内でポリペ
プチドを組換えによって生産する時には、アミノ末端メチオニン残基が存在する
であろう。

【００１３】 配列番号２の核酸分子に加えて、同じポリペプチドをコードするそれらの縮重
配列も利用できる。本発明は、「天然」プレ／プロ領域（すなわち、自然発生フ
ィブロラーゼ中で見られるもの）の代わりに代替的プレ／プロ領域をコードする
配列（すなわち、細胞膜を通過するポリペプチドの分泌に対応できる配列）など
の、成熟ポリペプチドをコードする領域の５’または３’部分に隣接する追加の
アミノ酸残基をコードすることができる核酸配列分子も包含する。追加の配列は
、宿主細胞に依存して転写または翻訳のプロモーターなどの調節配列を含む非コ
ード配列であってもよい。

【００１４】 ＮＡＴは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
，ＮＹ（１９８９）および／またはＡｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）に記載されているものなどのよく知
られている組換えＤＮＡ生産技術を用いて調製することができる。本ポリペプチ
ドまたはその先端切断種をコードするＤＮＡ分子は、例えば、ゲノムまたはｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってまたはＰＣＲ増幅によって
、フィブロラーゼをコードする核酸分子を得、続いてＮ−末端アミノ酸残基ＱＱ
Ｒをコードするコドンをセリン（Ｓ）で置換することにより、得ることができる
。あるいは、ＮＡＴをコードするＤＮＡ分子は、Ｅｎｇｅｌｓらによって、Ａｎ
ｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８巻，７１６〜７３４頁（１９８９）
に記載されているものなどの当業者によく知られている方法を用いる化学合成に
よって調製することができる。典型的には、ＤＮＡの長さは、数百ヌクレオチド
であろう。これらと同じ方法を用いて約百ヌクレオチドより大きい核酸をいくつ
かの断片として合成することができ、そしてそれらの断片を互いに連結して、所
望の長さのヌクレオチド配列を形成することができる。

【００１５】 適する宿主細胞内で発現させるために、ＤＮＡ分子を適切な発現ベクターに挿
入する。ベクターは、用いる特定の宿主細胞内で機能しうる（すなわち、ＤＮＡ
の発現が発生しうるように、ベクターが、宿主細胞機構と適合性である）ように
、選択する。ポリペプチドは、原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）または
真核宿主細胞内で発現させることができるが、以下でより詳細に説明するように
、酵母が好ましい。

【００１６】 ＮＡＴを発現するためにあらゆる宿主細胞内で用いられるベクターは、５’隣
接配列（「プロモーター」とも呼ばれる）および発現されるべきＤＮＡに機能す
るように結合されたその他の発現調節要素、ならびにエンハンサー、複製要素オ
リジン、転写終結要素、スプライス供与体部位および受容体部位を含有する完全
イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボゾーム結合部位要素、ポリアデニ
ル化配列、ＮＡＴをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および
選択可能なマーカー要素も含有することができる。これらの要素の各々を以下で
論議する。

【００１７】 任意に、ベクターは、「タグ」配列（すなわち、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓな
ど））または別の小さな免疫原性配列（ｃ−ｍｙｃまたは血液凝集素エピトープ
など、これらのためのモノクローナル抗体を含む抗体は、市販されている）をコ
ードするポリペプチドコード配列の５’および３’末端に配置されたオリゴヌク
レオチド配列も含有することができる。このタグは、ＮＡＴと共に発現され、宿
主細胞からこのポリペプチドを精製するための親和性タグとして役割を果たすこ
とができる。場合によっては、このタグは、多様な手段（例えば、選択性ペプチ
ダーゼの使用）によって、精製されたポリペプチドから、後で除去することがで
きる。

【００１８】 ５’隣接配列は、天然５’隣接配列であってもよいし、または同種由来配列（
すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株からのもの）、異種由来配列（す
なわち、宿主細胞種または株以外の種からのもの）、ハイブリッド配列（すなわ
ち、一つ以上の源からの５’隣接配列の組合せ）であってもよいし、または合成
配列であってもよい。５’隣接配列の源は、いかなる単細胞原核生物または真核
生物であってもよし、いかなる脊椎または非脊椎生物であってもよいし、あるい
はいかなる植物であってもよいが、但し、５’隣接配列が宿主細胞機構内で機能
し、宿主細胞機構によって活性化されうることを条件とする。

【００１９】 複製要素オリジンは、典型的には、市場で購入した原核発現ベクターの一部で
あり、宿主細胞内でのベクターの増幅を助ける。ある場合には、一定のコピー数
へのベクターの増幅が、ＮＡＴの最適な発現のために重要である。選択ベクター
が複製部位オリジンを含有しない場合には、既知の配列を基に化学合成して、ベ
クターに連結してもよい。

【００２０】 転写終結要素は、典型的には、ポリペプチドコード配列の３’から末端に位置
して、ｍＲＮＡの転写を終結させる役割を果たす。通常、原核細胞における転写
終結要素は、Ｇ−Ｃが豊富な断片であり、その後、ポリＴ配列となる。この要素
は、ライブラリーから容易にクローニングされ、またはベクターの一部として市
場で購入もされるが、核酸合成のための既知の方法を用いて容易に合成すること
もできる。

