JPH09504174A - プロテアーゼネキシン１変異体を含むキメラ蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書において変異体として示されるキメラ蛋白、およびこのような蛋白質を製造して、処方し、利用する方法が開示される。変異体の異なった５つの一般型が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼネキシン１異変体を含むキメラ蛋白 発明の分野 本発明は、一般的に蛋白質、蛋白質の類似体、および、蛋白質の生物学的活性 を変化させるために特異的に蛋白質を改変する方法に関する。より詳しくいえば 、本発明は蛋白質、例えばタンパク質分解酵素であるネキシン１の活性部位を同 定し、類似体を製造するためにアミノ酸を一個以上変えて活性部位を変化させ、 また、キメラ蛋白を製造するために、蛋白質の活性部位を全く別の蛋白質の活性 部位に置換することに関する。本発明はまた、システイン残基、あるいは失活さ せることなしにシステインで置換できるアミノ酸残基を同定し、システインのチ オ基にポリエチレングリコールを結合させて蛋白質の安定性を増加させることに 関する。発明の背景 蛋白質が体内で特異的な機能をもつことは、かなり前から知られている。例え ば、組織の再造形、炎症、凝血、フィブリン溶解などの通常の生理的機能には蛋 白質分解酵素が必要である。特に重要なのは、セリンプロテアーゼと呼ばれる構 造的な分類に属するプロテアーゼである。セリンプロテアーゼ・ファミリーに属 する機能蛋白のすべての活性部位は、セリン(名前はここから来た)、アスパラギ ン酸およびヒスチジンからなる特徴的な触媒三残基である。触媒部位のセリンの 水酸基は、加水分解されるべきペプチド結合のカルボニル基の炭素を求核攻撃し て、プロテアーゼをアシル化すると同時にペプチド結合を加水分解するのに関与 する。この反応後、速やかに脱アシル化が起こり、元のプロテアーゼが解離する 。 本発明の実施例を提供するために、本発明者らは、ヒト包皮細胞で調整された 無血清培地から精製したセリン蛋白質であるプロテアーゼネキシン１(PN-1)に注 目した(Scott,R.W.et al.,J Biol Chem（1983）58:1043910444)。これは42kd(キ ロダルトン)の糖蛋白質で、線維芽細胞や筋管、心筋細胞、脈管平滑筋細胞から 放 出される。この放出は、プラスノミノーゲン活性化因子の放出とともに起き、ホ ルボールエステルやマイトジェンによって刺激を受ける(Eaton,D.L.et al.,J Ce ll Biol(1983)123:128)。ネイティブなPN-1は約400アミノ酸からなる蛋白質で、 およそ10％の糖質を含む。血清中にごく僅かしか存在しないため、間質細胞の表 面上かその近くで機能しているようである。PN-1は、ウロキナーゼ酵素前駆体、 プラスミン、トリプシン、トロンビンおよびファクターXaで知られているすべて の活性化因子を阻害する(Eaton,D.L.et al.,J Biol Chem(1984)259:6241)。PN-1 ははまた、組織プラスミノーゲン活性化因子とウロキナーゼを阻害する。しかし 、PN-1はエラスターゼやカテプシンGを阻害しない。 本発明者らは、以前の出願（現在の米国特許第5、87、089号）において、PN-1の 反応部位領域が基質類似体となることに注目し、PN-1の反応部位の配列を変えれ ばPN-1の活性を大きく変えることができ、よってプロテアーゼの特異性も変えら れるのではないかと考えた。例えば、α-1-抗トリプシンについて同様の仕事が なされ、その結果、改変されて治療に利用できる可能性をもつ変異体を得た(M.C ourthey et al.,Nature(1985)313:149-151)。PN-1は、組織中に見られるという 点で、大部分のセルピンと異なっており、また、組織に局在するための、高い親 和性を有するヘパリン結合部位を持ち、プロテアーゼPN-1複合体のエンドサイト ーシスを担う組織クリアランスレセプターを持つ。本発明者らは、エラスターゼ などの生理的プロテアーゼの阻害因子となるPN-1変異体を製造することを可能と し、これによって薬学的に有用な活性を有する合成物を提供することを可能とし た。 本発明者らは、エラスターゼやカテプシンGを不活化する変異体を含むいくつ かの変異体をさらに発明し、また、様々なセリンプロテアーゼに関してプロテア ーゼ特異性および２次的会合速度定数を有意に改変した変異体を提供し、また、 このような変異体を設計し生産する方法を提供するために、本発明者らの以前の 研究を改善した。さらに、本発明者らは、元の分子に存在していたか、部位特異 的突然変異誘発によって蛋白質の表面に導入された１個以上のシステイン残基に ポリエチレングリコールを特異的に結合させる変異体とそのような変異体を産生 する方法、およびシステイン残基を導入するのに適した部位を決定する方法を提 供する。さらに本発明者らは、PN-1またはその変異体のプロテアーゼ阻害活性を 有 するレセプター結合蛋白質の特異的局在能とを組み合わせて、特定の基質につい て目的とする生物的活性が得られるようにした変異体と、そのような変異体を産 生する方法を提供する。発明の要約 本明細書では変異体とも呼ばれるキメラタンパク、および、その産生方法、調 製方法、利用方法が開示される。５種の変異体の一般型が開示される。本発明に かかるI型変異体は、PN-1の活性部位内の一アミノ酸を元のアミノ酸とは異なっ たアミノ酸で置換する、部位特異的突然変異誘発によって製造される。本発明に かかるII型変異体は、PN-1の活性部位が変更される点ではI型変異体と類似して いる。しかし、II型変異体を製造するには、PN-1の活性部位を他のセルピンの活 性部位に合致するように改変するが、この改変には一個以上のアミノ酸を置換し たり、欠失したり、付加したりする必要がある。本発明にかかるIII型変異体は 、PN-1の活性部位や一部を、特定のプロテアーゼに対する基質の配列に一致する 配列で置換することによって製造される。IV型変異体は、ネイティブな蛋白質に 存在するか部位特異的突然変異によって導入されたシステイン残基をポリエチレ ングリコールとの結合に用いるために製造される。本発明にかかるV型変異体は 、PN-1を異なったレセプターに局在させるために、他の蛋白質のレセプター結合 領域とPN-1を融合させた融合蛋白質を製造することを含む。I型、II型、あるい はIII型変異体を本明細書では変異体と呼ぶことにする。ポリエチレングリコー ルがチオ基に結合するIV型合成物をシステイン-PEG化蛋白と呼び、V型変異体は 融合蛋白あるいはキメラ蛋白と呼ぶ。 本発明においては、I型、II型、III型、IV型、V型のすべてまたはいずれかの 変異体を一個以上含む薬剤組成物を提供する。 本発明の重要な目的は、特にPN-1変異体において、特殊でかつ必要とされる生 物活性を有する異なった変異体を広い範囲で提供することである。 別の目的は、PN-1の活性部位中の一アミノ酸を変えるために部位特異的突然変 異誘発を用いてPN-1変異体を提供することである。 他の重要な目的は、PN-1の活性部位を、他の酵素の阻害因子、好ましくは他の セルピンの活性部位に合致するように特異的に変更して、PN-1変異体を提供する ことである。 さらに、本発明の重要な目的は、PN-1に他のプロテアーゼの基質配列を入れて 、そのプロテアーゼの活性を阻害できるようにした、プロテアーゼネキシン１の 変異体のような変異体を提供することである。 さらに、別の重要な目的は、チオ基に結合してPEG化する、すなわちポリエチ レングリコールが蛋白質中の、ジスルフィド結合に関係しないシテインアミノ酸 に結合する蛋白質を提供することである。 別の重要な目的は、まず、該蛋白質あるいは構造的に関連する蛋白質が通常グ リコシル化されている部位にシステイン残基を付加するために部位特異的突然変 異誘発を行い、次いで、ポリエチレングリコールをシステイン残基に結合させて 蛋白質にポリエチレングリコールを結合させる方法を提供することである。 別の重要な目的は、まず、蛋白質に該蛋白質の表面のある部位にシステイン残 基を付加するために部位特異的突然変異誘発を行い、次いで、PEGをシステイン 残基に結合させて蛋白質にPEGを結合させる方法を提供することである。 別の重要な目的は、蛋白質と反応する部分を２箇所もつPEGを含む試薬との反 応によってクロスリンクした２量体ないし多量体蛋白質を提供することである。 さらに、別の重要な目的は、PN-1を異なったレセプターに局在させるために、 他の蛋白質のレセプター結合領域をPN-1に連結させた融合蛋白質を提供すること である。 本発明の他の目的は、本発明にかかる合成物を散在させている賦形担体素材を 含む薬剤組成物を提供することである。 本発明の別の目的は、本発明にかかる賦形剤と合成物を含む組成物の薬学的有 効量をそれを必要とする患者に投与することを含む処置に関する治療方法を提供 することである。 本発明の特徴は、新しい結合部位を連結した蛋白質の本来の生物学的活性を維 持しつつ、特異的なレセプター結合部位をもつように変異体を設計できるところ にある。 本発明の利点は、本来の蛋白質に較べて、変異体が一定の蛋白質分解酵素に対 して実質的に異なった阻害的な効果をもつことである。 本発明の別の目的は、特異的な生物活性に関連した疾病の治療に役立つ変異体 を提供することである。 本発明のさらに別の利点は、エラスターゼ関連症の治療に役立つ変異体を記述 し、開示していることにある。 本発明の別の特徴は、本来の蛋白質に較べると、変異体がプロテアーゼ特異性 を実質的に変えている点である。 本発明の他の利点は、特定のセリンプロテアーゼに関し、本来の蛋白質がもつ ２次的会合速度定数に較べて、ある変異体が実質的に高い２次的会合速度定数を もつことである。 本発明の他の利点は、特定のセリンプロテアーゼに関し、本来の蛋白質がもつ ２次的会合速度定数に較べて、ある変異体が実質的に遅い２次的会合速度定数を もつことである。 さらに、別の目的は、注射用処方剤やスプレー用処方剤、エアロゾルの形状に ある薬剤組成物を用いて行われる、注射や鼻孔内または肺内輸送などの運搬方法 を提供することである。 別の利点は、蛋白質のシステイン残基にポリエチレングリコールを結合させる ことで、生物学的に安定した蛋白質を製造できることである。 