JP2002520044A - 抗−脈管形成ペプチドの可溶性誘導体 - Google Patents

抗−脈管形成ペプチドの可溶性誘導体

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Abstract

(57)【要約】 負のフィードバックプロセスを治療目的で増加でき、細胞膜および活性な脈管形成部位、特に管内皮の細胞膜および活性な脈管形成部位を標的とすることができる脈管形成阻害タンパク質の誘導体が調製されうることが見出された。本発明は、脈管形成を阻害できるポリペプチドの可溶性誘導体を提供し、該誘導体は、特に成長性血管の管内皮表面に対するアフィニティーを獲得するように、ポリペプチドに共有結合した異種膜結合エレメントの組み合わせを含む。可溶性ポリペプチドは、ヒトプラスミノーゲンの非触媒領域（タンパク質のＮ末端の５６０残基以内）；特に、プラスミノーゲンの金属プロテアーゼ消化によって生じたそのフラグメント；アポリポタンパク質（ａ）の肝細胞成長因子、プロトロンビン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、尿中型プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲン配列とのそのハイブリッドのようなクリングルドメインを含有する関連のタンパク質のフラグメント；正電荷〜中性または負電荷の突然変異を位置２０、２１、７８および７９に含有する上記のクリングルドメインの突然変異型；コラーゲン、特にコラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメント；プロラクチンのフラグメント、プロラクチンの１６ｋＤａ Ｎ末端領域；脈管形成媒介物質の受容体に対する中和抗体；脈管形成に関与するインテグリンのアンタゴニスト；およびそのハイブリッド、誘導体またはムテインから選択してもよい。低い膜アフィニティーを有する各膜結合エレメントは、１μＭ−１ｍＭの解離定数を有し、その誘導体は、膜成分に対して低いアフィニティーを有する十分量のエレメントを組み込んで特定の膜に対して０．０１−１０ｎＭの解離定数を生じうる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、抗−脈管形成ポリペプチド誘導体、治療におけるそれらの使用なら
びにそれらの生産のための方法および中間体に関する。
【０００２】 近年の研究は、血管を提供し、それゆえ腫瘍体に栄養を与える（脈管形成）新
血管新生プロセスの阻害により、腫瘍の成長を防ぐことができる種々のポリペプ
チドを同定した。これらの研究は、初期の観察により、いくつかの実験的な原発
腫瘍がそれら由来の転移細胞塊または二次腫瘍接種原のいずれかの成長を制御で
きることが導かれた（例えば、E. Gorelikら、Int. J. Cancer, 27, 617-625, 1
978）。さらに、原発腫瘍の除去は、転移の成長を加速することが見出され（例
えば、B. Fisherら、Cancer Res. 49, 1996-2001, 1989）、逆に、転移の存在は
明らかに、原発腫瘍の成長を阻害した（J.M. Yuhas & N.H. Pazmino, Cancer Re
s. 34, 2005-2010, 1974）。これらの観察は、少なくとも２つの可溶性媒介物質
、１つの刺激および脈管形成の他の阻害が原発腫瘍およびそれらの転移によって
生じており、２つの型の腫瘍体の間での明白な伝達の原因であるという仮説を導
いた。O'Reillyら（Cell, 79, 315-328, 1994）は、「アンジオスタチン（angio
statin）」と呼ばれる可溶性阻害剤の１つを豊富な血漿タンパク質プラスミノー
ゲンのフラグメントとして同定した。該フラグメントは、腫瘍を有するマウスの
尿および血液から単離され、プラスミノーゲンのＮ末端領域由来であり、最初の
２つの「クリングル」ドメインを含有することが示された。その後の研究は、プ
ラスミノーゲンの制限的なエラスターゼ消化によって単離された最初の３つのク
リングルドメイン（L. Sottrup-Jesenら、Prog. Chem. Fibrinolysis, 3, 191-2
09, 1978）もまた、アンジオスタチン活性を有し、クリングル４はそれを大きく
欠くが、クリングル５のみがイン・ビトロで強力な阻害物質であることを示した
（Y. Caoら、J. Biol. Chem. 271, 29461-29467, 1996, Y. Caoら、J. Biol. Ch
em. 272, 22924-22928, 1997）。さらに、プラスミノーゲンのこれらのアンジオ
スタチンフラグメントは、マトリックス金属プロテアーゼＭＭＰ−７（マトリラ
イシン）、ゼラチナーゼＢまたはＭＭＰ−９（B.C.Patterson & Q.A.Sang, J.Bi
o.Chem. 272, 28823-28825, 1997）およびストロメライシン（ＭＭＰ−３、H.R.
Lijnenら、Biochemistry, 37, 4699-4702, 1998）による天然の血漿プラスミノ
ーゲンの切断によって生じることができることが示された。タンパク質ジスルフ
ィド結合の還元に必要なものもまた、同定された（P. Stathakisら、J. Biol. C
hem. 272, 20641-20645, 1997, S. Gatelyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94
, 10868-10872, 1997）。
【０００３】 これらのプロセスは、アンジオスタチンの局所的生産がタンパク質還元酵素お
よびマトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）の両方を含む天然の脈管形成調節
経路の一部でありうることを示唆した。アンジオスタチンおよび別の構造的に別
個のエンドスタチンと呼ばれる脈管形成阻害剤（ヒトコラーゲンＸＶＩＩＩの２
０ｋＤａ Ｃ末端フラグメント）の両方を用いる研究もまた、脈管形成の阻害が
かかる分子を用いてイン・ビボで達成でき、かかる処理に対する腫瘍耐性が生じ
ないことを示した（M.S. O'Reillyら、Nature Medicine, 689-692, 1996, T. Bo
ehmら、Nature, 390, 404-407, 1997）。
【０００４】 要約すると、ＭＭＰの活性化による組織の腫瘍侵入のプロセスは、既知の脈管
形成因子のそれらの受容体での拮抗によって、またはいくつかの新規であるが、
おそらく受容体に媒介されるプロセスによって媒介される負のフィードバックと
いう面を有するようである。いずれの場合も、メカニズムは、薬物によって誘導
される耐性が生じないようなものである。今回、この負のフィードバックプロセ
スを治療目的で増加でき、細胞膜および活性な脈管形成部位、特に管内皮の細胞
膜および活性な脈管形成部位を標的とすることができる脈管形成阻害タンパク質
の誘導体が調製されうることが見出された。
【０００５】 ＷＯ９８／０２４５４は、低い個々の膜アフィニティーを有する異種膜結合エ
レメントの組み合わせの取り込みにより、外部細胞膜に対してアフィニティーを
有する可溶性治療的ポリペプチド誘導体の調製のための一般的な方法を開示する
。
【０００６】 したがって、本発明は、脈管形成を阻害できるポリペプチドの可溶性誘導体で
あって、該誘導体が管内皮、特に成長性血管の表面に対するアフィニティーを獲
得するように、ポリペプチドに共有結合した異種膜結合エレメントの組み合わせ
を含む誘導体を提供する。
【０００７】 「異種」なる語は、エレメントが抗−脈管形成タンパク質を誘導しうる天然の
全長タンパク質中に見出されないことを意味する。 「低い膜アフィニティーを有する膜結合エレメント」なる語は、エレメントが
膜に対して中程度のアフィニティー、すなわち、０．１μＭより多く、好ましく
は１μＭ−１ｍＭの解離定数を有することを意味する。エレメントは、好ましく
は、＜５ｋＤａのサイズを有する。
【０００８】 誘導体は、膜成分に対して低いアフィニティーを有する十分量のエレメントを
取り込んで、血管内皮の細胞膜に対して高い（好ましくは０．００１−１０ｎＭ
の解離定数）アフィニティーを有する誘導体を生じる。 エレメントは、医薬処方媒体中において有用な溶解度、好ましくは＞１００μ
ｇ／ｍｌを保持するように選択される。
【０００９】 したがって、本発明は、細胞膜にてアンジオスタチン物質の局在化を促進し、
それにより、下記を包含する腫瘍療法に有利な可能性のある１以上のいくつかの
生物学的に有意な効果を提供する。
【００１０】 効力および投与：動物研究において（例えば、T. Boehmら、上記引用文中）、
脈管形成ポリペプチドを複数投与で使用してきたが、ヒトで推定するならば、そ
れは、ヒト癌を治療するためのかかる物質の慢性的使用において、費用、デリバ
リー方法および患者のコンプライアンスという問題を提起する。それらの作用部
位およびそれらの推定受容体と同じ表面上に位置するならば、かかる物質は、投
与の規模および頻度の両方を減少させる有効濃度の増加および局所滞留時間を有
するであろう。
【００１１】 特異性：例えば、脈管形成に関係するインテグリンに対して感受性を有する膜
標的物質の使用は、脈管構造のどこかで正常なプロセスを中断する危険性を減少
するであろう。
【００１２】 本発明によって修飾されうる抗−脈管形成物質の例は、限定するものではない
が： ・ヒトプラスミノーゲンの非触媒領域（すなわち、該タンパク質のＮ末端の５
６０残基以内） ・特に、プラスミノーゲンの金属プロテアーゼ消化によって生じたそのフラグ
メント ・アポリポタンパク質（ａ）の肝細胞成長因子、プロトロンビン、組織型プラ
スミノーゲンアクチベーター、尿中型プラスミノーゲンアクチベーターおよびプ
ラスミノーゲン配列とのそのハイブリッドのようなクリングルドメインを含有す
る関連タンパク質のフラグメント
【００１３】 ・上記のクリングルドメインの突然変異型、例えば、正電荷〜中性または負電
荷の突然変異を位置２０、２１、７８および７９（Caoらによって用いられた番
号付け）に含有する突然変異型 ・コラーゲン、特に、コラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメント ・１６ｋＤａ Ｎ末端領域のようなプロラクチンのフラグメント ・脈管形成媒介物質の受容体に対する中和抗体 ・脈管形成に関与するインテグリンのアンタゴニスト を包含する。
【００１４】 本発明の好ましい誘導体は、構造： ［Ａ］−｛Ｌ−［Ｗ］｝ｎ−Ｌ−Ｘ ［式中、 Ａは可溶性抗−脈管形成物質であり、 各Ｌは独立して、任意のフレキシブルな連結基であり、 各Ｗは独立して、ペプチド膜結合エレメントであり、 ｎは１以上の整数であり、 Ｘは、いずれかのＷに共有結合していてもよいペプチドまたは非ペプチド膜結
合体である］ を有する。
【００１５】 フレキシブルな連結基は、一般に、大きくない比較的親水性の残基、例えば、
セリン、グリシンおよびアラニンが優勢な短い（３〜１０アミノ酸）ペプチド配
列であり、ベータ−ターン性を示してもよい（およびプロリンを含有する）が、
固定したコンホメーションを有さない。ベータ−アラニン、６−アミノヘキサン
酸ならびにオキシエチレンオリゴマーおよびポリマーのアルファ−アミノ，オメ
ガ−カルボキシ誘導体のようなアルファアミノ酸以外の非固定連結もまた、使用
してもよい。
【００１６】 ペプチド膜結合エレメントは、好ましくは、８〜２０アミノ酸長であり、エレ
メントＷは、好ましくは、可溶性ポリペプチドのＮまたはＣ末端のいずれかに連
続して位置する。アミノ酸配列は、好ましくは、４〜２０個のアミノ酸の親水性
および／またはフレキシブルなアミノ酸配列；直鎖状親水性合成ポリマー；およ
び化学的架橋基から選択される連結基によって、互いにおよび可溶性ペプチドに
連結される。
【００１７】 ペプチド結合は、適当なコーディングＤＮＡ配列の発現によって、化学的また
は生合成的に作成してもよい。非ペプチド結合は、翻訳後修飾によって化学的ま
たは酵素的に作成してもよい。
【００１８】 ペプチド膜結合エレメントを含むアミノ酸配列の適当な例は、ＷＯ９８／０２