【００２１】 選択可能マーカー遺伝子要素は、選択的培養培地内で増殖した宿主細胞の生存
および増殖に必要なタンパク質をコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子
は、（ａ）抗体または他の毒素（例えば、原核細胞にはアンピシリン、テトラサ
イクリンまたはカナマイシン、酵母宿主細胞にはゼオシン、および哺乳動物宿主
細胞にはネオマイシン）に対する耐性を与える、（ｂ）細胞の栄養素要求性欠如
を補足する、または（ｃ）複合培地から入手することができない重要な栄養素を
供給する、タンパク質をコードする。原核細胞の発現に用いるために好ましい選
択可能なマーカーは、カラマイシン耐性遺伝子、アンピリシン耐性遺伝子、およ
びテトラサイクリン耐性遺伝子である。

【００２２】 ｍＲＮＡの翻訳開始には、シャイン−ダルガルノ配列（原核生物用）またはコ
ザック配列（真核生物用）と通常呼ばれるリボゾーム結合要素が必要である。こ
の要素は、典型的には、プロモーターに対して３’、および合成されるべきポリ
ペプチドのコード配列に対して５’に配置される。シャイン−ダルガルノ配列は
多様であるが、典型的にはポリプリン（すなわち、高Ａ−Ｇ含量を有する）であ
る。多くのシャイン−ダルガルノ配列が特定されており、それらの各々が、上に
記載した方法を用いて容易に合成することができ、原核細胞ベクターにおいて用
いることができる。コザック配列は、典型的には開始コドンの直前および直後に
おける配列を含む。好ましいコザック配列は、ＡＵＧ開始コドンにおける高い翻
訳開始率に関係するものである。

【００２３】 ＮＡＴポリペプチドが宿主細胞から分泌されることが望ましいような場合には
、シグナル配列を用いて、それが合成される宿主細胞外にポリペプチドを向ける
ことができる。典型的には、シグナル配列は、核酸配列のコード領域に配置され
るか、またはコード領域の５’末端に直接配置される。多くのシグナル配列が特
定されており、選択された宿主細胞内で機能するそれらのすべてを本発明に用い
ることができる。従って、シグナル配列は、ポリペプチドに対して同種由来であ
ってもよいし、または異種由来であってもよい。さらに、シグナル配列は、上で
言及した方法を用いて化学的に合成することができる。

【００２４】 ベクターを構築し、核酸をベクターの適正部位に挿入した後、その完成ベクタ
ーを増幅および／またはポリペプチド発現のために適する宿主細胞に挿入するこ
とができる。

【００２５】 言及したように、宿主細胞は、原核細胞（大腸菌など）であってもよいし、ま
たは真核細胞（酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞など）であってもよい
。宿主細胞は、酵母であるにせよ他のなんらかの宿主であるにせよ、適切な条件
下で培養すると、ＮＡＴ［これを後に培地から（宿主細胞がそれを培地に分泌す
る場合）またはそれを生産した宿主細胞から直接（分泌されない場合）回収する
ことができる］を合成することができる。ＮＡＴポリペプチドは、回収後、モレ
キュラーシーブクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびこれらに
類するものなどの方法を用いて精製することができる。

【００２６】 宿主細胞の選択は、宿主細胞が、生物学的活性物質が細胞によって造られるよ
うに、ＮＡＴをその本来の第二次および第三次構造（例えば、ジスルフィドブリ
ッジなどの適正な配置）に「折りたたむ」ことができるようなのかに、大部分依
存するであろう。しかし、宿主細胞が生物活性材料を合成しない場合であっても
、当業者に既知であるものなどの適切な化学的条件を用いて合成した後に「折り
たたむ」ことができる。いずれの場合も、生物学的活性物質が得られたという事
実が、適正な折りたたみを結論しうる。

【００２７】 適する宿主細胞または細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）
または３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞でありうる。適する哺乳動物宿主細胞の選
択、ならびに形質転換、培養、増殖、スクリーニングおよび製品の生産および精
製のための方法は、当業者に既知である。他の適する哺乳動物細胞株は、サルＣ
ＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらに例とな
る哺乳動物宿主細胞には、形質転換された細胞株を含む霊長類細胞株および齧歯
動物細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物によ
って誘導される細胞株、ならびに初代体外移植組織も適する。候補細胞は、選択
遺伝子が遺伝子型的に不完全であってもよいし、優性作用性選択遺伝子を含有し
てもよい。さらにその他の適する哺乳動物細胞株には、ＨｅＬａ、マウスＬ−９
２９細胞、スイス、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＴマウス由来の３Ｔ３系統、ＢＨＫ
またはＨａｋハムスター細胞株が挙げられるが、それらに限定されない。

【００２８】 宿主細胞として、細菌細胞も有用である。例えば、大腸菌の多様な菌株（例え
ば、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）は、バイオテクノ
ロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、シュードドモナス種、他のバチルス種、ストレプロマイセス種など
の多様な菌種を用いることもできる。さらに、当業者に既知の酵母細胞の多くの
菌株も本発明のポリペプチドを発現させるための宿主細胞として利用することが
できる。また、所望とあらば、昆虫細胞を宿主細胞として用いることができる。
例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８巻、２
７７〜２９８頁（１９８６）を参照のこと。