別の利点は、好ましくは、元々グリコシル化される位置にある、蛋白質のシス テイン残基でポリエチレングリコール分子を蛋白質に容易に結合させるための方 法論を提供することである。 さらに、別の利点は、システインで置換されるアミノ酸残基を選択するのに、 続いて起こる置換されたシステイン残基のチオ基へのポリエチレングリコールの 結合により、システイン-PEG化蛋白質が生物学的活性を失うことなしに、野生型 の蛋白質よりも生物学的な安定性を増大させるように選択できることにある。 別の利点は、通常、生物学的安定性のためにグリコシル化が必要とされる蛋白 質を、原核生物宿主中、あるいは、グリコシル化される組み換え蛋白質のための 体制をもたない他の宿主中で発現させて商業的に生産できることにある。原核生 物宿主中で蛋白質を発現させた後、蛋白質の本来のシステイン残基または製造さ れたシステイン残基にポリエチレングリコールを結合させて生物学的な安定性を 強化することができる。 別の利点として、システイン-PEG化蛋白質は、従来のようにポリエチレングリ コールを蛋白質に結合させるために、蛋白質をジオキサンや塩化シアヌル、DMF その他の化学薬品のような毒性の高い化学剤にさらすことなく、産生できること にある。 本発明のこれらの及びその他の目的、利点および特徴は、以下により詳細に記 載されるところの構造、合成、処方および利用法、さらには、本明細書の一部を なす添付の図面を参照すれば、当業者にとって明らかになるであろう。図面の簡単な説明 図１は、PN-1αのコーディング領域の塩基配列とそれから導き出されたアミノ 酸配列を示し、 図２は、PN-1βのコーディング領域の塩基配列とそれから導き出されたアミノ 酸配列を示す。 図３は、X線結晶学により決定されたPN-1の３次元構造の概略図である。特に 関心があるアミノ酸残基のおおよその位置が、当該ヘリックス(h)あるいはβ-シ ート(s)の中の相対的位置に従って示されている。PN-1蛋白のヘリックスとβ-シ ートにはそれぞれ文字が付けられている(例えば、A,B,など)(Engh，etal.,1990 Protein Engin．3(6):469-477)。 図４は、本発明にかかる方法で製造されたシステイン-PEG化PN-1変異体（N99C ;N140C）を含む反応液サンプルの活性（白い四角）と従来の方法によって製造さ れたPEG化PN-1変異体（N99C;N140C）を含む反応液サンプルの活性（黒いひし型 ）を示したグラフである。好ましい態様の詳細な説明 本発明の合成物、変異体、処方およびそれらを作製、使用するための方法を説 明する前に、本発明が、説明される特定の合成物、変異体、処方および方法に限 定されるものではないことを理解されたい。当然ながら、このような変異体、処 方あるいは方法は様々である。本明細書で用いられる用語は、特定の態様のみを 説明するためのものであり、限定するためのものではない。本発明の範囲は、添 付の請求の範囲のみによって限定されるものとする。 本明細書と添付の請求の範囲において、単数形が用いられるときは、文中で別 途、明確に示されない限り、その指示物は複数の場合を含むことに注意されたい 。従って、例えば、「プロテアーゼネキシン１変異体」というときは、そのよう な変異体の混合物を含み、「類似体」というときには、そのような類似体の混合 物を含み、また、「治療方法」というときは、当業者に知られているはずの、あ るいは、この明細書を読めば分かるはずの治療のタイプに関する一つ以上の方法 を指すことを含んでいるなどである。 Ａ．定義 本明細書で用いられている「プロテアーゼネキシン１」と「PN-1」は互換的に用い られ、それぞれ図１と２に示されたPN-1αとPN-1βを構成するDNAのコドンとそ れからできるアミノ酸配列を表す。PN-1は、他の２つのネキシンプロテアーゼ因 子PN-IIおよびPN-IIIと区別されうる(Knauer,D.J．et al.,J Biol Chem（1982） 257:15098-15104)。これらもトロンビンの阻害因子であるが、このプロテアーゼ への結合は強くなく、異なった分子量と３次元構造および機能構造をもつ。 「変異体」、「蛋白質変異体」および「キメラ蛋白」という用語を、本明細書では互 換的に用いており、元の蛋白質の、あるいは、構造に多少の変化を加えられては いても元の蛋白質の生物学的に活性のある部分のアミノ酸配列に相当するアミノ 酸配列を表す。本発明による定型的な変異には、(1)本来のアミノ酸配列の中の 一個以上のアミノ酸を、元の蛋白質に存在するアミノ酸とは異なる一個以上のア ミノ酸で置換すること、および／または(2)本来の配列に一個以上のアミノ酸を 付加し、アミノ酸のそのような付加が変異体の生物学的活性を変えるもの、およ び／または(3)本来の配列から一個以上のアミノ酸を欠失させること、および／ または(4)ポリエチレングリコールを配列中の、本来の、あるいは、人為的に導 入したシステイン残基のチオ基に結合させること、および／または(5)元来ある ２つの配列を融合する、すなわち普通には結合しない２つの配列を融合すること が含まれる。 「プロテアーゼネキシン１変異体」と「プロテアーゼネキシン１の類似体」は、本 明細書で、I型変異体を定義するために同義的に用いられる語であり、従って、「 変異体」という用語に包含される。これらの用語は、一般的には、プロテアーゼ ネキシン１中の一個以上のアミノ酸を異なったアミノ酸で置換した蛋白質を表そ うとしたものである。より限定的には、本発明にかかるプロテアーゼネキシン１ 変異体は、活性部位あるいはその近傍で異なったアミノ酸に置換されている以外 は、プロテアーゼネキシン１と実質的に同じアミノ酸配列を含む。特に、異なっ たアミノ酸による置換は、P₁、P₂、P₃、P₄の部位のいずれか、および／またはP₁ '、P₂'あるいはP₃'、P₄'部位のいずれかで行われうる。プロテアーゼネキシン１ 配列中のアミノ酸のその他の置換や欠失も本発明に包含されるが、特定のプロテ アーゼに関する変異体の特異性および／または反応性を変更するという点では、 活性部位あるいはその近傍での置換が最も重要である。本発明にかかる特に好ま しいプロテアーゼネキシン１変異体は、本来のPN-1がほとんどあるいは全く活性 を示さない基質に関して強い活性を示す変異体で、このような変異体は、エラス ターゼを阻害し、特に、エラスターゼを阻害するとともにヘパリンおよび／また はヘパリン様化合物の存在下で活性が増大するエラスターゼを阻害することがで きるものをいう。他の好ましいプロテアーゼネキシン１変異体は、例えば、ウロ キナーゼおよび／または他のセリンプロテアーゼを阻害する効果を、プロテアー ゼネキシン１に較べて増大させている。 「コントロール配列」とは、目的のコーディング配列が適切に接続されれば、コ ントロール配列に適合性をもつ宿主中で発現させることができるDNA配列のこと をいう。このようなコントロール配列は、少なくとも原核生物宿主および真核生 物宿主のプロモーター配列を持ち、好ましくは転写終結シグナルを持つ。発現を 行わせるのに必要なあるいは有用な付加的因子も認められるであろう。「コント ロール配列」は、本明細書で用いられるときには、単に、特定の宿主を用いて発 現させるのに必要なあらゆるDNA配列を示す。 「細胞」、「細胞培養」、「組み換え宿主細胞」あるいは「宿主細胞」は、文脈から明 らかになるように、しばしば互換的に用いられる。これらの用語には、直接実験 対象となった細胞と当然ながらその後代が含まれる。偶発的な突然変異や環境の 違いのせいで、すべての後代が、必ずしも親細胞と全く同じではないことは知ら れている。しかしながら、そのように変異した後代も、その後代が最初に形質転 換された細胞に関連した特質を保持する限り、これらの用語に含めるものとする 。本件では、例えば、このような特質とは組み換えPN-1の産生能であろう。 「精製された」あるいは「精製した」という用語は、通常そのままの状態では混在 している物質を除いた材料を示す。したがって、「精製した」PN-1コーディングDN Aとは、もとの環境から単離された状態にあり、元来PN-1を産生している細胞が 通常産生するその他の蛋白質をコードするDNAの混入がないものをいう。「精製し た」PN-1とは、ヒトその他の哺乳動物の組織中の元の環境で通常共存する物質を 含んでいないPN-1をいう。勿論、「精製した」PN-1は、グリコシド残基のようなPN -1と共有的に結合する物質や、例えば、治療薬としての処方剤ために導入された 物質を含むかもしれない。「精製した」という語はまた、他の化合物を結合させる ため、および／または治療的処置あるいは診断的処置において用いられる処方剤 を提供するために、ポリエチレングリコールやビオチンなどの化合物やその他の 物質の一部が変異体に結合したものを含む。「精製した」というのは、単に、当該 の基質を本来の環境と、通常それが共存する物質から分離した状態をいう。勿論 、本明細書で請求されているDNAは、精製された、通常それと混在する物質を含 まないものであるが、PN-1をコードするDNAは、例えば、DNAがcDNAライブラリー から採られたときは、メッセンジャーの非コード領域を逆転写する結果できる、 コーディング配列の5'端および／または3'端の付加的な配列を含んだり、あるい は、成熟蛋白質をコードする配列だけでなくシグナル配列の逆転写産物を含むか もしれない。 DNA配列に関していうとき、「縮重した」とは、参照されたアミノ酸配列と同じ 配列をコードする塩基配列をいう。 「操作して結合した」というのは、構成成分の本来の生化学的機能など、必要と する機能を果たせるように構成して配置することをいう。したがって、コーディ ング配列に操作して結合したコントロール配列やプロモーターは、コーディング 配列の発現を可能にする。 「ヘパリン」、「ヘパラン硫酸」および「ヘパリン様化合物」は、本明細書では同義 的に用いられている用語である。これらの用語をそれぞれ単独で、あるいは他と 組み合わせて、一般的に硫酸多糖といわれる化合物の一大グループに包含させよ うとしている。硫酸多糖には、プロテオグリカン、およびヘキソサミンとアルド ウロン酸が交互につながった共重合体であるグリコサミノグリカン(GAG)が含ま れる。これらの共重合体は、硫酸化された状態で見られ、プロテオグリカンとし て合成され、まとめてムコ多糖と呼ばれる。