JPH0698002B2 - ヒトプロティンｃ活性の発現ベクター - Google Patents

ヒトプロティンｃ活性の発現ベクター

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトプロテインＣ活性をコードしているDNA
化合物および組換えDNAクローニングベクターに関する
ものである。本発明のベクターによれば、真核性または
原核性宿主細胞のいずれにおいても、この新規なDNA化
合物を発現させることができる。本発明はまた、これら
のクローニングベクターで形質転換された宿主細胞に関
するものである。本発明に係る形質転換宿主細胞は、ヒ
トプロテインＣまたはその前駆体、誘導体あるいはサブ
フラグメントを発現する。本発明に係るDNAの多くは、
これまで、自然界においても、また実験室においても合
成されたことのないヒトプロテインＣ誘導体の合成に利
用し得るものである。
発明の構成並びに目的 ビタミンＫ依存性の血漿タンパクであるプロテインＣ
は、生理学的に非常に重要なタンパク質である。おそら
く、プロテインＣは、他のタンパク質と一緒になつて、
血栓症の誘因である、血液凝固（凝血）に対する最も重
要なダウンレギユレーター（降下調整剤、down regulat
or）として作用すると思われる。換言すると、プロテイ
ンＣ酵素系は、抗凝血作用に関する主要な生理学的機構
に係つている。
プロテインＣの生物学的重要性および潜在的な治療上の
重要性は、臨床上の所見から推察される。先天性のホモ
接合体性プロテインＣ欠損症の場合には、罹患した家族
において、幼児期早期における急奔性紫斑病（しばしば
致死的な播種性の血管内凝固の型をとる）による死亡が
みられる。ヘテロ接合体性のプロテインＣ欠損症の場合
には、罹患した人々は重篤な、再発性の血栓塞栓症に苦
しむことになる。Ｂ型血友病または第IX因子欠損症の治
療のための血液濃縮物であつて、不純物としてプロテイ
ンＣを含んでいるものは、ヘテロ接合体性プロテインＣ
欠損症に有効であると同時に、ホモ接合体性の血管内凝
血を阻止し、治療するのにも有効であるということが臨
床上、充分に確立されている。
また、血栓塞栓症、あるいは、血栓塞栓症に至る前置的
な病的状態、即ち、播種性血管内凝固（凝血）、大け
が、大手術を受けた状態、およびがん等の状態にある場
合にも、プロテインＣレベルが異常に低くなるというこ
とが分つている。
ヒトプロテインＣは肝臓で生合成され、血漿中に存在し
ている、セリンプロテアーゼ（セリン分解酵素）前駆体
（酵素原）である。プロテインＣの生物学的な活性が完
全に発現されるためには、ビタミンＫ要求性の翻訳後
（ポスト−トランスレーシヨン）修飾がなされる必要が
ある。ジスルフイド結合を有する二本鎖の成熟プロテイ
ンＣ酵素原は、一本鎖前駆体の制限的タンパク分解によ
つて生成される。この制限的タンパク分解には、肝臓か
らの新生（形成途上にある）ポリペプチドが分泌される
間に、〜33アミノ酸残基からなるシグナルペプチド（下
記の残基１〜33）の開裂（切断）、〜９アミノ酸残基か
らなるプロペプチド（残基34〜42）の除去、並びに残基
198および199の除去が起こることによつて酵素原中に認
められる２本鎖が形成される過程が含まれていると考え
られる。酵素原が活性化されて活性なセリンプロテアー
ゼになる過程には、ARG−LEuペプチド結合（残基211お
よび212）のタンパク分解的な開裂が含まれる。この開
裂により、２本鎖分子の大きい方の鎖のアミノ末端を構
成するドデカペプチド（残基200〜211）が放出される。
プロテインＣは著しくグリコシル化されており；成熟酵
素は〜23％の炭水化物を含有している。また、プロテイ
ンＣはγ−カルボキシグルタミン酸やβ−ヒドロキシア
スパラギン酸等の多くの一般的でないアミノ酸をも含ん
でいる。γ−カルボキシグルタミン酸（gla）は、コフ
アクターとしてビタミンＫを必要とする、肝ミクロソー
ムのカルボキシラーゼによつて、グルタミン酸残基から
産生される。通常、原核生物は、組換え遺伝子から発現
されたタンパク質をグルコシル化、γ−カルボキシル化
あるいはβ−ヒドロキシグリコシル化しないので、通常
のヒトプロテインＣの翻訳後修飾があまり多くなされて
いない形のプロテインＣ誘導体の合成を初めて可能にし
た、という点で本発明は意義深いものといえる。これら
の特異な誘導体は、以下に詳しく述べる様に、極めて大
きい研究的価値と臨床上の価値を有している。
本明細書中に開示した発明の目的に沿つて、下記の如
く、用語を定義する。
ApR:アンピシリン耐性表現型またはアンピシリン耐性
（表現型）を付与する遺伝子。
ep:t-抗原（Ｆ）遺伝子のSV40初期プロモーター、t-抗
原結合部位、およびSV40複製起源からなるDNAセグメン
ト。
機能的ポリペプチド：回収可能な、生物学的に活性なヘ
テロローガス（異質の）またはホモローガス（同質の）
ポリペプチドまたは前駆体、ヘテロローガス・ポリペプ
チドとホモローガス・ポリペプチドの一部または全体と
からなる、回収可能な生物活性ポリペプチド、あるい
は、ヘテロロ−ガス・ポリペプチドと、特異的に開裂さ
れ得る生物学的に不活性なポリペプチドからなる回収可
能な生物学的に不活性な融合ポリペプチド。
G418R:G418耐性表現型またはG418耐性を付与する遺伝
子。これは、KmRと同意義に用いられる。
IVS:イントロンをコードしているDNA、介在配列とも称
される。
MSV LTR:ネズミ肉腫ウイルスの長い末端重復（terminal
repeat）のプロモーター活性を含有しているDNAセグメ
ント。
新生（形成途上にある）タンパク質:mRNA転写物の翻訳
によつて生産さされたポリペプチドであつて、まだ、如
何なる翻訳修飾もなされていない段階のポリペプチド。
pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA配列。
プロモーター:DNAのRNAへの転写を指令するDNA配列。
プロテインＣ活性：ヒトプロテインＣの生物学的機能、
および抗‐ヒトプロテインＣ抗体ら結合活性に関与す
る、ヒトプロテインＣのあらゆる性質を指す。
組換えDNAクローニングベクター:1またはそれ以上の付
加的なDNAセグメントを付加され得る、または既に付加
されたDNA分子からなる、自律的に複製可能なあらゆる
物質を指し、プラスミドおよびフアージを含むが、これ
らに限定されるものではない。
組換えDNA発現ベクター：プロモーターが挿入されてい
る組換えDNAクローニングベクター。
レプリコン：プラスミドまたはその他のベクターの自律
的な複製をコントロールすると共に、その様な複製を行
わせるDNA配列。
制限フラグメント:1またはそれ以上の制限エンドヌクレ
アーゼ酵素の作用によつて生成された全ての線状DNA配
列。
RSV LTR:ラウス肉腫（Rous Sarcoma）ウイルスの長い末
端重複のプロモーター活性を含有しているDNA配列。
感受性宿主細胞：特定の抗生物質または他の毒性化合物
に対する耐性を付与するDNAセグメントの存在なしに
は、これらの存在下で増殖することができない宿主細
胞。
構造遺伝子：機能的ポリペプチドをコードしているあら
ゆるDNA配列であつて、翻訳開始シグナルおよび翻訳停
止シグナルをも含有する。
TcR:テトラサイクリン耐性表現型またはテトラサイクリ
ン耐性を付与する遺伝子。
形質転換：受容宿主細胞にDNAを導入することであつ
て、その結果、受容細胞の遺伝型に変化をもたらすこ
と。
形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。
翻訳活性化配列：リボソーム結合部位および５′‐ATG-
3′の如き翻訳開始コドンを包含するDNA配列であつて、
mRNA転写物のペプチドまたはポリペプチドへの翻訳に与
る、あらゆるDNA配列。
酵素原：タンパク分解酵素の酵素活性を持たない前駆
体。
図面についての簡単な記述 第１図‐プラスミドpHC7の制限サイトおよび機能地図。
第２図‐プラスミドpSV2-HPC8の制限部位および機能地
図。
第３図‐プラスミドpL133の制限サイトおよび機能地
図。
第４図‐プラスミドpL132の制限サイトおよび機能地
図。
第５図‐プラスミドpL141の制限サイトおよび機能地
図。
第６図‐プラスミドpL142の制限サイトおよび機能地
図。
第７図‐プラスミドMSV-HPCの制限サイトおよび機能地
図。
第８図‐プラスミドpMMT△BPV-HPCの制限サイトおよび
機能地図。
第９図‐プラスミドpL151の制限サイトおよび機能地
図。
第10図‐プラスミドpCZ101の制限サイトおよび機能地
図。
第11図‐プラスミドpCZ10の制限サイトおよび機能地
図。
第12図‐pCZ459の制限サイトおよび機能地図。
本発明はヒトプロテインＣ活性を有するポリペプチドを
コードしている。組換えDNAベクター類に関するもので
ある。便宜上、本発明ベクターの暗号鎖だけを示すと、
それらベクターは以下の式で示される配列を有する： で示される配列を有し、Ｍは０または１、Ｎは０または
１を表わす。ただし、Ｍが０であるときにはＮも０であ
り;Rが式： で示される配列を有する。）。
本発明の組換えDNAベクターは、相互に （Ａ）暗号鎖 （Ｂ）真核性の転写および翻訳活性化配列；または、 （Ｃ）原核性の転写および翻訳活性化配列；並びに、 （Ｄ）該ベクターの、宿主内での自律的な複製または染
色体への組込みを与えるDNA配列 からなる複数のDNA配列をライゲート（結合）させるこ
とにより調製される。
本発明はまた、真核性宿主細胞内で、ヒトプロテインＣ
活性を持つているポリペプチドを生産する方法であつ
て： A.転写および翻訳活性化配列が転写および翻訳解読相内
に位置している、上記変法の（Ｂ）に従つて調製された
組換えDNAベクター（ただし、Ｎが１の場合、翻訳活性
化配列は翻訳開始コドンをコードしていない）によつて
真核性宿主細胞を形質転換し；次いで、 B.工程Ａで形質転換された宿主細胞を遺伝子の発現に適
した条件下において培養することからなる方法を提供す
るものである。この方法の一つの実施態様では、組換え
DNAベクターは、選択可能なマーカーを含有している。
本発明はまた、原核性宿主細胞内で、ヒトプロテインＣ
活性を有するポリペプチドを生産する方法であつて、別
法（Ｃ）に従つて調製されたベクター（ただし、Ｎは０
であつて、Ｍは０または１であり、しかも、選択マーカ
ーを含有している）を用いる点においてのみ上記の方法
と異なる方法を提供するものである。
本発明ベクターはヒトプロテインＣをコードしており、
ＭおよびＮが１の場合には、これまで知られていなかつ
た新生ヒトプロテインＣのアミノ酸配列をコードしてい
る。以後の記述を容易にするために、新生ヒトプロテイ
ンＣのアミノ酸配列に番号を付して示すと、該配列は
式： （式中、H2Nはアミノ末端、‐COOHはカルボキシ末端、A
LAはアラニン、ARGはアルギニン、ASNはアスパラギン、
ASPはアスパラギン酸、CYSはシステイン、GLNはグルタ
ミン、GLUはグルタミン酸、GLYはグリシン、HISはヒス
チジン、ILEはイソロイシン、LEUはロイシン、LYSはリ
シン、METはメチオニン、PHEはフエニルアラニン、PRO
はプロリン、SERはセリン、THRはスレオニン、TRPはト
リプトフアン、TYRはチロシン、そしてVALはバリンを表
わす） で示される。
本発明のDNA化合物は、ヒトプロテインＣ活性をコード
しているヒト肝臓mRNAから調製されたcDNAクローンから
導かれる。cDNAクローン（類）を組立てるために、プロ
テインＣをコードしているcDNAの末端に、５′ポリＧ配
列、３′ポリＣ配列、並びに５′および３′の両側にお
けるPst I制限酵素認識配列を組立てた。これらcDNAク
ローンの内、２個を操作し、新生期のヒトプロテインＣ
の暗号配列と、その暗号領域の５′および３′末端に位
置する、非翻訳mRNAをコードしているDNA部分との両方
と含むDNA分子を組立てた。このDNA分子をプラスミドpB
R322のPst I部位に挿入し、プラスミドpHC7を組立て
た。従つて、プラスミドpHC7は、前記の暗号配列（Ｍと
Ｎの両方が１である配列）、並びに、これも分子を１本
鎖だけで示すと、式： （式中、Ａはデオキンアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、そしてＴはチミジルを表わ
す） で示される付加的な配列を、新生期のヒトプロテインＣ
暗号配列の暗号鎖の５′および３′末端にそれぞれ有し
ている。DNA塩基対形成における相補性から、２本鎖DNA
分子の鎖の内、１方の鎖の配列があればそれと対向する
鎖の配列は十分決定できる。プラスミドpHC7、ノーザン
・リージヨナル・リサーチ・ラボラトリイ（NRRL、Nort
hern Regional Research Laboratory）、ペオリア、イ
リノイスに寄託され、このパーマネント・ストツク・カ
ルチヤー・コレクシヨンの一部となつている菌株、大腸
菌（E.coli）K12 RR1/pHC7から常法通り単離できる。大
腸菌K12 RR1/pHC7の培養物は、NRRLから、寄託番号NRRL
B-15926の下に入手可能である。プラスミドpHC7の制限
サイトおよび機能地図を添付の第１図に示す。
上記の如く、プロテインＣ活性をコードしているDNAを
含んでる様々な組換えDNA発現ベクターを組立てた。本
発明のベクター類は２つのタイプ：真核性、殊に、哺乳
類宿主細胞に形質転換する様、計画されたもの、並びに
大腸菌を形質転換する様、計画されたもの、に分けられ
る。本明細書で例示した真核性または哺乳類ベクターで
大腸菌を形質転換することもできるが、これらのプラス
ミド中に存在している、プロテインＣ活性の暗号DNAの
転写のための真核性プロモーターは、大腸菌内では効率
よく機能しない。
本発明に係る、新生ヒトプロテインＣをコードしている
DNA化合物は、哺乳類およびその他の真核性宿主細胞を
形質転換し、さらに、それら細胞内でプロテインＣ活性
を発現させるのに、特に好適である。多くの哺乳類宿主
細胞は、新生ヒトプロテインＣのアミノ末端に存在して
いるシグナルペプチドを認識し、適切にプロセシングす
るために必要な細胞機構を有している。ある種の哺乳類
宿主細胞は、血漿中に存在するヒトプロテインＣに認め
られる如く、グリコシル化、γ−カルボキシル化、およ
びβ−ヒドロキシル化等の翻訳後修飾をも行うことがで
きる。広範囲に及び様々な真核性宿主主細胞の形質転換
のためのベクターがあり、以下に例示する特定のベクタ
ーは決して、本発明の範囲を制限することを意図したも
のではない。
pSV2-型（タイプ）のベクターは、一定の真核性転写単
位‐‐プロモーター（ep）、介在配列（IVS）、および
ポリアデニル化（PA）部位を構成しているSV40ゲノムセ
グメントを含んでいる。SV40t-抗原が存在しない場合に
は、プラスミドpSV2-型ベクターは哺乳類およびその他
の真核性細胞の染色体性DNAに組込まれることによつて
宿主細胞を形質転換する。挿入遺伝子の転写がSV40プロ
モーターによつて行われる種々のプラスミドpSV2-型ベ
クター類、即ち、pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、お
よびpSV2-β‐グロブリンが組立てられている。これら
のベクターはアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレク
シヨン〔ATCC、American Type Culture Collection、ロ
ツクビレ、メリーランド（Rockville Maryland）〕また
はノーザン・リージヨナル・リサーチ・ラボラトリイ
（ペオリア、イリノイス）のいずれかから入手可能であ
る。
プラスミドpSV2-HPC8はプラスミドpSV2-gpt（ATCC3714
5）、プラスミドpHC7、および２個の合成リンカーから
導かれる本発明のベクターである。「gpt」という語句
は、プラスミドpSV2-gpt上に存在している大腸菌のキサ
ンチン‐グアノシン・ホスホリボシル・トランスフエラ
ーゼを表わしている。プラスミドpSV2-HPC8は、まず最
初、プラスミドpHC7由来の、新生プロテインＣの暗号配
列のアミノ末端から1/2の配列と１個の合成リンカーと
を含むHind III-Apa I制限フラグメントを調製し；次い
で、プラスミドpHC7由来の、新生プロテインＣの暗号配
列のカルボキシ末端から1/2の配列と１個の合成リンカ
ーとを含むApa I-Bgl II制限フラグメントを調製し；こ
れら２個のフラグメントをHind III-Bgl II-開裂プラス
ミドpSV2-gptに挿入することにより、組立てられた。プ
ラスミドpSV2-HPC8の詳しい組立て方法を実施例２に記
載し、該プラスミドの制限サイトおよび機能地図を添付
の第２図に示した。
プラスミドpSV2-HPC8を、プラスミドpSV2-β‐グロビン
（NRRL B-15928）と一緒に、プラスミドpL133の組立て
における出発物質として用いた。新生プロテインＣの全
暗号領域を含む、プラスミドpSV2-HPC8の２つの制限フ
ラグメント、〜0.29kbHind III-Sal Iフラグメントおよ
び〜1.15kb Sal I-Bgl IIフラグメントを、Hind III-Bg
l II-開裂プラスミドpSV2-β‐グロビンにライゲートし
た。得られたプラスミド（pL133と命名）は、β‐グロ
ビン暗号領域が全て、新生プロテインＣの暗号領域で置
き換えられたものであつた。プラスミドpL133の詳しい
組立て方法を実施例３に示し、該プラスミドの制限サイ
トおよび機能地図を添付の第３図に示した。
プラスミドpL132は、プラスミドpSV2-HPC8のHind III-S
al IおよびSal I-Bgl II制限フラグメントをプラスミド
pSV2-nneo（ATCC37149）に挿入したことを除き、プラス
ミドpL133の組立て法と類似の方法で組立てられた。「n
eo」という語句は、プラスミド中にネオマイシン耐性付
与遺伝子（これはG418耐性をも付与する）が存在してい
ることを表わす。その組立てについては実施例４に記載
されているが、これは多シストロンを産生する。新生の
プロテインＣおよびG418耐性付与暗号配列の両者は、同
一のSV40初期プロモーターによつて開始されるポリシス
トロン性mRNAとして転写される。G418は大多数の真核
性、その他の宿主細胞にとつて有毒であるため、プラス
ミドpL132形質転換体をG418耐性についてスクリーニン
グすることによつて選択することができる。プラスミド
pL132の制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示
す。
プラスミドpSV2-dhfr（ATCC37146）はSV40初期プロモー
ターのコントール下にあるネズミのジヒドロ葉酸還元酵
素（dhfr）を含有している。適当な条件下において、こ
のdhfr遺伝子は宿主の染色体内で増幅され、あるいは、
コピーされることが知られている。この増幅によつて、
dhfr遺伝子と極めて近接しているDNA配列が含まてくる
ことがある。プラスミドpL141は、VS40初期プロモータ
ーのコントロール下にある、dhfr遺伝子と、新生プロテ
インＣ構造遺伝子の両者を含有している本発明のベクタ
ーである。
プラスミドpL141を組立てるには、プラスミドpSV2-dhfr
上の単一のBamHI部位をXho I部位に変換してプラスミド
pSV2-dhfr-Xを得る。新生プロテインＣ構造遺伝子を含
有している、プラスミドpL133の２つのフラグメント、
〜0.64kb Pvu II-Bst E IIフラグメントと〜2.7kb Bst
E II-EcoR Iフラグメントを単離し、まずPvu II-Bst E
IIフラグメントをXho I-Bst E IIフラグメントに変換
し、次いで、EcoR I-Vho I-開裂プラスミドpSV2-dhfr-X
にライゲートした。得られたプラスミド（pL141と命
名）を添付の第５図に示し、その組立て法を実施例５に
述べる。
哺乳類その他の真核性宿主細胞内でプロテインＣ活性を
発現するために組立てられた本発明の例示プラスミドに
おいて、SV40初期プロモーター以外のプロモーターを用
いることができる。本発明は、本明細書中に例示した特
定の真核性プロモーターの使用に限定されるものでは、
決してない。その他のプロモーター類、例えば、SV40後
期プロモーターまたは、例えば、エストロゲン‐誘導性
の、ニワトリのオボアルブミン遺伝子、インターフエロ
ン遺伝子、グルココルチユイド‐誘導性のチロシンアミ
ノトランスフエラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝
子、主な初期および後期アデノウイルス遺伝子等の真核
性遺伝子からのプロモーターも、真核性宿主細胞内でプ
ロテインＣを生産するために計画された組換えDNA発現
ベクター中に使用するために、容易に単離し、修飾する
ことができる。また、プロテインＣを発現させるため
に、真核性プロモーター類を直列に並べて用いてもよ
い。さらに、広範囲の真核性宿主細胞に感染する多くの
レトロウイルスが知られている。レトロウイルスDNAの
長い末端重復（ロング・ターミナル・リピート）はしば
しばプロモーター活性をコードしており、これを、ヒト
プロテインＣの発現を駆動させる目的で、SV40初期プロ
モーターの代りに用いることができる。
プラスミドpRSV cat（ATCC37152）は、ニワトリその他
の宿主細胞に感染することが知られているラウス肉腫ウ
イルス（RSV）の長い末端重複部分を含んでいる。このR