【００２９】 選択された宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」または「トランスフェ
クション」とも呼ばれる）は、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、マ
イクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法な
どの方法を用いて達成することができる。選択される方法は、用いられる宿主細
胞のタイプに一部関係するであろう。これらの方法および他の適する方法は、当
業者に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献に記載されている
。

【００３０】 ベクターを含有する宿主細胞は、当業者によく知られている標準培地を用いて
培養することができる。培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要なすべての
栄養素を含有する。大腸菌細胞を培養するために適する培地は、例えば、Ｌｕｒ
ｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ
）である。真核細胞を培養するために適する培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥ
Ｍ、ＤＭＥＭであり、これらのすべてに、培養される特定の細胞株による要求に
応じて血清および／または増殖因子を補充することができる。昆虫培養のために
適する培地は、必要に応じてイーストラート、ラクトアルブミン加水分解物およ
び／またはウシ胎仔血清を補充したＧｒａｃｅ培地である。

【００３１】 典型的には、抗生物質、または形質転換細胞のみの選択的増殖に有用なその他
の化合物をサプリメントとして培地に添加する。用いられる化合物は、宿主細胞
を形質転換させたプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって決まる
。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に添加さ
れる化合物はカナマイシンである。

【００３２】 宿主細胞内で生産されるＮＡＴの量は、当業者に既知の標準的な方法を用いて
評価することができる。こうした方法には、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、非変性ゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分離、免
疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフト測定法などの活性測定法が挙げら
れるが、それらに限定されない。

【００３３】 ＮＡＴがグラム陰性菌以外の宿主細胞から分泌される場合、おそらく大部分が
その細胞培地内で見出されるであろう。ＮＡＴがグラム陰性菌から分泌される場
合、ある程度は、ペリプラズムにおいて見出されるであろう。ＮＡＴは、分泌さ
れない場合には、細胞質内に存在するであろう。

【００３４】 典型的には、細胞内ＮＡＴについては、先ず宿主細胞を機械的に破砕する。ペ
リプラズムにあるＮＡＴについては、機械的破砕または浸透処理のいずれかを用
いて、ペリプラズム内容物を緩衝溶液に放出させることができる。次に、ＮＡＴ
ポリペプチドをこの溶液から分離する。その後、多様な技術を用いて溶液からの
精製を達成することができる。ＮＡＴが、ヘキサヒスチジンまたは他の小ペプチ
ドなどのタグをそのカルボキシルまたはアミノ末端に含むように合成された場合
には、カラムマトリックスがそのタグまたはポリペプチドに対して高い親和性を
有する親和性カラムにその溶液を通すことによって、本質的に一段法で精製する
ことができる。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性を以ってニ
ッケルに結合するので、ニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎニッケルカラム
など）を精製に用いることができる（例えば、上記のＡｕｓｂｅｌら、ｅｄｉｔ
ｏｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。

【００３５】 他方、ポリペプチドがタグを有さず、抗体も利用できない場合には、他のよく
知られている精製のための手順を用いることができる。こうした手順には、イオ
ン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた本来のゲル電気泳動法、お
よび分取等電集束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機械／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられるが、それらに限定されない。場合によっては、こ
れらの技術の二つ以上を併用して、純度上昇を達成することができる。

【００３６】 酵母細胞は、ＮＡＴの精製に用いるために特に好ましく、ピキア属（例えば、
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））として既知の酵母属
のものは、例えば、大腸菌などの細菌細胞と比べて折りたたんだ状態への再生効
率が高いため、最も有利である。この酵母菌種に関する発現の適する組換え法は
、米国特許第４，８５５，２３１号（Ｓｔｒｏｍａｎら）、第４，８１２，４０
５号（Ｌａｉｒら）、第４，８１８，７００号（Ｃｒｅｇｇら）、第４，８５５
，２４２号（Ｃｒｅｇｇ）および第４，８３７，１４８号（Ｃｒｅｇｇ）に記載
されている。これら特許の開示は、本明細書中に参照により取り入れる。

【００３７】 注目に値することに、ピキア細胞を用いて、フィブロラーゼを、このメタロプ
ロティナーゼをコードするＤＮＡ分子から類似した効率で発現させることもでき
、こうした方法は、本発明の追加側面を成す。フィブロラーゼは、科学および特
許文献に記載されている既知のメタロプロティナーゼである。上で引用したＲａ
ｎｄｏｌｐｈらの文献および欧州特許出願第０ ３２３ ７２２号を参照のこと
。典型的には、発現されるフィブロラーゼは、配列番号６のｃＤＮＡ分子（また
は同じアミノ酸配列をコードするその変異体）によってコードされる配列番号５
のものであろう。こうした系におけるフィブロラーゼの発現は、典型的に、「成
熟」ポリペプチド（ヌクレオチド７８４〜１９３２）に加えて「プレプロ」配列
（ヌクレオチド１〜７８３）をコードする配列番号７のＤＮＡ分子を必要とする
であろう。