デキストラン硫酸などの他の化合物 は、本発明の目的からすると、「ヘパリン様」と考えられる。同じように、交互に つながった共重合体で、特に、強度に硫酸化されているために強く負に荷電して いるものは、本発明においては有用な「ヘパリン様」化合物である。グリコサミノ グリカンなどの「ヘパリン」および「ヘパリン様化合物」に関するより広範囲な情報 は、糖質の化学と生化学の進歩43巻51-134ページに発表された「ヘパリンの構造 と生物学的活性」の中でベニト・ケイス(Benito Casu)に詳細に述べられており、 この文献は、本明細書で開示されたPN-1変異体と組み合わせることで有効な化合 物を開示するために、本明細書に参照文献として包含される。 本発明の説明を分かり易くするために、アミノ酸の一文字記号と三文字略記の 関係を以下の一覧表に示す。 一文字記号 三文字記号 A アラニン ala C システイン cys D アスパラギン酸 asp E グルタミン酸 gln F フェニルアラニン phe G グリシン gly H ヒスチジン his I イソロイシン ile K リジン lys L ロイシン leu M メチオニン met N アスパラギン asn P プロリン pro Q グルタミン gln R アルギニン arg S セリン ser T スレオニン thr V バリン val W トリプトファン trp Y チロシン tyr アミノ酸は、以下のような一般構造式を有する。 そして、「R」基の化学的組成に基づいて以下のように分類する。 1.脂肪族 2.水酸基 3.硫黄基 4.芳香族 5.酸性（およびアミド） 6.塩基性 7.イミノ基 自然界に存在するアミノ酸は、一般的に、極性か非極性かで、以下のように分 類される。 極性 S、T、C、Y、D、N、E、Q、R、H、K 非極性 G、A、V、L、I、M、F、W、P アミノ酸が極性か非極性かを決めるのは「Ｒ」基である。 アミノ酸残基は、一般的に、以下のように４つの大きな分類群に下位分類され る。 酸性基：この残基は、生理的pH下で水素イオンを失うために陰性に荷電してお り、水溶液に引きつけられるため、この残基を含むペプチドが生理的pHの水溶媒 中でとる立体構造の表面に位置しようとする。 塩基性基：この残基は、生理的pH下で水素イオンと結合するために陽性に荷電 しており、水溶液に引きつけられて、この残基を含むペプチドが生理的pHの水溶 媒中でとる立体構造表面に位置しようとする。 中性/非極性基：この残基は、生理的pH下では荷電しておらず、水溶液に忌避 されるため、この残基を含むペプチドが水溶媒中あるとき、このペプチドがとる 立体構造の内部に位置しようとする。これらの残基は、ここでは「疎水性」とも呼 ばれる。 中性/極性基：この残基は、生理的pH下では荷電していないが、水溶液に引き つけられるため、この残基を含むペプチドが水溶媒中あるとき、このペプチドが とる立体構造の外部に位置しようとする。 それぞれの残基の分子を統計的に集めると、荷電するものもしないものもあり 、水溶媒に引きつけられたり、反発したりするのにも大小の程度があることは、 当然のことである。「荷電した」という定義に適合するのは、各分子のかなりの割 合（少なくとも25％程度）のものが、生理的pH下で荷電しているときである。極 性基と非極性基に分類するために必要とされる誘引あるいは忌避の程度は、恣意 的なものなので、本発明で特に考慮されたアミノ酸については、はっきりとどち らかに分類した。特に分けられていない大部分のアミノ酸は、既知の作用に基づ いて分類できる。 アミノ酸残基は、環状か非環状か、芳香族か非芳香族か、残基の側鎖置換基に 関する自明な分類によって、あるいは大きいか小さいかによって、さらに下位分 類できる。残基に、カルボキシル基の炭素を入れて全部で４個以下の炭素原子し か含まれていなかったら、その残基は小さいとみなされる。当然ながら、小さな 残基は必ず非芳香族である。 自然界に存在する蛋白質のアミノ酸の、前述のスキームにしたがった下位分類 は以下の通りである： 酸性：アスパラギン酸とグルタミン酸 塩基性/非環状：アルギニン、リシン 塩基性/環状：ヒスチジン 中性/極性/小型：スレオニン、セリン、システイン 中性/極性/大型/非芳香族：スレオニン、アスパラギン、グルタミン 中性/極性/大型/芳香族：チロシン 中性/非極性/小型：アラニン 中性/非極性/大型/非芳香族：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン 中性/非極性/大型/芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン プロリン 遺伝子がコードするアミノ酸のプロリンは、技術的には中性/非極性/大型/環 状で非芳香族のグループに入るが、ペプチド鎖の２次構造に影響を与えることが 知られているために特別なので、この定義のグループには入れず、独自のグルー プに入れられる。 遺伝子にコードされたアミノ酸に対する他のアミノ酸置換もまた、本発明の範 囲のペプチド合成物に含まれ、この一般的な分類表の中に分類される。 本発明の変異体は、遺伝子コードにはコードされていないが、普通に見られる アミノ酸を含み得る。例えば、β-アラニン(β-ala)、あるいは、3-アミノプロ ピオン酸、4-アミノ酪酸などの他のオメガ-アミノ酸、α-アミノイソ酪酸(Aib) 、サルコシン(Sar)、オルニチン(Orn)、シトルリン(Cit)、t-ブチルアラニン(t- BuA)、t-ブチルグリシン(t-BuG)、N-メチルイソロイシン(N-MeIle)、フェニルグ リシン(Phg)、およびシクロヘキシルアラニン(Cha)、ノルロイシン(Nle)、シス テイン酸(Cya)、およびメチオニンスルホキシド(MSO)。これらはまた便宜上、特 定のカテゴリーに分けられる。 上記の定義に基づくと、 Sarとβ-alaは、中性/非極性/小型； t-BuA、t-BuＧ、N-MeIle、NleおよびChaは、中性/非極性/大型/非芳香族； Ornは塩基性/非環状； Cyaは酸性； Cit、アセチルLysおよびMSOは、中性/極性/大型/非芳香族； そして、Phgは中性/非極性/大型/芳香族である。 遺伝子コードであるいは他の方法でコードされたアミノ酸のＬ型およびＤ型異 性体ともに、できた蛋白質が必要な活性をもっていれば、本発明において有用な アミノ酸として包含される。 様々なオメガ-アミノ酸は、大きさによって中性/非極性/小型(β-ala、すなわ ち3-アミノプロピオン酸、4-アミノ酪酸)、あるいは大型（他のすべて）に分類 される。 本発明の合成物を示すために用いられた表示法は、ペプチド中の各アミノ酸の アミノ基は左側に、カルボキシル基は右側に書くものとしている従来の慣習に従 った。本発明の選ばれた特別の態様を表す化学式において、アミノ末端とカルボ キシル末端は特に示さないことが多いが、特に言及しない限り、生理的pH値下で はそれらはその形態で存在するものとする。したがって、限定的な実施例におい ても、一般的な化学式においても、Ｎ末端のH⁺ ₂とＣ末端のO^-は必ずしも特には 示さないが、生理的pH値下では存在すると理解されるべきである。セリンプロテアーゼとそれらの阻害因子（セルピン） セリンプロテアーゼファミリーに属する酵素は、元来は作用機作に因んで名付 けられたものであるが、配列上や構造上でも相当に類似性が高い。セリンプロテ アーゼの中には、非常に特異性が高く、特定の標的蛋白質の一定のペプチド結合 しか切断しないものもあるが、特異性なしに多くの標的蛋白質を小さなペプチド に分解してしまうものもある。 セリンプロテアーゼは多くの段階で制御を受ける。あるものは不活性な酵素前 駆体として合成され、特定の場所で特異的な場合にのみ活性化される。このため 、身体は、すでに蓄えてある蛋白質分解活性因子を活性化して、生理的な変化に 速やかに対応できるのである。例えば、凝血活性のカスケードを開始させるよう な傷害に反応して、ファクターXやプロトロンビンなどの循環している酵素前駆 体が連続的に活性化されると凝血反応がおきる。さらに、蛋白質分解活性はレセ プター結合部位など、プロテアーゼや酵素前駆体の局所的濃度が活性化に備えて 高くなるような特異的な部位にしばしば局在する。 蛋白質分解活性は、活性化されても、空間的および時間的に制約を受けること が極めて重要である。このような制御は、蛋白質分解活性を阻止する特異的阻害 因子が存在することでしばしば可能になる。関連する蛋白質の主要なファミリー であるセリンプロテアーゼ阻害因子すなわち「セルピン」が、セリンプロテアーゼ の制御において鍵になる。セリンプロテアーゼ同様、セルピンも最初は共通の作 用機構によって定義されたが、配列に関しても、構造に関しても類似性が高いこ とが後になって分かった。 セルピンはすべて、両側を可変的なP₁およびP₁'によって区切られる反応ペプ チド結合をもつ阻害部位を含む。作用部位から左側の方向に離れるにつれて、ア ミノ酸はP₁、P₂、P₃などと呼ばれる。作用部位から右側の方向に離れるにつれて 、アミノ酸はP₁'、P₂ ^'、P₃ ^'などと呼ばれる。P₁残基は、反応ペプチド結合を通 常の基質と同じように攻撃する標的プロテアーゼの基質結合ポケットよって認識 される。しかし、ペプチド結合の加水分解とプロテアーゼの解離は完全には進ま ない。通常の脱アシル化過程が非常に緩慢なため、反応が実質的に不可逆的にな り、プロテアーゼは等モル濃度の複合体となって、安定な状態でトラップされる 。 プロテアーゼネキシン１（PN-1）はセルピンファミリーの一員である。PN-1は 、線維芽細胞、グリア細胞、血小板、マクロファージなど、様々なタイプの細胞 で産生される。PN-1は細胞から分泌されて、細胞外で標的のセリンプロテアーゼ に結合して、それを阻害する。そして、PN-1とプロテアーゼの複合体は細胞表面 にある特異的レセプターに再び結合し、そこから細胞内に取り込まれて分解され る。 PN-1は構造的にも、機能的にも抗トロンビン(AT-III)に非常によく似ている。 AT-IIIは、主に血漿の凝血阻止成分である。血漿中でのトロンビンのAT-IIIによ る阻害効果は、普段とても低いが、血管の内皮層にヘパリンあるいは他のムコ多 糖が存在するとかなり上昇する。ヘパリンが血液の「希釈剤」として、治療学上価 値があるのは、AT-IIIの活性を促進するためである。