４５４に開示されており、出典明示により本明細書の一部とする。それらは、 AspGlyProLysLysLysLysLysLysSerProSerLysSerSerGly（配列番号１０） GlySerSerLysSerProSerLysLysLysLysLysLysProGlyAsp（配列番号１１） SerProSerAsnGluThrProLysLysLysLysLysArgPheSerPheLysLysSerGly（配列番
号１２） AspGlyProLysLysLysLysLysLysSerProSerLysSerSerLys（配列番号１３） SerLysAspGlyLysLysLysLysLysLysSerLysThrLys（配列番号１４） を包含する。
【００１９】 これらは、静電スイッチ配列の例であり、それらは、管内皮および脈管形成プ
ロセスに関連することが知られている内在性膜タンパク質のリガンド由来のアミ
ノ酸配列と結合していてもよい。例えば、αｖβ３インテグリンは、ビトロネク
チンの受容体であり、ＲＧＤ配列を含有するリガンドを有する。
【００２０】 かかるペプチドは、ファージディスプレー技術（例えば、E. Koivunenら、Bio
technology, 13, 265-270, 1995）によって同定され、ジスルフィド強制（const
rained）配列AlaCysAspCysArgGlyAspCysPheCysGly（配列番号１５）を包含する
。
【００２１】 別の例は、血小板中のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ膜タンパク質に結合するヒトフィ
ブリノーゲンアルファ鎖由来のAspGlyProSerGluIleLeuArgGlyAspPheSerSer（配
列番号１６）である。一般に、ファージディスプレー様式において発生し、イン
・ビトロ（G.F.SmithおよびJ.K.Scott, Methods in Enzymology, 217H, 228-257
, 1993）またはイン・ビボ（R.Pasqualini & E.Ruoslahti, Nature, 380, 364-3
66, 1996）でのバイオパンニング（biopanning）操作によって選択されるような
ランダムな化学ライブラリー由来の結合配列は、本発明の使用に適したエレメン
トである。
【００２２】 フィブロネクチンまたはビトロネクチン結合タンパク質由来および膜タンパク
質内のエピトープに対して生じたモノクローナル抗体の相補性決定領域由来の配
列（例えば、J.W.Smithら、J.Biol.Chem. 270, 30486-30490, 1995参照）もまた
、適当な結合または標的エレメントである。
【００２３】 異種アミノ酸配列とヒトタンパク質の可溶性誘導体であるポリペプチドとの結
合は、特に、アミノ酸配列がヒトタンパク質由来ではない場合および反復投与が
考えられる場合、免疫原性の可能性を評価される必要があるであろう。一般に、
この問題は、既知ヒト配列にできるだけ近い配列を用い、二次構造および抗原性
インデックスのコンピューターの使用によって、取り組むことができる。
【００２４】 本発明の誘導体のポリペプチド部分は、目的の可溶性ポリペプチドおよび１以
上のペプチド膜結合エレメントおよび連結基を導入して付加的な膜結合エレメン
トで翻訳後誘導体化を容易にするためのシステインなどの任意の残基をコードし
ている修飾遺伝子の適当な宿主中における発現によって調製してもよい。
【００２５】 したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の誘導体の調製法であ
って、誘導体のポリペプチド部分をコードしているＤＮＡを組換え宿主細胞中に
発現し、生産物を回収し、その後、ポリペプチドを翻訳後修飾して、膜結合エレ
メントを化学的に導入することを特徴とする方法を提供する。
【００２６】 特に、該方法の組換え型態様は： ｉ）該ポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマー
を宿主細胞中において発現できる複製可能な発現ベクターを調製し； ｉｉ）発現ベクターを宿主細胞中へ導入し； ｉｉｉ）該宿主細胞を該ＤＮＡポリマーの発現が可能な条件下で培養して、該
ポリペプチドを生産し；次いで ｉｖ）該ポリペプチドを回収する 工程を含んでもよい。
【００２７】 ポリペプチド部分が新規な場合、ポリペプチド部分をコードするヌクレオチド
配列を含むＤＮＡポリマーならびにポリペプチド部分自体、およびそのＳ−誘導
体もまた、本発明の一部を形成する。特に、本発明は、ペプチド結合によって１
のペプチド膜結合エレメントに連結された可溶性ペプチドを含み、および／また
はＣ末端システインを包含する本発明の誘導体のポリペプチド部分およびポリペ
プチド部分をコードしているＤＮＡポリマーを提供する。
【００２８】 本発明の組換え工程は、Sambrookら、Molecular Cloning: A laboratory manu
al 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)およびDNA Clon
ing vols I, IIおよびIII（D.M.Glover編、IRL Press Ltd）に記載のような慣用
的な組換え技術によって行ってもよい。
【００２９】 本発明は、また、適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチド単位の縮
合によるＤＮＡポリマーの調製法を提供する。 該調製は、化学的、酵素的に、または２つの方法の組み合わせによって、イン
・ビトロまたはイン・ビボで適宜行ってもよい。したがって、ＤＮＡポリマーは
、D.M.Robertsら、Biochemistry 1985, 24, 5090-5098によって記載されるよう
な慣用的な方法によって、適当なＤＮＡフラグメントの酵素的連結によって調製
してもよい。
【００３０】 ＤＮＡフラグメントは、適当な制限酵素での必要なヌクレオチド配列を含有す
るＤＮＡの消化によって、化学的合成によって、酵素的重合化によって、または
これらの方法の組み合わせによって得てもよい。 制限酵素での消化は、適当なバッファー中２０−７０℃の温度で、一般に、０
．１−１０μｇＤＮＡを含有する５０μｌ以下の容量で行ってもよい。
【００３１】 ＤＮＡの酵素的重合化は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）ま
たはＴａｑもしくはＰｆｕポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼを用いて、
ヌクレオシド３リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを必要に応
じて含有する適当なバッファー中１０−７２℃で、一般に、５０μｌ以下の容量
でイン・ビトロで行ってもよい。
【００３２】 ＤＮＡフラグメントの酵素的連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガ
ーゼを用いて、適当なバッファー中４℃〜３７℃で、一般に、５０μｌ以下の容
量で行ってもよい。
【００３３】 ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学的合成は、慣用的なリン酸トリエス
テル、亜リン酸エステルまたはホスホルアミダイト化学によって、'Chemical an
d Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual' (H.G.Grasse
nおよびA. Lang編）, Verlag Chemie, Weinheim (1982)、または他の科学出版物
、例えば、M.J.Gait, H.W.D. Matthes M. Singh, B.S. SproatおよびR.C.Titmas
, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.SproatおよびW.Bannwarth, T
etrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.MatteucciおよびM.H.Caruthers, Te
trahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.MatteucciおよびM.H.Caruthers, Jour
nal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adamsら、Jour
nal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biern
at, J.McMannusおよびH.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539;
およびH.W.D.Matthesら、EMBO Journal, 1984, 3, 801に記載のような固相技術
を用いて行ってもよい。好ましくは、自動ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Appl
ied Biosystems 381A シンセサイザー）を用いる。
【００３４】 ＤＮＡポリマーは、好ましくは、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を
共に含む２以上のＤＮＡ分子を連結することによって調製される。 ＤＮＡ分子は、必要なコーディング配列を運搬するベクターの適当な制限酵素
での消化によって得てもよい。 ＤＮＡ分子の正確な構造およびそれらを得る方法は、所望の生産物の構造に依
存する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の構築に適当な戦略の設計は、当
業者にとって慣例のことである。
【００３５】 特に、特定の宿主細胞のコドン使用法を考慮してもよい。コドンは、Devereux
ら、(1984) Nucl. Acis Res., 12, 387において述べられた原理を用いて、イー
・コリ（E.coli）における高レベルな発現のために最適化してもよい。 組換え宿主細胞中におけるポリペプチドをコードしているＤＮＡポリマーの発
現は、ＤＮＡポリマーを宿主細胞中で発現できる複製可能な発現ベクターの手段
によって実施してもよい。新規な発現ベクターもまた、本発明の一部を形成する
。
【００３６】 複製可能な発現ベクターは、本発明にしたがって、宿主細胞に適合するベクタ
ーを切断して無傷レプリコンを有する線状ＤＮＡセグメントを提供し、連結条件
下で該線状セグメントを１以上のＤＮＡ分子と結合する（ここに、該ＤＮＡ分子
は該線状セグメントと共にポリペプチドをコードする）ことによって、調製して
もよい。 線状セグメントと１以上のＤＮＡ分子の連結は、所望により、同時にまたは連
続的に行ってもよい。
【００３７】 したがって、ＤＮＡポリマーは、所望により、予め形成されるか、またはベク
ターの構築の間に形成されてもよい。ベクターの選択は、イー・コリのような原
核生物またはマウスＣ１２７、マウスミエローマ、チャイニーズハムスター卵巣
、カビ、例えば、繊維状カビまたは単細胞「酵母」のような真核生物またはドロ
ソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）もしくはスポドプテラ
・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）のような昆虫細胞であってもよい宿
主細胞によって一部決定される。宿主細胞は、また、トランスジェニック動物中
にあってもよい。適当なベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミ
ドおよび例えば、バキュロウイルスまたはワクシニア由来の組換えウイルスを包
含する。
【００３８】 ＤＮＡポリマーは、フラグメントを発現している安定な形質転換哺乳動物細胞
系統の単離のために設計されたベクター、例えば、マウスＣ１２７細胞における
ウシパピローマウイルスベクター、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞にお
ける増幅ベクター中に構築されてもよい（DNA Cloning Vol. II D.M. Glover編
、IRL Press 1985; Kaufman, R.J.ら、Molecular and Cellular Biology 5, 175
0-1759, 1985; Pavlakis G.N.およびHamer, D.H. Proceedings of the National
Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D.V.ら、European
Patent Application No. 0093619, 1983）。
【００３９】 複製可能な発現ベクターの調製は、例えば、上掲のSambrookらに記載の手法に
より、ＤＮＡの制限、重合および連結に適当な酵素を用いて慣用的に行ってもよ
い。重合および連結は、ＤＮＡポリマーの調製のための上記のように行ってもよ
い。制限酵素での消化は、適当なバッファー中２０−７０℃で、一般に、０．１
−１０μｇＤＮＡを含有する５０μｌ以下の容量で行ってもよい。
【００４０】 組換え宿主細胞は、本発明にしたがって、形質転換条件下において宿主細胞を
本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換することによって調製される。適当
な形質転換条件は、慣用的であり、例えば、上掲のSambrookらまたは"DNA Cloni
ng" Vol.II, D.M. Glover編、IRL Press Ltd, 1985において記載されている。
【００４１】 形質転換条件の選択は、宿主細胞によって決定される。したがって、イー・コ
リのような細菌宿主は、ＣａＣｌ２溶液（Cohenら、Proc. Nat. Acad. Sci., 19
73, 69, 2110）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ２、酢酸カリウムおよびグリセロール
の混合物を含む溶液で処理し、次いで、３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパン−ス
ルホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理するか、または例えば、エレクト
ロポレーターの製造元であるBio-Rad Laboratories, Richmond, California, US
Aによって記載されるようにエレクトロポレーションによって処理してもよい。
培養中の哺乳動物細胞は、細胞上へのベクターＤＮＡのカルシウム共沈によって
、または陽イオンリポソームを使用することによって、形質転換してもよい。
【００４２】 本発明は、また、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞
に及ぶ。 ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換された宿主細胞の培養
は、例えば、上掲のSambrookらおよび"DNA Cloning"に記載のように慣用的に行
われる。したがって、好ましくは、細胞に栄養を供給し、４５℃以下で培養する
。
【００４３】 タンパク質生産物は、宿主細胞によって慣用的な方法によって回収する。した
がって、宿主細胞がイー・コリのような細菌性であって、タンパク質が細胞内に
発現される場合、それを物理的、化学的または酵素的に溶解し、得られたライゼ
ートからタンパク質生産物を単離してもよい。宿主細胞が真核生物である場合、
生産物は通常、栄養培地から単離される。
【００４４】 宿主細胞がイー・コリのような細菌性である場合、培養物から得られる生産物
は、最適な機能活性のためにフォールディングを必要としうる。これは、おそら
く、タンパク質が封入体として発現される場合である。重要と考えられる単離お
よびフォールディング過程のいくつかの態様がある。特に、ポリペプチドは、好
ましくは、混入タンパク質との集合塊の形成を最少化するためおよびポリペプチ
ドのミスフォールディングを最少化するために、フォールディング前に部分的に
精製される。したがって、封入体の特異的単離およびその後のフォールディング
前の付加的な精製による混入イー・コリタンパク質の除去は、該手法の重要な態
様である。
【００４５】 フォールディング過程は、ポリペプチドの中間の折りたたみ状態の凝集を最少
化するような方法で行われる。したがって、とりわけ、塩の型および濃度、温度
、タンパク質濃度、酸化還元バッファー濃度およびフォールディング時間につい
て注意深く考慮しなければならない。いずれかの所定のポリペプチドのための的
確な条件は、一般に予測できず、実験によって決定されなければならない。
【００４６】 封入体由来のタンパク質のフォールディングに利用できる多数の方法があり、
当業者に既知である。該方法は、一般に、例えば、８Ｍ尿素または６Ｍ塩酸グア
ニジンのような高濃度の変性剤の存在下で５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を用いて、封入体中の全てのジスルフィド結合を破壊することを含む。次工程は
、これらの薬剤を除去して、タンパク質のフォールディングを起こすことである
。ジスルフィド架橋の形成は酸化環境を必要とし、これは、いくつかの方法、例
えば、空気によって、または適当な酸化還元系、例えば、還元および酸化型グル
タチオンの混合物を取り込むことによって、提供されうる。
【００４７】 好ましくは、封入体は、メルカプトエタノールの存在下で８Ｍ尿素を用いて可
溶化され、最初の混入タンパク質の除去後、冷却したバッファーの添加によって
タンパク質は折りたたまれる。適当なバッファーは、I. Doddら、'Perspectives
in Protein Engineering and Complementary Technologies', Mayflower Publi
cations, 66-69, 1995に記載の技術を用いて同定されてもよい。多くのタンパク
質に適当なバッファーは、１ｍＭ還元型グルタチオンおよび０．５ｍＭ酸化型グ
ルタチオンを含有する２０−３００ｍＭエタノールアミンである。フォールディ
ングは、好ましくは、１〜５℃の温度範囲で１〜４日間にわたって行われる。
【００４８】 いずれかの沈殿または凝集が観察される場合、凝集されたタンパク質はいくつ
かの方法、例えば、遠心分離または硫酸アンモニウムのような沈殿剤での処理に
よって除去できる。これらの手法のいずれかを採用する場合、１量体ポリペプチ
ドが主要な可溶性生産物である。細菌細胞がタンパク質を分泌する場合、フォー
ルディングは通常、必要ない。
【００４９】 本発明の誘導体のポリペプチド部分は、翻訳後修飾を容易にするために、無対
の（好ましくは、Ｃ末端の）システインを包含してもよい。唯一の遊離のおよび
好ましくはＣ末端のシステインを包含する可溶性抗−脈管形成ポリペプチドもま
た、本発明の一部を形成する。
【００５０】 細菌系における発現は、中程度のサイズ（〜７０ｋＤａまで）であって、＜〜
８個のジスルフィド架橋を有するタンパク質に好ましい。遊離の末端システイン
がリフォールディングまたは安定性の問題を引き起こすことができるより複雑な
タンパク質は、真核生物細胞系統（特に、ＣＨＯ）における安定な発現を必要と
しうる。これは、また、炭水化物膜結合エレメントが翻訳後に導入される場合に
必要とされるであろう。ポリペプチド部分をコードしている組換えバキュロウイ
ルスで感染された昆虫細胞の使用もまた、より複雑なタンパク質を調製するため
の有用な一般的な方法であり、ある特定の翻訳後プロセス（例えば、パルミトイ
ル化）を生合成的に行うことが望まれる場合に好ましい（例えば、M.J.Pageら、
J. Biol. Chem. 264, 19147-19154, 1989）。
【００５１】 組換えクリングルドメインの発現および単離に特異的な方法は、例えば、S. C
learyら、Biochemistry 28, 1884-1891, 1989、V.S.DeSerranoら、Arch. Bioche
m. Biophys. 294, 282-290, 1992、N. Menhartら、Biochemistry 30, 1948-1957
, 1991およびD.Martiら、Eur. J. Biochem. 219, 455-462, 1992に開示されてい
る。
【００５２】 Ｃ末端がシステインで誘導体化されたタンパク質を扱う好ましい方法は、方法
の段落に一般的に下記されるような、メルカプトエタノールまたはグルタチオン
との混合ジスルフィド、または２−ニトロ，５−カルボキシフェニルチオ−誘導
体である。
【００５３】 ペプチド膜結合エレメントは、メリフィールド法のような標準的な固体合成を
用いて調製してもよく、該方法は、ミリスチン酸またはパルミチン酸由来のＮ−
アシル基のような必要とされる非ペプチド膜結合エレメントをペプチドのＮ末端
に取り込むように適応できる。さらに、タンパク質へのその後の連結のためのア
ミノ酸残基の活性化は、かかる膜結合エレメントの化学的合成の間に達成できる
。かかる活性化の例は、システインチオールとの混合型２−ピリジルジスルフィ
ドの形成またはＮ−ハロアセチル基の取り込みを包含する。これらの基の両方は
、各々、ジスルフィド交換およびアルキル化によって遊離のチオールと反応でき
る。ペプチドは、所望によリ、Ｃ末端アミドとして、および／またはアセチルの
ような慣用的なＮ末端保護基を用いて調製できる。
【００５４】 本発明は、また、ＷＯ９８／０２４５４に開示されるように誘導体化され、好
ましくは、１以上の以下の特徴： チオール基にて活性化されていてもよい末端システイン残基； ペプチドのＮ末端またはリジン残基のε−アミノ基に位置するＮ−ハロアセチ
ル基（ここに、ハロは塩素、臭素またはヨウ素を示す）； Ｃ末端のアミド基； Ｎ末端保護基；および Ｎ末端またはリジン残基のε−アミノ基の脂肪酸Ｎ−アシル基 を有するペプチド膜結合エレメントを提供する。
【００５５】 化学的架橋基、それらの形成に適当な試薬およびタンパク質とのそれらの反応
の条件は、ＷＯ９８／０２４５４に記載されるものを包含する。２−イミノチオ
ランは、特に、本発明のためのタンパク質接着基として有用である。タンパク質
接着基として遊離のチオール官能基を作成する好ましい方法は、還元剤を用いる
ジスルフィド含有タンパク質の部分的還元を含む。好ましくは、タンパク質は、
ヒトプラスミノーゲンのＮ末端の５６１アミノ酸由来であり、還元剤は、トリス
−（２−カルボキシエチル）ホスフィンである。
【００５６】 連結されるべきポリペプチドは、連結剤またはタンパク質接着基を導入するた
めに試薬を用いて、典型的には、ポリペプチドに試薬を過剰に添加することによ
って、通常、中性または穏かなアルカリ性バッファー中で別々に反応させ、反応
後、低分子量物質をゲルろ過または透析によって除去する。ｐＨ、温度、バッフ
ァーおよび反応時間の正確な条件は、使用される試薬の性質および修飾されるべ
きポリペプチドに依存するであろう。ポリペプチド連結反応は、好ましくは、修
飾されたポリペプチドを中性バッファー中、等モル比で混合することによって行
われる。他の反応条件、例えば、時間および温度は、所望の連結度を得るために
選択されるべきである。チオール交換反応が含まれる場合、反応は、好ましくは
、窒素雰囲気下で行われるべきである。好ましくは、ＵＶ−活性生産物が生産さ
れ（例えば、２−ピリジルジチオ誘導体からのピリジン２−チオンの遊離由来）
、それにより、カップリングをモニターできる。
【００５７】 連結反応後、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のようない
くつかのクロマトグラフィー法によって、ポリペプチド複合体を単離できる。こ
れらの手法は、低圧または高速変形のいずれかであってもよい。慣用的な一般的
な最終段階精製戦略は、Ｃ２−Ｃ８、好ましくはＣ４媒体上のＨＩＣおよび陽イ
オン交換クロマトグラフィーである。これらの方法は、疎水性静電スイッチの組
み合わせが挿入された誘導体化および非誘導体化タンパク質の分離に好ましい。
固定化したリジンまたは６−アミノヘキシル（ＡＨ）媒体上のアフィニティーク
ロマトグラフィーは、リジンまたはＡＨ結合部位を含有するプラスミノーゲン誘