SVの長い末端重複配列は、プラスミドpRSV catの〜0.76
kbNde I-Hind III制限フラグメントとして単離すること
ができる。このRSVの長い末端重複に含まれるプロモー
ター〔ゴーマン（Gorman）ら、1982、P.N.A.S.79:677
7〕を、プラスミドpL133の〜5.1kbNde I-Hind IIIフラ
グメントにクローンすると、SV40初期プロモーターと置
き換わり、新生ヒトプロテインＣ構造遺伝子の転写と発
現を駆動するのに適正な位置をとる。得られたプラスミ
ド（pL142と命名）を添付の第６図に示す。プラスミドp
L142の組立てを実施例６に記載する。
本発明に係るもう１つのプラスミドは、プロテインＣの
発現を駆動するために、ラウス肉腫ウイルスの長い末端
重復のプロモーターを用い、また、選択および遺伝子の
増幅のためにdhfr遺伝子を含有している。このプラスミ
ド（pL151と命名）は、プラスミドpSV2-dhfr-Xの〜4.2k
bEcoR I-Xho I制限フラグメントをプラスミドpL142の〜
1.06kbBst E II-Nde I制限フラグメント、およびプラス
ミドpL133の〜2.74kbBst E II-Eco R I制限フラグメン
トにライゲートすることにより、組立てられた。ライゲ
ーシヨンとプラスミドpL151の組立てを達成するため
に、ライゲーシヨンに用いたpL142制限フラグメントのN
de I部位を、DNAリンカーを付加することにより、Xho I
部位に変換した。プラスミドpL151の組立てを以下の実
施例９に記載し、該プラスミドの制限サイトおよび機能
地図を添付の第９図に示す。
プラスミドpMSVi（NRRLB-15929）は、マウス等の宿主細
胞に感染するウイルスとして知られているネズミ肉腫ウ
イルス（MSV）の長い末端重復（LTR）を含有している。
プラスミドpSV2-HPC8の〜1.4kb Bcl I制限フラグメント
をプラスミドpMSViの単一のBgl II制限酵素認識配列に
クローニングすることにより、新生プロテインＣ構造遺
伝子をMSVの長い末端重復のプロモーターのコントロー
ル下に置く。得られたプラスミド（pMSV-HPCと命名）を
添付の第７図に示した。プラスミドpMSV-HPCの組立て
は、実施例７に記載されている。
マウスのメタロチオネイン（MMT）プロモーターも真核
性宿主細胞内で使用するために、充分に特性化されてい
る。このMMTプロモーターは、本発明に係る別のプラス
ミド（pMMT△BPV-HPCと命名されている）の組立てにお
ける出発物質である、15kbプラスミドpdBPV-MMTneo（AT
CC37224）内に存在している。プラスミドpMMT△BPV-HPC
を組立てるには、まず、プラスミドpdBPV-MMTneoをBamH
Iで消化し、次いで、再ライゲートし、プラスミドpMMT
△BPVを形成する。このBamH I欠失により、ウシ乳頭腫
ウイルス（BPV）DNAの〜8kbが除去される。次いで、プ
ラスミドpMMT△BPVをBgl IIで消化し、このBgl II-消化
プラスミドに、プラスミドpSV2-HPC8の〜1.4kbBCl I制
限フラグメントをライゲートした。得られたプラスミド
（pMMT△BPV-HPCと命名）は、MMTプロモーターの下で転
写および発現が行われる位置に、新生プロテインＣ構造
遺伝子を含有している。プラスミドpMMT△BPV-HPC内
の、新生プロテインＣ構造遺伝子のすぐ下流に隣接し
て、メタロチオネインプロモーターによつてコントロー
ルされ、プラスミドpMMT△BPV-HPCで形質転換された宿
主の選択を可能ならしめる、G418耐性‐付与遺伝子が存
在している。プラスミドpMMT△BPV-HPCの組立ては実施
例８に記載されており、該プラスミドの制限サイトおよ
び機能地図は、添付の第８図に示されている。
上記のベクター類（プラスミドpHC7を除く）は、様々な
真核性（殊に哺乳類）宿主細胞に導入（トランスフオー
ム）可能であり、それらの内で発現し得る。プラスミド
pSV2-HPC8、pL142およびpL133は安定な形質転換体を単
離、同定するための選択マーカーを有していないので、
これらのベクター類は、以下の実施例12に示す如く、過
渡的な段階でのアツセイに、あるいは、同時形質転換を
目的とする場合に、最も有用なベクターである。通常、
大腸菌内でプラスミドDNAを調製する方が、他の宿主生
物内で調製するよりも効率的的であるので、これらのベ
クター類はすべて（プラスミドpMC7をも含む）、大腸菌
内で複製され得る配列を含有している。
上記のベクター類に含まれている新生ヒトプロテインＣ
構造遺伝子は、この新生ヒトプロテインＣ構造遺伝子と
関連する特定のプロモーターが機能する宿主細胞内で発
現する。SV40初期プロモーター、ネズミの肉腫ウイルス
の長い末端重複プロモーター、並びにマウスのメタロチ
オネインプロモーターは、広範囲に及ぶ様々な宿主細胞
内で機能する。プラスミドpSV2-TPC8、pL133、pL132、p
L151、pL141、PYSV-HPC、pMMT△BPV-HPCおよびpL142に
とつて好ましい宿主細胞を、適当な注を添えて表Ｉに示
す。
本発明において好ましい形質転換体は、HepG-2/PL132,H
epG-2/pMSV-HPC,HepG-2/pL141,HepG-2/pL151,HepG-2/pM
MT△BPV-HPC,H4IIEC3/pL141,H4IIEC3/pL132,H4IIEC3/pM
MT△BPV-HPC,H4IIEC3/pMSV-HPC,H4IIEC3/pL151,LLC-MK2
/pL132,LLC-MK2/pMMT△BPV-HPC,LLC-MK2/pL141,LLC-MK2
/pL151,C127I/pMMT△BPV-HPC,C127I/pMSV-MPC,C127/pL1
51,3T3/pMSV-HPC,3T3/pMMT△BPV-HPC,3T3/pL132,3T3/pL
141,3T3/pL151,RPMI8226/pMSV−HPC,RPMI18226/pMMT△B
PV-HPC,RPMI8226/pL132,RPMI8226/pL141,RPMI8226/pL15
51,CHO-K1/pMSV-HPC,CHO-K1/pMMT△BPV-HPC,CHO-K1/pL1
32,CHO-K1/pL141,CHO-K1/pL151,CHO-K1（dhfr-）/pMSV-
HPC,CHO-K1（dhfr-）/pMMT△BPV-HPC,CHO-K1（dhfr-）/
pL132,CHO-K1（dhfr-）/pL141,およびCHO-K1（dhfr-）/
pL15である。
本発明のDNA化合物は、例えば、大腸菌、枯草菌（Bacil
lus）およびストレプトマイセス等の原核性宿主細胞内
でも発現し得る。通常、原核性宿主細胞は組換え遺伝子
から製造された哺乳類タンパク質を、グリコシル化、γ
−カルボキシル化またはβ−ヒドロキシル化しないの
で、原核性宿主細胞内で本発明のプロテインＣ活性をコ
ードしているDNAを発現させることにより、種々の新規
なヒトプロテインＣ誘導体を生産することができる。原
核性宿主細胞内で発現された新規なプロテインＣ誘導体
は様々な程度のプロテインＣ活性を示し、従つて、これ
を翻訳後修飾の研究に用いることができる。
これらの新規な誘導体はまた、プロテインC-特異抗体の
産生を刺激するための抗限として用いることができ、あ
るいは、プロテインＣの測定にも用いることができる。
多くの測定法においては、試料中のタンパク質レベルを
測定するのに競合的な抗体結合を利用する。即ち、放射
活性（またはそれ以外の方法で）標識した、原核生物‐
産生ヒトプロテインＣを、血漿中のプロテインＣの測定
における「競合的な分子（competing molecule）」とし
て用いることができる。当該技術分野の人々ならば、そ
の様な測定が、入院患者または外来患者に対するプロテ
インＣを含む治療法の治療期間中において、さらには、
凝固障害を有する患者の診断のために、必須であるとい
うことを容易に理解するであろう。
さらに、ヒトプロテインＣの抗凝固活性は、このタンパ
ク質からγ−カルボキシル化されたグルタミン酸残基を
除去することにより、プロテインＣのプロフイブリノリ
テイツク活性から分離することができる。活性化された
ヒトプロテインＣは、軽鎖のアミノ末端に集まつている
幾つかのγ−カルボキシル化グルタミン酸（gla）残基
を含有しており、これらの残基を除去すると、抗凝固活
性は破壊されるが、得られた「gla-減少」プロテインＣ
のプロフイブリノリテイツク活性は破壊されていない。
本発明は、（１）新生ヒトプロテインＣ構造遺伝子中
の、ヒトプロテインＣの「gla-領域」であるアミノ酸残
基１〜83をコードしているDNAを欠失させ、この欠失さ
れたDNAを真核性（または原核性）宿主細胞内で発現さ
せるか；あるりいは（２）新生ヒトプロテインＣの構造
遺伝子、あるいはそのサブフラグメントまたは誘導体
を、組換え法によつて生産されたヒトプロテインＣをγ
−カルボキシル化しない大腸菌、またはその他の適当な
原核性宿主細胞内で発現させる、という異つた２つの方
法によつてgla-減少プロテインＣを生産することに関す
るものである。
本発明に係る、プロテインＣ活性をコードしているDNA
化合物を原核性宿主細胞内で発現させる前に、真核性の
シグナルペプチドをコードしているDNAを除去した。理
論上、新生ヒトプロテインｃのアミノ末端における最初
の33アミノ酸残基が、プロテインＣの肝臓から血流中へ
の分泌を促すシグナルペプチドとしての作用を有する。
本発明は、真核性宿主細胞内でプロテインＣ活性を発現
させるために特定の真核性シグナルペプチドを用いるこ
とに限定されるものではない。一般則として、原核生物
は有効に真核性シグナルペプチドをプロセシングしな
い；従つて、新生ヒトプロテインＣ構造遺伝子のシグナ
ルペプチドをコードしている部分を原核生物内で発現さ
せることは、幾分、非能率的であろう。本明細書中では
特に例示していないが、本発明は、原核生物内でプロテ
インＣを発現させ、分泌させることを目的とする、原核
性シグナルペプチドの暗号DNAとプロテインＣ活性の暗
号DNAとの融合物をも包含するものである。
上記の如く、新生ヒトプロテインＣの１〜33アミノ酸残
基は、細胞外分泌のための「シグナル」をコードしてい
ると思われ、活性なプロテインＣ中には存在していな
い。ヒトプロテインＣのプロペプチドを構成している。
新生ヒトプロテインＣの残基34〜42もまた、このタンパ
ク質のプロセシングおよび活性化の間に除去され、それ
らは、該分子の正しい折りたたみと修飾に寄与している
と考えられている。新生ヒトプロテインＣの残基33〜42
は以下に例示する原核性発現ベクター中にコードされて
いるが、本発明は、新生ヒトプロテインＣの、残基33を
含まない、残基34〜42をコードしている原核性発現ベク
ターをも包含するものである。
しかしながら、本発明は、特定のプロテインＣ誘導体の
発現に限定されるものではない。本発明のDNAは、新生
プロテインＣのアミノ酸残基１〜42または１〜83をコー
ドしている部分を欠失し、その結果、誘導体を発現させ
る様、容易に修飾することができる。さらに、活性なヒ
トプロテインＣの軽鎖または重鎖を発現させるベクター
を組立てるために本発明化合物を操作して活性なヒトプ
ロテインＣ重鎖（アミノ酸残基212〜461）と、活性なヒ
トプロテインＣ軽鎖（アミノ酸残基43〜197）とを分離
することは容易である。この様にして、真核性または原
核性の適当な宿主内で２本の鎖を別々に生産し、次い
で、化学的に再結合することにより、活性なヒトプロテ
インＣを合成することができる。
新生ヒトプロテインＣのアミノ酸残基１〜42、198およ
び199に関する上記のタンパク分解的プロセシングに加
えて、プロテインＣ酵素原の活性化はアミノ酸残基200
〜211の除去をも含む。このプロセシングは、天然では
インビボ（生体内）、より特異的には、血流内で起きて
いると考えられている。活性化の過程において種々の有
用なプロテインＣ誘導体が存在しており、本発明の組換
えDNA発現ベクターは、その内のどれをコードしていて
もよい。その様なベクターによつて不活性な形のヒトプ
ロテインＣを組換え生産することができ、ヒトの循環系
内で、あるいは実施例15の方法に従つて活性化すること
ができる。
また、ヒトプロテインＣの軽鎖と重鎖とを別個に生産
し、次いで化学的に再結合する方法を、他の、種々の有
用なヒトプロテインＣ誘導体の生成に利用することがで
きる。例えば、新生ヒトプロテインＣのアミノ酸残基33
〜197、34〜197または43〜197を含む軽鎖分子を生産
し、次いで、これと、新生ヒトプロテインＣのアミノ酸
残基200〜461または212〜461を含む重鎖分子と再結合さ
せると、その結果、活性プロテインＣ誘導体、あるい
は、残基33〜42または34〜42、および200〜211を含むペ
プチドが切断される（その様な切断は、ヒトの循環系で
自然に起こる）ことによつて活性化されるプロテインＣ
誘導体が生産される。
プラスミドpCZ460は、プロテインＣ活性を大腸菌内で発
現させるためめに組立てられた本発明プラスミドであ
る。プラスミドpCZ460は、プラスミドpCZ101、プラスミ
ドpHC7、および様々なDNAリンカー類から組立てられ
た。プラスミドpCZ101はスコナーらにより、記載されて
いる〔Schoner et.al.、（1984）プロシーデイングス・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
イズUSA 81 5403〜5407〕。pCZ101の制限サイトおよび
機能地図を添付の第10図に示す。
実施例10に記載の如く、様々な操作を介して、合成Xba
I-Nde IリンカーをプラスミドpCZ101のlppプロモーター
の下流に導入した。得られたプラスミド（pCZ11と命
名）に、メチオニニル残基と新生ヒトプロテインＣのア
ミノ酸残基33〜39（上記の番号に従う）をコードしてい
るもう１つのDNAリンカーを付加することにより、該プ
ラスミドを修飾した。次いで、このプラスミド（pCZ451
と命名）をBamH Iで切断した後、アミノ酸残基39〜445
をコードしている、プラスミドpHC7の〜1.2kb BamH Iフ
ラグメントを挿入し、プラスミドpCZ445を得た。さら
に、初期の組立て段階で偶然付加された余分なNde Iリ
ンカーを除去することによつてプラスミドpCZ455を修飾
し、プラスミドpCZ459を得た。
プラスミドpCZ459は、メチオニル残基と新生プロテイン
Ｃのアミノ酸残基33〜445を発現させる様に位置してい
るlppプロモーターを含んでいる。コピー数コントロー
ルが失われる温度（＞〜25℃）の下で、プラスミドpCZ4
59は大腸菌内で、メチオニル残基、新生ヒトプロテイン
Ｃのアミノ酸残基33〜445、および最初に大腸菌lpp遺伝
子から単離されたプラスミドDNAによつてコードされて
いた約36のアミノ酸残基、を含む分子量約50キロダルト
ンの機能的ポリペプチドを発現する。プラスミドpCZ459
の制限サイトおよび機能地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpCZ459に、ヒトプロテインＣのカルボキシ末
端であるアミノ酸残基446〜461をコードしているDNAを
挿入し、プラスミドpCZ460を得た。このプラスミドpCZ4
60の組立ては、まずカルボキシ末端暗号DNAを含有して
いる、プラスミドpHC7の〜0.88kb Pst I制限フラグメン
トをプラスミドpUC19〔フアーマシア（Pharmacia）In
c.、800センテニアル・ドライブ、ピスキヤツタウエイ
（Centennial Dr.Piscataway）NJ08854から入手可能〕
に挿入し、プラスミドpUC19HCを得ることにより、行わ
れた。プラスミドpUC19HCは、プロテインＣ構造遺伝子
のカルボキシ末端‐暗号DNAを単離することができる〜8
0bp BamH I 制限フラグメントを含有している。プラス
ミドpUC19HCをBamH I で開裂して〜80bp BamH Iフラグ
メントを単離し、これをプラスミドpCZ459に挿入するこ
とにより、プラスミドpCZ460を得た。プラスミドpCZ460
は新生ヒトプロテインＣのアミノ酸残基２〜32が存在し
ないことを除き、これと同じポリペプチドをコードして
おり、これを発現させる。プラスミドpUC19HCとプラス
ミドpCZ460の詳しい組立て方法を実施例11に示す。
特殊なプロモーターの選択は、本発明の実施可能性（オ
ペラビリテイ）にとつて臨界的な事でないので、ヒトプ
ロテインＣ活性の大腸菌内での発現は、決して、特定の
プロモーターの使用に限定されない。既に例示したリポ
タンパク質プロモーターに代り得るプロモーターには、
大腸菌ラクトース（lac）、大腸菌trp、バクテリオフア
ージλＰＬＯＬ、およびバクテリオフアージλＰＲＯＲ
等のプロモーターが含まれるが、これらに限定されな
い。さらに、trpプロモーターとlacプロモーターの如
く、１またはそれ以上のプロモーターを直列に配した
り、tacプロモーターの如く、ハイブリツドプロモータ
ーを用いて、プロテインＣ構造遺伝子の発現を行わせる
こともできる。上記のプロモーターは、いずれも、既に
特性化されており、当業者が熟知しているものであっ
て、合成的に、あるいは既知のプラスミドから組立てる
ことができるものである。
プラスミドpCZ460の複製は、シヨーナーら〔Schoner e
t.al.（1984）プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨ
ナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズUSA、81 540
3〜5407〕の開示した熱誘導性（サーモインジユーサブ
ル）ランナウエイレプリコンにより、きめることができ
る。30℃、特に25℃以下の温度では、このレプリコンは
約10〜15コピー／細胞という、比較的低いコピー数を保
持している。温度が37℃にまで上ると、コピー数コント
ロールが失なわれ、このレプリコンを含有しているプラ
スミドは、1000〜2000コピー／細胞にまで増幅される。
当業者ならば理解するであろうが、本発明は、決して、
特定のランナウエイレプリコン、または特定のコピー数
の突然変異体しか使用してはならないというものではな
い。その他の誘導可能なランナウエイレプリコンまたは
高コピー数のレプリコンを、適切な選択により、あるい
は組立てることにより、得ることができる。その様なレ
プリコンも、本発明の範囲内に含まれる発現ベクターの
組立てに用いることができる。
本発明に係るヒトプロテインＣ誘導体遺伝子の如き外来
性遺伝子をランナウエイレプリコンを含有しているベク
ターにクローニングすると、誘導に際してコントロール
が外される結果、タンパク質の含成速度が著しく大きく
なると共に、細胞質内にタンパク性顆粒が形成される。
この顆粒のタンパク組成の均質性は高く、この顆粒の少
なくとも50％、多くは80％（いずれも乾重量％）以上が
所望のタンパク質生産物からなる。この顆粒は、容易に
細胞リゼイト（溶解液）から単離され、また、低濃度の
尿素、あるいは洗浄剤溶液で洗浄しても安定である。洗
浄することにより、顆粒に対して非特異的に結合してい
るタンパク質が除かれる。
しかしながら、本発明は、大腸菌内でプロテインＣ活性
を発現させる場合にランナウエイレプリコンを使用しな
ければならないというものではない。プラスミドpBR32
2、pBR328、pACYC184等のプラスミドに由来する多くの
レプリコンが当業者に知られており、それらは、本発明
のプロテインC-暗号DNAを発現させるために設計され
た、組換えDNAクローニング、および発現ベクターの組
立てに適している。本発明はまた、本明細書中に例示し
たプラスミドに含まれている実際の選択マーカーの使用
に限定されるものでもない。本発明のDNA化合物（また
は配列）を含んでいる組換えDNAクローニングベクタ
ー、または発現ベクターに用いるのに適当な、真核性並
びに原核性宿主細胞用の、広範囲に及ぶ種々の選択マー
カーが存在している。
本発明の例示DNA配列およびプラスミドには多くの修飾
や変更が可能である。例えば、遺伝暗号の同義性によ
り、本明細書中に例示した翻訳終止（停止）シグナル で置き換えることのみならず、ポリペプチドの暗号領域
全体を通して、ヌクレオチドの置換を行うことができ
る。その様な配列は、ヒトプロテインＣについて現在知
られているアミノ酸配列またはDNA配列から推定するこ
とができ、下記の従来からの合成法により、組立てるこ
とができる。その様な合成法は、実質上、イタクラらの
方法〔Itakura et.al.、19777サイエンス（Science）19
8:1056〕並びにクレアらの方法〔Crea et.al.1978、プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ
・オブ・サイエンスイズUSA75:5765〕に従つて行うこと
ができる。従つて、本発明は特に例示したDNA配列およ
びプラスミドに限定されるものではない。
本発明の原核性発現ベクターおよび本発明方法は、広範
囲の宿主生物、とりわけ、大腸菌、大腸菌K12、大腸菌K
12 RSV308、大腸菌K12 HB101、大腸菌K12 C600、大腸菌
K12 RR1、大腸菌K12 RR1△M15、大腸菌K12 MM294等のグ
ラム陰性菌に適用し得る。本発明のすべての態様が有用
であるが、いくつかのベクターおよび形質転換体が好ま
しい。好ましい形質転換体は、大腸菌K12 RV308/pCZ460
である。
当業者には理解されるであろうが、本発明の発現ベクタ