AT-III同様、PN-1にも高い 親和性をもつヘパリン結合部位があり、ヘパリン存在下では、ずっと急速に（50 -100倍）トロンビンを阻害する。従って、PN-1には抗凝血剤として治療学上の利 用可能性がある。 一方、PN-1は、多くの点でAT-IIIとは異なっている。AT-IIIとは違って、PN-1 はまた、トリプシンだけでなく、フィブリン溶解酵素ウロキナーゼとプラスミン の効果的な阻害因子である。さらに、PN-1は血漿中に有意な量を見出せず、主に 組織中で機能しているのかもしれない。PN-1の強い親和性をもつヘパリン結合部 位は、表面や周囲の細胞外基質に硫酸プロテオグリカンを含む細胞や結合組織に PN-1を局在させるのに役立っている。したがって、PN-1の主要な役割は、血液と は対照的に、組織中の蛋白質分解活性を制御することにあるらしい。PN-1の役割 をさらに明らかにする事実として、PN-1が脳組織に存在していることが分かった 。末梢神経の再生と神経突起の伸長に関わっているのかもしれない。 PN-1がセリンプロテアーゼを阻害する相対的効率は、以前ビース(Bieth,J.G.) (Bull．Euro．Physiopath．Resp．(1980)16:183-195)によって説明され、スコッ トら(Scott et al.)(J．Biol．Chem．(1985)260:7029-7034)によって報告された ２次会合速度定数（Ｋ_ass）によって測定することができる。これらの文献は、 ここにおいて会合速度定数の意味を開示し説明するために参照文献として包含さ れる。一般的には、特定のプロテアーゼと阻害因子の反応に関して、Ｋ_assの値 が１ｘ10⁵ M^-1S^-1以上であれば生理学的には重要だと考えられる(Travis and Sa lveson Ann．Rev，Biochem．(1983)52:655-709)。Ｋ_assすなわち会合速度定数は 、モル数と秒数の逆数を単位にしているので、Ｋ_assが大きくなるほど阻害は速 やかになる。したがって、Ｋ_ass値は常に特定の酵素に関する値として与えられ 、もし、酵素の阻害が起こらなかったら値は０になる。 エラスターゼ-α-1抗トリプシンやプラスミン-α-2-抗プラスミンなど、多く の生理学的に重要なプロテアーゼ阻害因子の反応は、１ｘ10⁷ M^-1S^-1以上の速度 定数で起こる。トロンビン-PN-1反応は、ヘパリン存在下では同じ速度で起こる 。PN-1の説明（αとβ） 図１と２にそれぞれ、PN-1αとPN-1βのアミノ酸配列を示す。α型とβ型は、 PN-1αのarg₃₁₀がPN-1βではthr₃₁₀-gly₃₁₁に置換されているところが異なる。P N-1の反応中心部位の配列を、抗トロンビンIIIなどの他のセルピンの配列と比較 してみると、アルギニン345（PN-1βでは346）が反応中心部位すなわち「P₁」部 位であると推測される。「P₁」部位（PN-1αでは345番目の、PN-1βでは346番目 のアルギニン）は、トロンビンとの複合体から離れるときにPN-1から解離するペ プチド断片の配列決定によって確認されている。さらに、PN-1は通常、トロンビ ン、プラスミン、トリプシン、プラスノミノーゲン活性化因子あるいは血漿カリ クラ インのようにアルギニンの位置（「P₁」残基）で切断する酵素だけを阻害する。 以上のことに基づいて、図１と２のそれぞれに示されたPN-1αとPN-1βの配列 を参照すると、「P₁」部位は、PN-1αでは346番目のセリン、PN-1βでは347番目の セリンだということがわかる。プロテアーゼ阻害因子の作用の説明 身体が速やかに反応できるよう、いくつかのセリンプロテアーゼが不活性な酵 素前駆体の形で、比較的高濃度に合成されていて、特定の出来事が起きたときに だけ活性化される。例えば、傷害に対する反応において、ファクターXやプロト ロンビンのような循環性の酵素前駆体が連続して活性化されると、凝固反応が起 きる。この活性化が凝血作用のカスケードを引き起こす。蛋白質分解活性は、し ばしばレセプター結合部位などの特定の部位に集中する。蛋白質分解酵素は一度 活性化されると、その酵素活性は、空間的にも時間的にも制約されることが非常 に重要である。このような制約は、部分的にはセルピンの阻害効果によってもた らされる。 セルピンはすべて、両側をP₁およびP₁ ^'残基によって区切られる反応ペプチド 結合をもつ阻害部位を含む。「P₁」残基（例えば、PN-1αでは345番目の、PN-1β では346番目のアルギニン）が、標的プロテアーゼの基質結合ポケットによって 認識される。（プロテアーゼによる阻害因子の）「反応」部位を認識すると、プロ テアーゼは、阻害因子の反応ペプチド結合が通常の基質であるかのように攻撃す る。しかし、セルピンの場合はペプチド結合の加水分解とプロテアーゼの解離は 完全には進まない。通常の脱アシル化過程が非常に緩慢なため、反応が実質的に 不可逆的になり、プロテアーゼは阻害因子と共有結合して、等モル濃度の複合体 となって、安定な状態でトラップされる。P₁残基は、標的プロテアーゼの基質結 合ポケットによって認識される優勢な決定基であるため、この残基を変更すると 、阻害因子のプロテアーゼ特異性を完全にかえるか、得ることのできる阻害効果 の程度が実質的に変化する。P₁残基近傍の残基（すなわちP₄-P₄'）もプロテアー ゼ特異性に影響する。したがって、これらの残基を変えることも、阻害効果を変 更する結果になる。変異体一般 多くの天然蛋白質のアミノ酸配列、活性部位および生化学的活性が知られており 、特に天然のセルピンも知られている。ある種のプロテアーゼに関して、高度の 活性をもつ蛋白質もあり、そのプロテアーゼには実質的に活性をもたない蛋白質 もある。本発明者らは、この知見に注目し、指向的な方法で、その活性部位を、 該プロテアーゼに関して全く異なる活性をもつ別の蛋白質の活性部位で置き換え て、特定の蛋白質のプロテアーゼ阻害活性を変えることができるだろうと考えた 。あるいは、最初の蛋白質に、２番目の蛋白質レセプター結合領域を連結させて 、本発明の変異体を製造できる。異なった蛋白質の生化学的機能と蛋白質結合特 異性は分かっているので、本発明の方法によって、一定の論理的演繹を行うこと が可能になり、蛋白質の活性（例えば、結合活性）が変わるだけでなく、特異的 で指向的な方法で変わるという比較的強い期待をもって、特異的な変異体を製造 するのが可能になる。 本発明にかかるキメラ（V型変異体）製造の実施例を以下に述べるようにして 実行した。第一の蛋白質には、該レセプターに関しては実質的に結合力がないこ とが分かっており、第二の蛋白質には、このレセプターに関して非常に強い結合 力があることが分かっている。（レセプターは、何らかの蛋白質あるいはその一 部、リガンド、細胞表面領域あるいは分子である。）第二の蛋白質の結合領域を 第一の蛋白質に繋げることによって、第一の蛋白質の生化学的機能をもち、それ 以前には第二の蛋白質だけしか結合できなかったレセプターに結合できる変異体 を提供することができる。結合特異性を利用し、２つの異なる蛋白質の生化学的 活性を利用するために、本発明の方法を利用した特殊な実施例を以下に述べる。 本発明の変異体が利用される特異的な状況を以下に述べる。単球と好中球が血 流から炎症組織に移行するのには、相互作用する部位での活性化が必要である。 この活性化には、接着分子の発現と移行装置の補充が含まれる。内皮を通って移 行するためには、基底膜と細胞外基質を含んだ細胞間連結部が分解されなければ ならない。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）-プラスミンのシ ステムが、細胞外におけるタンパク質分解の調節に重要な役割を演じていること が今や明らかになっている。すなわち、好中球が血管内皮層を通って、回りの組 織に移行して行くために、細胞内の結合を壊す上でuPA-プラスミンが重要である 。 好中球細胞が内皮を通って周囲の組織に移行することは必要であるが、あまりに 多くの好中球があまりに速く移動すると、組織に不必要な炎症を起こさせること になり、恐らく、炎症組織を通過する血液の流れを妨げることになる。変異体で 、(1)活性化された内皮細胞に結合し、(2)uPA-プラスミンを阻害するものは、特 定の部位で炎症を防止し、および／または、抑制したりするのに役立つ。 腫瘍細胞の侵襲性も、腫瘍細胞転移モデル系(Ossowski and Reich，1983; Hea ring，et al.,1988)、および、細胞外基質分解と基底膜侵襲(Gergman，et al.,1 986; Mignatti，et al.,1986; Reich，et al.，1988; Cajot，et al.,1990)で示 されたようにuPA-プラスミンシステムに依存している。ヒトの乳ガン組織では、 uPAの濃度が正常組織に較べて、かなり高くなっている。モデル系では、悪性細 胞の侵襲性の増加に比例して、uPARの量が増加する(Ossowski，1988; Hearing， et al.,1988)。uPAやプラスミンの蛋白質分解活性を妨げる因子が、細胞外基質 の分解や基底膜の侵襲を防ぎ、炎症を防止するのを助けているのであろう。同様 に、ウロキナーゼがウロキナーゼレセプター（uPAR）と相互作用するのを妨げる 因子が、転移を阻止しているのかもしれない。 本発明の変異体蛋白は、ウロキナーゼレセプターをブロックして、ウロキナー ゼを阻害するように設計することができる。特に、ウロキナーゼレセプターをブ ロックする能力とウロキナーゼおよびプラスミンを阻害する能力とを組み合わせ て、炎症を防止ないし軽減する効果をもつ変異体を産生することができる。この ような変異体は、どちらかの蛋白質だけを用いたときよりも、炎症を防止したり 軽減したりする上で効果的である。変異体のウロキナーゼレセプター結合能力を 利用すれば、変異体を細胞外基質分解が起きる、目的の特異的な部位に局在させ て、酵素を阻害し、分解の原因となる酵素の結合を妨げれば、それ以上の分解を 特異的に防止できる。こうすれば、炎症を軽減ないし防止する二重の効果が生じ る。 本発明のキメラ蛋白を製造するために、uPAとuPARが癌の侵襲と炎症において 果たす中心的な役割を調べた。この知見によって、本発明が、uPAのuPARへの結 合を妨げて、細胞の侵襲部位で発生するuPAとプラスミンの両者を阻害するキメ ラ蛋白を提供することが分かった。 