【００３８】 特性を変更するためにポリペプチドがポリマーまたは他の分子に結合して誘導
体を形成する、ＮＡＴの化学的修飾種も、本発明の範囲内に包含される。特にヒ
トを治療するためには、一つ以上の他の化学部分をポリペプチド部分に結合させ
ることによるなどの方法でＮＡＴを誘導体化することが有利でありうる。こうし
た化学部分は、多様な可溶性ポリマーの中から選択することができる。ポリマー
は、それが結合するＮＡＴポリペプチドが生理学的環境などの水性環境に混和で
きるように、水溶性であるべきである。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレ
ングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カル
ボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エ
チレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダ
ムもしくは非ランダムコポリマーのいずれか（融合分子に関しては、さらに、以
下を参照のこと））、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）
ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン
オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリ
スチレンマレエートおよびポリビニルアルコールから成る群から選択することが
できる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、それが水に安定であ
るため、製造に有利である。

【００３９】 ポリマーは、いかなる分子量ものもでもよく、また枝分かれしていても、枝分
かれしていなくてもよい。ポリエチレングリコールについては、取り扱いおよび
製造が容易であるための好ましい分子量は、約２キロダルトン（ｋＤａ）〜約１
００ｋＤａの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において
、一部の分子が、出発分子量より重い、多少軽いであろうことを示す）。所望の
治療プロフィール（例えば、所望の持続放出時間、生物学的活性に関してなにか
あるとすれば効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用
タンパク質に対するポリエチレングリコールの他の既知の作用）によっては、他
のサイズを用いてもよい。

【００４０】 このように結合されるポリマー分子の数は可変的であり得、当業者は、機能へ
の効果を確認することができるであろう。あるものは、単一誘導体であり得、ま
たは、同じまたは異なる化学部分（例えば、異なる重量のポリエチレングリコー
ルなど）を有する二、三、四またはいくつかの組み合わせの誘導体をもたらし得
る。ポリマー分子のＮＡＴポリペプチド分子に対する比率は、反応混合物中のそ
れらの濃度の変化につれて変化するであろう。一般に、最適な比率（過剰な未反
応ポリペプチドまたはポリマーが存在しない反応率という点で）は、所望の誘導
の度合い（例えば、単一誘導、二誘導、三誘導など）、選択されるポリマーの分
子量、ポリマーが枝分かれしているか、枝分かれしていないか、および反応条件
などの因子によって決定されるであろう。

【００４１】 化学部分は、ポリペプチドの機能性領域または抗原性領域に対する作用を考慮
して、ＮＡＴに結合されるべきである。当業者には利用可能な多数の結合方法が
ある。例えば、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）、お
よびＭａｌｉｋら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０巻
、１０２８〜１０３５頁（１９９２）（塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのＰ
ＥＧ化を報告している）を参照のこと。説明のために、ポリエチレングリコール
は、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応性基によってアミノ酸残基に
共有結合することができる。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子（
または他の化学部分）に結合することができるものである。遊離アミノ基を有す
るアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ−末端アミノ酸残基が挙げられる。遊
離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、
およびＣ−末端アミノ酸残基が挙げられる。スルフヒドリル基も、ポリエチレン
グリコール分子（または他の化学部分）を結合するための反応性基として用いる
ことができる。製造するためには、Ｎ−末端などのアミノ基における、またはリ
ジン基に対する結合が好ましい。受容体結合を望む場合には、受容体結合のため
に重要な残基での結合は避けるべきである。

【００４２】 Ｎ−末端化学修飾誘導体を特に望むことができる。説明したようなポリエチレ
ングリコールを用いると、多様なポリエチレングリコール分子（分子量、枝分か
れなどによって）から、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のポリペプ
チド分子に対する比率、行われるＰＥＧ化反応のタイプ、および選択したＮ−末
端ＰＥＧ化ＮＡＴを得る方法を選択することができる。Ｎ−末端ＰＥＧ化製剤を
得る方法（すなわち、必要な場合には、他のモノＰＥＧ化部分からこの部分を分
離すること）は、ＰＥＧ化ＮＡＴ分子母集団からのＮ−ＰＥＧ化物質の精製によ
るものであってもよい。選択的Ｎ−末端化学修飾は、誘導体化のために利用可能
な、異なるタイプの第一級アミノ基の、異なる反応性（リジン対そのＮ−末端）
が発揮される還元アルキル化によって達成することができる。１９９６年４月２
５日公布の国際公開公報ＷＯ９６／１１９５３を参照のこと。適切な反応条件の
もとで、ポリマーを包含するカルボニル基によりＮ−末端での実質的選択的誘導
体化が達成される。例えば、リジン残基のε−アミノ基と、ポリペプチドのＮ−
末端残基のα−アミノ基のものとの間のｐＫａ差を利用することができるｐＨで
、反応を行うことによって、ＮＡＴを選択的にＮ−末端ＰＥＧ化することができ
る。こうした選択的誘導によって、ポリペプチドへのポリマーの結合を調節する
。すなわち、ポリマーとの結合は、主としてポリペプチドのＮ−末端で起こり、
リジン側鎖アミノ基の有意な修飾は起こらない。還元アルキル化を用いるとき、
ポリマーは、上記のタイプのものであることができ、またポリペプチドに結合す
るための単一反応性アルデヒドを有さなければならない。単一反応性アルデヒド
を含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを用いることができる
。