ーは真核性または原核性いずれの宿主細胞にも用いるこ
とができ、その様にして、ヒトプロテインＣ活性を有す
るポリペプチドを宿主に発現させることができる。宿主
細胞内で機能し、新生ヒトプロテインＣ構造遺伝子の転
写を駆動する様なプロモーターを含有しているベクター
で該宿主細胞を形質転換すると共に、該宿主細胞がシグ
ナルペプチドのプロセシングを行うための細胞機構を有
しているならば、培地から、プロテインＣ活性を単離す
ることができる。他の発現状況下、例えば、プラスミド
pCZ460が大腸菌RV308中に含まている場合には、プロテ
インＣ活性を宿主細胞から単離しなければならない。
前記の如く、組換え法によつて生産されたプロテインＣ
は血栓性の疾患の治療に優れた効果を現わすことであろ
う。ホモ接合体性またはヘテロ接合体性のプロテインＣ
を欠損している人々は重篤な血栓症に苦しんでおり、今
日では、凝固因子である第IX因子濃縮物（これはプロテ
インＣを含んでいる）によつて治療されている。これら
の内、ホモ接合体性プロテインＣ欠損症の人々の治療に
は、血漿が〜3000mlであると仮定し、血管外空隙への幾
分かの拡散を見積ると、酵素を酵素原の形で投与すると
すると、組換え法で生産されたプロテインＣを、用量域
5mg〜100mg/投与を１日２回与えるとよい。また、ヘテ
ロ接合体性のプロテインＣ欠損症の場合に必要なプロテ
インＣの用量はホモ接合体性の場合よりも低く、酵素原
の形として、用量域は2.5mg〜50mg/投与となる。
組換えにより生産されたプロテインＣは、深部静脈血栓
症、肺動脈塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動
脈で生じた塞栓、急性心筋梗塞症、血栓性発作および伝
染性血管内凝血等を含む、血管内凝固に関連する広範な
種々の後天性の疾患状態を予防、並びに治療するのにも
有用であろう。実験データ並びに臨床データによると、
従来からの抗凝血剤、特にワルフアリン（warfarin）
は、侵入性のがんの治療に有用であり、その様な悪性腫
瘍が転移し離れた病巣を生じることを阻止または減少さ
せる様、作用することが分つている。組換えにより生産
されたプロテインＣは、以下に詳しく述べる理由に基づ
き、これらの臨床状況において従来用いられていた抗凝
固剤の代替品として重要なものである。
深部静脈血栓症や肺動脈塞栓症は従来からの抗凝血剤で
治療できるが、例えば、手術を受けている患者、慢性的
な就床患者、およびうつ血性心不全症患者等、血栓塞栓
症を併発する危険率が高いとされている患者に対して、
血栓塞栓症の発現を防止することは、臨床的により有意
義なことである。手術を受けた年令が50歳の患者の50％
以上が、また全体としては、手術を受けた患者の約20％
以上が術後の深部静脈血栓症に苦しんでおり、また、深
部静脈血栓症の術後には、全症例中約20％が１またはそ
れ以上の肺動脈塞栓を併発している。今日、深部静脈血
栓症の防止のために、術前および術後に低用量のヘパリ
ン（例えば８時間毎に5,000単位）を投与している。低
用量のヘパリン投与は時々、手術中または手術後に重篤
な出血を引き起こす。活性化されたプロテインＣはヘパ
リンよりも選択性が高く、トロンビンが生成し、線維素
トロンビンが形成された時、およびその位置でしか活性
を示さない。それ故、プロテインＣは、深部静脈血栓症
を防止するために予防的に用いたとき、ヘパリンよりも
有効であり、しかも、出血性合併症を引き起こし難いと
思われる。深部静脈血栓症の予防を目的とする場合の組
換え一生産プロテインＣの用量は１〜10mg/日の範囲で
あり、プロテインＣの投与は、手前前60時間から開始
し、患者が動ける様になるまで続ける必要がある。確定
的で客観的に証明された深部静脈血栓症および／または
肺動脈塞栓症の場合の活性なプロテインＣの投与量は、
負荷用量として１〜10mg、以後、３〜30mg/日の範囲の
量の継続注入、とする。末梢動脈の塞栓の場合にも同様
な投与計画をたてることができる。活性プロテインＣの
注入により、出血性の合併症が減少されると思われるこ
とから、急性の動脈閉鎖を併発し、その場合に、四肢の
切断を避け、四肢を守ることがしばしば要求される血栓
切除術または塞栓切除術と関連した外科的処置におい
て、ヘパリンの代りに活性プロテインＣを用いることが
できる。
心臓に発生する動脈塞栓は、人工心臓弁を有する患者に
おける心臓弁と関連した疾患、急性心筋梗塞、およびあ
る種のタイプの不整脈等の心疾患に併発していることが
多い。この様な問題に対する従来からの経口抗凝固剤に
よる治療は必ずしも完全に有効であるといえず、しか
も、経口抗凝固剤の使用には、常に、出血が併発する危
険性が本質的に存在している。確立された深部静脈トロ
ンビンー肺動脈塞栓の治療に匹敵し得る用量の活性プロ
テインＣを携帯用のポンプで連続注入する方法は、心臓
性の塞栓の予防に、実質上有効である。
同様に、末梢動脈（特に、頚動脈）中の血栓が発生源と
なつている塞栓は、血小板機能の抑制作用を有する薬
物、経口抗凝固剤、またはそれらの複合剤を含む現在用
いられている治療方法によつては充分に治療または予防
することができない。心臓性の塞栓の場合の如く、この
心臓性塞栓に関して示したと同様のやり方で活性プロテ
インＣを長期間投与する方法は、頚動脈血栓に由来する
塞栓を防ぎ、塞栓症性の発作に至ることを防止するのに
大いに有効である。
組換えプロテインＣはまた、血栓性発作の治療にも有用
である。今日、発作は、常に従来からの抗凝固剤で治療
し得るわけではない。ヘパリンまたは経口抗凝固剤によ
る発作の治療も時には有効であるが、梗塞を起こしてい
る脳領域での出血の危険性を高め、そのことにより、発
作に伴なう神経学的な損傷を悪化させる。プロテインＣ
は出血性の合併症を引き起こす可能性が低いので、これ
を発作を起こした患者に投与することで閉塞性の動脈血
栓の局所的な拡がりを防止でき、その結果、発作に起因
する神経学的損傷を軽減することができる。活性プロテ
インＣの投与量は発作の性質および重篤度に応じて、各
患者毎に異なる。
組換え法で生産された活性プロテインＣは、インビボで
の線維素（フイブリン）溶解の促進能力を有しているの
で、急性心筋梗塞の治療に有効である。活性プロテイン
Ｃを、組織プラスミノーゲン賦活剤と一緒に、心筋梗塞
の急性期に投与するとよい。閉塞性の冠血栓が溶解した
後、冠性の再閉塞を防止するために、活性プロテインＣ
をさらに数日ないし数週間投与する。急性の心筋梗塞の
場合には、組織プラスミノーゲン活性化剤による治療の
開始時に、プロテインＣを負荷用量として１〜10mg与
え、以後、３〜30mg/日の用量域で、プロテインＣを連
続注入する。
プロテインＣ酵素原または活性型のプロテインＣは播種
性血管内凝固の治療に有用である。前記の如く、おそら
く、トロンボモジユリン（血栓調節因子）−トロンビン
によるタンパク質の広範囲に及ぶ活性化と、それに続く
その活性化された酵素の異化または不活化を含む機構に
より、播種性血管内凝固においてはプロテインＣのレベ
ルが著しく減少する。広範な臨床試験において、播種性
血管内凝固症患者に対するヘパリンおよび経口抗凝固剤
の投与が行われたが、それらの試験の結果は期待外れで
あつた。播種性血管内凝固症患者は、特徴的に、徴小循
還をも含む、広い範囲に及ぶ血栓を有し、広域性微小循
還内のフイブリントロンビンの形成の間に、まず活性化
され、次いで不活化されることによる必須凝血因子（es
sential cloffing factors）の「消費」に起因する重篤
な出血性の障害を伴なうことが多い。播種性血管内凝固
においては、プロテインＣは従来の抗凝固剤とは明らか
に異なる利点を有する。プロテインＣは高い選択性を有
するので、ヘパリンや経口抗凝固剤の如き、播種性血管
内凝固に関連した出血性障害を悪化させることがないば
かりか、さらに微小血管性のフイブリン折出物が形成さ
れることを遅延させ、あるいは阻止する。播種性血管内
凝固のための製剤としては、活性化されたセリンプロテ
アーゼよりもプロテインＣ酵素原を選択するのがよい。
そうすれば、これらの患者の微小循還内に実質的な量存
在するトロンボモジユリン‐トロンビンにより、該酵素
原の活性なセリンプロテアーゼへの完全な活性化が確保
されることになる。必要とされる用量は、治療開始時に
おいて循還液中に存在するプロテインＣの量に応じて異
なるが、ホモ接合体性、またはヘテロ接合体性のプロテ
インＣ欠損症の場合の用量に匹敵する量である。
従来からの抗凝固剤、特にワルフアリンは侵入性の悪性
腫瘍を治療するのに有用であることを示す証拠が提示さ
れている。多くの腫瘍細胞は、局部的なフイブリンの折
出を招く様な、凝固系の活性化を引き起こす物質を産生
する。これらのフイブリン折出物は、がん細胞が分割し
て転移病巣を作る際の「巣」の役割を果す。１つの臨床
研究によると、肺に小さい細胞性のがんを有する患者に
おいて、がんの化学療法に加えてワルフアリンを投与さ
れていた患者は、この化学療法のみを受けた患者よりも
長く存命し、転移病巣の広がりも少ないということが示
された。しかしながら、この研究で採用されたがんの化
学療法は、今日、臨床腫瘍学において適切と考えられて
いる治療法程強力ではなかつた。より強力ながんの化学
療法においては、殆んど常に、血小板の大幅な減少をも
たらし、そして、血小板減少症とワルフアリン治療との
組み合わせによつて、患者は重篤な出血性合併症の容認
し難い程高い危険性にさらされることになる。活性プロ
テインＣは従来の抗凝固剤よりも高い選択性を有し、ヘ
パリンまたは経口抗凝固剤のいずれよりも、はるかに高
い治療指数を有するので、血小板減少症患者に投与して
も比較的安全であり、従つて、活性プロテインＣと併用
することにより、侵入性ががんの患者を、有効な強度の
化学療法で治療することができるのである。活性プロテ
インＣによる侵入性がんの治療は、深部静脈血栓症‐肺
動脈塞栓の場合に用いられる投与計画に準じて行う。
本発明化合物は薬学的に有用な組成物を調製するための
既知の方法に従つて製剤化されることができる。即ち、
本発明のヒトプロテインＣ産物と薬学的に許容し得る担
体賦形剤とを混合することにより、組成物を調製する。
適当な担体賦形剤、および例えばヒトアルブミンの如き
他のヒトタンパク質をも含むそれらの製剤化は、当業者
周知である。その様な組成物中には、宿主（患者）に対
して有効な投与を行うのに適当な薬学的に許容し得る組
成物を調製する上で適量の担体賦形剤と一緒に、有効量
のプロテインＣが含有されている。このプロテインＣ組
成物は非経口的に投与することができるが、該物質が確
実に有効な形で血流中に運ばれる様な他の方法によつて
も投与され得る。
以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の組立てに用いた方法、及びその方法の説明を適
宜記載した。
実施例１ 大腸菌（E.coli）K12 RR1/pHC7の培養および
プラスミドpHC7の単離 A.大腸菌K12 RR1/pHC7の培養 テトラサイクリン15μg/mlを含有しているＬブロス（10
gペプトン、10gNaCl、および5g酵母エキス）１に大腸
菌K12 RR1/pHC7（NRRL B−15926）を接種し、エアーシ
エーカー（空気振盪機）内で37℃において、590nmにお
ける光学的密度（O.D.）が〜１吸収単位になるまでイン
キユベートし、この時点でクロラムフエニコール150mg
を加えた。約16時間インキユベーシヨンを続けた；この
クロラムフエニコールの添加によつてタンパク質合成が
阻止され、その結果、以後の細胞分割は阻害されたが、
プラスミドの複製は継続された。
B.プラスミドpHC7の単離 実施例1Aで調製した培養物を、ソルボール（Scrvall）G
SA ローター〔ジユポン（Dupont）co.、インスツルメ
ント・プロダクツ（Instruments Product）、バイオメ
ジカル・デイビジヨン（Biomedical Division）、ニユ
ータウン（Newtown）、CN06470〕中、４℃において6000
rpmで５分間遠心した。得られた上清を捨て、細胞ペレ
ツトをTESバツフアー（10mMトリス‐HCl、pH7.5;10mM N
aCl;および1mM EDTA）40ml中で洗浄し、次いで再ペレツ
ト化した。再度、上清を捨てた後、細胞ペレツトをドラ
イアイス‐エタノール浴中で凍結させ、次いで解凍し
た。解凍した細胞ペレツトを25％スクロース/50mM EDTA
溶液10mlに再懸濁した。5mg/mlリゾチーム溶液1ml;0.25
M EDTA3ml、pH8.0;および10mg/mlのRNAseA 100mlを加え
て混合した後、得られた溶液を氷上で15分間インキユベ
ートした。溶解液〔3mlの10％トリトン（Triton）‐X10
0、75mlの0.25MEDTA、pH8.0;15mlの1Mトリス‐HCl、pH
8.0;および水7mlを混合して調製〕3mlをこのリゾチーム
処理細胞に加え、混合し、得られた溶液を氷上でさらに
15分間インキユベートした。溶解した細胞をドライアイ
ス‐エタノール浴中で凍結した後、解凍した。
SW27ローター〔ベツクマン（Beckman）7360 N.リンカー
ン・アベニユー、リンカーンウツド、IL60646〕中、25,
000rpmで40分間遠心することにより、溶液中の細胞破片
を除いた。CsCl30.44gと5mg/mlエチジウムブロマイド溶
液〜1mlを加え、溶液の容量を40mlに調整した後、Vti50
超遠心管（ベツクマン）中にデカントして入れた。チユ
ーブをシールした後、溶液をVti50ローター中で42,000r
pmにおいて16時間遠心した。紫外光で観察し、得られた
プラスミドのバンドを単離した動、ti75チユーブに入れ
てローター（ベツクマン）内に置き、55,000rpmで16時
間遠心した。必要な用量調節は、いずれも0.761g/mlのC
sClを含むTESを用いて行つた。再度、プラスミドバンド
を単離し、塩−飽和イソプロパノールでエチジウムブロ
マイドを抽出し、TESバツフアーで1:3に希釈した。次い
で、２容量のエタノールを溶液に加えた後、−20℃で一
夜インキユベートした。この溶液をSS34ローター（ソル
ボール）中、10,000rpmで15分間遠心することにより、
プラスミドDNAをペレツト化した。
この方法によつて得たプラスミドpHC7 DNA〜1mgをTEバ
ツフアー（10mMトリス−HCl、pH8.0および1mM EDTA）中
に懸濁し、−20℃で保存した。プラスミドpHC 7の制限
サイトおよび機能地図を添付の第１図に示す。
実施例２ プラスミドpSV2−HPC8の組立て A.プラスミドpHC7の〜1.25kb Ban I制限フラグメントの
組立て 実施例１で調製したプラスミドpHC7DNA50μを、制限
酵素Ban I 5μ（〜50単位）、10×Ban I制限バツフア
ー（1.5M NaCl:60mMトリス−HCl、pH7.9;60mM MgCl2;お
よび1mg/ml BSA）10μ、および水35μと混合し、消
化が完了するまでインキユベートした。次に、このBan
I消化プラスミドDNAを3.5％ポリアクリルアミドゲル（2
9:1、アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）電気泳
動にかけ、〜1.25kb Ban I制限フラグメントが他の制限
産物から分離されるまで泳動させた。ゲルをまずエチジ
ウムブロマイドの希薄溶液で染色し、次いで、このゲル
を紫外線下で観察することにより、DNAバンドを調べ
た。
〜1.25kb Ban I制限フラグメントを含む領域をゲルから
切り取り、試験管内に入れて小片にくずした。この小片
の入つた試験管内に抽出バツフアー（500mM NH4OAc、10
mM MgOAc、1mM EDTA、１％SDSおよび10mg/ml tRNA）1ml
を加え、37℃で一夜置いた。遠心して残渣をペレツト化
し、上清を新らしいチユーブに移した。得られた残渣を
抽出バツフアー200μで１回洗浄し、洗浄上澄み液
を、一夜抽出によつて得た最初の上清と合わせた。上清
をグラスウール製プラグ（plug）に通した後、２容量の
エタノールを加えて混合した。得られた溶液をドライア
イス−エタノール浴中に〜10分間置き、次いで、遠心し
てDNAをペレツト化した。
この方法で〜1.25kb Ban I制限フラグメント約８μｇを
得た。この精製（純化）フラグメントをTEバツフアー10
μに懸濁し、−20℃で保存した。
B.Hind III−Bcl I−Ban Iリンカーの組立て このリンカーの組立てに用いたDNAフラグメントは、シ
ステツク（Systec）1450A DNAシンセサイザー（Synthes
izer）（システツク・インコーポレイテツド3816チヤン
ドラー・ドライブ、ミネアポリス、MN）またはABS380A
DNAシセサイザー〔アプライド・バイオシステムス（App
lied Biosystems），インコーポレイテツド、850リンカ
ーン・センター・ドライブ、フオスターシテイ、CA 944
04〕のいずれかを用いて合成した。当業者は多くのDNA
合成装置を知つており、それらをフラグメントの製造に
用いることができる。加えて、これらのフラグメント
は、実質上、イタクラらの方法〔ltakura et.al.、1977
サイエンス（Science）、198:1056〕およびクレアらの
方法〔crea et.al.、1978、プロシーデイングス・オブ
・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、US
A、75:5765〕に従つて常法通り調製することもできる。
これらの一本鎖リンカー500ピコモルづつを、T4ポリヌ
クレオチド・キナーゼ15単位（〜0.5μ）、10×リガ
ーゼバツフアー（300mMトリス−HCl、pH＝7.8;100mM Mg
Cl2;100mMジチオトレイトール；および1mg/ml BSA）２
μ、500μMATP10μ、および水7.5μを含む制限バ
ツフアー０μ中でキナーゼ処理した。37℃で30分間、
キナーゼ反応混合物をインキユベートし、次いで、100
℃で10分間インキユベートして反応を止めた。キナーゼ
処理を確実にするために、反応物を氷上で冷やし、0.2M
ジチオトレイトール２μ、5mMATP2.5μ、およびT4
ポリヌクレオチドキナーゼ15単位を加えて混合し、この
反応混合物を37℃でさらに30分間インキユベートした。
100℃で10分間、インキユベートして反応を止め、氷上
で冷却した。
キナーゼ処理は別々に行なうが、各キナーゼ反応の後、
２本の一本鎖DNAリンカーを混合した。鎖をアニーリン
グするために、〜150mlの水の入つた水浴中で100℃にお
いて10分間、キナーゼ反応の反応混合物をインキユベー
トした。このインキユベーシヨンの後、水浴を閉じ、室
温まで放冷した（この工程は、約３時間を要した）。次
いで、キナーゼ処理したDNAを含むチユーブが入つたま
まの水浴を、４篩の冷蔵庫内に１夜置いた。この方法に
より、一本鎖をアニーリングした。組立てられたリンカ
ーは式： で示される構造を有していた。このリンカーを、使用に
供するまで−20℃で保存した。
C.〜1.23kb Hind III−Apa I制限フラグメントの組立て 実施例2Aで単離した〜1.25kb Ban I フラグメント〜８
μｇを実施例2Bで組立てたリンカー〜50μ（〜500ピ
コモル）、T4 DNAリガーゼ１μ（〜10単位）、10×リ
ガーゼバツフアー10μ、10m MATP10μおよび水19μ
に加えて混合し、得られたライゲーシヨン反応混合物
を４℃で一夜インキユベートした。
65℃で10分間インキユベーシヨンすることにより、ライ
ゲーシヨン反応を止めた。終濃度が0.3Mになる量のNaOA
Cと２容量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノ
ール浴中で冷却した後、得られた溶液を遠心することに
より、DNAをペレツト化した。
このDNAペレツトを10×Apa I 反応バツフアー（60mM Na
Cl;60mMトリス−HCl、pH＝7.4;60mM MgCl2;および60mM2
−メルカプトエタノール）10μ、制限酵素Apa I5μ
（〜50単位）、および水85μ中に溶かし、この反応混
合物を37℃に２時間置いた。次いで、上記の如くににし
て反応を止め、DNAをペレツト化した。このDNAペレツト
を10×Hind III反応バツフアー（500mM NaCl;500mMトリ
ス−HCl、pH＝8.0;および100mM MgCl2）10μ、制限酵
素Hind III 5μ（〜50単位）および水85μ中に溶か
し、この反応混合物を37℃に２時間置いた。
Hind III消化の後、反応混合物を3.5％ポリアクリルア
ミドゲル上に適用し、実質上、実施例2Aの方法に従つて
所望〜1.23kb Hind III−Apa I 制限フラグメントを単
離した。所望のフラグメント約５μｇを得、TEバツフア
ー10μに懸濁し、−20℃で保存した。
D.プラスミドpHC7の〜0.88kb Pst I制限フラグメントの
単離 実施例１で調製したプラスミドpHC7DNA50μを制限酵
素Pst I 5μ（50単位）、10×Pst I反応バツフアー
（1.0M NaCl;100mMトリス−HCl、pH＝7.5;100mM MgCl2;
および1mg/ml BSA）10μ、および水35μと混合し、
37℃で２時間インキユベートした。次いでPst1−消化プ
ラスミドpHC7 DNAを3.5％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、実質上、実施例2Aの方法に従つて所望の0.