uPAのレセプター結合領域は、アミノ末端断片（ATF）の135番目の残基に位置 している。この領域（すなわち、ATF）は、高い親和力をもってuPARに結合し（ Ｋ_dは0.1から１nM）、競合的にuPAのuPARへの結合を阻止する。 PN-1は、インビトロ（in vitro）で、腫瘍細胞に媒介される細胞外基質の分解 と腫瘍細胞の移動を妨げる。ここでPN-1は、uPA-プラスミンシステムを阻害した 。腫瘍転移と白血球の侵襲を、より効果的で特異的に阻害する因子を製造するた めに、本発明は、uPAとPN-1のアミノ末端断片（ATF-PN1）を含むキメラ蛋白を提 供する。ATF部位が存在するために、このキメラ蛋白は細胞侵襲部位に高い親和 性をもち、PN-1蛋白質をもつために、uPAとプラスミンを阻害する。I型変異体 本発明のこの局面は、反応部位を何らかの方法で改変するために、PN-1のアミ ノ酸配列を操作して、セリンプロテアーゼに対するPN-1のプロテアーゼ特異性あ るいは阻害効果の強さを変えることに関する。より特異的には、本発明は、プロ テアーゼネキシン１の作用部位に影響を与えるため、プロテアーゼネキシン１の 一個以上のアミノ酸を置換し、および／または、プロテアーゼネキシン１の配列 にアミノ酸を欠失あるいは付加することを含む。これは、セリンプロテアーゼに 対するプロテアーゼネキシン１のプロテアーゼ特異性、および/または、阻害効 の強さを変えるためである。一般的に、プロテアーゼ特異性あるいは阻害効果の 強さは、P₁、P₂、P₃、P₄あるいはP₁ ^'、P₂ ^'、P₃ ^'、P₄ ^'部位のアミノ酸を置換して 変更することができる。さらに特異的には、本発明は、「P₁」部位のアルギニン 残基と「P₁'」部位のセリンのいずれかあるいは両者を異なった残基で置換して、 プロテアーゼ特異性が全く異なったPN-1変異体、および/または、特定のセリン プロテアーゼに対する異なった阻害効果をもつPN-1変異体を製造すること含む。 本発明にかかるPN-1変異体は、それらの機能性についても説明することができ る。重要なのは、本発明のPN-1変異体には、エラスターゼを阻害できるものがあ る。これらの一般的なグループの中には、ヘパリンおよび/またはヘパリン様化 合物の存在下でエラスターゼ阻害能力が非常に亢進するPN-1変異体も含まれる。 本発明にかかる別のPN-1変異体グループには、PN-1に較べてセリンプロテアーゼ を阻害する能力が高いPN-1変異体が含まれる。本発明のPN-1変異体は、ウロキナ ー ゼ、ファクターXaプラスミン、カリクライン、ファクターXIIa、ファクターXIa 、ファクターVa、tpA、エラスターゼ、カテプシン、コントラプシンなどのセリ ンプロテアーゼを阻害するように設計される。本発明の機能的な目的は、一般的 に、DNA操作によって、エラスターゼのようなセリンプロテアーゼを阻害し、ヘ パリンなどの他の化合物の存在下でこの阻害能が高まる合成物を得ることである 。特異的には、酵素をコードするDNAは、DNAの中に特定のセリンプロテアーゼに 対する基質をコードするDNAの配列を組み込まれるよう操作される。そして、組 み換えられたDNAを、特定のセリンプロテアーゼに対する基質を含む、本発明の 変異体を産生するために発現させる。基質が存在するため、該セリンプロテアー ゼの活性は、変異体によって特異的に阻害されうる。また一方で、変異体は本来 の生物学的活性を保持している。 本発明にかかる変異体の異なる５つの型について、以下でさらに詳細に説明す る。ＰＮ−１変異体−活性部位の操作 明確化するために、単一部位の置換を最初に検討（Ｐ₁部位と、次にＰ₁’部位 ）し、続いて複数の置換を検討する。Ｉ型変異体：単一部位突然変異 アルギニン残基は、極性の塩基性アミノ酸である。この極性アルギニンの非極 性残基による置換は、得られるセリンプロテアーゼ阻害の程度に劇的な影響を及 ぼす。この影響の具体的な例として、アルギニン（αでは３４５位、βでは３４ ６位）がイソロイシンで置換されている本化合物ＮＣＹ２０１０が挙げられる（ Ｒ３４５Ｉ）。このＲ３４５Ｉ変異体（即ち、イソロイシンがＰＮ−１αの３４ ５位のアルギニンを置換している）は、ヘパリンが存在しようと存在しまいと、 本質的にトロンビン阻害活性を失っている。同時に、このＮＣＹ２０１０変異体 は、好中球エラスターゼ活性の良好な阻害物質である。未変性の線維芽細胞ＰＮ −１はエラスターゼに対して阻害効果を持たず、それどころかエラスターゼの基 質であることに注目すると、これは驚くべきことである。 ＮＣＹ２０１０の活性は、セリンプロテアーゼを阻害するプロテアーゼ阻害物 質（本発明のＰＮ−１変異体のような）での相対有効性が公知の標準により測定 されることを理解して考察すべきである。この標準は、二次会合速度定数（ｋ_{as s} ）であり、（Bieth，J.G.，Bull．Euro．Phvsiopath．Resp.（1980）16:183-19 5）に記載され、Scottら（J．Biol．Chem.（1985）260:7029-7034）により報告 されるが、これらの両文献は二次会合速度定数を開示するため本明細書に参照と して組み込まれる。 一般に、特定のプロテアーゼ−阻害物質反応のｋ_ass値が１×１０⁵Ｍ^-1Ｓ^-1以 上であれば、生理学的に有意であると考えられ（TravisとSalveson，Ann．Rev． Biochem. ,（1983）52:655-709）、この文献は速度定数の意味を記載するため本 明細書に参照として組み込まれる。エラスターゼ−α−１−アンチトリプシンや プラスミン−α−２−アンチプラスミンのような多くの生理学的に重要なプロテ アーゼ−阻害物質反応は、１×１０⁷Ｍ^-1Ｓ^-1以上というような高い速度定数で 起こる。トロンビン−ＰＮ−１反応は、同様の高い速度か、又はヘパリンの存在 下では更に速い速度で起こる。 未変性ＰＮ−１は、エラスターゼの活性を阻害する効果を本質的に持たない。 しかし、本発明のＲ３４５Ｉ変異体は、セルピンについての新規な生物学的活性 、即ち、エラスターゼを阻害するその能力を明白な形で提供するのみでなく、極 めて強力なエラスターゼ阻害物質を明白な形で提供するものである。このＲ３４ ５Ｉ変異体のこのような程度までエラスターゼを阻害する能力は、それ自体驚く べき知見であった。しかし、このような強力なエラスターゼ阻害物質を提供する ことに加えて、これらの変異体は、ヘパリンの存在下ではエラスターゼの阻害に 更に大きな能力を有することが、予期しない明白な形で見い出された。 本発明の変異体は、エラスターゼ阻害物質として作用する能力の改善を明瞭に 提供することができるだけでなく、ヘパリン、ヘパリン様化合物、又は血管の内 皮細胞による裏打ちに通常見い出される他の関連するムコ多糖類の存在下で、こ れらの活性が部位特異的に大きく増強されるような活性を提供することができる 。ヘパリンに加えて、表面及び周囲の細胞外マトリックスに通常見い出される他 のヘパリン様化合物のような、ある範囲の硫酸化プロテオグリカン類は、エラス ターゼを阻害する本発明の変異体の能力を増大させるのみでなく、ヘパリンやヘ パリン様化合物に対するこれらの変異体の親和性により部位特異的活性を提供す る であろう。 エラスターゼに及ぼすＲ３４５Ｉ変異体の阻害効果は、ヘパリンの存在下で約 ２桁上昇する。肺気腫、先天性α−１−抗トリプシン欠損症、炎症及び敗血症シ ョックのようなエラスターゼ関連疾患に罹患している個体を治療するために、極 性アルギニン残基をバリンのような非極性残基で置換した「Ｐ₁」変異体が、ヘ パリンで活性化可能な阻害物質として使用できるであろうことは、容易に決定で きる。使用することができる非極性残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ及びＷ を含み；更に好適には（バリンに類似した「Ｒ」基構造により）Ｇ、Ａ、Ｖ及び Ｌであり；そして最も好適にはＩである。 広い意味で本発明は、強力なエラスターゼ阻害物質として作用することができ るＰＮ−１変異体を包含する。更に具体的には、本発明は、エラスターゼ阻害物 質として作用し、更にヘパリン及びヘパリン様物質の存在下でこのエラスターゼ を阻害する能力が大きく上昇するＰＮ−１変異体を包含する。更になお具体的に は、本発明は、エラスターゼ阻害物質として作用し、かつその変異体はヘパリン の存在下で１０倍以上、好適にはヘパリンの存在下で５０倍以上、そしてより好 適にはヘパリンの存在下で１００倍以上エラスターゼを阻害する能力が上昇する 、ＰＮ−１変異体を包含する。本発明の有用な調剤は、ヘパリン及び種々の硫酸 化多糖類又はプロテオグリカンのようなヘパリン様化合物に加えて、薬剤学的組 成物中に処方されるＰＮ−１変異体を含む。ヘパリン様化合物が高度に硫酸化さ れていて、このため高い負の電荷を与える場合が特に好ましい。 極性アルギニンを置換したバリンのような非極性残基を含む本発明のＰ₁変異 体が、エラスターゼの活性を阻害するこれらのＰ１変異体の能力を利用して個体 を治療するために使用することができることは既に述べられている。ＰＮ−１に より阻害されるウロキナーゼやプラスミンのような他のプロテアーゼがヘパリン で活性化可能ではないため、これは非常に驚くべきことである。何ら特定の理論 に束縛される意図はないが、陰イオン性であるヘパリンに対する結合を促進する エラスターゼの陽イオン性のために、本発明のＰ₁変異体はエラスターゼを阻害 するのに有効であるようである。従って、ヘパリンで活性化可能なエラスターゼ の阻害物質を得るためには、同様の活性を合理的に期待するために、非極性で、 かつ 類似した「Ｒ」基を有する他の残基で活性部位が置換される。ＰＮ−１変異体の新規な面 ＰＮ−１α及びＰＮ−１βの配列は、各々図１及び図２に示される。更に、両 者の特徴を決める要因は既に述べられている。本開示の前に、ＰＮ−１のエラス ターゼ阻害物質などの本発明の変異体は知られていなかった。更に、任意のこの ような変異体が何かの活性を、まして得られた型の活性を提供するかどうかは知 られていなかった。実際、エラスターゼは未変性ＰＮ−１を切断する。この切断 がトロンビンや他のプロテアーゼに対してＰＮ−１を不活化する。Ａｒｇ₃₄₅を Ｉｌｅに変えること（Ｒ３４５Ｉ）で、ＰＮ−１がエラスターゼの更に良好な基 質に変化し、これによりＰＮ−１の不活化を早めることは可能であった。