【００４３】 本発明に従って、ＮＡＴまたは化学修飾誘導体をインビボで、最も好ましくは
、血栓内経由（すなわち、例えば、カテーテルなどによる血管内の血餅部位への
直接局所送達）で投与するために、処方することができる。全身送達は、全身性
循環における不活性免疫α２マクログロブリンが、ＮＡＴと複合して、フィブリ
ンまたはフィブリノーゲンとの相互作用を妨げる可能性があるので、通常、好ま
しくない。しかし、α２マクログロブリンの循環レベルを超え、従って、全身投
与および送達を可能にするより大量のＮＡＴを用いることができる場合もある。
一般に、有効量のＮＡＴと共に、製薬上許容されうる希釈剤、保存薬、可溶化剤
、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬品組成物は、本発明に包
含される。「有効量」とは、測定可能な生物学的作用を生じるための十分な量（
すなわち、治療される血餅を溶解させる血栓溶解に有効な量）を意味する。

【００４４】 典型的には、ＮＡＴは、非常に純粋な形態であり、送達ビヒクルとして用いら
れるあらゆる医薬品組成物は、通常、除菌膜を通して濾過することなどによって
、使用のために前滅菌されるであろう。

【００４５】 当業者は、投与して、望ましい治療効果を観察することによって有効な投薬量
を確認することができるであろう。この範囲において特に有効な投薬量は、治療
を受ける特定の疾患または状態、ならびに患者の年齢および全身の健康状態に依
存し、標準的な臨床手順によって決定することができる。可能な場合には、ヒト
に試験する前に、生物学的試験システムの場合のように、まずインビトロで、次
に、インビボで有用な動物モデル系において医薬品組成物の用量反応曲線を決定
することが望ましい。治療状況、治療を受けている疾患のタイプおよび他の適用
可能なファクターを考慮して、熟練した開業医は、過度の努力をはらうことなく
適正な用量を確認することができるであろう。典型的に、開業医は、投薬が望ま
しい効果（すなわち、血餅の溶解）を達成するまでＮＡＴ組成物を投与するであ
ろう。組成物は、一回投薬として、またはある期間にわたって二回以上の投薬（
同じ量のポリペプチドを含有してもよいし、またはしなくともよい）として、ま
たは持続性ベースで投与することができる。

【００４６】 ＮＡＴは、標準法に従って抗体を生成するために用いることもできる。抗体は
、ポリクロナール、モノクロナール、組換え、キメラ、単鎖および／または二重
特異性抗体などであることができる。免疫応答を生じる可能性を改善するために
、ＮＡＴのアミノ酸配列を分析して、免疫抗原性の増大に関わることができる部
分の分子を特定することができる。例えば、Ｈｏｐｅ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ，７８巻，３８２４〜３８２８頁（１９８１）などの
方法に従って、アミノ酸配列をコンピュータ分析にかけて、表面エピトープを特
定することができる。

【００４７】 ＮＡＴのエピトープを認識するポリクローナル抗体の生産のために、当業者に
既知の多様な手順を用いることができる。抗体を生産するために、ウサギ、マウ
ス、ラットなど（それらに限定されない）の多様な宿主動物にポリペプチドを注
射することによって免疫することができる。宿主種に依存して、フロイントのア
ジュバント、水酸化アルミニウム（みょうばん）などのミネラルゲル、リゾレシ
チンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、
オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール
、およびBacille Calmette-Guerinおよびコリネバクテリウム・パルヴムなどの
潜在的に有用なヒトアジュバントを含む（しかし、これらに限定されない）多様
なアジュバントを用いて、免疫学的応答を増大させることができる。

【００４８】 ＮＡＴに対するモノクローナル抗体を調製するために、無限継代細胞株による
抗体分子の培養物内生産を提供するあらゆる技術を用いることができる。例えば
、Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁（１９７５）に記載されているＫ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発されたハイブリドーマ技
術、ならびにトリオーマ技術、ＫｏｚｂｏｒらによってＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ，４巻，７２頁（１９８３）に記載されているヒトＢ−細胞ハイブリ
ドーマ技術、およびＣｏｌｅらによって「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（モノクローナル抗体および
癌治療）」，Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁（１９８５）
に記載されているモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ
技術は、本発明によるモノクローナル抗体の調製にすべて有用である。

【００４９】 本発明の抗体を治療に用いて、インビボで、投与後、過剰量のＮＡＴと結合さ
せ、その結果過剰量のＮＡＴを中和または阻害するなどのことができる。さらに
、抗体は、体液、組織サンプルまたは他の抽出物中のＮＡＴの存在を検出するた
めのタグ形態などで、既知の診断法に従って、診断のために用いることができる
。

【００５０】 （特定の実施形態の説明） 本発明を以下の実施例においてさらに説明する。

【００５１】 実施例１ ＮＡＴ配列の誘導体化 フィブロラーゼを生産するために有効な方法は、先ずそれをプレプロフィブロ
ラーゼとして発現させる。この場合、プロテアーゼｋｅｘ−２による分解が、「
プレプロ」および「成熟」領域の接続部において発生して、生物学的活性物質（
「成熟」フィブロラーゼ）を得る。このデザインによるプレプロフィブロラーゼ
の合成および加工は、培地への成熟フィブロラーゼの分泌を導く。分解した結合
部における実際の配列は、（．．．ＴＫＲ↓ＱＱＲＦ．．．）である。