導体の単離に好ましい技術である。
【００５８】 複合体は、低圧または高速ゲルろ過、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
、等電点または電子スプレー質量分析を包含するいくつかの技術によって特徴付
けられうる。
【００５９】 １の好ましい態様において、本発明は、１以上のジスルフィド架橋によって、 N-ミリストイルAspGlyProLysLysLysLysLysLysSerProSerLysSerSerGlyCys N-ミリストイルGlySerSerLysSerProSerLysLysLysLysLysLysProGlyAspCys CysAspGlyProLysLysLysLysLysLysSerProSerLysSerSerLys(N-ε-ミリストイ
ル) N-ミリストイルSerLysAspGlyLysLysLysLysLysLysSerLysThrLysCys （配列番号１７−２０） に連結されたヒトプラスミノーゲンクリングルドメインの誘導体に関する。
【００６０】 さらに好ましい態様は、上記のタンパク質にＣ末端伸長を組み込む。例えば、
配列：AspGlyProSerGluIleLeuArgGlyAspPheSerSerCys（配列番号２１）またはAl
aSerAspAlaArgGlyAspSerPheAlaGlyCys（配列番号２２）は、タンパク質伸長のシ
ステインの直前に付加的なスペーサー配列を有していてもよい上記の膜標的誘導
体のいずれかに連結された。
【００６１】 本発明の誘導体は、好ましくは、医薬組成物として投与される。 したがって、本発明の誘導体は、また、本発明の誘導体を医薬上許容される担
体と共に含んでなる医薬組成物を提供する。 本発明による組成物は、いずれかの経路、詳細には非経口、経口、舌下、皮下
、腹膜内および経皮的経路も包含するが、特に、静脈内注入によって、または吸
入による投与するための慣例の手法にしたがって処方してもよい。組成物は、錠
剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、クリームまたは液体調製物、例えば経口
または滅菌非経口溶液もしくは懸濁液の形態、あるいはスプレー、エーロゾルま
たは他の吸入に慣用的な方法の形態であってもよい。
【００６２】 本発明の局所的処方は、例えば、軟膏、クリームまたはローションおよび目ま
たは耳用滴剤、浸漬した外傷用医薬材料およびエーロゾルとして提供されてもよ
く、保存料、薬物の浸透を補助する溶媒ならびに軟膏およびクリーム中の皮膚軟
化薬のような適当な慣用的な添加剤を含有していてもよい。
【００６３】 処方は、また、クリームまたは軟膏基剤およびローションのためのエタノール
またはオレイルアルコールのような融和性の慣用的な担体を含有していてもよい
。かかる担体は、処方の約１％から約９８％まで存在していてもよい。より普通
には、それらは処方の約８０％までである。
【００６４】 経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位投与量を与える形態であってもよく
、結合剤、例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガ
カントゴムまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、砂糖、
トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤
成形滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコ
ールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、馬鈴薯デンプン；または許容される湿潤剤
、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムのような慣用的な賦形剤を含有していてもよ
い。錠剤は、また、タンパク質分解に対するポリペプチド薬物の安定化のための
薬剤およびマクロ分子のための吸収増加剤を含有していてもよい。錠剤は、通常
の製薬実施においてよく知られた方法によって被覆されていてもよい。
【００６５】 坐剤は、慣用的な坐剤基剤、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含
有するであろう。 非経口投与の場合、化合物および滅菌ビヒクル（水が好ましい）を用いて、流
体単位投与形態が調製される。化合物は、ビヒクルおよび使用される濃度に依存
して、ビヒクル中に溶解する。溶液の調製において、化合物を注射用の水に溶解
し、滅菌ろ過した後、適当なバイアルまたはアンプルに充填し、密封することが
できる。
【００６６】 非経口処方は、生物分解可能なポリマー、例えば、ポリ−乳酸コ−グリコール
酸（poly-lactic co-glycolic acid）の微小球内に被包するような徐放系を包含
してもよい。 有利には、局所麻酔剤、保存料および緩衝化剤のような物質をビヒクル中に溶
解できる。安定性を高めるために、バイアル中に充填後、組成物を冷凍し、真空
下で水を除去することができる。次いで、凍結乾燥粉末をバイアル中に密封し、
使用前に液体を復元するために、注射水の付随のバイアルを供給してもよい。有
利には、表面活性剤または湿潤剤を組成物中に含ませて、化合物の均一な分布を
促進する。
【００６７】 本発明の組成物は、また、適当には、吸入剤またはネブライザーのためのエー
ロゾルもしくは溶液として、吸入用微粉末として、単独またはラクトースのよう
な不活性担体と共に呼吸系に投与するために与えられてもよい。かかる場合、活
性化合物の粒子は、適当には、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満
の直径、例えば、１−５０ミクロン、１−１０ミクロンまたは１−５ミクロンの
範囲の直径を有する。適宜、少量の抗−喘息薬および気管支拡張薬、例えば、イ
ソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニルエフィリンおよびエフ
ェドリンのような交感神経興奮作用性アミン；テオフィリンおよびアミノフィリ
ンのようなキサンチン誘導体およびプレドニソロンのようなコルチコステロイド
およびＡＣＴＨのような副腎興奮薬を含ませてもよい。
【００６８】 微粉末処方は、適当には、計量された投与量としてエーロゾル中で、または適
当な呼吸活性化装置によって、またはバリスティック技術によって経皮的に投与
されてもよい。
【００６９】 適当な計量された投与量のエーロゾル処方は、慣用的なプロペラント、エタノ
ールのような共溶媒、オレイルアルコールのような表面活性剤、オレイルアルコ
ールのような滑沢剤、硫酸カルシウムのような乾燥剤および塩化ナトリウムのよ
うな密度条件剤を含む。
【００７０】 ネブライザーのための適当な溶液は、例えば、ｐＨ４−７で緩衝化されていて
もよい、２０ｍｇ ｍｌ−１まで、より一般的には０．１〜１０ｍｇ ｍｌ−１の
化合物を含有する、標準的な噴霧装置と共に使用するための等張滅菌溶液である
。
【００７１】 投与される物質の量は、誘導体の効力および病気の性質に依存し、治療を管理
している内科医により環境にしたがって決定されるであろう。しかしながら、一
般に、疾患または障害の治療のための有効量のポリペプチドは、投与回数が５回
までで投与されるか、または注入による１日に０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ、好
ましくは１日に０．１ｍｇ−１０ｍｇ／ｋｇの投与範囲である。 本発明の化合物を上記の投与量範囲内で用いて、不利な毒物学的効果は示され
ない。
【００７２】 本発明は、また、薬剤として使用するための本発明の誘導体を提供する。 本発明は、さらに、本発明の可溶性ペプチドの可溶性誘導体を投与することを
特徴とする可溶性ペプチドによる治療に影響を受けやすい障害の治療法、および
かかる障害の治療用薬剤の調製のための本発明の誘導体の使用を提供する。 本発明は、また、確立された原発腫瘍を治療するため、および手術後の二次腫
瘍の成長を予防するための医薬組成物に向けられる。
【００７３】 以下の方法および実施例は本発明を説明する。 実施例において使用された一般的方法 （ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡの増幅 ポリメラーゼ連鎖反応は、選択されたセグメントに隣接するように設計された
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、鋳型ＤＮＡ分子からＤＮＡのセグメン
トを増幅するために用いられた。ヌクレオチドは、Amersham Pharmacia Biotech
のＳｕｐｅｒ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ由来であり、反応バッファーはHT Bio
technology Ltd.から得た。
【００７４】 （ｉｉ）ＤＮＡ切断 制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs）によるＤＮＡの切断は、製
造者の指示に従い、供給されたバッファーを用いて行った。 （ｉｉｉ）ＤＮＡ連結 ＤＮＡフラグメントの連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）
および供給された反応バッファーを用い、典型的には、３７℃で１時間または１
６℃で一晩行った。
【００７５】 （ｉｖ）ＤＮＡ精製 ＤＮＡフラグメントは、GeneClean (Bio101) またはGFX PCR DNA and Gel Ban
d Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、アガロースから
、または溶液中で精製した。 （ｖ）プラスミド単離 プラスミドの単離は、Sambrookら（1989）Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 2nd Edition (Cold Spring Harbour Laboratory Press)に記載されてい
るように、または商業的に入手可能なキットによって、製造者の指示に従い、ア
ルカリ溶解法によって行った。典型的には、Promega WizardTM SV Miniprepキッ
トまたはQiagen Plasmid Maxiキットを用いた。
【００７６】 （ｖｉ）部位特異的突然変異誘発 部位特異的突然変異誘発は、Stratagene QuickChangeTMキットを用いて行った
。製造者のガイドラインを用いて、鋳型ＤＮＡ内にヌクレオチド変化を導入する
ように相補性突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの対を設計した。突然変異誘発
プロトコールの第１工程は、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび製造者に
よって供給された反応バッファーの存在下で、相補性突然変異誘発性オリゴヌク
レオチドを用いる鋳型ＤＮＡの増幅を要求する。最終ＤＮＡ鋳型濃度０．４ｎｇ
／μｌおよび最終オリゴヌクレオチド濃度２５０ｎＭを含有する反応物が調製さ
れた。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる増幅は、製造者のガイドラインにしたがっ
て行われた。
【００７７】 （ｖｉｉ）イー・コリ中へのＤＮＡの導入および組換えクローンの選択 プラスミドＤＮＡを用いて、供給者の指示に従い、コンピテントイー・コリ細
胞（典型的には、ＸＬ１Blue株−Stratagene）を形質転換した。形質転換された
細胞は、適当な抗生物質、典型的には１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る培地上で生育できるそれらの能力によって選択された。
【００７８】 （ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡ配列決定は、規約（Lark Technologies, Inc.）下で、自動蛍光ＤＮＡ