88kbフラグメントを精製した。所望のフラグメント約５
μｇを得、これをTEバツフアー10μに懸濁し、−20℃
に保存した。
E.Pst I−Bcl I−Bgl II リンカーの組立て 実質上、実施例2Bの方法に従つて、式： で示されるリンカーをライゲーシヨンに用いるために組
立て、調製した。
F.〜0.19kb Apa I−Bgl II制限フラグメントの組立て 実施例2Dで単離した〜0.88kb Pst Iフラグメント〜５μ
ｇを実施例2Eで組立てたリンカー〜50μ（〜500ピコ
モル）、T4 DNAリガーゼ１μ（〜単位）、10×リガー
ゼバツフアー10μ、10mM ATP10μおよび水19μに
加えて混合し、得られたライゲーシヨン反応混合物を４
℃で一夜インキユベートした。
65℃で10分間インキユベーシヨンすることにより、ライ
ゲーシヨン反応を止めた。ライゲートしたDNAを沈殿さ
せた後、このDNAペレツトを10×Apa I 反応バツフアー1
0μ、制限酵素Apa I 5μ（〜50単位）、および水85
μに中溶かし、この反応混合物を37℃に２時間置い
た。次いで、反応を止め、再度、DNAをペレツト化し
た。このDNAペレツトを10×Bgl II反応バツフアー（1M
NaCl;100mMトリス−HCl、pH＝7.4;100mM MgCl2および10
0mM2−メルカプトエタノール）10μ、制限酵素Bgl II
5μ（〜50単位）および水85μ中に溶かし、この反
応混合物を37℃に２時間置いた。
Bgl II消化の後、反応混合物を3.5％ポリアクリルアミ
ドゲル上に適用し、実質上、実施例2Aの方法に従つて所
望の〜0.19kb Apa I−Bgl II制限フラグメントを単離し
た。所望のフラグメント約１μｇを得、TEバツフアー10
μに懸濁し、−20℃で保存した。
G.Hind III−Bgl II−消化プラスミドpSV2−gptの単離 プラスミドpSV2−gptDNA（ATCC37145）約10μｇを10×H
ind III反応バツフアー10μ、制限酵素Hind III5μ
（〜50単位）、および水85μに溶かし、反応混合物を
37℃で２時間保つた。次いで、この反応混合物をNaOAc
0.25Mとした後、２容量のエタノールを加え、ドライア
イス−エタノール浴中で冷却し、遠心してDNAをペレツ
ト化した。
このDNAペレツトを10×Bgl IIバツフアー10μ、制限
酵素Bgl II5μ（〜50単位）、および水85μに溶か
し、反応混合物を37℃で２時間保つた。Bgl II消化の
後、反応混合物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、
フラグメントを分離した。エチジウムブロミドと紫外光
を用いて観察し、所望の〜5.1kb Hind III−Bgl II フ
ラグメントを含有しているバンドをゲルから切り取つて
透析チユーブ内に入れ、アガロースからDNAが放出され
るまで電気泳動を続けた。フエノールとCHCl3を用いて
透析チユーブから、DNAを含有しているバツフアーを抽
出した後、このDNAを沈殿させた。このペレツトをTEバ
ツフアー10μに再懸濁した。このものは、プラスミド
pSV2−gptの所望の〜5.1kd Hind III−BglIIフラグメン
トで構成されていた。
H.プラスミドpSV2−HPC8の組立てのためのフラグメント
のライゲーシヨン 実施例2Cで調製した〜1.23kb Hind III−Apa I制限フラ
グメント２μ、実施例2Fで調製した〜0.19kb Apa I−
Bgl IIフラグメント３μ、および実施例2Gで調製した
−5.1kb Hind III−Bg lIIフラグメント２μを混合
し、次いで、10×リガーゼバツフアー10μ、10mMATP1
0μ、T4 DNAリガーゼ１μ（〜10単位）および水72
μと一緒に16℃で一夜インキユベートした。ライゲー
トされたDNAは所望のプラスミドpSV2−HPC8を構成して
いた。このプラスミドの制限サイトおよび機能地図を添
付の第２図に示す。
I.大腸菌K12 RR1/pSV2−HPC8の組立て 大腸菌K12 RR1（NRRL B−15210）のＬ−ブロス中培養物
50mlを590nmにおけるO.D.が〜0.2になるまで増殖させ
た。この培養物を氷上で10分間冷却した後、遠心して細
胞を集めた。得られた細胞ペレツトを冷100mM CaCl225m
l中に再懸濁し、氷上で25分間インキユベートした。遠
心して細胞を再度ペレツト化し、得られたペレツトを冷
100mM CaCl22.5mlに再懸濁して一夜、氷上でインキユベ
ートした。
この細胞懸濁液200μを実施例2Hで調製した、ライゲ
ートしたDNAと混合し、氷上で20分間インキユベートし
た。次いでこの混合物を42℃において２分間、さらに室
温で10分間インキユベートした。この細胞混合物にＬ−
ブロス3mlを加えた後、空気振盪機（エアーシエーカ
ー）中、37℃で２時間インキユベートした。
この細胞混合物の一部をアンピシリン100μg/mlを含ん
だＬ−寒天平板（Ｌ−ブロス中に寒天15g/を含む）に
適用し、この平板を37℃でインキユベートした。大腸菌
K12 RR1/pSV2−HPC8形質転換体を、そのプラスミドDNA
の制限酵素分析により、証明した。選択のための抗生物
質としてテトラサイクリンではなく、アンピシリンを用
いる外は、実質上、実施例１の方法に従つて大腸菌K12
RR1/pSV2−HPC8からプラスミドDNAを得た。
実施例３ プラスミドpL133の組立て A.プラスミドpSV2−HPC8の〜0.29kbHind III−Sal I制
限フラグメントの単離 プラスミドpSV2−HPC8 50μｇを10×Hind III 反応バツ
フアー10μ、制限酵素Hind III 5μ（〜50単位）、
および水85μに溶かし、この反応混合物を37℃で２時
間インキユベートした。Hind III消化の後、DNAを沈殿
させ、得られたDNAペレツトを10×Sal I反応バツフアー
（1.5M NaCl;60mMトリス−HCl、pH＝7.9;60mM MgCl2;60
mM2−メルカプトエタノール；および1mg/ml BSA）10μ
、制限酵素Sal I 5μ（〜50単位）、および水85μ
に溶かした。得られたSal I反応混合物を37℃で２時
間インキユベートした。
このHind III−Sal I−消化プラスミドpSV2−HPC8を3.5
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の〜0.
29kb Hind III−Sal I制限フラグメントが他の反応生成
物から明確に分かれるまで、泳動させた。実質上、実施
例2Aの方法に従い、所望のフラグメントを精製した。得
られたフラグメント〜２μをTEバツフアー10μに懸
濁し、−20℃で保存した。
B.プラスミドpSV2−HPC8の〜1.5kbSal I−Bgl II制限フ
ラグメントの単離 プラスミドpSV−HPC850μｇを10×Bgl II反応バツフア
ー10μ、制限酵素Bgl II5μ（〜50単離）、および
水85μに溶かし、この反応混合物を37℃で２時間イン
キユベートした。Bgl II消化の後、DNAを沈殿させ、得
られたDNAペレツトを10×Sal I反応バツフアー10μ、
制限酵素Sal I5μ、および水85μに溶かした。得ら
れたSal I反応混合物を37℃で２時間インキユベートし
た。
このSal I−Bgl II−消化プラスミドpSV2−HPC8を3.5％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の〜1.15
kb Sal I−Bgl II制限フラグメントが他の反応生成物か
ら明確に分かれるまで、泳動させた。実質上、実施例2A
の方法に従い、所望フラグメントを精製した。得られた
フラグメント〜８μｇをTEバツフアー10μに懸濁し、
−20℃で保存した。
C.プラスミドpSV2−β−グロブリンの〜4.2kb Bgl II−
Hind III 制限フラグメントの単離 プラスミドpSV2−β−グロブリン（NRRLB−15928）の所
望の〜4.2kb Bgl II−Hind III 制限フラグメントの単
離は、プラスミドpSV2−gptの代りにプラスミドpSV2−
β−グロブリンを用いる外は実質上、実施例2Gの方法に
従つて行われた。得られたDNA〜５μｇをTEバツフアー1
0μに懸濁し、−20℃で保存した。
D.プラスミドpL133の組立てのための、フラグメントラ
イゲーシヨン 実施例3Aで得たフラグメント２μ、実施例3Bで得たフ
ラグメント２μ、および実施例3Cで得たフラグメント
２μを一緒に混合し、実質上、実施例2Hの方法に従つ
てライゲートさせた。ライゲートしたDNAは所望のプラ
スミドpL133を構成していた。このプラスミドの制限サ
イトおよび機能地図を添付の第３図に示す。
E.大腸菌K12 RR1/pL133の組立て 形質転換のためのDNAとしてプラスミドpSV2−HPC8でな
くプラスミドpL133を用いる外は実質上、実施例2Iの方
法に従い、所望の大腸菌K12 RR1/pL133形質転換体を組
立てた。
細胞の培養に用いた抗生物質がテトラサイクリンではな
くアンピシリンであることを除き、実質上、実施例１の
方法に従つて大腸菌K12 RR1/pL133形質転換体からプラ
スミドDNAを得た。
実施例４ プラスミドpL132の組立て A.プラスミドpSV2−neoの〜5.7kb Hind III−Bgl II制
限フラグメントの単離 プラスミドpSV2−neo（ATCC37149）の〜5.7kb Hind III
−Bgl IIフラグメントの単離は、プラスミドpSV−gptの
代りにプラスミドpSV2−neoを用いる外は、実質上、実
施例2Gの方法に従つて行われた。得られたDNA〜５μｇ
をTEバツフアー10μに懸濁し、−20℃で保存した。
B.プラスミドpL132の組立てのための、フラグメントの
ライゲーシヨン プラスミドpSV2−neoの〜5.7kb Hind III−Bgl II制限
フラグメント（実施例4Aで調製）２μ、実施例3Aで調
製したプラスミドpSV2−HPC8の〜0.29kb Hid III−Sal
I制限フラグメント２μ、および実施例3Bで調製した
プラスミドpSV2−HPC8の〜1.15kb Sal I−Bgl II制限フ
ラグメント２μを一緒に混合し、実質上、実施例2Hの
方法に従つてライゲートさせた。ライゲートしたDNAは
所望のプラスミドpL132を構成していた。このプラスミ
ドの制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
C.大腸菌K12 RR1/pL132の組立て 形質転換のためのDNAとしてプラスミドpSV2−HPC8では
なくプラスミドpL132を用いる外は実質上、実施例2Iの
方法に従い、所望の大腸菌K12 RR1/pL132形質転換体を
組立てた。
細胞の培養に用いた抗生物質がテトラサイクリンではな
くアンピシリンであることを除き、実質上、実施例１の
方法に従つて大腸菌K12 RR1/pL132形質転換体からプラ
スミドDNAを得た。
実施例５ プラスミドpL141の組立て A.プラスミドpSV2−dhfr−Ｘを得るための、プラスミド
pSV2−dhfrにおけるXho I認識配列の組立て プラスミドpSV2−dhfr（大腸菌K12 HB101/pSV2−dhfr、
ATCC37146から単離）10μｇと10×BamH I塩類10μ、
制限酵素BamH I 2μ（〜20単位）、および水88μと
を混合し、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユ
ベートした。フエノールおよびクロロホルムで抽出して
反応を止めた後、BamH I消化プラスミドpSV2−dhfr DNA
を沈殿させ、遠心して集めた。
このDNAペレツトを、50mM DTT1μ、各dNTPの100mM溶
液４μ、DNAポリメラーゼＩのクレノー（klenow）フ
ラグメント１μ〔〜５単位、ニユー・イングランド・
バイオラボス〔New England Biolabs）〕、水34μ、
およびクレノー・バツフアー（400mM KPO4、pH＝7.5;66
mM MgCl2;および10mM 2−メルカプトエタノール）５μ
に再懸濁し、14℃で１時間インキユベートした。0.25
MEDTA4μを加え、次いでフエノール抽出を行うことに
より、反応を止めた。反応混合物からDNAを沈殿させ、
遠心してペレツト化した。DNA〜10μｇを得、これをTE
バツフアー20μに溶かした。
式： で示されるXhoリンカー（類）（ニユーイングランドバ
イオラボス、32トザーロード、ベバーリイ、MA09195）
を下記の方法でキナーゼ処理し、ライゲーシヨンのため
に調製した。リンカー４μ（〜２μｇ）を水20.15μ
と10×キナーゼバツフアー（500mMトリス−HCl、pH＝
7.6および100mM MgCl2）５μに溶かし、90℃で２分間
インキユベートした後、室温まで冷却した。この混合物
にγ−32p−ATP5μ（〜20μci）、1M DTT2.5μ、お
よびポリヌクレオチドキナーゼ５μ（〜10単位）を加
えた後、37℃で30分間インキユベートした。次いで、0.