【００５２】 Ｋｅｘ−２は、二つの隣接する塩基性アミノ酸、この場合はリジン（Ｋ）−ア
ルギニン（Ｒ）の後で分解するエンドプロテアーゼである。上述の配列を有する
ＤＮＡから発現された成熟フィブロラーゼは、予測Ｎ−末端グルタミン（Ｑ）残
基が実際に脱アミド化および環化されてピログルタミン酸（Ｅ）を生じたことを
示した。この化学修飾は、Ｎ−末端環化グルタミン（ピログルタミン酸）残基を
有するペプチドがアミノ酸配列のためのエドマン分解手順で反応できないため、
望ましくないと考えられた。従って、成熟フィブロラーゼについての配列におけ
るＮ−末端の両方のグルタミン（Ｑ）残基を削除し、Ｎ−末端アルギニン（Ｒ）
残基が生じた。ｋｅｘ−２は、言及したように二つの隣接する塩基性アミノ酸の
後で分解するため、配列（．．．ＫＲＲＦ．．．）がｋｅｘ−２分解のためのあ
いまい部位を提供することが予想された。従って、Ｎ−末端アルギニン（Ｒ）残
基（上で下線で示した）をセリン（Ｓ）残基で置換して、配列（．．．ＫＲＳＦ
．．．）を得た。セリンの選択は、ｋｅｘ−２の分解が加水分解部のＣ−末端側
で発生する時、それを促進するアミノ酸を導入することの必要性に基づく。Ｒｈ
ｏｌａｍら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，２２７巻，７０７〜７１４頁（１９９５）。

【００５３】 結果、プレプロフィブロラーゼのＤＮＡ配列は、標準ＰＣＲプロトコルを用い
て、成熟フィブロラーゼのＮ−末端コード領域における特定部位の変異誘発によ
って修飾され、「ＱＱＲ」のコドンを「Ｓ」のコドンに置換された。このように
、配列番号３のアミノ酸配列を有するプレプロＮＡＴを得た。ＰＣＲ反応を起動
するために用いたオリゴヌクレオチドを下に列挙し、それらの標的配列との相同
性も示す。最初に、オリゴ１および４を一方のプライマー対として、およびオリ
ゴ２および３をもう一方のプライマー対として用い、両方ともテンプレートとし
て親遺伝子のＤＮＡを用いて、二つのＰＣＲ反応を行った。これら二つの反応の
ＤＮＡ生成物（６０１および８１５のヌクレオチド長）をアガロースゲル電気泳
動法によって精製し、混合して、プライマー対としてオリゴ１および２を用いる
第二ラウンドのＰＣＲにおいてテンプレートとして役立たせた。この最終ＰＣＲ
生成物（１３７２のヌクレオチド長）を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよび
ＮｏｔＩで分解した。この分解物をフェノール／クロロホルムで除タンパクし、
ＤＮＡを沈降させた。回収したＤＮＡの一部をプラスミドｐＰＩＣＺα（カリフ
ォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＶＩ９５−
２０）に連結し、同様に、これを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＮｏ
ｔＩで分解して、酵素により脱ホスホリル化し、フェノール／クロロホルムで除
タンパクした。後続段階のすべては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｉｃｈｉａ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ マニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．
カタログ番号Ｋ１７１０−０１）に従って行った。連結反応生成物をエレクトロ
ポレーションによって大腸菌中に形質転換させて、ゼオシン含有固形培地上での
生存物を選択した。このプラスミドを分離し、プロフィブロラーゼ領域をＤＮＡ
配列決定によって確認した。このプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＰｍｅ
Ｉで分解することによって線状化し、その後、ピキア・パストリス ＧＳ１１５
ｈｉｓ^＋中に形質転換させた。ＧＳ１１５株は、通常ｈｉｓ⁻であり、そのため
、ｈｉｓ^＋遺伝子型が、野生型株のｈｉｓ４遺伝子を有するＤＮＡ源での形質転
換によって回復した。あるいは、ｈｉｓ^＋株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒ
ｐ．から購入することができる（Ｘ−３３細胞株、カタログ番号Ｃ１８０−００
）。相同組換え体を、耐ゼオシンコロニーとして選択した。候補クローンをメタ
ノール含有培地中にて誘導し、そのブロスを、クマシー染色を用い、４〜２０％
ＰＡＧＥ上でＮＡＴ生産を検定した。

【００５４】 特定部位のＰＣＲ突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、以下のおとり
であった： オリゴ１ 5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ （配列番号８） オリゴ２ 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ （配列番号９） オリゴ３ （配列番号１０） 5’-TCCAATTAAACTTGACTAAGAGATCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3’ オリゴ４ （配列番号１１） 5’-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3’