配列決定を用いて行った。 （ｉｘ）オリゴヌクレオチドの生産 オリゴヌクレオチドをGenosysから購入した。 （ｘ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Novexシステム (Novex GmbH, Heidleberg, Germany）を
用い、製造者の指示にしたがって行った。４−２０％のアクリルアミド勾配を含
有する予めパックされたゲルを用いた。タンパク質分子量標準（例えば、LMW Ki
t, Pharmacia, Sweden またはNovex Mark 12, Novex, Germany）を包含する電気
泳動用の試料は、通常、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ含有バッファー（５％（ｖ／ｖ）
２−メルカプトエタノールを含有するまたは含有しない）中１：１に希釈し、ゲ
ルに充填する前に、室温で０．５時間放置した。
【００７９】 （ｘｉ）ジスルフィドの還元およびタンパク質中のチオールの修飾 多数のチオールを含有するタンパク質（特に、末端システインおよび内部チオ
ール対を含有するタンパク質）の単離および精製の間、十分に変性されたタンパ
ク質のリフォールディングの間に不適当なジスルフィド対合が起こるので、ジス
ルフィド結合の選択的還元が必要である。さらに、正しいジスルフィド対合が起
こるとしても、タンパク質中の遊離のシステインが例えば、グルタチオンで阻害
される可能性がある。これらの誘導体は、一般に非常に安定である。それらをよ
り反応性にするために、例えば、別の官能基とのその後の結合のために、それら
は、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチ
ル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）を用いて選択的に還元される必要があり、次
いで、適度に活性化されたジスルフィド誘導体を得るために直接使用または修飾
される。エルマン試薬（ＤＴＮＢ）は、かかる遊離チオールとの混合ジスルフィ
ドを与える試薬の例である。ＤＴＮＢでの処理を省略する場合、確実に遊離チオ
ール含有タンパク質の２量体化を最小限にするために、実験計画の慎重な注意が
必要である。上記の「選択的に還元される」なる語は、反応条件、例えば、時間
、温度および反応物のモル比が、タンパク質のＣ末端のジスルフィド架橋のみが
還元されるように、またはタンパク質の天然構造内の所望のジスルフィドのみの
還元が達成されるように、注意深く制御されなければならないことを意味する。
ＴＣＥＰは、Pierce & Warriner (Chester, Cheshire）から入手可能であり、以
下の一般的な実施例は、使用されうる、遊離チオールの発生およびそれらの任意
の修飾に有用な条件の型を説明する。
【００８０】 ＴＣＥＰは、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（約ｐＨ４．５）中の２０ｍＭ溶液として
調製してもよく、−４０℃で保管してもよい。ＤＴＴは、リン酸ナトリウムｐＨ
７．０中の１０ｍＭで調製してもよく、−４０℃で保管してもよい。ＤＴＮＢは
、リン酸ナトリウムｐＨ７．０中の１０ｍＭで調製してもよく、−４０℃で保管
してもよい。上記の全ての試薬は、典型的には、モル等量またはモル過剰で使用
され、理論的に正確な濃度は、実験的に同定する。反応時間および温度は、同様
に、実験的に決定する。一般に、時間は、１〜２４時間の範囲であり、温度は、
２〜３０℃の範囲である。過剰な試薬は、バッファー交換によって、例えば、Se
phadex G25を用いて除去してもよい。適当なバッファーは、０．１Ｍリン酸ナト
リウムｐＨ７．０である。
【００８１】 実施例 実施例１：ヒトプラスミノーゲンクリングル１−３とミリストイルスイッチペ
プチド１（ＭＳＷＰ−１）の複合体の調製 ヒトプラスミノーゲンのＫ１−Ｋ３フラグメント（リジン結合部位１としても
知られている）は、L. Sottrup-Jensenら、1978（引用文中）の方法によって調
製され、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０中の１．７ｍｇ／ｍｌ
（〜５０マイクロモル）の溶液として使用された。 該溶液（５０μｌ）に、最終濃度１００μＭおよび２５０μＭに対応する各々
、１μｌまたは２．５μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中における５ｍＭ
ＴＣＥＰ溶液を添加した。アリコートを密閉したマイクロチューブ中、１６℃
で１４時間インキュベートして、クリングルジスルフィド結合の部分的還元をも
たらした。ミリストイルスイッチペプチド１（ＷＯ９８／０２４５４の実施例２
、２．５μｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．
２中における１０ｍＭ溶液）を最終濃度が約０．５ｍＭ（タンパク質の１０倍過
剰なモル濃度）まで添加された。混合物は、１６℃で１５分間インキュベートし
、次いで、４℃で２時間維持した後、−７０℃で冷凍した。これらの物質のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＳＷＰ−１を添加したがＴＣＥＰを添加しなかった対照
と比べて行った。対照Ｋ１−Ｋ３は、見かけの分子量２９ｋＤａ、３４ｋＤａお
よび３７ｋＤａの３つの主要なバンドおよびSottrup-Jensenらによって記載され
た「プールＩＩ」の成分に対応する高分子量の弱いバンドを示した。２または５
倍過剰なモル濃度のＴＣＥＰでの前処理は、主要な３つのシフトを生じて、見か
けのＭｒ３８ｋＤａ、４３ｋＤａおよび４７ｋＤａを有する新規なバンドを与え
た。より高いモル比のＴＣＥＰを用いる場合、バンドは不明瞭になり、分離した
シフトが観察されなかった。
【００８２】 上記のＫ１−Ｋ３−ＭＳＷＰ１の反応混合物（０．０５ｍｌ）は、０．１Ｍリ
ン酸ナトリウムｐＨ７．０（０．０５ｍｌ）で希釈し、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ムｐＨ７．０で洗浄し、吸引乾燥したトヨパール・ブチル（Toyopearl Butyl）
６５０Ｍマトリックス（８０ｍｇ）と混合した。懸濁液は、４℃で５分間混合し
、次いで、１００００ｇで２分間遠心分離した。上澄液を採取し、保持した。ペ
レット（マトリックス）を２ｘ０．４ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．
０で洗浄し、次いで、吸着したタンパク質を０．１ｍｌの０．６Ｍエタノールア
ミン（最終エタノールアミン濃度が約０．３Ｍになるように）を用いて溶出した
。Ｍｋ１２標準（Novex）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Novex, ４−２０％アクリ
ルアミド勾配）、次いで、クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ２５０での染色
による全ての関連したフラクションの分析は、２つの種、〜４０Ｋ推定Ｋ１−Ｋ
３−ＭＳＷＰ１種および見かけの分子量約５０Ｋの別のポリペプチドがマトリッ
クスに吸着し、エタノールアミンバッファーで溶出したことを示した。Ｋ１−Ｋ
３−ＭＳＷＰ１とトヨパール・ブチル マトリックスとの間の主要な相互作用が
ＭＳＷＰ１部分を介するので、これらの結果は、ＭＳＷＰ１およびＫ１−Ｋ３の
成功した複合体の証拠を提供する。 該結果は、Ｋ１−Ｋ３の１モルあたり２〜４分子のＭＳＷＰ−１が添加された
ことを示唆する。
【００８３】 実施例２：Ｋ７８−Ｒ５６１プラスミノーゲン（Ｃ５５８−［ＭＳＷＰ１］）
の調製 標題化合物の調製は段階的に行う。 （ｉ）遊離のチオールをＣ５５８位置に有するプラスミンＡ鎖（M.Fordgrenら
、FEBS Letters, 213, 254-260, 1987の補正した番号における残基Ｋ７８−Ｒ５
６１）の単離は、ＵＳ４，９０８，２０４に記載の方法と類似の方法を用いて行
う。該方法は、５０ｍＭ ＤＴＴを用いる適当なバッファー条件下での鎖間ジス
ルフィドの還元、次いで、リジン−セファロース上でのクロマトグラフィーを用
いるＢ−鎖からのＡ−鎖の分離を含む。最も重要なことに、単離方法は、遊離チ
オールをＣ５５８位置に有するＡ鎖調製物を生じることができる。
【００８４】 （ｉｉ）プラスミンＡ鎖およびＭＳＷＰ−１分子を適当な条件下で混合して、
標題化合物を生じる。適当な条件は、ＷＯ９８／０２４５４により詳細に記載さ
れており、例えば、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０中、２０℃でのプラス
ミンＡ鎖に対する少し過剰なモル濃度のＭＳＷＰ−１の短時間（２〜４時間）の
反応を包含する。典型的には、０．０５ｍＭプラスミンＡ鎖および０．２ｍＭ
ＭＳＷＰ−１を用いる。本発明の生産物は、第一の例において、約２Ｋリガンド
の添加に対応するＳＤＳ ＰＡＧＥ上での修飾されたプラスミンＡ鎖の移動度に
おける（非修飾と比較した）少しの減少の検出によって同定される。
【００８５】 （ｉｉｉ）本発明の生産物は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーま
たはリジン−アガロース上のアフィニティークロマトグラフィーを用いて、均一
に精製され、臨床上許容される調製物として使用するために、所望によリ、安定
化剤（例えば、マンニトール）のような賦形剤の存在下で、適当なバッファー中
へのバッファー交換によって処方され、所望により、凍結乾燥される。
【００８６】 実施例３：イー・コリ発現系を用いるヒトプラスミノーゲン（Ｓ４５８−Ｃ５
４８）を含むクリングル５の生産およびＭＳＷＰ−１との複合 以下の段階は、標題化合物の調製に含まれる。 （ｉ）クリングル５をコードしているＤＮＡの調製 （ｉｉ）イー・コリ発現のための発現ベクター構築 （ｉｉｉ）イー・コリからのクリングル５の発現、リフォールディングおよび
単離 （ｉｖ）膜結合エレメントでの修飾
【００８７】 （ｉ）クリングル５をコードしているＤＮＡの調製 ヒトプラスミノーゲンのクリングル５をコードしているＤＮＡ配列は、例えば
、ＵＳ５３０２３９０に記載されるハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
ーをコードしているプラスミド（例えば、ｐＤＢ８５０）内に含有される。成熟
ポリペプチドの所望の配列を配列番号１に示す。
【００８８】 配列番号１ SerGluGluAspCysMetPheGlyAsnGlyLysGlyTyrArgGlyLysArgAlaThrThr ValThrGlyThrProCysGlnAspTrpAlaAlaGlnGluProHisArgHisSerIlePheThr ProGluThrAsnProArgAlaGlyLeuGluLysAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAsp ValGlyGlyProTrpCysTyrThrThrAsnProArgLysLeuTyrAspTyrCysAspVal ProGlnCysAlaAlaProSerPheAspCys
【００８９】 クリングル５ＤＮＡは、ベクターｐＤＢ５８０から、ポリメラーゼ連鎖反応お
よびクリングル５配列に部分的に相補的であるが、付加的なアミノ酸残基または
制限部位を導入するために付加的なヌクレオチド配列を含有する下記のような１
対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
【００９０】 プライマー１（配列番号２）は、イー・コリベクターｐＢｒｏｃ４１３に存在
するＮｄｅＩの制限部位を導入し、また、翻訳開始のためのメチオニン残基を所
望の配列のＮ末端に導入する。 プライマー２（配列番号３）は、付加的なアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（配列番号２３）をポリペプチドのＣ末端
に導入する。該配列は、プラスミノーゲンに天然のものであるが、ハイブリッド