01mMATP3.35μと、さらに５μのキナーゼを加え、
なお30分間、37℃において反応を続けた。次いで、得ら
れた反応混合物を−20℃で保存した。
BamH I−消化、クレノー処理を行なつたプラスミドpSV2
−dhfr6.8μ（〜3.4μｇ）と、キナーゼ処理したXho
Iリンカーとを混合し、水11.3μ、10×リガーゼバツ
フアー3.5μ、10mM ATP1.4μ、およびT4DNAリガー
ゼ２μ（〜10単位）と一緒に16℃で一夜インキユベー
トした。65℃で10分間インキユベートすることにより、
反応を止めた。
10×Xho I反応バツフアー（1.5M NaCl;60mMトリス−HC
l、pH＝7.9;60mM MgCl2;60mMメルカプトエタノール；お
よび1mg/ml BSA）10μ、制限酵素Xho I5μ（〜100
単位）、および水50μを上記の反応混合物に加え、37
℃で４時間インキユベートした。反応混合物を１％アガ
ロースゲル上に適用し、実質上、実施例2Gの方法に従つ
て所望のフラグメントを単離した。得られたフラグメン
ト〜２μをTEバツフアー10μに懸濁した。
次いで、Xho I リンカーに付加したBamH I消化プラスミ
ドpSV2−dhfrをライゲートし、形質転換に係るDNAがプ
ラスミドpSV2−dhfr−Ｘである外は実質上、実施例2Hお
よび2Iの方法に従つて大腸菌K12 RR1を形質転換した。
得られた大腸菌K12 RR1/pSV−dhfr−Ｘ形質転換体を、
そのアンピシリン耐性表現型、並びにそのプラスミドDN
Aの制限酵素分析により、同定した。細胞の培養期間中
に用いる抗生物質がアンピシリンであることを除き、実
質上、実施例１の方法に従い、この形質転換体からプラ
スミドpSV2−dhfr−Ｘを単離した。
B.プラスミドpSV2−dhfr−Ｘの〜4.2kb EcoR I−Xho I
制限フラグメントの単離 プラスミドpSV2−dhfr−X5μを10×Xho I 反応バツフ
アー10μ、制限酵素Xho I5μ（〜50単位）、および
水85μと混合し、得られた反応混合物を37℃で２時間
インキユベートした。反応の後、Xho I 消化プラスミド
pSV2−dhfr−X DNAを沈殿させ、遠心して集めた。このD
NAペレツトを10×EcoR I反応バツフアー10μ、制限酵
素EcoR I5μ（〜50単位）、および水85μに再懸濁
し、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベート
した。EcoR I反応の後、得られたXho I−EcoR I−消化
プラスミドpSV2−dhfr−X DNAを１％アガロースゲルに
適用し、実質上、実施例2Gの方法に従い、所望の〜4.2k
b EcoR I−Xho l制限フラグメントを精製した。得られ
たフラグメント〜10μｇをTEバツフアー20μに懸濁
し、20゜で保存した。
C.プラスミドpL133の0.64kb Pvu II−BstE II制限フラ
グメントからのXho I−BstE II制限フラグメントの組立
て プラスミドpL13350μｇを10×Pvu II反応バツフアー（6
00mM NaCl;60mMトリス−HCl、pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM
メルカプトエタノール；および1mg/ml BSA）10μ、制
限酵素Pvu II 5μ（〜50単位）、および水85μと混
合し、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベー
トした。反応の後、Pvu II−消化プラスミドpL133DNAを
沈殿させ、遠心して集めた。
実施例5Aで用いたXhoリンカーと同じリンカー約５μｇ
を実質上、実施例5Aの方法に従つてキナーゼ処理し、Pv
u II−消化プラスミドpL133DNAにライゲートした。ライ
ゲーシヨン反応の後、DNAを沈殿させ、遠心して集め
た。
このDNAペレツトを10×Xho I反応バツフアー20μ、制
限酵素Xho I10μ（〜100単位）、および水165μに
再懸濁し、37℃で４時間インキユベートした。次いで、
この反応混合物に制限酵素BstE II 5μ（〜50単位）
を加えた後、鉱油の下、60℃で４時間インキユベートし
た。得られたXho I−BstE II−消化DNAを3.5％ポリアク
リルアミドゲルに適用し、実質上、実施例2Aの方法に従
い、所望の〜0.64kbXho I−BstE II制限フラグメントを
精製した。得られたフラグメント約３μｇをTEバツフア
ー６μに再懸濁し、−20℃で保存した。
D.プラスミドpL133〜2.7kb EcoR I−BstE II 制限フラ
グメントの単離 プラスミドpL133 50μｇを10×BstE II反応バツフアー1
0μ、制限酵素BstE II 5μ（〜50単位、および水85
μを混合し、得られた反応混合物を鉱油の下、60℃で
２時間インキユベートした。反応の後、BstE II−消化
プラスミドpL133DNAを沈殿させ、遠心して集めた。この
DNAペレツトを10×EcoR I反応バツフアー10μ、制限
酵素EcoR I 5μ（〜50単位）、および水85μに再懸
濁し、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベー
トした。EcoR I反応の後、得られたBstE II−EcoRI−消
化プラスミドpL133DNAを１％アガロースゲルに適用し、
実質上、実施例2Gの方法に従い、所望の〜2.7kb EcoR I
−BstE II 制限フラグメントを精製した。得られたフラ
グメント〜10μｇをTEバツフアー20μに懸濁し、20゜
で保存した。
E.プラスミドpL141の組立てのためのフラグメントのラ
イゲーシヨン、および大腸菌K12 RRの１形質転換 実施例5Bで調製したプラスミドpSV2−dhfr−Ｘの〜4.2k
b EcoR I−Xho I制限フラグメント２μ、実施例5Cに
おいてプラスミドpL133から組立てた〜0.6kb Xho I−Bs
tE II制限フラグメント２μ、および実施例5Dで調製
したプラスミドpL133の〜2.7kbEcoR I−BstE II制限フ
ラグメントを一緒に混合し、実質上、実施例2Hおよび2I
の方法に従つてライゲートし、得られたプラスミドpL14
1DNAを用いて大腸菌K12 RR1を形質転換した。所望の大
腸菌K12 RR1/PL141形質転換体をそのアンピシリン耐性
表現型とそのプラスミドDNAの制限酵素分析により、同
定した。細胞の培養期間中に用いる抗生物質がアンピシ
リンである外は実質上、実施例１の方法に従い、形質転
換体からプラスミドpL141を単離した。プラスミドpL141
の制限サイトおよび機能地図を添付の第５図に示す。
実施例６ プラスミドpL142の組立て A.プラスミドpRSVcatの〜0.76kb Nde I−Hind III 制限
フラグメントの単離 プラスミドpRSVcat（ATCCに、寄託番号ATCC37152の下で
寄託されている宿主大腸菌HB101から入手可能）50μｇ
を10×Hind III 反応バツフアー10μ、制限酵素Hind
III 5μ（〜50単位）、および水85μに溶かし、こ
の反応混合物を37℃で２時間インキユベートした。Hind
III 消化の後、DNAを沈殿させ、遠心して集めた。得ら
れたDNAペレツトを10×Nde I反応バツフアー（1.5M NaC
l;100mMトリス−HCl、pH＝7.8;70mM MgCl2;および60mM2
−メルカプトエタノール）10μ、制限酵素Nde I 10μ
（〜30単位）、および水85μに溶かした。得られた
反応混合物を37℃で消化が完了するまでインキユベート
した。
このHind III −Nde I−消化プラスミドpRSVcatDNAを3.
5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、〜0.7kb N
de I−Hind III制限フラグメントを実質上、実施例2Aの
方法に従い、単離、精製した。得られたフラグメント〜
５μｇをTEバツフアー10μに懸濁し、−20℃で保存し
た。このフラグメントはラウス肉腫ウイルス由来の長い
末端重復のプロモーター活性を含有しており、多くの真
核性細胞内でのDNA転写におけるプロモーターとして機
能する。
B.プラスミドpL133の〜5.1kb Nde I−Hind III制限フラ
グメントの単離 この単離は、プラスミドpRSVcatの代りにプラスミドpL1
33を消化する外は実質上、実施例6Aの方法に従つて行わ
れた。さらに、3.5％ポリアクリルアミドゲルの代りに
１％アガロースゲルを用い、実質上、実施例2Gの方法に
従つてフラグメントを単離した。得られた約５μｇの所
望のフラグメントをTEバツフアー10μに懸濁し、−20
℃で保存した。
C.プラスミドpL142の組立てのためのライゲーシヨン、
および大腸菌K12 RR1の形質転換 実施例6Aで単離したプラスミドpRSVcatの〜0.76kb Nde
I−Hind III制限フラグメント２μを実施例6Bで単離
したプラスミドpL133の〜5.1kb Nde I−Hind III制限フ
ラグメント１μにライゲートした。ライゲーシヨンは
実質上、実施例2Hの方法に従つて行われた。ライゲート
されたDNAは所望のプラスミドpL142を構成しており、こ
れを用いて実質上、実施例2Iの方法に従つて大腸菌K12
RR1を形質転換した。大腸菌K12 RR1/pL142形質転換体
を、そのアンピシリン耐性表現型とそのプラスミドDNA
の制限酵素分析により、同定した。プラスミドpL142の
制限サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す。形質
転換体からのプラスミドpL142の単離は、細胞の培養に
際して用いる抗生物質がアンピシリンであることを除
き、実質上、実施例１の方法に従つて行つた。
実施例７ プラスミドpMSV−HPCの組立て プラスミドpMSVi（NRRL B−15929）10μｇを10×Bgl II
バツフアー10μ、制限酵素Bgl II2μ（〜20単
位）、および水88μに溶かし、得られた反応混合物を
37℃で２時間インキユベートした。Bgl II−消化プラス
ミドpMSVi DNAをフエノールおよびクロロホルムの両者
で抽出した後、DNAを水10μに再懸濁した。
Bgl II−消化プラスミドpMSVi DNA2μを下記の実施例
8Cで調製したプラスミドpSV2−HPC8の〜1.425kb Bcl I
制限フラグメント２μと混合し実質上、実施例2Hおよ
び2Iの方法に従い、２つのフラグメントをライゲート
し、これを用いて大腸菌k12 RR1を形質転換した。
所望のpMSV−HPC形質転換体をそのプラスミドDNAの制限
酵素分析と、そのアンピシリン耐性およびテトラサイク
リン耐性表現型により同定した。プラスミドpMSV−HPC
の制限サイトおよび機能地図を添付の第７図に示す。プ
ラスミドpMSV−HPC上にはネズミ肉腫ウイルス配列が存
在しているので、このプラスミドを包膜し（カプシドで
包み）、広い宿主域を有するヘルパーウイルス〔例、ア
ンフオトロピツク（amphotropic）。ネズミ白血病ウイ
ルス〕またはその様なヘルパー機能を担つているセルラ
インによつて供給される転移−活性機能を有する透過性
のベクターにすることができる。この方法により、ベク
ターの形質転換能を大いに高め、ベクターが発現し得る
宿主細胞の範囲を広げることができる。
実施例８ プラスミドpMMT△BPV−HPCの組立て A.中間体プラスミドpMMT△BPVの組立て プラスミドpdBPV−MMTneo（ATCC37224）約１μｇを、10
×BamH I 反応バツフアー10μ、制限酵素BemH I 5μ
（〜50単位）、および水85μと混合し、得られた反
応混合物を37℃で２時間インキユベートした。
65℃で５分間インキユベートした後、BamH I消化プラス
ミドpdBPV−MMTneo DNAをリガーゼバツフアーで濃度約
0.1μg/μに希釈し、T4DNAリガーゼでライゲートした
後、得られたプラスミドpMMT△BPV DNAを用い、実質
上、実施例2Hおよび2Iの方法に従つて大腸菌K12 RR1を
形質転換した。大腸菌K12 RR1/pMMT△BPV形質転換体
を、そのアンピシリン耐性表現型とそのプラスミドDNA
の制限酵素分析により同定した。細胞培養に際して用い
る抗生物質がアンピシリンである外は実質上、実施例１
の方法に従つて形質転換体からプラスミドpMMT△BPV DN
Aを単転した。
B.Bgl II−消化プラスミドpMMT△BPVの調製 プラスミドpMMT△BPV DNA10μｇを10×Bgl IIバツフア
ー10μ、制限酵素Bgl II5μ（〜50単位）、および
水85μに溶かし、得られた反応混合物を37℃で２時間
インキユベートした。次いで、この反応混合物をフエノ
ールで１回、さらにクロロホルムで１回抽出し、DNAを
沈殿させ、遠心して集めた。この様にして得たBgl II−
消化プラスミドpMMT△BPV〜10μｇをTEバツフアー20μ
に懸濁し、20℃で保存した。
C.プラスミドpSV2−HPC8の〜1.425kb Bcl I制限フラグ
メントの単離 制限酵素Bcl IによつてDNAを完全に消化するためには、
認識配列中のデオキシアデニル残基がメチル化されてい
てはならない。Bcl I消化に供されるプラスミドDNAを大
腸菌内で生産する場合には、大腸菌K12 GM48（NRRL B−
15725）の如く、アデニンメチラーゼ欠損株を用いる必
要がある。
形質転換のために大腸菌K12 GM48を用意し、これを、実
質上、実施例2Iの方法に従い、プラスミドpSV2−HPC8で
形質転換した。細胞培養中に用いる抗生物質がアンピシ
リンである外は、実質上、実施例１の方法に従つて大腸
菌K12 GM48/pSV2−HPC8形質転換体からプラスミドpSV2
−HPC8 DNAを単離した。
大腸菌K12 GM48/PSV2−HPC8形質転換体から単離したプ
ラスミドpSV2−HPC8 DNA50μｇを10×Bcl I反応バツフ
アー（750mM KCl;60mMトリス−HCl、pH＝7.4;100m MMgC
l2;10mMジチオトレイトール；および1mg/ml BSA）10μ
、制限酵素Bcl I 5μ（〜50単位）および水85μ
に溶かし、得られた反応混合物を50℃で２時間インキユ
ベートした。このBcl I−消化プラスミドpSV2−HPO8 DN
Aを１％アガロースゲルに適用して所望の〜1.425kb Bcl
I制限フラグメントを単離し、実質上、実施例2Gの方法
に従つて精製した。得られたフラグメント〜５μｇをTE
バツフアー10μに溶かし、−20℃に保存した。
D.プラスミドpMMT△BPV−HPCの組立てのためのライゲー
シヨンおよび大腸菌K12 RR1の形質転換 実施例8Bで調製したBgl II−消化プラスミドpMMT△BPV
DNA 2μと、実施例8Cで単離した、プラスミドpSV2−H
PC8の〜1.425kb Bcl I制限フラグメント２μとを混合
し、実質上、実施例2Hおよび2Iの方法に従つてライゲー
トし、得られたプラスミドpMMT△BPV−HPC DNAを用いて
大腸菌K12 RRlを形質転換した。所望の大腸菌K12 RR1/p
MMT△BPV−HPC形質転換体を、そのアンピシリン耐性表
現型とそのプラスミドの制限酵素分析により、同定し
た。細胞培養中に用いる抗生物質がアンピシリンである
外は実質上、実施例１の方法に従つて形質転換体からプ
ラスミドpMMT△BPV−HPCを単離した。プラスミドpMMT△
BPV−HPCの制限サイトおよび機能地図を添付の第８図に
示す。
実施例９ プラスミドpL151の組立て A.プラスミドpL142から導かれる〜1.06kb BstE II−Xho
I制限フラグメントの組立て プラスミドpL142 DNA50μｇを10×Nde I反応バツフアー
10μ、制限酵素Nde I 5μ（〜50単位）、および水8
5μに溶かし、得られた反応混合物を37℃に２時間置
いた。反応後、DNAを沈殿させ、遠心して集めた。DNAペ
レツトをクレノーバツフアーに再懸濁し、実質上、実施
例5Aの方法に従つてNde I−消化DNAをクレノー酵素で処
理した。クレノー反応の後、DNAを再度沈殿させ、遠心
して集めた。
実質上、実施例5Aの方法に従つてXhoリンカー（５′−C
CTCGAGG−３′）をキナーゼ処理し、ライゲーシヨンの
ために調製したNde I−消化、クレノー処理プラスミドp
L142DNAにライゲートした。このライゲーシヨン反応物
を熱は不活性化した後、DNAを沈殿させ、遠心して集め
た。
このDNAペレツトを10×Xho I反応バツフアー20μ、制
限酵素Xho I 10μ（〜100単位）および水170μに溶
かし、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベー
トした。次いで、この反応混合物に制限酵素BstE II 5
μ（〜50単位）を加え、鉱油下60℃で４時間インキユ
ベートした。フエノール沈殿の後、消化DNAをポリアク
リルアミドゲルに適用し、実質上、実施例2Aの方法に従
つて〜1.06kb BstE II−Xho I制限フラグメントを単離
し、精製した。所望のフラグメント約５μｇを得、これ
をTEバツフアー10μに懸濁し、−20℃で保存した。
B.ライゲーシヨン、並びにプラスミドpL151および大腸
菌K12 RR1/pL151の最終的な組立て 実施例9Aで調製した、プラスミドpL142から導かれた〜
1.06kb BstE II−Xho I制限フラグメント２μを実施
例5Bで調製したプラスミドpSV2−dhfr−Ｘ〜4.2kb EcoR
I−Xho I制限フラグメント２μ、および実施例5Dで
調製したプラスミドpL133の〜2.74BstE II−EcoR I制限
フラグメント２μにライゲートした。ライゲーシヨン
反応は、実質上、実施例2Hの方法に従つて行われた。
ライゲートされたDNAは所望のプラスミドpL151を構成し
ており、これを用いて、実質上、実施例2Iの方法に従
い、大腸菌K12 RR1を形質転換した。所望の大腸菌K12 R
R1/pL151形質転換体をアンピシリン−含有培地上で選択
し、そのプラスミドDNAの制限酵素分析により、同定し
た。このプラスミドpL151の制限サイトおよび機能地図
を添付の第９図に示す。
実施例10 プラスミドpCZ11組立て A.中間体プラスミドpCZ118の組立て プラスミドpCZ101 10μｇを10×Nde I反応バツフアー10
μ、制限酵素Nde I 10μ（〜20単位）、および水80
μに溶かし、得られた反応混合物を37℃において、消
化が完了するまでインキユベートした。このNde I−消
化プラスミドpCZ101DNAを沈殿させ、遠心して集めた。
このDNAペレツトを10×EcoR I反応バツフアー10μ、
制限酵素EcoR I 2μ（〜20単位）、および水88μに
溶かし、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベ
ートした。
再度DNAを沈殿させ、遠心して集めた後、実質上実施例5
Aの方法に従い、Nde I−EcoR I消化プラスミドpCZ101DN
Aを、クレノー酵素で処理した。このクレノー処理DNAを
リガーゼバツフアー中で濃度約0.1μg/μに希釈し、
次いで、実質上実施例2Hの方法に従つて自己ライゲート
させた。DNA配列決定の結果、クレノー酵素にヌクレア
ーゼが混ざつていることが判明し、いくらか分解されて
いたが、lppプロモーターには著しい影響がなかつた。
コンピテント大腸菌K12 RV308細胞を用意し、形質転換
用DNAを加えた後25℃以上の温度で細胞をインキユベー
トしない、ということの外は、実質上、実施例2Iの方法
に従い、プラスミドpCZ118DNAで形質転換した。すなわ
ち、形質転換するDNAを細胞と混合し、氷上で30分ない
し１時間インキユベートした後、細胞を遠心して集め
た。得られた細胞ペレツトをＬ−ブロス〜1mlに再懸濁
し、この懸濁液を25℃において１時間インキユベートし
た後、選択用平板上にプレートした。大腸菌K12 RV308/
pCZ118形質転換体をそのカナマイシン耐性表現型とその
プラスミドDNAの制限酵素分析により同定した。この形
質転換体を、カナマイシンと一緒にTYブロス中、低温
（〜25℃）で、600nmにおけるO.D.が0.5〜1.0に達する
まで培養し、次いで、それらを37℃で４時間またはそれ
以上インキユベートすることにより、該形質転換体から
プラスミドpCZ118DNAを単離した。次に細胞を集め、実
質上、実施例1Bの方法に従いプラスミドpCZ118DNAを単
離した。
B.中間体プラスミドpCZ141の組立て プラスミドpCZ118DNA10μｇを10×BamH I バツフアー10
μ、制限酵素BamH I 2μ（〜20単位）、および水88
μに溶かし、得られた反応混合物を37℃で２時間置い
た。このBamH I−消化プラスミドpCZ118DNAを沈殿さ
せ、遠心して集めた。このDNAペレツトをクレノ−バツ
フアーに再懸濁し、実質上、実施例5Bの方法に従つてク
レノー酵素で処理した。次に、得られたBamH I−消化、
クレノー処理プラスミドpCZ118DNAを65℃において５分
間インキユベートした。
Nde I リンカー（５′−CCATATGG−３′、ニユーイング
ランドバイオラボ供給）をキナーゼ処理し、ライゲーシ
ヨンのために精製して、実質上、実施例5Aの方法に従
い、BamH I−消化、クレノー−処理プラスミドpCZ118DN
Aにライゲートした。リンカーがライゲートされた後、
酢酸ナトリウム（NaOAc）を、制限酵素Ned I 10μ
（〜30単位）と一緒に、濃度が150mMになる様に加え、
得られた反応混合物を37℃において、Nde I による消化
の完了が認められるまで、インキユベートした。次い
で、このNde I消化DNAを１％アガロースゲルに適用し、
実質上、実施例2Gの方法に従い、〜9.2kb Nde I制限フ
ラグメントを単離し、精製した。〜５μｇのフラグメン
トを得、これをTEバツフアー10μに懸濁した。
上記如くにして調製したDNA4μを自己ライゲートし、
得られたプラスミドpCZ141DNAを用い、実質上、実施例1
2Aの方法に従つて大腸菌K12 RV308を形質転換した。大
腸菌K12 RV308/PCZ141形質転換体をそのカナマイシン耐
性表現型とそのプラスミドDNAの制限酵素分析により、
同定した。実質上、実施例10Aの方法に従い、形質転換
体からプラスミドpCZ141DNAを単離した。
プラスミドpCZ141のDNA配列決定により、クレノー酵素
による処理の際、予測された様に、BamH I オーバーラ
ツプ（重複）の“充填（filledin）”がなされていない
ことが分つた。その代り、BamH I オーバーラツプと隣
接する配列は、Nde Iリンカーの付加に先立ち、プラス
ミドpCZ118DNAから除かれてしまつていた。この混合ヌ
クレアーゼ活性は、実質上に、以後のプラスミドpCZ459
の組立てには影響を及ぼさなかつた。
C.中間体プラスミドpCZ10の組立て プラスミドpCZ141 10μｇを10×Xba I反応バツフアー
（500mM NaCl;60mMトリス−HCl、pH−7.9;60mM MgCl2;
および1mg/ml BSA）10μ、制限酵素Xba I 5μ（〜5
0単位）、および水85μに溶かし、得られた反応混合
物を37℃で２時間インキユベートした。このXba I−消
化プラスミドpCZ141 DNAを沈殿させ、遠心して集めた。
このDNAペレツトを10×Nde I反応バツフアー10μ、制
限酵素Nde I 10μ（〜30単位）、および水80μに再
懸濁し、得られた反応混合物を37℃で消化が完了するま
でインキユベートした。
このNde I−Xba I−消化プラスミドpCZ141DNAを１％ア
ガロースゲルに適用し、実質上、実施例2Gの方法に従つ
て〜8.6kb制限フラグメントを単離し、精製した。約５
μｇのフラグメントを得、これをTEバツフアー10μに
懸濁した。
式： で示されるDNAリンカーを合成し、キナーゼ処理して実
質上、実施例2Bの方法に従い、ライゲーシヨンのために
調製した。このリンカーは、両端に位置する一本鎖DNA
配列を介して、プラスミドpCZ141の〜8.6kb Nde I−Xbe
I制限フラグメントとライゲーシヨンされる。プラスミ
ドpCZ141のXba I部位はこのプラスミド上に存在してい
るlppプロモーターの直ぐ下流に位置している上記のリ
ンカーはアデニル並びにチミジル残基に富む配列であ