【００５５】 これらのオリゴヌクレオチドの位置は、二重鎖ＤＮＡ配列（配列番号１２ コ
ード鎖またはセンス鎖、配列番号１３ 相補鎖またはアンチセンス鎖）およびＮ
ＡＴを作るために修飾されたフィブロラーゼ（プレプロ領域を含む）の対応する
アミノ酸配列（配列番号１４）に関連させて以下に示す。成熟フィブロラーゼの
Ｎ−末端およびＣ−末端領域は、末端アミノ酸配列（ＱＱＲＦおよびＬＮＫＰ）
に下線をつけることによって示す。Ｎ−末端領域（ＱＱＲＦ）は、（ＱＱＲをＳ
に置換するように）修飾されたものである。オリゴ３および４には下に断続線を
挿入して、フィブロラーゼのＮ−末端領域における残基ＱＱをコードする削除さ
れたコドンの位置を示す。

【００５６】

【化１】

【００５７】 実施例２ ピキア・パストリス内でのＮＡＴの発現 大腸菌内でＮＡＴのＤＮＡの発現を試みたが、極めて乏しい折りたたみ再生お
よび希釈条件の必要性のために、精製効率が低かった。これらおよびその他のこ
とを考慮して、宿主細胞として、ピキア・パストリス、すなわち酵母種を使用す
ることにした。プレプロＮＡＴｃＤＮＡ（配列番号４）でトランスフェクトされ
たピキア・パストリスから選択したクローンの培養物を５００ｍＬの以下の接種
増殖培地に接種した： バッチ培地１リットルあたり 酵母エキス ３０．０ｇ リン酸水素２カリウム １７．２ｇ グルコース ２０．０ｇ ビオチン ０．００４ｇ 水 １リットルまで リン酸、８５％ ｐＨを６．００に調整するため

【００５８】 トランスフェクトされたＰ．パストリス細胞をシェーカー内で約３０から３２
時間、３０℃でインキュベートした。得られた培養物の約１％（ｗ／ｖ）を用い
て、１０リットルの発酵槽に接種した。発酵槽は、無菌基本塩およびグルコース
（以下）を含んでいた。発酵槽を滅菌後、バッチ培地１リットルあたり１２ミリ
リットルのＰＴＭ４塩（ＰＴＭ４は、硫酸銅５水和物、ヨウ化ナトリウム、硫酸
マグネシウム１水和物、モリブデン酸ナトリウム２水和物、ホウ酸、塩化コバル
ト６水和物、塩化亜鉛、硫酸第一鉄７水和物、ｄ−ビオチン、硫酸および精製水
を含有する微量金属溶液である）を添加した。発酵増殖温度は３０℃であった。
発酵糟のｐＨは、水酸化アンモニウムおよび硫酸でｐＨ６．００に調節した。培
地に添加した亜鉛塩からの亜鉛は、メタロプロティナーゼ構造の一部としてＮＡ
Ｔに取り込まれることとなる。

【００５９】 バッチ培地１リットルあたりの基本塩 リン酸、８５％ ２６．７ｍＬ 硫酸カルシウム ０．９３ｇ 硫酸カリウム １８．２ｇ 硫酸マグネシウム−７Ｈ_２Ｏ １４．９ｇ 水酸化カリウム ４．１３ｇ グルコース ３０．０ｇ 水 １リットルまで

【００６０】 グルコースが完全に消費されるまで（１７〜２０時間）、バッチ培養物を増殖
させた。その後、供給バッチ層を開始させた。供給バッチ層培地は、グルコース
および１リットルあたり１２ｍＬのＰＴＭ４塩から成った。導入供給物は、グル
コース、２５％のメタノール、および１リットルあたり１２ｍＬのＰＴＭ４塩か
ら成った。導入時、反応器の温度は、２０℃に変えた。導入層を６０〜７５時間
持続させた。条件を整えた培地を回収し、細胞破壊片を廃棄した。

【００６１】 実施例３ ピキア・パストリスからのＮＡＴの精製 実施例２からの酵母ブロス（細胞デブリスが少ない馴らし培地）を透明化し、
ｐＨおよび伝導度を６．５および１０〜２０ｍＳ／ｃｍにそれぞれ調整した。銅
（Ｃｕ）を充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡させた固定化金属親
和性樹脂にブロスを充填した。樹脂をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中イミダゾール勾
配（０〜１００ｍＭ）を用いて溶離した。「成熟」ＮＡＴ（配列番号１）を含有
する画分をプールし、伝導度が１．５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．４より低くなるまで
希釈した。１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）で平
衡させたＳＰセファロース樹脂（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＡｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）に、希釈したプ
ールを充填した。カラムをＭＥＳで洗浄し、ＭＥＳ中ＮａＣｌ勾配（０〜５００
ｍＭ）を用いて溶離した。ＮＡＴを含有する画分をプールし、保管した。