プラスミノーゲンアクチベータープラスミドのいくつかにおいて出現しない。末
端システインは、その後の化学的修飾に必要である。アミノ酸のほかに、翻訳終
止コドンおよびＢａｍＨＩ部位を添加する。 クリングル５をコードしている配列は、プライマー１およびプライマー２（配
列番号２および３）を用いて増幅されて、ＰＣＲ産物１を生じた。
【００９１】 配列番号２：プライマー１ GGCATATGTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAAT
【００９２】 配列番号３：プライマー２ GGGGATCCTTAGCAGTCAAACGAAGGTGCAGCACACTGAGGGACATCACAGTAGTCGT
【００９３】 （ｉｉ）イー・コリ発現のための発現ベクター構築 ＰＣＲ産物１を精製し、保持ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）中に直接連
結し、イー・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換するために使用した。プラス
ミドＤＮＡを形質転換された細胞のコロニーのいくつかから調製し、各々のクロ
ーン化されたＰＣＲ産物１の無欠性をＤＮＡ配列決定によって決定した。正しい
ＤＮＡ配列を有するＰＣＲ産物１を運搬するプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩおよ
びＢａｍＨＩで消化して、フラグメント１を生じた。ベクターｐＢｒｏｃ４１３
を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、フラグメント２を生じた。フ
ラグメント１および２は、アガロースゲル電気泳動によって、消化反応の副産物
から分離し、次いで、ゲルから切り出し、精製した。精製されたフラグメント１
および２を連結して、ベクターｐＢＣ８７−０１を生じた。
【００９４】 （ｉｉｉ）イー・コリからのクリングル５の発現、リフォールディングおよび
単離 ｐＢＣＳ７−０１を用いて、コンピテントイー・コリ細胞（典型的にはＢＬ２
１（ＤＥ３）株Stratagene）を製造者によって推奨された条件下で形質転換する
。新しく形質転換された細胞の単一コロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含有する５ｍｌのLuria Broth (Miller修飾）（Sigma）に接種し、３７
℃で一晩生育させた。これを用いて、２リットルの円錐フラスコ中の５００ｍｌ
の同じ培地に接種し、２００ｒｐｍで振盪しながら、６００ｎｍで約０．５の最
適な密度に達するまで、３７℃でインキュベートする。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍ
Ｍになるまで添加し、２００ｒｐｍでさらに３時間振盪させる。６０００ｒｐｍ
での遠心分離によって細胞をペレット化し、クリングル５産物をリフォールドし
、６−アミノヘキシル−セファロースまたは４−アミノベンズアミジン−セファ
ロースを用いてリフォールドしたクリングルを精製する以外は本質的にWilhem O
.G.ら (J. Biol. Chem. 265, 14606-14611, 1990）によって記載されるように、
封入体から回収する。
【００９５】 （ｉｖ）膜結合エレメントでの修飾 クリングル５産物をまず、ＴＣＥＰを用いて還元し、次いで、実施例２に記載
のようにＭＳＷＰ−１と反応させる。修飾された生産物を、１０ｋＤａカットオ
フ膜を用いる限外ろ過によって、または実施例１に記載のようにトヨパール・ブ
チル上の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって単離する。
【００９６】 実施例４：バキュロウイルス発現系を用いるヒトプラスミノーゲン（Ｓ４５８
−Ｃ５４８）を含むクリングル５の生産およびＭＳＷＰ−１へのその稀有t合 以下の段階は、標題化合物の調製に包含される。 （ｉ）クリングル５をコードしているＤＮＡの調製 （ｉｉ）バキュロウイルス／昆虫細胞発現のための発現ベクター構築 （ｉｉｉ）バキュロウイルス／昆虫細胞系からのクリングル５の発現および単
離 （ｉｖ）膜結合エレメントの修飾
【００９７】 （ｉ）クリングル５をコードしているＤＮＡの調製 ヒトプラスミノーゲンのクリングル５をコードしているＤＮＡ配列は、例えば、
ＵＳ５３０２３９０に記載されるハイブリッドプラスミノーゲンアクチベーター
をコードしているプラスミド（例えば、ｐＤＢ８５０）内に含有される。成熟ポ
リペプチドの所望の配列を配列番号１に示す（実施例３参照）。バキュロウイル
スベクターを用いて、所望のポリペプチド配列は、成熟ポリペプチドが培養培地
中に分泌されるように、昆虫細胞中においてシグナルペプチドの後に発現される
。シグナルペプチドは、ｇｐ６４をコードしているバキュロウイルス遺伝子由来
であり、増幅されたクリングル５ＤＮＡフラグメントの発現ベクターｐＢａｃＳ
ｕｒｆ−１（Novagen）中でのクローニングによって、クリングル５コーディン
グ領域に結合する。
【００９８】 クリングル５ＤＮＡは、ベクターｐＤＢ８５０から、ポリメラーゼ連鎖反応お
よびクリングル５配列に部分的に相補的であるが、付加的なアミノ酸残基または
制限部位を導入するために付加的なヌクレオチド配列を含有する下記のような１
対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅された。
【００９９】 プライマー３（配列番号４）は、切断にて、バキュロウイルスベクターｐＢａ
ｃＳｕｒｆ−１中のＰｓｔＩ部位に適合性の結合力のある末端を生じるＮｓｉＩ
部位を導入する。
【０１００】 プライマー４（配列番号５）は、付加的なアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＣｙｓをポリペプチドのＣ末端に導入する。該配
列は、プラスミノーゲンに天然のものであるが、ハイブリッドプラスミノーゲン
アクチベータープラスミドのいくつかにおいて出現しない。末端システインは、
その後の化学的修飾に必要である。アミノ酸のほかに、翻訳終止コドンおよびＢ
ａｍＨＩ部位を添加する。 クリングル５をコードしている配列は、プライマー３およびプライマー４（配
列番号４および５）を用いて増幅されて、ＰＣＲ産物２を生じた。
【０１０１】 配列番号４：プライマー３ GGATGCATTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAAT
【０１０２】 配列番号５：プライマー４ GGGGATCCTTAGCAGTCGAAGGACGGAGCAGCACACTGAGGGACATCACAGTAGTCGT
【０１０３】 （ｉｉ）バキュロウイルス／昆虫細胞発現のための発現ベクター構築 ＰＣＲ産物２を精製し、保持ベクターｐＣＲ２．１（Invistrogen）中に直接
連結し、イー・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換するために使用した。プラ
スミドＤＮＡを形質転換された細胞のコロニーのいくつかから調製し、各々のク
ローン化されたＰＣＲ産物２の無欠性をＤＮＡ配列決定によって決定した。正し
いＤＮＡ配列を有するＰＣＲ産物２を運搬するプラスミドを制限酵素ＮｓｉＩお
よびＢａｍＨＩで消化して、フラグメント３を生じた。ベクターｐＢａｃＳｕｒ
ｆ−１を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化して、フラグメント４を生じ
た。フラグメント３および４は、アガロースゲル電気泳動によって、消化反応の
副産物から分離し、次いで、ゲルから切り出し、精製した。精製されたフラグメ
ント３および４を連結して、ベクターｐＡＳ８７−０１を生じた。
【０１０４】 （ｉｉｉ）バキュロウイルス／昆虫細胞系からのクリングル５の発現および単
離 ｐＡＳ８７−０１を用いて、製造者によって推奨された条件下で、ＢａｃＰａ
ｋキット（Clontech）の成分を使用するＳｆ９細胞中への線状バキュロウイルス
ＤＮＡとのコトランスフェクションにより、バキュロウイルス発現ベクターｖＡ
Ｓ８７−０１を生じる。クリングル５遺伝子を含有する組換えバキュロウイルス
を培養上澄液中に存在する組換えタンパク質のウェスタンブロットまたは活性ア
ッセイによって同定する。ｖＡＳ８７−０１の単一の確認されたクローンをプラ
ーク精製し、スケールアップする。
【０１０５】 Ｓｆ９細胞は、低血清または無血清条件下、５０分の１希釈の酵母ヒドロライ
ゼート（Sigma）、１０００分の１希釈の脂質混合物（Sigma）および１００分の
１希釈のＰｌｕｒｏｎｉｃ（１０％ストック）（Sigma）を補足したＩＰＬ４１
培地（Sigma）中２８℃で生育させる。細胞は、５ｘ１０５〜１ｘ１０６細胞／
ｍｌの密度まで生育させ、細胞あたり５プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染多重
度（ＭＯＩ）にてｖＡＳ８７−０１を感染させる。感染した培養物をさらに、４
８−７２時間生育させた後、上澄液を採取する。６−アミノヘキシル−または４
−アミノベンズアミジン−セファロース上のクロマトグラフィーによって、クリ
ングル５生産物を直接単離する。
【０１０６】 （ｉｖ）膜結合エレメントでの修飾 クリングル５産物をまず、ＴＣＥＰを用いて還元し、次いで、実施例２に記載
のようにＭＳＷＰ−１と反応させる。修飾された生産物を、１０ｋＤａカットオ
フ膜を用いる限外ろ過によって、または実施例１に記載のようにトヨパール・ブ
チル上の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって単離する。
【０１０７】 実施例５：ピチア・パストリス（Pichia pastoris）発現系を用いるヒトプラ
スミノーゲン（Ｓ４５８−Ｃ５４８）を含むクリングルの生産およびＭＳＷＰ−
１との複合 以下の段階は、標題化合物の調製に含まれる。 ｉ）ピチア・パストリスシャトルベクターの調製 ｉｉ）クリングル５をコードしているＤＮＡの調製 ｉｉｉ）ピチア・パストリス発現のための発現ベクター構築 ｉｖ）ピチア・パストリスからのクリングル５の発現および単離 ｖ）膜結合エレメントでの修飾
【０１０８】 （ｉ）ピチア・パストリスシャトルベクターの調製 ヒトクリングル５を発現するために使用されたピチア・パストリス発現ベクタ
ーは、ｐＰＩＣ９Ｋであった。該ベクターは、サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）α−因子接合フェロモンプレプロペプチドシグナル配
列を含有し、それは、外来タンパク質のＮ末端に融合されるとき、宿主細胞から
のその分泌を指示し；該シグナル配列はベクターのマルチプルクローニング部位
に隣接している。外来ＤＮＡの導入に都合のよいＸｈｏＩ制限部位がマルチプル
クローニング部位のわずかに前に位置する。しかしながら、第２のＸｈｏＩ部位
がｐＰＩＣ９Ｋ中のどこかに位置し、第１のＸｈｏＩ部位を選択的に切断するた
めのベクターの消化は効果がない。この問題を克服するために、シグナル配列お
よびマルチプルクローニング部位をコードしているｐＰＩＣ９Ｋの部分を異なる
ベクター中でサブクローン化して、「都合のよい」ＸｈｏＩ部位がただ一つしか
ないシャトルベクターを生じた。
【０１０９】 ベクターｐＰＩＣ９Ｋを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化して、シグ
ナル配列およびベクターのマルチプルクローニング部位をコードしているフラグ
メント５を遊離した。消化されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動に付し、フ
ラグメント５を切り出し、精製した。
【０１１０】 唯一のＢａｍＨＩ部位を含有するがＮｏｔＩ部位を含有しない商業的に入手可
能なベクター、ｐＵＣ１９（New England Biolabs）を部位特異的突然変異誘発
に付して、ＢａｍＨＩ部位の近くに唯一のＮｏｔＩ部位を導入した。２つの相補
的な突然変異誘発性オリゴヌクレオチド、プライマー５（配列番号６）およびプ
ライマー６（配列番号７）を用いて、突然変異誘発を行った。