る。Nde I認識配列に挿入されるあらゆる構造遺伝子の
ための、強力なリボソーム結合部位をコードしている。
プラスミドpCZ141の〜8.6kb Xba I−Nde I制限フラグメ
ント２μと上記のXba I−Nde Iリンカー100ピコモル
とをライゲートし、得られたプラスミドpCZ10DNAを、実
質上、実施例10Aの方法に従つて大腸菌K12 RV308に導入
（トランスフオーム）した。大腸菌K12 RV308/pCZ10形
質転換体を、そのカナマイシン耐性表現型とそのプラス
ミドDNAの制限酵素分析によつて同定した。実質上、実
施例10Aの方法に従い、この形質転換体からプラスミドp
CZ10を単離した。プラスミドpCZ10の制限サイトおよび
機能地図を添付の第11図に示す。
D.中間体プラスミドpCZ114の構築 プラスミドpCZ101DNA10μｇを、10×Xba I反応緩衝液10
μ、制限酵素Xba I 2μ（〜20単位）およびH2O88μ
に溶解し、得られた消化液を37℃で２時間インキユベ
ートした。このXba I消化したプラスミドpCZ101DNAを遠
心によつて沈殿させ、集めた。このDNAペレツトを、10
×BamH I反応緩衝液10μ、制限酵素BamH I 2μ（〜
20単位）およびH2O88μに溶解し、得られた反応液を3
7℃で２時間インキユベートした。実質上、実施例2Gの
方法に従つて、このXba I−BamH Iで消化したプラスミ
ドpCZ101DNAを１％アガロースゲルにかけ、〜10.2kbのX
ba I−BamH I制限フラグメントを単離し、精製した。約
５μｇのフラグメントが得られ、TE緩衝液10μに懸濁
させ、−20℃で貯蔵した。
プラスミドpCZ101DNA50μｇを、10×BamH I反応緩衝液2
0μ、制限酵素BamH I 5μ（〜50単位）、制限酵素H
giA I 5μ（〜50単位）およびH2O170μに溶解し、
得られた反応液を37℃で２時間インキユベートした。実
質上、実施例2Aの方法に従つて、このBamH I−HgiA Iで
消化したプラスミドpCZ101DNAを3.5％ポリアクリルアミ
ドゲルにかけ、〜0.6kbのBamH I−HgiA I制限フラグメ
ントを単離し、精製した。約５μｇのフラグメントが得
られ、TE緩衝液10μに懸濁させ、−20℃で貯蔵した。
以下の配列： で示されるDNAリンカーを、実質上、実施例2Bの方法に
従つて、ライゲーシヨン用に構築し、キナーゼ処理し、
調製した。上記のDNAリンカーは、Xba I−HgiA I切断DN
Aに適合する、単鎖DNA延長部を有している。
実質上、実施例10Aでの教示に従つてプラスミドpCZ101
の〜10.2kb Xba I−BamH I制限フラグメント２μ、プ
ラスミドpCZ101の〜0.6kb BamH I−HgiA I制限フラグメ
ント２μ、および上記リンカー100ピコモルをライゲ
ーシヨンし、得られたプラスミドpCZ114DNAで、E.coli
K12 RV308を形質転換した。このE.coli K12 RX308/pCZ1
14形質転換体は、そのカナマイシン耐性の表現型によつ
て、およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析によつて
同定した。プラスミドpCZ114は、実質上、実施例10Aの
方法に従つて形質転換体から単離した。プラスミドpCZ1
14は本質的にプラスミドpCZ101と同様の制限部位および
機能地図を有している。
E.プラスミドpCZ114由来の〜0.9kb Nde I−Kpn I制限フ
ラグメントの構築 プラスミドpCZ114DNA50μｇを、10μの10×sma I反応
緩衝液〔1.5MのNaCl、60mMのトリス−HCl（pH＝7.4）、
60mMのMgCl2、100mMの２−メルカプトエタノール、およ
び1mg/mlのBSA〕、５μ（〜50単位）の制限酵素sma I
および85μのH2Oに溶解し、得られた反応液を37℃で
２時間インキユベートした。反応を、フエノールおよび
CHCl3抽出によつて終結させ、次いでSma I消化したプラ
スミドpCZ114DNAを遠心して集めた。
Nde Iリンカー〔５′−CCATATGG−３′、ニユーイング
ランド・バイオラブス（New England Biolabs）〕を、
実質上、実施例10Bの方法に従つて、キナーゼ処理し、
そしてSma I消化したプラスミドpCZ114DNAにライゲーシ
ヨンした。ライゲーシヨンをフエノールおよびCHCl3抽
出で終結させた後、DNAを沈殿させ、集めた。このDNAペ
レツトを10μの10×Kpn I反応緩衝液〔60mMのNaCl、6
0mMのトリス−HCl（pH＝7.5）、60mMのMgCl2、60mMの２
−メルカプトエタノール、および1mg/mlのBSA〕、５μ
（〜50単位）の制限酵素Kpn I、および85μのH2Oに
溶解し、得られた反応液を37℃で２時間インキユベート
した。65℃で10分間加熱することによつて反応を終結さ
せた。室温まで冷却した後、10×Nde I反応緩衝液20μ
、制限酵素Nde I 15μ（〜45単位）、およびH2O65
μをKpn I消化したDNAに加え、得られた反応液を37℃
で数時間インキユベートした。
このNde I−Kpn I消化したDNAを、実質上、実施例2Aの
方法に従つて、3.5％ポリアクリルアミドゲルにかけ、
〜0.9kb Nde I−Kpn I制限フラグメントを単離し、精製
した。約５μｇ所望のフラグメントが得られ、10μに
懸濁させ、−20℃で貯蔵した。
F.プラスミドpCZ11の最終的な構築 プラスミドpCZ10DNA10μｇを、10×Kpn I反応緩衝液10
μ、制限酵素Kpn I 5μ（〜50単位）、およびH2O85
μに溶解し、得られた反応液を37℃で２時間インキユ
ベートした。65℃で10分間インキユベートして反応を終
結させた。次いで、10×Nde I反応緩衝液20μ、制限
酵素Nde I 5μ（〜50単位）、およびH2O75μを加え
た後、37℃で２時間インキユベートして、このKpn I消
化したDNAをNde Iで消化した。
このKpn I−Nde I消化したプラスミドpCZ10DNAを、実質
上、実施例2Gの方法に従つて、１％アガロースゲルにか
け、〜7.9kb Nde I−Kpn I制限フラグメントを精製し
た。約５μｇのフラグメントが得られ、TE緩衝液10μ
に懸濁させた。
プラスミドpCZ10の〜7.9kb Nde I−Kpn I制限フラグメ
ント２μおよびプラスミドpCZ114の〜0.9kb Nde I−K
pn I制限フラグメント２μを、実質上、実施例10Aの
方法に従つて、ライゲーシヨンし、得られたプラスミド
pCZ11DNAでE.coli RV308を形質転換した。このE.coli K
12 RV308/pCV11形質転換体は、そのカナマイシン耐性の
表現型によつて、およびそのプラスミドDNAの制限酵素
分析によつて同定した。実質上、実施例10Aの方法に従
つて、形質転換体からプラスミドpCZ11を単離した。
プラスミドpCZ10に存在する1ppプロモーターおよび合成
リボソーム結合部位の“下流”に、BamH I制限酵素認識
部位を配置するように、プラスミドpCZ11を構築した。
このBamH I部位によつて、プラスミドpCZ11に、プロテ
インＣ活性をコードしているDNA配列を挿入し、該配列
を1ppプロモーターの制御下に置くことができる。この
構築を下記の実施例11に開示する。
実施例11 プラスミドpCZ460の構築およびE.coliにおけるプロテイ
ンＣ誘導体の発現 A.中間体プラスミドpCZ451の構築 プラスミドpCZ11（10μｇ）を、10×BamH I反応緩衝液1
0μ、制限酵素BamH I 5μ（〜10単位）、制限酵素N
de I 5μ（〜10単位）およびH2O80μに溶解し、得
られた反応液を37℃で２時間インキユベートした。この
Nde I−BamH I消化したプラスミドpCZ11DNAを、実質
上、実施例2Gの方法に従つて、１％アガロースゲルにか
け、〜8.6kb Nde I−BamH I制限フラグメントを単離
し、精製した。約５μｇのフラグメントが得られ、TE緩
衝液10μ懸濁させた。
以下の配列： で示されるDNAリンカーを、実質上、実施例2Bの方法に
従つて、ライゲーシヨン用に構築し、キナーゼ処理し、
調製した。このリンカーは、上記調製のNde I−BamH I
消化したプラスミドpCZ11DNAとのライゲーシヨンが可能
な、単鎖DNA延長部を有している。メチオニンのコド
ン、および新生ヒトプロテインＣのアミノ酸残基33−39
のコドンをコードするように、このリンカーを設計し
た。アデニルおよびチミジルに富むようにし、それでも
なお天然のヒトプロテインＣにおけると同様のアミノ酸
配列を暗号化するようにリンカーを設計した。既述した
ように、新生ヒトプロテインＣ構造遺伝子の、推定の信
号ペプチド暗号化している領域は、原核生物宿主細胞用
に設計した発現プラスミドには含めなかつた。
実質上、実施例10Aの方法に従つて、プラスミドpCZ11の
〜8.6kb Nde I−BamH I制限フラグメント２μと上記
リンカー100ピコモルをライゲーシヨンし、得られたプ
ラスミドpCZ451DNAを使用してE.coli K12 RV308を形質
転換した。E.coli K12 RV308/pCZ451形質転換体は、そ
のカナマイシン耐性の表現型によつて、およびそのプラ
スミドDNAの制限酵素分析によつて同定した。実質上、
実施例10Aの教示に従つて、形質転換体からプラスミドp
CZ451DNAを単離した。
プラスミドpCZ451を部分的に配列決定することにより、
このプラスミドは、プラスミドpCZ11の構築の間に、Nde
Iリンカーが複数個直列に結合したため、２つのNde I
部位を有することがわかつた。直列に並んだNde I部位
は望ましくなく、実施例11Cに記載のようにして除去し
た。
B.中間体プラスミドpCZ455の構築 プラスミドpCZ451を、10×BamH I反応緩衝液10μ、制
限酵素BamH I 2μ（〜20単位）およびH2O88μに溶
解し、得られた反応液を37℃で２時間インキユベートし
た。反応をフエノールおよびCHCl3抽出で終結させた
後、遠心によつてDNAを沈殿させ、集めた。BamH I消化
したプラスミドpCZ451DNA10μｇをTE緩衝液20μに溶
解し、−20℃で貯蔵した。
E.coli K12 RV308にはDNA制限−修飾系が存在するので
（E.coli K12 RR1には存在しない）、実施例１で単離し
たようなプラスミドpHC7DNAは、プラスミドDNAを修飾す
るが制限はしない宿主細胞に導入して形質転換し、この
細胞から単離しなければならない。本発明の構築におい
ては、プラスミドpHC7から単離したBamH Iフラグメント
はE.coli K12 RV308制限系によつて制限されないの
で、、このようなサイクリングは必要ない。しかし、一
般的にはこのようなサイクングが必要である。E.coli K
12 JA221（NRRU B−15211）はこのようなサイクリング
に適する宿主である。
プラスミドpHC7DNA50μｇを、10×BamH I反応緩衝液10
μ、制限酵素BamH I 5μ（〜50単位）およびH2O85
μに溶解し、得られた反応液を37℃で２時間インキユ
ベートした。BamH Iで消化したプラスミドpHC7DNAを、
実質上、実施例2Gの教示に従つて、１％アガロースゲル
にかけ、〜1.2kb BamH I制限フラグメントを単離し、精
製した。約５μｇのフラグメントが得られ、TE緩衝液10
μに溶解し、−20℃で貯蔵した。
実質上、実施例10Aの方法に従つて、BamH I消化したプ
ラスミドpCZ451（２μ）およびプラスミドpHC7〜1.2k
b BamH I制限フラグメント２μをライゲーシヨンし、
得られたプラスミドpCZ455DNAを使用してE.coli K12 RV
308を形質転換した。このE.coli K12 RV308/PCZ455転換
体を、そのカナマイシン耐性の表現型によつて、および
そのプラスミドDNAの制限酵素分析によつて同定した。
実質上、実施例10Aの教示に従つて、形質転換体からプ
ラスミドpCZ455を単離した。
プラスミドpHC7の〜1.2kb BamH I制限フラグメントは、
BamH Iで消化したプラスミドpCZ451に、２配向のどちら
ででもライゲーシヨンすることができる。これら２配向
のうちの１方だけ（プラスミドpCZ455と称される）が、
プロテインＣを暗号化するDNAを正確に再構築する。プ
ロテインＣのヌクレオチド配列がわかつているので、正
しい配向は制限酵素分析によつて容易に同定される。プ
ラスミドpCZ455においては、〜1.2kb BamH I制限フラグ
メント内に位置するBgI II制限酵素認識配列が、1ppプ
ロモーターの３′末端に位置するXba I制限酵素認識配
列のできるだけ近くに配置されるように、この〜1.2kb
BamH I制限フラグメントを配向させる。
C.中間体プラスミドpCZ459の構築 実施例11Aに記載したように、プラスミドpCZ451およびp
CZ455における直列に並んだ複数のNde I制限部位の存在
は望ましくない。この直列部位は、1ppプロモーターと
プロテインＣを暗号化するDNAの開始コドンの間に位置
しており、プロテインＣ暗号化配列のmRNA転写の枠外読
み取りを引き起こすことがある。従つて、プラスミドpC
Z455（50μｇ）を10×Kpn I反応緩衝液10μ、制限酵
素Kpn I 5μ（−50単位）およびH2O85μに溶解し、
得られた消化液を37℃で２時間インキユベートした。次
いで、このKpn I消化したプラスミドpCZ455DNAを、10×
Nde I反応緩衝液20μ、制限酵素Nde I 15μ（〜45
単位）およびH2O65μに添加した後、得られた反応液
を37℃でNde I消化が完結するまでインキユベートし
て、Nde I消化を行なつた。
実質上、実施例2Gの方法に従つて、〜1.9kb Nde I−Kpn
I制限フラグメントを反応混合物から単離し、精製し
た。約５μｇのフラグメントが得られ、TE緩衝液10μ
に懸濁させた。
実質上、実施例10Aの方法に従つて、実施例10Fで調製し
たプラスミドpCZ10の〜7.9kb Nde I−Kpn I制限フラグ
メント２μとプラスミドpCZ455の〜1.9kb Nde I−Kpn
I制限フラグメントをライゲーシヨンし、得られたプラ
スミドpCZ459DNAでE.coli RV308を形質転換した。この
E.coli K12 RV308/pCZ459形質転換体を、このカナマイ
シン耐性の表現性によつて、およびそのプラスミドDNA
の制限酵素分析によつて同定した。実質上、実施例10A
の方法に従つて、形質転換体からプラスミドpCZ459を単
離した。プラスミドpCZ459の制限部位および機能地図
を、添付の第12図に示す。
プラスミドpCZ459は、先に番号を付した新生ヒトプロテ
インＣのアミノ酸残基33〜445のコドンをコードしてい
るDNAと、その前のメチオニンコドンをコードしているD
NAを発現させるために配置された1ppプロモーターを含
有している。従つて、プラスミドpCZ459は、真核生物の
信号ペプチドのアミノ酸残基２〜32およびプロテインＣ
のカルボキシ末端における最後の16アミノ酸残基をコー
ドしている部分のみを欠く、ほとんどすべての新生プロ
テインＣ構造遺伝子を含有する。プラスミドpCZ459のプ
ロテインＣを暗号化している部分の３′末端に位置する
DNAは、E.coliのリポタンパク遺伝子由来であり、プロ
テインＣを暗号化しているDNAと共に転写される。
プラスミドpCZ459の1ppプロモーターから転写されるmRN
Aは、ポリペプチド、すなわちそのアミノ末端にメチオ
ニン残基を有し、これに新生ヒトプロテインＣのアミノ
酸残基33〜445が続き、次いでこれにリポタンパク遺伝
子由来のDNAによつて暗号化されている以下のアミノ酸
配列（前記の定義を使用して）： ARG−LEU−SER−ASN−ASP−VAL−ASN−ALA−MET−ARG−
SER−ASP−VAL−GLN−ALA−ALA−LYS−ASP−ASP−ALA−
ALA−ARG−ALA−ASN−GLN−ARG−LEU−ASP−ASN−MET−
ALA−THR−LYS−TYR−ARG−LYS−COOH が続く、ポリペプチドに翻訳される。この融合遺伝子の
産物は、50.5キロダルトン（kd）の計算分子量を有し、
E.coli K12 RV308/pCZ459形質転換体を37℃で培養すれ
ば、該産物を含有する顆粒を産生する。
この顆粒は、約35kdおよび22kdの測定分子量を有する、
融合遺伝子産生物の２つの異なるサブフラグメントをも
含有する。理論的には、これらのサブフラグメントは、
ヒトプロテインＣの軽鎖および重鎖の間に位置するLYS
−ARG配列部分でこの融合遺伝子産物が開裂することに
より生成し（新生ヒトプロテインＣのアミノ酸残基198
および199）、計算分子量31.7kdおよび18.8kdのポリペ
プチドを生じる。融合遺伝子産物および両サブフラグメ
ントは、天然のヒトプロテインＣに対するポリクローナ
ル抗体と反応する。
D.中間体プラスミドpUC19HCの構築およびその〜80bp Ba
mH I制限フラグメントの単離 10μｇのプラスミドpUC19〔市販品より入手可能、フア
ーマシア・Ｐ−Ｌ・バイオケミカルズ・インコーポレー
シヨン（Pharmacia P−L Biochemicals、Inc）、ニユー
ジヤージー08854、ピスカタウエイ、センテニアル・ア
ベニユー、800番（800Centennial Ave.,Pi−scataway,
N.J.08854）〕を、10×Pst I反応緩衝液10μ、制限酵
素Pst I 2μ（〜20単位）およびH2O88μ溶解し、得
られた反応液を37℃で２時間インキユベートした。フエ
ノールおよびCHCl3抽出によつて反応を終結させた後、
遠心によりDNAを沈殿させ、集めた。このPst I消化した
プラスミドpUC19DNAペレツトをTE20μに溶解し、−20
℃で貯蔵した。
実質上、実施例2Gおよび2Hの方法に従つて、このPst I
消化プラスミドpUC19DNA2μを、実施例2Dで調製した
プラスミドpHC7の〜0.88kb PstI制限フラグメント１μ
にライゲーシヨンし、得られたプラスミドpUC19HCDNA
を使用してE.coli K12 RR1△M15（NRRL B−15440）を形
質転換した。この形質転換した細胞を、50μg/mlのアン
ピシリン、1mMのIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシド）、および50μg/mlのXG（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含
有するＬ−寒天指示平板上に植えた。プラスミドpUC19
で形質転換した細胞は指示平板上で青色を呈し、一方プ
ラスミドpUC19HCで形質転換した細胞は指示平板上で白
色であつた。
プラスミドpHC7の〜0.88kb Pst I制限フラグメントは２
つのの方向のどちらででも挿入することができるので、
プラスミドDNAの制限酵素分析を使用してE.coli K12 RR
1△M15/pUC19HC形質転換体を同定した。プラスミドpUC1
9HCとは、プラスミドpUC19由来DNAのBamH I制限部位に
近接している、〜0.88kb Pst I制限フラグメントのPst
Iオーバーラツプ（重複）の１個から〜60kb離れてBamH
I制限部位を配置している配向であるものという。選択
に使用する抗生物質がテトラサイクリンではなくアンピ
シリンであること以外は、実質上、実施例１の方法に従
つて、プラスミドpUC19HCを形質転換体から単離した。
プラスミドpUC19HCのDNA100μｇを、10×BamH I反応緩
衝液10μ、制限酵素BamH I 10μ（〜100単位）およ
びH2O80μに溶解し、得られた反応液を37℃で２時間
インキユベートした。実質上、実施例2Aの方法に従つ
て、BamH Iで消化したプラスミドpUC19HCのDNAを、6.5
％ポリアクリルアミドゲルにかけ、〜80bp BamH I制限
フラグメントを精製した。約１μｇのフラグメントが得
られ、TE緩衝液５μに懸濁させ、−20℃で貯蔵した。
E.BamH I消化プラスミドpCZ459の調製およびプラスミド
pCZ460の最終的な構築 プラスミドpCZ459（５μｇ）を、10×BamH I反応緩衝液
２μ、制限酵素BamH I 1μ（〜５単位）およびH2O1
7μに溶解し、得られた反応液を37℃で５分間インキ
ユベートした。フエノールおよびCHCl3抽出によつて反
応を終結させた。部分的なBamH I消化物を得るため、反
応時間を短かくした。この、部分的にBamH I消化したプ
ラスミドpCZ459を沈殿させ、集めた後、実質上、実施例
2Hの教示に従つて、DNAペレツトをリガーゼ緩衝液に懸
濁させ、プラスミドpUC19HCの〜80Dp BamH I制限フラグ
メント２μにライゲーシヨンした。
所望のプラスミドpCZ460DNAを構成しているこのライゲ
ーシヨンDNAを使つて、実質上、実施例10Aの方法に従つ
て、E.coli K12 RV308を形質転換した。E.coli K12 RV3
08/pCZ460形質転換体を、そのカナマイシン耐性の表現
型によつて、およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析
によつて同定した。プラスミドpCZ460を、実質上、実施
例10Aの方法に従つて、形質転換体から得た。
〜80bpフラグメントは、２つの可能な方向の両方向で、
かつ、プラスミドpCZ459の２つのBamH I制限酵素認識部
位の両部位に挿入することができた。従つて、様々なプ
ラスミドが上記のライゲーシヨン中に産生した。プラス
ミドpCZ460は、適切なBamH I部位に、また同時に、プロ
テインＣを暗号化しているDNA配列の再構築に必要な方
向で、〜80bp BamH I制限フラグメントを挿入して得ら
れるプラスミドに与えられる名称である。従つて、プラ
スミドpCZ460においては、新生ヒトプロテインＣのアミ
ノ酸残基33〜461は、プラスミド上に存在する1ppプロモ
ータと隣接している転写の読み取り相内に位置するDNA
セグメント上に、正しくコードされている。プラスミド
pCZ460の制限酵素分析により、１以上の〜80bp BamH I
制限フラグメントが、部分的にBamH I消化したプラスミ
ドpCZ459出発物質にライゲーシヨンしていることがわか
つた。正しいプロテインＣを暗号化しているDNA配列は
適切に再構築されたので、プラスミド上に存在するこの
付加的なフラグメントは、プロテインＣを暗号化してい
るDNA配列中に介在していることもなく、また、それを
延長するものでもない。
E.coli K12 RV308/pCZ460（NRRL B−15927）形質転換体
は、プラスミドpCZ460上に暗号化されたプロテインＣ誘
導体を含有する顆粒を産生する。このプロテインＣ誘導
体は約50キロダルトンの測定分子量を有し、DNA配列か
らの正確な計算値は約48.3kdである。E.coli K12 RV308
/pCZ460形質転換体は、抗ヒトプロテインＣのポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体と交差反応する。測定
分子量50kd、22kd、および34kdの３種類の異なるポリペ
プチドを産生する。22kdおよび34kdのポリペプチドは、
活性なヒトプロテインＣの軽鎖と重鎖を分離する、リジ
ンおよびアルギニン残基部分（前記、形成されつつある
ヒトプロテインＣに付与されるアミノ酸配列の残基198
および199に対応する）での50kdのプロテインＣ誘導体
の切断（計算分子量29.5kdおよび18.8kdのポリペプチド
を生じるであろう）に起因すると考えられている。
実施例12 HepG−2/pL133形質転換体の構築 次に挙げる方法はHepG−2/pL133形質転換体の構築につ
いて記載するものであるが、プラスミドpSV2−HPC8、pL
132、pL151、pMSV−HPC、pL141、pL142、およびpMMT△B
PV−HPC等、本発明の他のプラスミドすべてのHepG2形質
転換体の構築にも同様に適用することができる。さら
に、この方法は、好ましいセルラインとして本明細書中
第１表に挙げたセルラインにも一般的に適用することが
できる。真核性宿主細胞のための形質転換法は、当分野
で既知である。たとえば、ウイグラー等〔Wigler et a