【００６２】 実施例４ ラット頚動脈の急性血栓症における血栓溶解；ＮＡＴのウロキナーゼとの比較 「成熟」ＮＡＴ（配列番号１）が生物学的に活性であり、機能的に独特である
ことを実証するために、急性薬理学研究を、ラットに陽極電流をかけることによ
って頚動脈の一つに局所性損傷を作ることにより行った。この損傷によって、一
般には１５分以内に形成される閉鎖性血栓が生じる。血栓が形成されたら、動脈
を３０分間観察して、頚動脈閉鎖が安定であることを確認した。その後、ヘパリ
ンおよびアスピリンを静脈内に投与して、血栓のさらなる増殖を防止した。その
後、試験材料を動脈内注入することによって動物を治療した。試験材料の送達中
、頚動脈を通る血流量をモニターして、血餅溶解の成功を検出し、血餅溶解が発
生した時間を書き留めた。血餅溶解が発生した実験のパーセンテージを記録し、
血餅溶解が成功した実験のみ、グループ平均を計算した。試験材料の出血の可能
性の目安として、手術部位から放出されたすべての血液をガーゼスワブで回収し
た。そのスワブを洗剤溶液に入れて、赤血球を溶解し、ヘモグロビンを放出させ
、その後、これを分光光度法によって定量した。放出されたヘモグロビンを用い
て、血液の損失量を計算した、試験データを下の表に報告する。

【００６３】

【表１】

【００６４】 これらの研究は、ＮＡＴが、インビボでの血餅溶解の動物モデルにおいて生物
学的に活性であることを立証している。さらに、血餅溶解は、ウロキナーゼと比
較して著しく短縮された時間で、また手術部位からの少ない血液損失で達成され
た。従って、ＮＡＴの活性プロフィールは、ＮＡＴを用いる血餅溶解がより急速
に、また出血性合併症が低減されて発生する点で、プロスミノーゲン活性因子類
の血栓溶解薬（ウロキナーゼによって代表される）とは区別できる。

【００６５】 ＮＡＴのフィブリン溶解活性は、フィブロラーゼのものに匹敵する。さらに、
上述したように、組換え発現に基づくＮＡＴのＮ−末端の安定性によって、明瞭
な利点であるさらに均質な最終生成物を生じる（すなわち、このＮ−末端は、時
間経過によって変化して異なる形態の混合物になることはなく、したがって、こ
のポリペプチドをより安定にする。）。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 「シグナル」ペプチドを含む「プレプロ」領域（下線あり）、および成熟ポリ
ペプチド（下線なし）から成るＮＡＴの完全アミノ酸配列（配列番号３）を線状
型で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｎ 9/50 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84 9/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/19 37/48 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リー，ホエイミン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリ・パーク、ナンバー・545、ノ ース・ベンチユ・パーク・ロード・587・ エフ (72)発明者 マン，マイクル・ベンジヤミン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、 サウザンド・オークス、ラグビー・サーク ル・1506 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA12 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 4B064 AG27 DA01 DA13 4B065 AA77 AB01 BA02 CA33 CA44 4C084 AA02 AA03 AA07 AA14 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA53 DC10 DC50 NA14 ZA542 4C085 AA13 AA14 AA16 BB11 CC05 CC21 CC22 CC23 EE01 EE06 FF02 FF13 FF21 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA24 EA50

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を有するフィブリン溶解活性ポリ
   ペプチド。
2. 【請求項２】 酵母内での組換え発現によって造られた、請求項１に記載の
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号１のポリペプチドをコードする核酸分子。
4. 【請求項４】 配列番号４の配列を有する、請求項３に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の核酸分子に機能するように結合された発現
   調節要素を含む発現ベクター。
6. 【請求項６】 核酸分子が配列番号４のヌクレオチド配列を有する、請求項
   ５に記載の発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項３に記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェク
   トされた宿主細胞。
8. 【請求項８】 原核または真核細胞である、請求項７に記載の形質転換また
   はトランスフェクトされた宿主細胞。
9. 【請求項９】 酵母細胞である、請求項８に記載の形質転換またはトランス
   フェクトされた原核細胞。
10. 【請求項１０】 ピキア・パストリスである、請求項９に記載の形質転換ま
    たはトランスフェクトされた酵母細胞。
11. 【請求項１１】 ＮＡＴを生産するための方法であって、 ＤＮＡ分子が発現されるような条件のもとで、その発現を促進するための調節要
    素に機能するように結合された前記メタロプロティナーゼをコードするＤＮＡを
    含有する宿主細胞を培養すること、および 宿主細胞培養物から発現されたメタロプロティナーゼを単離すること、 を含む方法。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡ分子が配列番号４のものである、請求項１１に記載
    の方法。
13. 【請求項１３】 宿主細胞が酵母細胞である、請求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 酵母細胞がピキア・パストリスである、請求項１３に記載
    の方法。
15. 【請求項１５】 フィブロラーゼおよびＮＡＴから成る群から選択されるメ
    タロプロティナーゼフィブリン溶解薬を製造するための方法であって、 ＤＮＡ分子が発現されるような条件のもとで、その発現を促進するための調節要
    素に機能するように結合された前記メタロプロティナーゼをコードするＤＮＡを
    含有するピキア属宿主細胞を培養すること、および 宿主細胞培養株から発現されたメタロプロティナーゼを単離すること、 を含む方法。
16. 【請求項１６】 ピキア属宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項１
    ５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 血栓溶解に有効な量のＮＡＴを哺乳類に投与することを含
    む、哺乳類の血栓症を治療するための方法。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体。
19. 【請求項１９】 モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。