【０１１１】 配列番号６：プライマー５ CGAGCTCGAATTCACTGGCGGCCGCTTTACAACGTCGTGACTGG
【０１１２】 配列番号７：プライマー６ CCAGTCACGACGTTGTAAAGCGGCCGCCAGTGAATTCGAGCTCG
【０１１３】 突然変異誘発反応によって生じたベクター、ｐＵＣ１９Ｎを制限酵素ＢａｍＨ
ＩおよびＮｏｔＩで同時に消化し、Ｓｉｚｅ−Ｓｅｐカラム（Amersham Pharmac
ia Biotech）を用い、製造者の指示にしたがって精製した。精製したフラグメン
トおよびＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＵＣ１９Ｎを連結して、ピチア・パス
トリスシャトルベクターｐＵＣＰＩＣを生じ、それを用いて、コンピテントイー
・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene）を形質転換した。形質転換細胞の単
一コロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌのＬ
Ｂ培地に接種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩生育させ、ｐＵＣＰ
ＩＣプラスミドＤＮＡを調製するために使用した。
【０１１４】 （ｉｉ）クリングル５をコードしているＤＮＡの調製 成熟クリングル５ポリペプチドの所望の配列を配列番号１に示す（実施例３参
照）。クリングル５ＤＮＡは、ベクターｐＢＣ８７−０１（実施例３参照）から
、ポリメラーゼ連鎖反応およびクリングル５配列に部分的に相補的であるが、付
加的なアミノ酸残基または制限部位を加えるために付加的なヌクレオチドを含有
する下記のような１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
【０１１５】 プライマー７（配列番号８）は、唯一のＸｈｏＩ制限部位を導入し、クリング
ル５をコードしている領域に隣接し、その上流のＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドをコ
ードするように設計された。該ジペプチドは、培養培地中へのその分泌前に、確
実にシグナル配列が成熟クリングル５ポリペプチドから切断するために必要であ
る。
【０１１６】 プライマー８（配列番号９）は、唯一のＥｃｏＲＩ制限部位を導入し、翻訳終
止コドンをクリングル５のＣ末端システイン残基に隣接し、その下流に導入する
ように設計された。
【０１１７】 配列番号８：プライマー７ GGGTATCTCTCGAGAAAAGATCCGAAGAAGACTGTATGTTTG
【０１１８】 配列番号９：プライマー８ GCCCTAGGGAATTCAGCAGTCGAAGGACGGAGC
【０１１９】 クリングル５をコードしている配列をｐＢＣ８７−０１から、ポリメラーゼ連
鎖反応およびプライマー７および８（配列番号８および９）を用いて増幅して、
ＰＣＲ産物３を生じた。 （ｉｉｉ）ピチア・パストリス発現のための発現ベクター構築 ＰＣＲ産物３を精製し、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化して
、フラグメント６を生じた。消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に付した
。フラグメント６を切り出し、精製した。シャトルベクターｐＵＣＰＩＣを制限
酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、Ｓｉｚｅ−Ｓｅｐカラム（Amer
sham Pharmacia Biotecｈ）を用い、製造者の指示にしたがって精製した。精製
したフラグメント６およびＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＵＣＰＩＣを連結し
て、ベクターｐＵＣＰＩＣ８７−０１を生じ、それを用いてコンピテントイー・
コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene）を形質転換した。
【０１２０】 ベクターｐＵＣＰＩＣ８７−０１中におけるクリングル５をコードしているＤ
ＮＡの無欠性は、ＤＮＡ配列決定（Lark Technologies, Inc.）によって証明さ
れた。ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化して、フラグメント
７を生じ、それをアガロースゲル電気泳動に付し、精製した。ベクターｐＰＩＣ
９Ｋを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｓｉｚｅ−Ｓｅｐカラム（
Amersham Pharmacia Biotecｈ）を用い、製造者の指示にしたがって精製した。
精製したフラグメント７およびＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＰＩＣ９Ｋを連
結して、ベクターｐＡＧ８７−０１を生じ、それをイー・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ
細胞（Stratagene）中でクローン化した。
【０１２１】 （ｉｖ）ピチア・パストリスからのクリングル５の発現および単離 ピチア・パストリス（ＳＭＤ１１６８株−Invitrogen）のスフェロプラストを
調製し、Multi-Copy Pichia Expression Kit Instruction Manual（Invitrogen
）にしたがって、１０μｇの精製されたＳａｌＩ消化したｐＡＧ８７−０１でト
ランスフェクトした。ピチア・パストリスＳＭＤ１１６８細胞は、そのヒスチジ
ノールデヒドロゲナーゼ遺伝子において突然変異を有し、それらをアミノ酸ヒス
チジンの不在下で生育できなくする。ベクターｐＡＧ８７−０１は、ヒスチジノ
ールデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能的コピーを運搬するので、該ベクターで形質
転換した細胞をヒスチジン欠乏培地上で生育できるその能力について選択した。
【０１２２】 形質転換細胞からのクリングル５の発現は、Multi-Copy Pichia Expression K
it Instruction Manualにおいて与えられた実験ガイドラインを用いて調べた。
ｐＰＩＣ９Ｋ由来のベクターを用いるピチア・パストリスからの外来遺伝子の発
現は、２つの段階：（ｉ）典型的に緩衝化最少グリセロール（ＭＢＧ）培地を用
いる生育相および（ｉｉ）典型的に緩衝化最少メタノール（ＢＭＭ）培地を用い
る誘導相において達成される。細胞は、ＢＭＧ培地中で迅速に生育するが、外来
遺伝子のプロモーター制御性転写のスイッチが切れるので、外来タンパク質は生
産できない。細胞はＢＭＭ培地中でゆっくりと生育するが、外来遺伝子のプロモ
ーター制御性転写のスイッチが入る。外来タンパク質の発現についてスクリーン
するための典型的な実験は、バイオマスを蓄積するための生育相、次いで、外来
タンパク質を蓄積するための誘導相を使用する。
【０１２３】 形質転換細胞の１０個のコロニーをランダムに取り上げ、５０ｍｌファルコン
チューブ中の５ｍｌのＢＭＧ培地に接種した。培養物を２５０ｒｐｍで振盪しな
がら３０℃で３６時間インキュベートし、１５００ｇで１０分間の遠心分離によ
って細胞をペレット化し、上澄液を廃棄し、細胞を５ｍｌのＢＭＭ培地（１％ｖ
／ｖメタノールを含有する）中に再懸濁した。培養物を２５０ｒｐｍで振盪しな
がら３０℃で、２４時間後に１％（ｖ／ｖ）メタノールを添加して４８時間イン
キュベートした。遠心分離によって細胞をペレット化し、培養上澄の試料をクリ
ングル５の存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１０個のクローン
全てが、これらの条件下、培養培地１Ｌあたり１−２ｍｇの可溶性タンパク質の
発現レベルでクリングル５を生産した。
【０１２４】 １クローンを用いて３０ｍｌのＢＭＧ培地に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しな
がら３０℃で２４時間インキュベートして、大量誘導実験のスターター培養物を
生産した。各々、７５０ｍｌのＢＭＧを含有する４個の５リットルの円錐フラス
コに各々、７．５ｍｌのスターター培養物を接種し、２００ｒｐｍで振盪しなが
ら３０℃で３６時間インキュベートした。１５００ｇで１０分間の遠心分離によ
って細胞を回収し、培養上澄液を廃棄し、細胞を７５０ｍｌのＢＭＭアリコート
（１％ｖ／ｖメタノールを含有する）中に再懸濁した。４つのアリコートを４つ
の５リットル円錐フラスコに戻し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で６０時
間インキュベートし、このとき、２４時間後および４８時間後に１％（ｖ／ｖ）
メタノールを添加した。次いで、１５００ｇで２０分間の遠心分離によって細胞
を除去し、培養上澄液をプールし、４℃で保管した。
【０１２５】 プールした培養上澄液のｐＨを５Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ３．０に調整し、次
いで、酸性化した上澄液を２０ｍＭ酢酸中で予め平衡化したMacroprep Hi-S陽イ
オン交換マトリックス（BioRad）中を通過させた。カラムを２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムバッファー、ｐＨ４．６で洗浄し、結合したクリングル５タンパク質を、１
Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．６での洗
浄によって溶出し、溶出されたフラクションは、生産物とみなされた。ＳＤＳ
ＰＡＧＥ、次いで、タンパク質の染色による生産物の分析は、およその分子量８
０００Ｄａおよび１００００Ｄａを有する２つの主要なポリペプチド種を明らか
にした。バンド強度の概算に基づいて、生産物は、約５ｍｇのクリングル５を含
有した。クリングル５のさらなる精製は、６−アミノヘキシル−または４−アミ
ノベンズアミジン−セファロース上でのクロマトグラフィーによって達成される
。
【０１２６】 （ｖ）システイン尾部を有するクリングル５のＭＳＷＰ−１での修飾 陽イオン交換精製工程由来のクリングル５を３ｋＤａのカットオフ膜を用いる
攪拌セル（Amicon）中における限外ろ過によって濃縮した。物質試料を１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中においてバッファー交換して、ク
リングル５の１８０μＭ溶液（約１．８ｍｇ／ｍｌ）を生じた。３つの２００μ
ｌアリコートを取り、ＴＣＥＰのクリングル５に対する最終モル比が１．５、２
．０または３．０であるように、１０ｍＭ ＴＣＥＰを各々に添加した。これら
の反応物を室温で一晩インキュベートし、次いで、エタノールアミンの最終濃度
５０ｍＭにした。各反応物をＭＳＷＰ−１処理のための３つの試料に分けた：Ｍ
ＳＷＰ−１のクリングル５に対する最終モル比が各々、ゼロ、２．０または４．
０になるように、これらの１つは未処理のままで、他の２つには、ＭＳＷＰ−１
を添加した。これらの反応物を室温で２時間インキュベートし、非還元性ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、次いでタンパク質の染色によって分析した。およその分子量が約１
２０００Ｄａである新規な種がＭＳＷＰ−１で処理した試料に見られたが、ＭＳ
ＷＰ−１を省略した試料には見られなかった。これは、ＭＳＷＰ−１とクリング
ル５ｃｙｓの成功した複合体と一致した。修飾産物は、トヨパール・ブチル上の
疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、実施例１に記載の方法と同様に単