本発明 は、活性部位が置換されている変異体を提供するのみでなく、このような変異体 が活性を有し、この活性は元のＰＮ−１の活性とは実質的に異なることを示す。 多くの変異体とこれらの活性が示されたため、活性を有する更に別の変異体も製 造することができるであろう。これに関連して、Ｐ₁及びＰ₁’部位の両方が置換 されている変異体を製造することができると仮定される。このような二重置換は 、種々の異なる方法で行われる。 このような変異体を製造する１つの方法は、極性残基の代わりの非極性残基を 含むような、存在する残基とは実質的に異なる残基で１つの部位を置換し、一方 もう１つの部位を、極性であるか非極性であるかに関して、そして類似した「Ｒ 」基を有することに関して、そこに存在する残基と実質的に類似した残基で置換 することである。別の方法は、両方の部位を元の残基とは実質的に異なる残基で 置換することである。変異体を製造するための更に別の可能な手段は、上記で示 唆した手法のいずれかを他の部位の置換と組合せて使用することであろう。本明 細書の記載を読んだ当業者には、種々のこのような置換が想起可能であろう。重 要なことは、生じた変異体が活性を提供し続けることである。活性を提供する変 異体の能力は、基質の特異性に依存する。従って、本発明は、所定のプロテアー ゼに関する活性を保ち続けるか、又は別のプロテアーゼに関する実質的な活性を 獲得する変異体を提供するための、残基の単一、二重及び多重置換を包含するこ とを意図している。 本発明に関連して、活性を有するＰＮ−１変異体は、下記を有する変異体であ る：（１）ｔＰＡ、ウロキナーゼ、及び／又は他の関連酵素を阻害することに関 する実質的に高い活性；（２）エラスターゼを阻害することに関する実質的に高 い活性；又は最も好適には（３）エラスターゼを阻害することに関する実質的に 高い活性であって、その活性はヘパリンの存在下で更に劇的に上昇する。本発明 は、エラスターゼを阻害するＰＮ−１変異体を製造することが可能であり、更に エラスターゼを阻害するだけでなく、ヘパリンの存在下でエラスターゼを阻害す る活性が実質的に上昇する変異体を製造することが可能であることを証明したた め、このような阻害物質の分野の当業者は、本発明の範囲に含まれることが意図 される他の変異体を想到することが可能であろう。具体的なＰＮ−１変異体 本発明のプロテアーゼネキシン−１変異体の例を、変異体の「特徴」と共に表 ２に示す。 上記例１〜８１は、ＰＮ−１の活性部位内の異なる部位の置換を表す。例えば レコード番号２〜２１は、ＰＮ−１のＰ₁位の置換を表す。「ＷＴ」の表示は、 ＣＨＯ細胞により産生される天然の又は野生型の配列を示すために提供される。 本開示から明らかなように、これらの例は、活性部位内の各位置で２０アミノ酸 全部の置換を受けてよく、即ち、部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｐ₁、Ｐ₂、 Ｐ₃、Ｐ₄、Ｐ₁’、Ｐ₂’、Ｐ₃’、及びＰ₄’位に、全２０個の天然アミノ酸が置 換されてよい。 部位指向性突然変異誘発を用いて、個々のＩ型変異体を製造することができる 。しかし同時に大量のＩ型変異体を製造することもできる。例えば全２０個の天 然アミノ酸が全８つの位置で置換している、６４００万の異なる変異体を同時に 製造することができる。このような製造は、１９９３年６月２９日発行の米国特 許第5,223,409号に開示されたファージディスプレイ合成方法（phage display s ynthesis methodology）を用いて行うことができる。更に、１９９１年４月２３ 日発行の米国特許第5,010,175号に開示された化学合成方法を使用してこのよう な変異体の大量混合物を製造することができる。次いで米国特許第5,223,409号 に開示されたような異なる型のスクリーニング法を使用して特定の活性を決定す るために変異体をスクリーニングすることができる。Ｉ型変異体の試験 変異体をプロテアーゼ群と比較し、異なるプロテアーゼに対するこれらの二次 速度定数を測定することにより、本発明の任意の変異体を試験することができる 。このような試験は例示数のＩ型変異体で実施され、結果は表１Ａ〜１Ｉに記載 される。 II型変異体：セルピン活性部位の交換 本発明のII型変異体は、Ｉ型変異体と同様の方法で製造される。しかしＰＮ− １の活性部位は、別のプロテアーゼ、好適には別のセルピンの活性部位の配列に 適合するような方法で修飾される。本発明のII型変異体の例は、下記のものを含 む： Ｉ型変異体に関する上述のものと同じ方法を使用してII型変異体を製造するこ とができる。更に、上記引用特許（本発明に参照として組み込まれる）に開示さ れた方法を使用してII型変異体を製造することができる。この方法は、最初に別 のセルピンの活性部位を決定するということだけが異なる。異なるセルピンの活 性部位のアミノ酸配列を決定し、この異なるセルピンの活性を試験した後に、天 然のＰＮ−１に比較して、特定のかつ目的の変化した活性を有するII型変異体を 製造することができる。II型変異体の試験 上述の通り、本発明の全ての変異体はプロテアーゼ群に対するこれらの二次速 度定数を測定することにより試験することができる。Ｉ型変異体と同様に、代表 する数のII型変異体で試験を行い、得られた結果を下記表２Ａ及び２Ｂに示す。 ＮＣＹ２２０２（特にヘパリンの存在下で）の活性は、両者ともカテプシンＧ を阻害するがエラスターゼは阻害しないという点でＮＣＹ２３２２の活性と幾分 類似している。これは同程度の基質特異性のため全く予期しないことである。III型変異体：某質配列の組み込み 本発明のIII型変異体は、最初にプロテアーゼの基質配列を決定することによ り製造される。公知で本発明に関して有用であろう幾つかのプロテアーゼの基質 配列を下記表３Ａに示す。 ｋ_cat及びｋμにより決定される最良の人工小分子ペプチド基質（即ち、Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）を測定することにより、又は天然タンパ ク質基質（例えばトロンビンに対するフィブリノーゲン）の配列を検討すること により、他の基質配列を測定することができる。 プロテアーゼが結合するアミノ酸配列（即ち、その特異的基質配列）の測定後 、ＰＮ−１の活性部位の全て又は一部を置換するためにその配列を使用する。II I型変異体の例は下記のものである： III型変異体の試験 上記表３Ｂに、具体的なIII型変異体を示す。表３Ａに示されるようなプロテ アーゼの基質配列がＰＮ−１に含まれる。これらの変異体をプロテアーゼ群に対 して試験した。その結果を表３Ｃ〜３Ｊに示す。 IV型変異体 本発明のIV型変異体は、アミノ酸配列が天然タンパク質と同一であるか又はそ れらとは異なっている他の全ての変異体とは全く異なる。IV型変異体は、生物学 的安定性の向上が望まれる時に、一般に任意のタンパク質、タンパク質断片、又 はペプチドへのＰＥＧの共有結合（即ち、カップリング）により生成することが できる。この内特に興味あるものは、治療上の適用に有用な、セリンプロテアー ゼ阻害タンパク質、成長因子、及びサイトカインのようなタンパク質、タンパク 質断片、及びペプチドである。タンパク質ＰＮ−１、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、及びアンチトロンビン−III（ＡＴIII）は特 に興味深い。本発明の方法を使用してIV型変異体を作成するために修飾すること ができる、興味ある具体的なタンパク質の例、及びタンパク質群の例を表４Ａに 示す。 IV型変異体は、ポリエチレングリコールをタンパク質のシステイン残基のチオ 基に付加することにより製造される。タンパク質に付加されるＰＥＧ残基は、分 子量で約２００〜２００００分子量の範囲であろう。好適にはＰＥＧ残基は、約 １０００〜８０００分子量、より好適には約３２５０〜５０００、最も好適には ５０００分子量である。 タンパク質にポリエチレングリコールを付加する一般的方法は、１９７９年１ ２月１８日発行の米国特許第4,179,337号に開示される（タンパク質にポリエチ レングリコールを付加する方法を開示するため本明細書に参照として組み込まれ る）。更に、ポリエチレングリコールを付加する他の方法は、１９９２年６月１ ６日発行の米国特許第5,122,614号に開示され、これもまたタンパク質にポリエ チレングリコールを付加する方法を開示するため本明細書に参照として組み込ま れる。 本発明者らは、タンパク質中のシステイン残基にポリエチレングリコールを付 加することにより、新規修飾タンパク質を製造することができることを発見した 。好適には、このタンパク質は、普通グリコシル化されている位置でシステイン 残基にポリエチレングリコールを付加することにより修飾される。別の好適な実 施 態様においては、普通グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）されている位 置にシステイン残基を付加し、この付加したシステイン残基のチオ基にポリエチ レングリコールを付加する。更に、関心あるタンパク質が構造上関連したタンパ ク質群の一員であるならば、他の任意の一員のグリコシル化部位を関心あるタン パク質上のアミノ酸に一致させ、このアミノ酸をポリエチレングリコールの付加 のためのシステインに変化させることができる。或は、関心あるタンパク質又は 関連タンパク質について結晶構造が決定されると、活性部位又は結合部位から遠 く離れた表面残基をポリエチレングリコールの付加のためのシステインに変化さ せることができる。 また、システイン残基のチオ基に他の基を付加することができることも見い出 された。例えば、システイン残基のチオ基にビオチンを付加することによりタン パク質をビオチン化することができる。IV型変異体の例は、下記のものである： 上記例の中で、レコード番号１及び２は、ポリエチレングリコール又はビオチン がペプチドのリシンの位置に付加している当該分野で公知の一般的型のものであ る。しかし、レコード番号３及び４は、各々ポリエチレングリコール又はビオチ ンがシステイン基で結合している例である。このようなものの重要性は更に以下 に記載される。 タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加は、血清半減期を上 昇させ、免疫原性及び抗原性を低下させる一般的な方法である。