l.、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス米国（P.N.A.S.USA）、76、1373
頁（1979）〕およびグラハム等〔Graham et al.、バイ
ラロジー（Virology）、52、456頁（1973）〕。
A.細胞の調製 ヒト肝臓芽細胞腫の細胞、HepG−２（ATCC＃HB8065）の
培養物を、形質転換当日に40〜50％の面生長（融合度）
が得られるように、形質転換に先だつて１〜２日継代培
養した。形質転換の２〜３時間前に培地を交換した。そ
れぞれの形質転換には、25cm2フラスコの細胞培養物１
つを必要とする。
B.DNAの調製 プラスミドpL133DNA10〜20μｇを、2MのCaCl262.5μ
およびH2O437.5μに加えた。次いで、この0.5mlのDNA
を、0.5ml2×HeBS〔10g/Lヘペス（pH＝7.5）、16g/LのN
aCl、0.74g/LのKCl、0.25g/LのNa2PO4、および2g/Lのデ
キストロース〕滴下し、乳状の沈殿を生成させた、この
混合物を細胞に加える前に、室温で10〜20分間放置し
た。インキユベーシヨンを長くすると、うまく形質転換
しない、粗い沈殿を生じることもあるが、時折、沈殿を
生じさせるためにより長いインキユベーシヨン時間が必
要になることがある。
C.細胞の形質転換 実施例12Bで調製したDNA溶液1mlを、穏やかに撹拌しな
がら25cm2フラスコのHepG−２細胞に加え、37℃で３〜
４時間インキユベートした。細胞を切り離さないように
注意しながら、細胞を、血清を含まない増殖培地（ダル
ベツコの変性イーグル培地、ギブコ）で２回洗浄した。
15％のグリセリンを含むHeBS1mlを細胞に加え、次いで3
7℃で２分間インキユベートした。
この“グリセリン−シヨツク”インキユベーシヨンは、
血清を含まない増殖培地を加え、次いで血清を含まない
増殖培地で２回洗浄することによつて終結させた。次
に、血清代用品〔ウシ血清アルブミンまたはウルトロサ
ーＧ（Ultroser−Ｇ）、リアクテイフ・イー・ベー・エ
フ・フオク・シミ（Reactff I.B.F.Foc.Chim.）（LK
B）、ポアンテ・ギラール（Pointet Girard）、92390ビ
ルヌベラ・ギヤレンヌ（Villeneuvela Garenne）、フラ
ンスより市販〕を含有する完全な、新鮮な増殖培地およ
び12.5μg/mlビタミンK1を加え、細胞を37℃のインキユ
ベーターに戻した。ウシ胎児血清は、プロテインＣ検定
を妨害するウシ因子およびプロテアーゼを含有するた
め、培地に使用しなかつた。
通常は形質転換の約96時間後に、一時検定のために、5m
Mの最終濃度となるように酪酸ナトリウムを加えた。G41
8Rまたはdhfr遺伝子のような選択マーカーを含有するプ
ラスミドを包含する形質転換のために、安定な形質転換
体の選択が望ましい時には、酪酸ナトリウムは加えず、
選択剤（たとえば400μg/mlG418）を形質転換の約２〜
４日後に加えた。この時にはウシ胎児血清を含有する完
全な培地を加え、選択培地で、２〜３週間、５〜７日毎
に培地を変えながら細胞を増殖させる。次いで個々のク
ローンを、さらに分析するため単離する。
D.プロテインＣの検定 HepG−2/pL133形質転換体および擬形質転換HepG−２細
胞を、形質転換の96時間後に、プロテインＣについて検
定した。擬形質転換細胞は、形質転換操作にかけたが、
形質転換するDNAには接触させなかつたものである。こ
の検定には、後述するようにプロテインＣに対する抗体
を必要とする。プロテインＣに対する抗体を調製するた
めの、プロテインＣ精製のための技術は、ポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体調製のための技術と同様、
当分野で知られている。
ヤギ抗−ヒトプロテインＣポリクローナル抗体を、96−
ウエル（くぼみ）の組織培養皿中で一晩インキユベート
し、抗体をプラスチツクに結合させた。ウエルを緩衝液
で洗浄した後、HepG−2/pL133形質転換体からの、およ
び擬形質転換したHepG−２細胞からの培地試料をこのウ
エルに加えた。この培地試料は形質転換の96時間後に採
取した。このウエル中の培地試料を、37℃で２時間イン
キユベートした後、ウエルを緩衝液ですすぎ、マウス抗
−ヒトプロテインＣモノクローナルIgGをウエルに加
え、４℃で１晩インキユベートした。
未結合のモノクローナル抗体を緩衝液ですすぎ流した
後、ペルオキシダーゼでコンジユゲートした、ヒツジ抗
−マウスIgGをウエル加え、37℃で２時間インキユベー
トした。緩衝液ですすいだ後、ABTS（2,2′−アジノ−
ジ−３−エチルベゾチアゾリン−スルホン酸塩）の溶液
をウエルに加え、室温かつ暗所でのインキユベーシヨン
を継続し、試料の光学密度を30分毎に２時間、405nmで
測定した。
本質的に、この検定は、皿に付着しているポリクローナ
ル抗体に結合するプロテインＣによつて行なわれる。次
いでモノクローナル抗体がプロテインＣに結合し、ペル
オキシダーゼをコンジユゲートした抗−マウスIgGがモ
ノクローナル抗体に結合するようになる。ペルオキシダ
ーゼは時間依存性の反応でABTSと反応し、405nmに強い
吸収がある生成物を与える。簡単に言えば、試料中のプ
ロテインＣが多ければ多ほど、405nmでのO.D.測定値は
高くなる。
HepG−2/pL133形質転換体は、擬形質転換細胞の10培ま
での測定値を与え、HepG−2/pL133形質転換体におい
て、プラスミド制御のプロテインＣが発現してることを
示した。HepG−２細胞は染色体性のプロテインＣ構造遺
伝子を含有しているので、mRNAを形質転換体から単離
し、プラスミドにコードされたプロテインＣのメツセー
ジ（情報）が存在するかどうかを測定した。その結果、
この形質転換体が、染色体由来のプロテインＣのmRNAよ
り5X多いプラスミド由来のプロテインＣのmRNAを有して
いることがわかつた。測定値は、調整培地1mlあたりプ
ロテインＣ約100〜300ngに対応する。
同様の検定をCHO−K1（dhfr-）/pL141形質転換体につい
て行ない、調整培地1mlあたりのプロテインＣが約1.8μ
ｇであることを測定した。DXB11宿主細胞のようなCHO−
K1（dhfr-）宿主細胞は、CHO−K1細胞に見い出される野
生種のジヒドロ葉酸還元酵素を欠いている。このような
dhfr-CHO−K1宿主細胞は、よく知られた方法に従つて得
ることができる。組み換えDNAの増幅により、HepG−2/p
L133形質転換体よりDXB11/pL141形質転換体の方に、よ
り多くの組み換えプロテインＣ遺伝子コピーが存在する
ので、DXB11/pL141形質転換体はより多数のプロテイン
Ｃを発現する。前記のようにこのこの増幅は当分野でよ
く知られており、野生種のdhfr遺伝子を含有するプラス
ミドで形質転換された宿主細胞を、増加量のメトトレキ
セイトにさらすことによつて行なう。このメトトレキセ
イト仲介の増幅は、多種多様の宿主細胞において行なう
ことができ、dhfr-セルラインに限定はされない。LLG−
MK2/pL132形質転換体で行なつたプロテインＣ検定は、
調整培地1mlあたり約25ngのプロテインＣを示した。
実施例13 組み換えヒトプロテインＣ酵素原の活性化 本実施例は、組み換えヒトプロテインＣを発現し、分泌
する哺乳動物細胞の調整組織培養培地から単離した組み
換えヒトプロテインＣに適用する。調整組織培養培地に
含有されるプロテインＣを、予め精製することなく、直
接活性化することもできる。
活性化は、ウシトロンビンと複合したウサギトロンボモ
ジユリン（thrombomodulin）を利用し、この複合体をア
ガロースビーズ上に固定する。アガロースビーズは沈殿
性であり、従つて容易に活性化混合物から除去される。
トロンボモジユリン−トロンビンは、次に示す方法で容
易アガロースビーズに固定できる。ウサギトロンボモジ
ユリンに対して結合親和力を有するモノクローナル抗体
を、６〜８炭素原子のアームを持つた架橋アガロースビ
ーズ〔たとえばアフイゲルTM102およびアフイゲルTM20
2、バイオ・ラツド（BioRed）、リツチモンド、カリフ
オルニア〕に共有結合させる。精製したネズミIgGモノ
クローナル抗体は、架橋アガロースのアームの化学構造
に依存して、その遊離のカルボキシまたは遊離のアミノ
基を介して共有結合することができる（共有結合には通
常のカルボジイミド化合物を使用する）。たとえば、約
0.15OD単位のIgGタンパクが、このアガロースゲルマト
リツクスに共有結合することができる。次に、高純度の
ウサギトロンボモジユリン調製物を、0.02Mトリス−HCl
（pH7.4）および0.15MのNaClの緩衝液で0.15OD単位/ml
まで希釈する。次いで、結合したモノクローナル抗−ト
ロンボモジユリン抗体でパツクされたアガロースビーズ
１容量を、トロンボモジユリン１容量と混合し、混合物
を緩やかに撹拌しながら一晩インキユベートする。
次いでこのビーズを遠心し、結合したトロンボモジユリ
ン量を、精製したタンパクのE1％（吸光係数）を8.8、M
r（分子量）を75kdと仮定して、上澄液のA280の測定に
より算出する。見かけ上均質になるまで精製したウシト
ロンビン（比活性:2,000NIHU/mg）を固定化したトロン
ボモジユリンに対して等モルの計算値量よりわずかに過
剰量加える。次いでこのビーズを30分〜１晩、４℃でイ
ンキユベートする。このインキユベーシヨンの後、ビー
ズを0.02Mトリス−HCl（pH7.4）および0.15MのNaCl緩衝
液で６〜10回洗浄し、次いでビーズをこの緩衝液中、４
℃で貯蔵する。
精製したプロテインＣ溶液またはプロテインＣ含有組織
培養培地1mlを、パツクされたビーズ50μに加え振盪
器上、37℃で30分間インキユベートする。活性化したセ
リンプロテアーゼへの酵素原の活性化は、通常1mg/mlの
ウシ血清アルブミン（放射線酵素検定グレード、シグ
マ、セントルイス、ミズーリ）を含有する、種々の生理
的pHおよびイオン強度の緩衝液中で容易に起こる。この
活性化反応はカルシウムを必要とし、このため、通常、
活性化混合物に、最終濃度が0.005〜0.025Mになるよう
にCaCl2を加える。
インキユベーシヨンの終了時に、遠心によつてビーズを
除去し、見かけ上均質になるまで精製した、ヒト抗トロ
ンビンIIIを加えて残存する遊離のトロンビンすべてを
失活させる。精製した抗トロンビンIII（1OD単位/ml）2
0μを、活性化混合物それぞれ500μに加える。室温
で15分間インキユベートした後、合成ペプチドパラニト
ロアニリド（pNA）基質Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−pNA
〔Ｓ−2238、カビービトラム（KabiVitrum）、ストツク
ホルム、スウエーデン〕、または活性化プロテインＣに
感応性の他のトリペプチドパラニトロアニリド基質を使
用して、活性混合物について、活性化したプロテインＣ
の活性を試験する。
この手法によつて、翻訳後のγ−カルボキシ化修飾が起
こつたかどうかとは関係なく、プロテインＣについて、
活性化したプロテインＣ活性の活性化および発現が可能
である。しかし、“glaが少ない”プロテインＣの活性
化速度は、翻訳後の修飾を受けたプロテインの活性化速
度の約20％である。もし、発現した産生物がγ−カルボ
キシグルタメート残基を含有しなければ、活性化インキ
ユベーシヨンの期間は、この比較的低い活性化速度を考
慮して延長する。
別法では、見かけ上均質になるまで精製したウシ凝固因
子Xaを利用し、凝固因子Va（Xaが関与するプロトロンビ
ンからトロンビンへの変換に必須であり、かつ活性化プ
ロテインＣ感応性の補助因子である）の不活性化速度を
測定することからなる凝固検定法で活性化プロテインＣ
の活性を測定することができる。HepG−2/pL133形質転
換体からの調整培地について前記の活性化法を行ない、
凝固検定によつて証明したとき、該培地は擬一形質転換
したHepG−２細胞（〜125ng/ml）に比べ〜2Xないしそれ
以上の活性化プロテインＣ（〜250ng/ml）を有すること
がわかつた。
CHO−K1−（dhfr-）/pL141形質転換体の培地から単離し
たプロテインＣを本実施例の方法に従つて活性化し、凝
固およびアミドール性（amidolytic）検定で試験した。
この検定は、プロテインＣが活性であることを明らかに
し、そして形質転換したCHO−K1宿主細胞が実質的なγ
−カルボキシラーゼ活性を有していることを示した。プ
ロテインＣのようなビタミンＫ−依存性セリンプロテア
ーゼ（これに限定はされない）を含む多数のポリペプチ
ドが、少なくともその生物学的活性の一部にγ−カルボ
キシル化を必要とし、そしてたとえばHepG−２およびH4
IIEC3セルライン等、少数のセルラインしかγ−カルボ
キシラーゼ活性を有していないので、CHO−K1宿主細胞
における実質的なγ−カルボキシラーゼ活性の発現は予
期しないものであつた。従つて、本発明は、CHO−K1宿
主細胞（そのdhfr-誘導体を含む）を使用して、γ−カ
ルボキシル化したポリペプチド、特にヒトプロテインＣ
のようなビタミンＫ−依存性セリンプロテアーゼ、を産
生するための方法をも含有するものである。
アミドール性または凝固検定のいずれを利用しようが、
通常、ヒト血漿由来の高純度活性化プロテインＣを標準
として使用して検量線を作製する。
固定化したトロンボモジユリン−トロンビン調製物は再
使用が可能である。完全に活性化した活性体は、0.02M
トリス−HCl（pH7.4）および0.15MのNaCl緩衝液でビー
ズを繰り返し洗浄すると簡単に再生できる。
この技術は、大スケールで大量のプロテインＣを活性化
するのに適している。大量に活性化しようとするときに
は、活性化しようとするプロテインＣの量に適した大き
さのカラムにビーズを詰め、プロテインＣ溶液を低流出
速度（たとえば６〜10ml/h）でカラムに通す。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpHC7の制限サイトおよび機能地図、
第２図はプラスミドpSV2−HPC8の制限部位および機能地
図、第３図はプラスミドpL133の制限サイトおよび機能
地図、第４図はプラスミドpL132の制限サイトおよび機
能地図、第５図はプラスミドpL141の制限サイトおよび
機能地図、第６図はプラスミドpL142の制限サイトおよ
び機能地図、第７図はプラスミドpMSV−HPCの制限サイ
トおよび機能地図、第８図はプラスミドpMMT△BPV−HPC
の制限サイトおよび機能地図、第９図はプラスミドpL15
1の制限サイトおよび機能地図、第10図はプラスミドpCZ
101の制限サイトおよび機能地図、第11図はプラスミドp
CZ10の制限サイトおよび機能地図、第12図はpCZ459の制
限サイトおよび機能地図を示すそれぞれ模式図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＣＢ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 9359−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スタンレイ・リチヤード・ジヤスクナス・ ジユニア アメリカ合衆国インデイアナ46220、イン デイアナポリス、ノース・タクシードウ・ ストリート6910番 (72)発明者 メイ‐フエイ・ツアイ・ライ アメリカ合衆国インデイアナ46032、カー メル、ペブル・ビーチ・ドライブ2110番 (72)発明者 シエイラ・パークス・リトル アメリカ合衆国インデイアナ46208、イン デイアナポリス、サンセツト・アベニユー 4629番 (72)発明者 ジヨージ・ルイス・ロング アメリカ合衆国インデイアナ46220、イン デイアナポリス、ワイマン・コート6532番 (72)発明者 ロバート・フランク・サンテレ アメリカ合衆国インデイアナ46077、ザイ オンズヴイレ、サウス500、イースト11735 番 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1984〔81〕Ｐ．4766−4770

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】暗号鎖が式： で示される配列を有し、Ｍは０または１、Ｎは０または
    １を表わす。 ただし、Ｍが０であるときにはＮも０であり； Ｒが式： で示される配列を有する。） で示される、ヒトプロテインＣ活性を有するポリペプチ
    ドをコードしている二本鎖デオキシリボ核酸からなる構
    築されたDNA化合物。
  2. 【請求項２】暗号鎖が式： で示される配列を有し、Ｍは０または１、Ｎは０または
    １を表わす。 ただし、Ｍが０であるときにはＮも０であり； Ｒが式： で示される配列を有する。 で示される、ヒトプロテインＣ活性を有するポリペプチ
    ドをコードしている二本鎖デオキシリボ核酸からなる構
    築されたDNA化合物を含有しているプラスミド。
  3. 【請求項３】プラスミドpHC7、pSV2−HCP8、pMSV−HP
    C、pL133、pL132、pL151、pL141、pL142、pMMTΔBPV−H
    PCまたはpCZ460である第２項記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】暗号鎖が式： で示される配列を有し、Ｍは０または１、Ｎは０または
    １を表わす。 ただし、Ｍが０であるときにはＮも０であり； Ｒが式： で示される配列を有する。） で示される、ヒトプロテインＣ活性を有するポリペプチ
    ドをコードしている二本鎖デオキシリボ核酸からなる構
    築されたDNA化合物を含有しているプラスミド で形質
    転換された哺乳動物細胞。
  5. 【請求項５】プラスミドがpSV2−HCP8、pMSV−HPC、pL1
    33、pL132、pL151、pL141、pL142、またはpMMTΔBPV−H
    PCである第４項記載の細胞。
  6. 【請求項６】HepG−２、CV−１、LLC−MK2、3T3、CHO−
    K1、CHO−K1（phfr-）、HeLa、RPM18226、H4IIEC3、C12
    7I、またはHS−スルタン細胞である第４項記載の細胞。
  7. 【請求項７】暗号鎖が式： で示される配列を有し、Ｍは０または１、Ｎは０または
    １を表わす。 ただし、Ｍが０であるときにはＮも０であり； Ｒが式： で示される配列を有する。） で示される、ヒトプロテインＣ活性を有するポリペプチ
    ドをコードしている二本鎖デオキシリボ核酸からなる構
    築されたDNA化合物を含有しているプラスミド で形質
    転換された大腸菌細胞。
  8. 【請求項８】プラスミドがpCZ460である第７項記載の細
    胞。
  9. 【請求項９】大腸菌K12である第７項記載の細胞。
  10. 【請求項１０】大腸菌K12RV308、MM294、RR1またはRR1
    ΔM15である第９項記載の細胞。
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PT (1) PT81959B (ja)
SG (1) SG50631A1 (ja)
ZA (1) ZA86780B (ja)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
US5981216A (en) * 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
ATE74164T1 (de) * 1985-04-22 1992-04-15 Genetics Inst Herstellung mit hoher leistung des aktivfaktors ix.
US4968626A (en) * 1985-08-15 1990-11-06 Board Of Reagents Of The University Of Washington DNA sequence coding for protein C
US4959318A (en) * 1985-06-27 1990-09-25 Zymogenetics, Inc. Expression of protein C
US5516650A (en) * 1985-06-27 1996-05-14 Zymogenetics, Inc. Production of activated protein C
ATE93272T1 (de) * 1985-06-27 1993-09-15 Zymogenetics Inc Expression von protein c.
USRE38981E1 (en) * 1985-08-15 2006-02-14 Board Of Regents Of The University Of Washington DNA sequence coding for protein C
US5618715A (en) * 1985-12-20 1997-04-08 Oncogen Limited Partnership Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
GB8607502D0 (en) * 1986-03-26 1986-04-30 Antibioticos Sa Penicillium chrysogenum
US5550036A (en) * 1986-04-09 1996-08-27 Eli Lilly And Company Method for co-amplification of human protein C genes in human cells
IL98886A (en) * 1986-04-09 1992-12-01 Lilly Co Eli Method for producing a functional polypeptide in a eukaryotic cell
JPS63105675A (ja) * 1986-10-23 1988-05-10 Green Cross Corp:The ヒトウロキナ−ゼの製造方法
AU1187588A (en) * 1987-01-15 1988-08-10 Codon Genetic Engineering Laboratories Tandem gene eukaryotic expression vectors
WO1989012685A1 (en) * 1987-05-18 1989-12-28 Integrated Genetics, Inc. Improved protein c molecules and method for making and activating same
DK260987D0 (da) * 1987-05-22 1987-05-22 Nordisk Gentofte Fremgangsmaade til fremstilling af et humant protein samt dna-sekvens til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden
JPS6445398A (en) * 1987-08-13 1989-02-17 Kowa Co Antithrombin-binding substance monoclonal antibody, hybridoma producing said antibody and method for purifying and measuring thrombin-binding substance utilizing said monoclonal antibody
US5084274A (en) * 1987-11-17 1992-01-28 Scripps Clinic And Research Foundation Inhibition of arterial thrombotic occlusion or thromboembolism
IL87171A (en) * 1987-11-23 1995-08-31 Monsanto Co ANDC of human tissue factor inhibitor
US4992373A (en) * 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
US5196322A (en) * 1987-12-28 1993-03-23 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