離する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/775 Ｃ０７Ｋ 14/78 14/78 16/36 16/36 Ｃ１２Ｎ 9/68 Ｃ１２Ｎ 9/68 9/72 9/72 9/74 9/74 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ジェレミー・リチャード・ブライト イギリス、エイチピー４・３エイエイ、ハ ートフォードシャー、バーカムステッド、 チェシャム・ロード、ザ・ヘイブン (72)発明者 マイケル・スチュワード イギリス、シービー11・４エックスイー、 エセックス、サフロン・ウォルデン、リト ルベリー・グリーン、トーマス・ウォー ク、ホワイトビーム・コテージ (72)発明者 ビビアン・フランシス・コックス イギリス、ティエヌ13・２エックスピー、 ケント、セブンオークス、ダントン・グリ ーン、パウンズリー・ロード、ベック・コ テージ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 DA02 DA06 DA12 EA02 EA04 FA18 GA11 HA01 4B050 CC03 CC08 DD07 LL01 4C076 AA01 AA07 AA08 AA12 AA17 AA25 AA37 BB01 BB11 CC27 CC29 CC41 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA40 DA65 DA89 EA28 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリペプチドと共有結合した低い膜アフィニティーを有する
    ２以上の異種膜結合エレメントを含み、該エレメントが独立して、熱力学的な付
    加と共に管内皮の成分と相互作用できる、可溶性抗−脈管形成ポリペプチドの可
    溶性誘導体。
  2. 【請求項２】 可溶性ポリペプチドがヒトプラスミノーゲンの非触媒領域（
    該タンパク質のＮ末端の５６０残基以内）；特に、プラスミノーゲンの金属プロ
    テアーゼ消化によって生じたそのフラグメント；アポリポタンパク質（ａ）の肝
    細胞成長因子、プロトロンビン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、尿中
    型プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲン配列とのそのハイブ
    リッドのようなクリングルドメインを含有する関連のタンパク質のフラグメント
    ；正電荷〜中性または負電荷の突然変異を位置２０、２１、７８および７９に含
    有する上記のクリングルドメインの突然変異型（Caoら、1997によって用いられ
    た番号付け）；コラーゲン、特に、コラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメント；プロ
    ラクチンのフラグメント、プロラクチンの１６ｋＤａ Ｎ末端領域；脈管形成媒
    介物質の受容体に対する中和抗体；脈管形成に関与するインテグリンのアンタゴ
    ニスト；およびそのハイブリッド、誘導体またはムテインから選択される請求項
    １記載の誘導体。
  3. 【請求項３】 低い膜アフィニティーを有する各膜結合エレメントが１μＭ
    −１ｍＭの解離定数を有する請求項１または２記載の誘導体。
  4. 【請求項４】 各膜結合エレメントが＜５ｋＤａのサイズを有する上記請求
    項いずれか１項記載の誘導体。
  5. 【請求項５】 膜成分に対して低いアフィニティーを有する十分量のエレメ
    ントを組み込んで、特定の膜に対する０．０１−１０ｎＭの解離定数を生じる上
    記請求項のいずれか１項記載の誘導体。
  6. 【請求項６】 医薬処方媒体中＞１００μｇ／ｍｌの溶解度を有する上記請
    求項のいずれか１項記載の誘導体。
  7. 【請求項７】 少なくとも１つのエレメントが親水性である上記請求項のい
    ずれか１項記載の誘導体。
  8. 【請求項８】 ２〜８個の膜結合エレメントを含む上記請求項のいずれか１
    項記載の誘導体。
  9. 【請求項９】 膜結合エレメントが、脂肪酸誘導体；塩基性アミノ酸配列；
    既知の内在性膜タンパク質のリガンド；膜タンパク質のエピトープに対して生じ
    たモノクローナル抗体の相補性決定領域由来の配列；およびランダム化学または
    ペプチドライブラリーのスクリーニングによって同定された膜結合配列から選択
    される上記請求項のいずれか１項記載の誘導体。
  10. 【請求項１０】 膜結合エレメントが、約８〜１８個のメチレン単位を有す
    る脂肪族アシル基、長鎖（８−１８メチレン）脂肪族アミンおよびチオール、ス
    テロイドおよびファルネシル誘導体から選択される脂肪酸誘導体である請求項９
    記載の誘導体。
  11. 【請求項１１】 膜結合エレメントがｎが３〜１０の（Ｌｙｓ）ｎを包含す
    る塩基性アミノ酸配列である請求項９または１０記載の誘導体。
  12. 【請求項１２】 結合エレメントが： ｉ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＧ ｉｉ）ＧＳＳＫＳＰＳＫＫＫＫＫＫＰＧＤ ｉｉｉ）ＳＰＳＮＥＴＰＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＧ ｉｖ）ＤＧＰＫＫＫＫＫＫＳＰＳＫＳＳＫ ｖ）ＳＫＤＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫ （左がＮ末端）（配列番号１０〜１４） から選択される請求項１１記載の誘導体。
  13. 【請求項１３】 膜結合エレメントが、ジスルフィド強制配列ＡＣＤＣＲＧ
    ＤＣＦＣＧ（配列番号１５）；血小板中のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ膜タンパク質に
    結合するヒトフィブリノーゲンアルファ鎖由来のＤＧＰＳＥＩＬＲＤＦＳＳ（配
    列番号１６）；フィブロネクチンまたはビトロネクチン結合タンパク質由来およ
    び膜タンパク質内のエピトープに対して生じたモノクローナル抗体の相補性決定
    領域由来の配列；αｖβ３インテグリンまたはＲＧＤ配列を有するリガンドから
    選択される管内皮および脈管形成プロセスに関連することが知られている内在性
    膜タンパク質のリガンド由来である請求項９〜１１のいずれか１項記載の誘導体
    。
  14. 【請求項１４】 構造： ［Ｐ］−｛Ｌ−［Ｗ］｝ｎ−Ｘ ［式中、Ｐは可溶性抗−脈管形成ポリペプチドであり、各Ｌは独立して任意のフ
    レキシブルな連結基であり、各Ｗは独立してペプチド膜結合エレメントであり、
    ｎは１以上の整数であり、Ｘは、いずれかのＷに共有結合していてもよいペプチ
    ドまたは非ペプチド膜結合体である］ を有する上記請求項のいずれか１項記載の誘導体。
  15. 【請求項１５】 ペプチド膜結合エレメントが８〜２０個のアミノ酸長であ
    って、エレメントＷが可溶性抗−脈管形成ポリペプチドのＮまたはＣ末端のいず
    れかに連続して位置し、アミノ酸配列が、４〜２０個のアミノ酸の親水性および
    ／またはフレキシブルなアミノ酸配列；直鎖状親水性合成ポリマー；および化学
    的架橋基から選択される連結基によって、互いにおよび可溶性抗−脈管形成ペプ
    チドに連結している請求項１４記載の誘導体。
  16. 【請求項１６】 化学的架橋基が式（Ｉ）： −Ａ−Ｒ−Ｂ− ［式中、ＡおよびＢの各々（同一でもよく、または異なっていてもよい）は、−
    ＣＯ−、−Ｃ（＝ＮＨ２ ＋）−、マレイミド、−Ｓ−または結合を示し、Ｒは結
    合または１以上の−（ＣＨ２）−またはメタ−、オルト−もしくはパラ−二置換
    フェニル単位を所望により親水性部分と一緒に含有する連結基である］ で示される基である請求項１４または１５記載の誘導体。
  17. 【請求項１７】 Ｒが−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｓ−Ｓ−（
    ＣＨ２）ｑ−および−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２） ｑ −（ここに、ｒは少なくとも２の整数であり、ｐおよびｑは独立して、少なく
    とも２の整数である）または（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−（４−フ
    ェニル）（ここに、ｎは３〜８の整数である）から選択される請求項１６記載の
    誘導体。
  18. 【請求項１８】 組換え宿主細胞中において誘導体のポリペプチド部分をコ
    ードしているＤＮＡを発現し、生産物を回収し、その後、膜結合エレメントを化
    学的に導入するように翻訳後にポリペプチドを修飾することを特徴とする請求項
    １〜１７のいずれか１項記載の誘導体の調製法。
  19. 【請求項１９】 １のペプチド膜結合エレメントに結合されたペプチドによ
    って連結された可溶性抗−脈管形成ペプチドを含む請求項１記載の誘導体のポリ
    ペプチド部分。
  20. 【請求項２０】 Ｃ末端システインを包含する請求項１または１９記載の可
    溶性ポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜１７のいずれか１項記載のポリペプチド部分を
    コードしているＤＮＡポリマー。
  22. 【請求項２２】 宿主細胞中において請求項２１記載のＤＮＡを発現できる
    複製可能な発現ベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項２２記載の複製可能な発現ベクターで形質転換され
    た宿主細胞。
  24. 【請求項２４】 チオール基にて活性化されていてもよい末端システイン残
    基；ペプチドのＮ末端またはリジン残基のε−アミノ基に位置するＮ−ハロアセ
    チル基（ここに、ハロは塩素、臭素またはヨウ素を示す）；Ｃ末端のアミド基；
    Ｎ末端保護基；およびＮ末端またはリジン残基のε−アミノ基の脂肪酸Ｎ−アシ
    ル基から選択される１以上の誘導体化を含む低い膜アフィニティーを有するペプ
    チド膜結合エレメントを含む請求項１〜１７のいずれか１項記載の誘導体。
  25. 【請求項２５】 請求項２４に記載のように誘導体化されたペプチド膜結合
    エレメントを含み、ここに、ペプチドが請求項１１または１２に定義されたペプ
    チドのアミノ酸配列およびＮ末端またはペプチドのリジン残基のε−アミノ基に
    ８〜１８個のメチレン単位の脂肪酸Ｎ−アシル基を有する請求項２４記載の誘導
    体。
  26. 【請求項２６】 アミノＣ２−６アルカンチオールのＣ１０−２０脂肪性ア
    シル誘導体（Ｃ−置換されていてもよい）を含む請求項２５記載の誘導体。
  27. 【請求項２７】 Ｎ−（２−ミリストイル）アミノエタンチオールおよびＮ
    −ミリストイルＬ−システインから選択される請求項２６記載の誘導体。
  28. 【請求項２８】 請求項１〜１７のいずれか１項記載の誘導体を医薬上許容
    される担体または賦形剤と共に含んでなる医薬組成物。
  29. 【請求項２９】 原発性または二次腫瘍の治療における薬剤としての使用の
    ための請求項１〜１７のいずれか１項記載の誘導体。
  30. 【請求項３０】 請求項１〜１７のいずれか１項記載の可溶性ペプチドの可
    溶性誘導体を投与することを特徴とする原発性または二次腫瘍の治療法。
  31. 【請求項３１】 原発性または二次腫瘍の治療のための薬剤の調製のための
    請求項１〜１７のいずれか１項記載の誘導体の使用。
  32. 【請求項３２】 原発性または二次腫瘍の治療のための薬剤の製造における
    使用のための請求項１〜１７のいずれか１項記載の誘導体。
  33. 【請求項３３】 可溶性抗−脈管形成ペプチドを複数の膜結合エレメントに
    共有結合させることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項記載の可溶性誘
    導体の製造法。
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