Nucciらは、ア デノシンデアミダーゼ、急性リンパ芽球性白血病の治療のためのＬ−アスパラギ ナーゼ、抗癌剤及び抗ウイルス剤としてのインターフェロンアルファ２ｂ（ＩＦ Ｎ−α２ｂ）、抗癌剤としてのスーパーオキシドジスムターゼ、ストレプトキナ ーゼ、ｔＰＡ、ウロキナーゼ、ウリカーゼ、ヘモグロビン、インターロイキン、 インターフェロン、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、及び他の成長因子を含む、ＰＥＧの付 加により修飾された幾つかのタンパク質を記載している（Nucciら，1991，Adv． Drug Delivery Rev．6:133-151）。 典型的には、このＰＥＧ残基の付加によるタンパク質の修飾は、タンパク質の 表面上のリジン残基と反応する官能基でＰＥＧを活性化することを伴う。このタ ンパク質の修飾を完全に進めると、タンパク質の活性は通常消失する。現在の修 飾方法は、部分的なタンパク質のＰＥＧ化のみを行う。通常これにより活性がわ ずか５０％消失し、血清半減期が大きく上昇するため、目的の活性を得るために 要するタンパク質の全用量は低くなる。 部分修飾の避けられない結果は、タンパク質当りのＰＥＧ基（リジン残基に結 合しているＰＥＧ）数の統計的分布があることである。また、表面のリジン残基 のランダムな利用もある。例えば、アデノシンデアミダーゼが最適に修飾される 時、このタンパク質にはタンパク質当り約１４個のＰＥＧがあり、個々のタンパ ク質当りの実際のＰＥＧの分布は広く、実際に使用されるリジン残基の分布は広 い時、５０％の活性の消失がある。 ＰＥＧ修飾の初期の研究は、シアヌル酸クロリドでＰＥＧを活性化してタンパ ク質とカップリングすることに依存していた。この方法には、幾つかの不利な点 があり、中で最も顕著なものはシアヌル酸クロリドの毒性と活性化の消失である 。最近になって、ＰＥＧ化反応に伴う化学物質の毒性を低下させる著しい進歩が あった。Zalipskyら（Zalipsky，S.，Seltezer，R．& Nho，K．(1991)ポリマー 性薬剤及び薬剤送達システム（Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems） ，ACS.）は、遊離リジン残基を介してタンパク質と安定なカルバミン酸結合を生 成するためのＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩の使用を記載している。遊離リジ ンを 介するＰＥＧによるタンパク質の修飾のために幾つか他の方法があるが、それぞ れタンパク質の部分的でランダムな修飾に関連した問題、及びリジン残基が重要 である場合に活性の消失の可能性に関連する問題がある。 ＰＥＧ化法の技術の現状は、反応をより特異的に行うことができれば大きく改 善されるであろう。例えば、ＰＥＧ化の間タンパク質の反応領域をブロックする ことができれば、このタンパク質は完全に修飾後でさえ全活性を保持することが 期待される。この方法は費用がかかり不便であることが理解される（この修飾が 、活性部位が保護されている親和性精製工程で行われ、タンパク質が全て一工程 で精製される場合を除いて）。ある場合には活性部位領域をブロックすることに より、回復不可能な活性の消失を招くため、この方法は使用されえない。 別の代替法は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕなどのような他の残 基を、活性が消失しないような方法でＰＥＧ修飾することである。これらの残基 の多くは活性部位かその近くにあるか、又はこれらの残基は表面に存在しないか 、血清半減期に著しく影響を与えるのに充分な数で表面に存在しないか、又は修 飾の化学反応が標的残基に対して充分に特異的でないか、この化学反応が活性の 消失なしにはタンパク質が耐えられない程苛酷であるかということが、予想され るか又は可能性がある。 最も望ましい状況は、反応性で容易にかつ特異的に修飾でき、そして活性部位 領域から遠く離れているあるアミノ酸の表面分布が存在することであろう。シス テインは活性部位かその近くで使用されることは稀であり（システインプロテア ーゼを除いて）、修飾の化学反応はよく確立しているため、システインはこのよ うな修飾に理想的な候補である。マレイミド−ＰＥＧが恐らく最も有用であるが 、他の化学物質も特異的システイン修飾のために利用可能である。部位指向性突 然変異誘発を使用して、活性部位領域とは遠く離れた表面に新規システイン残基 を付加することができる。Ｘ線結晶構造が公知であれば、この方法は最も便利に かつ容易に行うことができる。 このタンパク質工学の手法をもってしても、充分に安定性を増大させるために 、どの表面残基をシステインに変えるか、そして幾つのＰＥＧ修飾部位を付加す べきかということは、容易に推察できない。多くの手法があり、それにより、２ ０ 以上の独立の単一部位システイン突然変異体を生成させ、各々独立にＰＥＧ化し 、残存活性について各々解析する。充分な活性を保持している突然変異タンパク 質類を、複数のＰＥＧ付加部位を有する１つのタンパク質を作成するために結合 させることができる。 三次元構造の知識が必要でない利点を有し、また悪い部位を取り除く進化の選 択力を利用する、良好なＰＥＧ付加部位を同定するための別の手法がある。安定 性を促進し、血清半減期を上昇させるために、自然は、分泌タンパク質の表面に グリコシル化残基を付加することを選択した。例えば、周知のＮ−グリコシル化 シグナルの部分である時アスパラギン残基はグリコシル化される（ＮＰ！Ｔ／Ｓ Ｐ！）。これらＡｓｎ残基のシステインによる置換、これに続くシステイン特異 的ＰＥＧ化は、活性の消失が最小で血清半減期が著しく上昇したタンパク質が得 られることを予期させる。現在まで、この方法はin vitroのグリコシル化に最も 近いことであり、不適切な糖残基によるグリコシル化が肝臓による血清からのク リアランスを増大させ、一方ＰＥＧ残基はむしろ不活性であると予期されるため 、幾つかの点ではそれ以上である。 高度のＰＥＧ修飾が必要とされ、修飾すべきタンパク質が構造相関タンパク質 群の一員であるならば、同じタンパク質群の他のタンパク質はしばしば、関心あ るタンパク質には見い出されないグリコシル化部位を１つ以上有する。これらの 「新規」潜在部位が合理的に保存される領域にあるならば（即ち、挿入の部分で ないか、又は異なる構造を有する程に異なってはいない配列）、Ａｓｎと同等な 残基のシステインによる置換、これに続くＰＥＧ化により、活性の有意な消失な く高度にＰＥＧ修飾されたタンパク質を得られることが予期される。 更に高度のＰＥＧ修飾が必要であるならば、他の溶媒に接する残基をシステイ ンに変えて、生じたタンパク質をＰＥＧ化することができる。適切な残基は、当 業者には容易に決定できる。例えば、関心あるタンパク質又は関連するタンパク 質の三次元構造が利用可能であれば、溶媒に接するアミノ酸は容易に同定される 。また、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ及びＧｌｕのような荷電したアミノ酸は、ほぼ 例外なくタンパク質の表面に見い出される。これらの１つ、２つ又は多くの残基 のシステインによる置換は、ＰＥＧ付加の別の部位を与える。更に、抗体に認識 さ れる未変性タンパク質中のアミノ酸配列は、通常タンパク質の表面にある。溶媒 に接するアミノ酸を決定するためのこれらの及び他の方法は、当業者にはよく知 られている。 またＰＥＧによるタンパク質の修飾は、生物学的安定性が上昇したタンパク質 、断片、及び／又はペプチドの二量体及び多量体複合体を生成するために使用す ることができる。これらの本発明の二量体及び多量体タンパク質は、天然の二量 体又は多量体タンパク質であってもよい。例えば、この二量体又は多量体は、タ ンパク質の架橋サブユニット（例えばヘモグロビン）よりなっていてもよい。或 は、この二量体及び多量体タンパク質は、通常架橋していない２つのタンパク質 よりなっていてもよい（例えば、架橋ＥＰＯタンパク質の二量体）。 本発明の二量体タンパク質は、このタンパク質を、２つのタンパク質反応性残 基を有するＰＥＧよりなる試薬である（マレイミド）₂−ＰＥＧと反応させるこ とにより製造することができる。二官能性ＰＥＧ残基によるこのＰＥＧ化反応に より、一般式： Ｒ₁−Ｓ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｒ₂ （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なるタンパク質を表してよく；そしてＳは、 未変性Ｒ₁又はＲ₂タンパク質のいずれかに存在するか、又は部位指向性突然変異 誘発により導入されたシステインのチオ基を表す）で示される二量体が生成する 。タンパク質Ｒ₁及びＲ₂は、各々サイズが、約６〜１，０００アミノ酸、好適に は約２０〜４００アミノ酸、より好適には４０〜２００アミノ酸に変化してよい 。二量体分子中では、Ｒ₁及びＲ₂は好適には約１００〜２００アミノ酸である。 特に関心のある二量体及び多量体は、分子量約４００００未満である、タンパク 質、タンパク質断片及び／又はペプチドよりなるものを含む。 タンパク質が２つ以上のシステインを含有する（又は含有するように設計され た）場合、タンパク質（Ｒ₁、Ｒ₂、・・・・・Ｒ_nにより表される）が同一又は 異なっている多量体タンパク質を生成することができる。Ｒ₁、Ｒ₂、・・・・・ Ｒ_nにより表されるタンパク質は、サイズが、約６〜１０００アミノ酸、好適に は２０〜４００アミノ酸、より好適には４０〜２００アミノ酸に変化してよい。 このような多量体タンパク質は、下記一般式： Ｒ₁−（−Ｓ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｒ₂）_n （式中、Ｒ₁は、例えば２〜２０個の遊離システイン、通常５〜７個の遊離シス テインである、複数の遊離システインを有するタンパク質を表す）で示されてよ い。Ｒ₂は、Ｒ₁と同一であるか又は異なるタンパク質を表してよい。更に、Ｒ₁ に結合した各Ｒ₂タンパク質は、同一タンパク質であっても、又は幾つかの異な るタンパク質を表してもよい。 多量体架橋の程度は、存在する及び／又はタンパク質中に設計されたシステイ ンの数により、及び反応混合物中に使用される（マレイミド）₂ＰＥＧの濃度に より制御することができる。