ZA889497B (en) * 1987-12-28 1990-08-29 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c
US5009889A (en) * 1987-12-31 1991-04-23 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of dysfunctional vascular endothelium using activated protein C
JPH01285196A (ja) * 1988-05-11 1989-11-16 Chisso Corp 発光蛋白エクオリンの製造法
GB8819607D0 (en) * 1988-08-17 1988-09-21 Wellcome Found Novel combination
CA1332049C (en) * 1988-10-07 1994-09-20 Eli Lilly And Company Eukaryotic expression
US5047335A (en) * 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US5147638A (en) * 1988-12-30 1992-09-15 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system
US6423313B1 (en) * 1988-12-30 2002-07-23 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system
US5120537A (en) * 1989-06-14 1992-06-09 Oklahoma Medical Research Foundation Factor xa based anticoagulant compositions
SE464135B (sv) * 1989-07-14 1991-03-11 Kabivitrum Ab Foerfarande foer bestaemning av funktionell aktivitet av fritt protein s eller protein c i ett plasmaprov
EP0506821B1 (en) * 1989-12-29 1998-02-04 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein c
US5358932A (en) * 1989-12-29 1994-10-25 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein C
US5225537A (en) * 1989-12-29 1993-07-06 Zymogenetics, Inc. Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins
EP0521873B1 (en) * 1990-01-29 1999-06-02 Zymogenetics, Inc. Anticoagulant proteins
US5270178A (en) * 1990-02-23 1993-12-14 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
IL97312A (en) 1990-02-23 1999-01-26 Lilly Co Eli A method of generating a polypeptide in an eukaryotic vector AND recombinant surrogate cell containing an enhanced transcriptional control unit based on the primary late adenovirus coefficient
IL97311A0 (en) * 1990-02-23 1992-05-25 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c
US5571786A (en) * 1990-08-16 1996-11-05 Immuno Aktiengesellschaft Use of protein C or the activation peptide of protein C for preparing a pharmaceutical preparation
US5831141A (en) * 1991-01-11 1998-11-03 United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of a heterologous polypeptide in mammary tissue of transgenic non-human mammals using a long whey acidic protein promoter
US6262336B1 (en) 1991-01-11 2001-07-17 American Red Cross Expression of a heterologous protein C in mammary tissue of transgenic animals using a long whey acidic protein promoter
US5965789A (en) * 1991-01-11 1999-10-12 American Red Cross Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals
JPH06507307A (ja) * 1991-01-11 1994-08-25 アメリカン・レツド・クロス トランスジェニック動物の乳腺組織における活性ヒトプロテインｃの発現
US5833982A (en) * 1991-02-28 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5861374A (en) * 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
US5817788A (en) * 1991-02-28 1998-10-06 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5788965A (en) * 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5997864A (en) 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
AT397615B (de) * 1991-05-14 1994-05-25 Immuno Ag Arzneimittel enthaltend protein c
US6039944A (en) * 1992-02-28 2000-03-21 Zymogenetics, Inc. Modified Factor VII
MY110664A (en) * 1992-05-21 1999-01-30 Lilly Co Eli Protein c derivatives
DE4320294A1 (de) * 1993-06-18 1994-12-22 Immuno Ag Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen
DE69434332T2 (de) * 1993-11-12 2006-02-02 Gilead Sciences, Inc., Foster City Thrombin mutanten
US7060484B1 (en) 1993-11-12 2006-06-13 Gilead Sciences, Inc. Polypeptides and coagulation therapy
US5618714A (en) * 1993-12-15 1997-04-08 Eli Lilly And Company Methods for producing protein C
AU710504B2 (en) 1994-03-15 1999-09-23 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
WO1995030429A1 (en) * 1994-05-04 1995-11-16 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Novel ophthalmologic uses of protein c
AT403167B (de) * 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
US6017697A (en) 1994-11-14 2000-01-25 Eli Lilly And Company Excitatory amino acid receptor protein and related nucleic acid compounds
US6211142B1 (en) * 1995-03-10 2001-04-03 Genentech, Inc. Compositions comprising gas6 polypeptides and articles of manufacture comprising the same
PT931148E (pt) 1996-10-16 2006-06-30 Zymogenetics Inc Homologos do factor de crescimento fibroblastico
ES2265159T3 (es) * 1996-11-08 2007-02-01 Oklahoma Medical Research Foundation Uso de una proteina c modificada.
US20060127387A1 (en) * 1997-04-22 2006-06-15 Zikria Bashir A Compositions based on polysaccharides and protein C and methods of using the same for preventing and treating sepsis and other conditions
US6159468A (en) * 1997-04-28 2000-12-12 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
US6630137B1 (en) 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
KR20010013413A (ko) * 1997-06-05 2001-02-26 피터 지. 스트링거 혈전성 질환의 치료 방법
HUP0001237A3 (en) 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders
US6815533B1 (en) 1998-07-31 2004-11-09 Eli Lilly And Company Cryogranulation of activated protein C
WO2000023101A1 (en) 1998-10-22 2000-04-27 Eli Lilly And Company Methods for treating sepsis
CA2351067A1 (en) 1998-11-13 2000-05-25 Eli Lilly And Company Method of treating heparin-induced thrombocytopenia
CN1326356A (zh) 1998-11-20 2001-12-12 伊莱利利公司 治疗病毒性出血热的方法
AU1723200A (en) 1998-11-23 2000-06-13 Eli Lilly And Company Method of treating sickle cell disease and thalassemia
AU1751801A (en) * 1999-11-19 2001-05-30 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
US7204981B2 (en) * 2000-03-28 2007-04-17 Eli Lilly And Company Methods of treating diseases with activated protein C
WO2001089558A2 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Eli Lilly And Company Formulations and use of activated protein c and protein c zymogen for treating hypercoagulable states
US6933367B2 (en) 2000-10-18 2005-08-23 Maxygen Aps Protein C or activated protein C-like molecules
AU2002210388B2 (en) * 2000-10-18 2006-11-23 Perseid Therapeutics Llc Protein C or activated protein C like molecules
WO2002085117A1 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Eisai Co., Ltd. Methods and compositions for preventing and treating septic shock and endotoxemia
WO2003007686A2 (en) * 2001-07-19 2003-01-30 Dmi Biosciences, Inc. Use of copper chelators to inhibit the inactivation of protein c
US20030073636A1 (en) * 2001-09-19 2003-04-17 Oklahoma Medical Research Foundation Method of treating diabetes
EP1453529A4 (en) 2001-09-19 2007-09-26 Oklahoma Med Res Found TREATMENT OF SEPSIS WITH TAFI
US7308303B2 (en) * 2001-11-01 2007-12-11 Advanced Bionics Corporation Thrombolysis and chronic anticoagulation therapy
AU2003213146A1 (en) * 2002-03-08 2003-09-22 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
WO2004056309A2 (en) 2002-12-05 2004-07-08 Socratech L.L.C. Neuroprotective activity of activated protein c is independent of its anticoagulant activity
US20060094650A1 (en) * 2002-12-27 2006-05-04 Juridical Foundation The Chemo-Sero- Therapeutic Research Institute Agent for improving life expectancy in therapy of malignant tumor
US20070142272A1 (en) * 2003-01-24 2007-06-21 Zlokovic Berislav V Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity
US9192657B2 (en) 2003-07-08 2015-11-24 The Scripps Research Institute Activated protein C variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity
JP4986618B2 (ja) * 2003-07-08 2012-07-25 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 通常の細胞保護活性を有するが抗凝固活性が低下した活性化プロテインｃ変異体
WO2005078074A2 (en) 2004-02-13 2005-08-25 Novozymes A/S Protease variants
WO2006014839A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-09 The University Of Rochester Activated protein c inhibits undesirable effects of plasminogen activator in the brain
US20090148458A1 (en) * 2005-06-23 2009-06-11 The University Of British Columbia Coagulation factor iii polymorphisms associated with prediction of subject outcome and response to therapy
KR20080071116A (ko) * 2005-06-24 2008-08-01 드럭리큐어 에이피에스 기도에 영향을 미치는 염증 질환에 있어서 활성화 단백질ｃ의 기도 투여법
WO2007140625A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 The University Of British Columbia Interferon gamma polymorphisms as indicators of subject outcome in critically ill subjects
WO2008048646A1 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 Socratech L.L.C. Use of human protein c with altered glycosylation and sialic acid content as a medicament
WO2008073603A2 (en) * 2006-10-31 2008-06-19 The Scripps Research Institute Dosing regimen of activated protein c and variants having reduced anticoagulant activity
WO2009089620A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 The Universityof British Columbia Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound
RU2469093C2 (ru) * 2008-12-19 2012-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА
WO2012068519A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Sirius Genomics Inc. Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof
US20150150954A1 (en) 2012-07-04 2015-06-04 The University Of Sydney Treatment of inflammatory skin disorders
WO2015157791A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 The University Of Sydney Treatment of abnormal cutaneous scarring
WO2023119230A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 L'oreal Coagulation pathway and nicotinamide-adenine dinucleotide pathway modulating compositions and methods of their use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4438032A (en) * 1981-01-30 1984-03-20 The Regents Of The University Of California Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom
US4382028A (en) * 1982-07-19 1983-05-03 Monsanto Company Separation of plasma proteins from cell culture systems
AU572125B2 (en) * 1983-03-17 1988-05-05 Mabco Limited Monoclonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin and their diagnotic uses
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
ATE74164T1 (de) * 1985-04-22 1992-04-15 Genetics Inst Herstellung mit hoher leistung des aktivfaktors ix.
AU603768B2 (en) * 1985-07-04 1990-11-29 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４〔８１〕Ｐ．４７６６−４７７０

Also Published As

Publication number Publication date
DE3687584T3 (de) 2001-05-03
JP2854282B2 (ja) 1999-02-03
KR860006546A (ko) 1986-09-13
EP0191606A2 (en) 1986-08-20
US4775624A (en) 1988-10-04
PT81959B (pt) 1988-07-01
JPH0759190B2 (ja) 1995-06-28
JP2854283B2 (ja) 1999-02-03
PT81959A (en) 1986-03-01
CA1341073C (en) 2000-08-08
DK55086A (da) 1986-08-09
DK55486D0 (da) 1986-02-05
NZ215031A (en) 1988-02-29
CN86100868A (zh) 1986-09-24
GR860334B (en) 1986-06-05
IE59423B1 (en) 1994-02-23
ES551761A0 (es) 1987-03-16
ES557100A0 (es) 1987-08-16
JPH10327876A (ja) 1998-12-15
US5151268A (en) 1992-09-29
JPH06189782A (ja) 1994-07-12
IE860328L (en) 1986-08-08
JPH09273A (ja) 1997-01-07
DK55086D0 (da) 1986-02-05
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