更に、単一のＰＥＧ残基を有するタンパク質、及び 複合体内のタンパク質間のＰＥＧ架橋を有するタンパク質のカップリングの形成 のため、タンパク質との同じ反応でマレイミド−ＰＥＧ＋（マレイミド）₂−Ｐ ＥＧ試薬を使用してもよい。少なくとも部分的には未変性タンパク質に比較して 増大したサイズのため、生成する二量体又は多量体タンパク質は、未変性タンパ ク質に比較して半減期が上昇する。このような大きなタンパク質は、小さなタン パク質ほど急速には腎臓により分解されたり循環中から排除されることはない。 更に、二量体又は多量体タンパク質の活性又は能力は増大しているかもしれない 。 二量体及び多量体タンパク質は、マレイミド−ＰＥＧ又は（マレイミド）₂− ＰＥＧとの反応により生成されてよい。本発明の方法を使用する二量体及び／又 は多量体複合体形成のためのタンパク質の例は、ＰＮ−ＬＰＮ−１変異体、ヘモ グロビン、及びエリトロポエチン（ＥＰＯ）、更には表４Ａに例示される任意の タンパク質又はタンパク質群の任意のタンパク質を含む。好適には本発明の方法 により生成されるタンパク質は、ヘモグロビンの「ａ」及び「ｂ」鎖のＰＥＧ化 架橋複合体であり、分子間及び／又は分子内架橋を有するヘモグロビンの多量体 複合体も本主題の方法により生成される。 一般に、ＰＥＧ修飾のためのシステイン残基を同定する方法、及び／又は後で ＰＥＧの付加により修飾されるシステインで置換されるアミノ酸残基を同定する 方法により、未変性タンパク質のほとんど又は全ての活性を保持することが合理 的に予期されるＰＥＧ化タンパク質を生成することができる。システインによる 修飾及び／又は置換のために選択される部位は、タンパク質の構造に基づき選択 される。即ち、選択される部位は、活性部位には関与しない溶媒に接する残基で ある。 活性部位の外側に位置する突然変異の影響は、これらがタンパク質の主要な活 性を一般に変化させないことで一般に予測可能である。更に、本明細書に記載さ れる構造の突然変異は、タンパク質の溶媒に接する領域内（即ち、タンパク質の 「表面」上）であるため、タンパク質分子内の他の残基とは限定された相互作用 を有するか又は相互作用がない。即ち、これらの位置の突然変異は、タンパク質 内の他の任意のアミノ酸のコンホメーションに影響する可能性は小さい。Ｖ型変異体 本発明のＶ型変異体は、ＰＮ−１に全ての又は断片の別のタンパク質を縮合す ることにより製造される。好適には、ＰＮ−１を異なる受容体（即ち、ウロキナ ーゼ受容体）に局在させるために、ウロキナーゼのようなタンパク質のアミノ末 端断片をＰＮ−１に縮合する。ウロキナーゼの使用に加えて、ｔＰＡ、IX因子、 Ｘ因子、及びプロテインＣのようなタンパク質のアミノ末端断片を縮合すること ができる。Ｖ型変異体の例は、下記の通りである： 本発明のＶ型変異体は、Ｉ、II及びIII型の変異体と同様の方法で製造するこ とができる。しかし、異なるタンパク質のＮ−末端断片をＰＮ−１に化学的に縮 合することにより、このような変異体を製造することが好適である。 Ｖ型変異体はまた、両方のタンパク質成分の精製した調製物の化学結合により 製造することができる。このような結合は、便利には二官能性架橋剤を使用する ことにより達成される。このような結合を化学的に確立する方法は、当業者には よく知られている。この方法で製造される具体的な変異体は、ＥＧＦ；IX因子； Ｘ因子；及びＡＰＣの任意の１つにＰＮ−１を縮合することにより製造される変 異体を含む。 本発明のＰＥＧ化方法は、一般的方法であることを意図し、このため任意のタ ンパク質に適用して、溶解性、循環半減期を増大させ、及び／又は免疫原性を低 下させることが可能である。Ｖ型変異体の試験 本発明のＶ型変異体は、ＰＮ−１が別のタンパク質に共有結合したキメラタン パク質である。上記の同じプロテアーゼ群を使用して本発明のＶ型変異体の１つ を試験した。その結果を以下に示す。 用途及び投与 本発明の異なるキメラタンパク質、ＰＮ−１変異体及びシステイン−ＰＥＧ化 タンパク質（上述の通り）は、異なる効果を提供する可能性がある。例えば、極 性アルギニン残基に置換したバリンといった非極性残基を伴うＰ₁変異体は、ヘ パリン活性化可能な阻害物質として使用できるだろう。かかる阻害物質は、エラ スターゼ関連疾病を患う個体を治療するのに使用できる。このような疾病に制限 されるわけではないものの、かかる変異体は、気腫、先天性α−１−抗トリプシ ン不全症、炎症、関節炎及び敗血症性ショックを治療するのに使用できる。 本発明のキメラタンパク質、ＰＮ−１変異体及び／又はこれらのタンパク質の システイン−ＰＥＧ化の態様の最も重要でかつすぐに考えつく用途の１つは、創 傷の治ゆを助け創傷部位の炎症を減少させるため創傷に対し応用するためのさま ざまな包帯を伴う、クリーム又はゲルといったさまざまな局所的製剤形態又はこ のような製剤形態の組合せの中にこれらを内含させることにある。本発明のキメ ラタンパク質、ＰＮ−１変異体及びこれらのタンパク質のシステイン−ＰＥＧ化 の態様が、炎症を低減させる上で有効であると考えられていることから、本発明 のキメラタンパク質、ＰＮ−１変異体及び／又はこれらのタンパク質のシステイ ン−ＰＥＧ化の態様を含む注入製剤は、炎症を減少させるべく、炎症を起こして いる関節又は体のその他の炎症部域の中に直接注入することができる。さらに、 本発明の製剤は、炎症が起こらないようにするため、外傷（例えば外科手術にお いて）ひいては炎症を受ける可能性のある特定の部位に対して、キメラタンパク 質、ＰＮ−１変異体及び／又はこれらのタンパク質のシステイン−ＰＥＧ化の態 様を供給することによって、予防的に使用することもできる。 一般に、本発明のキメラタンパク質、ＰＮ−１変異体及び／又はシステイン− ＰＥＧ化タンパク質を含む薬学組成物は、約５〜８、より好ましくは６〜８のpH で、薬学的に受容できる無毒で不活性の水性担体媒質の中で調剤されるが、この 薬学組成物の好ましいpHは利用されるタンパク質及び治療すべき状態に応じて異 なる。 本発明で特に有利なのは、システイン−ＰＥＧ化タンパク質及びこれらのタン パク質を含む薬学組成物である。タンパク質のＰＥＧ化は、治療用に直ちに使用 でき（すなわち再構築を必要としない）、未修正タンパク質に比べ増大した可溶 性及び増大した半減期を有しかつ免疫原性及び抗原性が低下したタンパク質を生 成する(Nucci et al，1991，Adv．Drug Delivery res．6; 133-151)。ＰＥＧ化 されたタンパク質の半減期の増大は、有効用量として必要とされるタンパク質の 量を減らし、必要な投与回数及び頻度を減らし、患者がタンパク質に露呈される のを減少させ、かくしてアレルギー反応、毒性効果又はその他の副作用の可能性 が低くなる。ＰＥＧ化されたタンパク質がもつこれらの特徴は、タンパク質の免 疫原性及び／又は毒性に関係する望ましくない副作用に対する可能性が比較的低 いタンパク質の長期使用を可能にしている。タンパク質のＰＥＧ化によって半減 期の増大に影響が及ぼされるタンパク質の例としては、ｈＧＨ、インシュリン、 インターフェロン−アルファ２Ａ（ＩＦＮ−アルファ−２Ａ、インターフェロン −アルファ２Ｂ（ＩＦＮ−アルファ−２Ｂ）、ｔＰＡ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、抗 原Ｅ、アルギナーゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、バトロクソ ビン、ウシ血清アルブミン、カタラーゼ、エラスターゼ、8.因子、ガラクトシダ ーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターグルクロニダーゼ、ＩｇＧ、ミツ バチ毒、ヘモグロビン、インターロイキン−２、リパーゼ、フェニルアラニンア ンモニアリアーゼ、アルファ−プロテイナーゼ阻害物質、プロ−ウロキーゼ、プ リンヌクレオシドホスホリラーゼ、ブタクサアレルゲン、ストレプトキナーゼ、 スーパーオキシドジスムターゼ、ｔＰＡ、Ｄ−アルファ−トコフェロール、トリ プシン、トリプトファナーゼ、ウリカーゼ及びウロキナーゼがある（一般に、Nu cci et al.前掲書を参照のこと；また、Davis et al．1981 Clin．Exp．Immunol ，46; 649-652(ウシアデノシンデアミナーゼ)；Nishimura et al．1985 Life Sc i．33; 1467-1473(バトロクソビン)；Savoca et al．1979 Biochimica et Bioph ysica ACTA 578; 47-53(アルギナーゼ)；Till，et al．1983 J，Trauma 23; 269 -277(アスパラギナーゼ)；Veronese et al．1983 J．Pharm．Pharmocol，35; 28 1-283(スーパーオキシドジスムターゼ)；Davis et al．1981 Lancet 2; 281-283 (尿酸オキシダーゼ)；及びDellinger et al．1976 Cancer（ガン）38; 1845-184 6 も参照のこと）。 ＰＥＧ化タンパク質は、さまざまな疾病の治療のために投与することができる 。疾病状態の症例及びこれらの疾病に治療において有用なタンパク質の例を、表 ６Ａに示す。 上述のとおり、キメラタンパク質、ＰＮ−１変異体及びシステイン−ＰＥＧ化 タンパク質は、製剤の形で及び上述の投与経路によって送り出すことができる。 特定の製剤形態、正確な用量及び投与経路は、担当の医師によって決定されるこ とになり、又各々の特定の状況に従って変動する。このような決定は、治療すべ き状態、投与すべきタンパク質、特定のタンパク質の薬物速度プロフィールとい ったような変数ならびに、患者の疾病状態（例えば重症度）、年令、体重、性別 、食餌法、投与時間、薬物組合せ、反応感受性、療法に対する寛容性及び療法に 対する応答性といったような、薬物としてのタンパク質の有効性を修正しうるさ まざまな要因を考慮することによって行なわれる。長期にわたり作用するタンパ ク 質薬物は、３〜４日に一回、一週間に一回、又は２週間に一回の割合でしか投与 できない。薬学組成物中でシステイン−ＰＥＧ化タンパク質が使用される場合、 例えば、システイン−タンパク質の上のＰＥＧ半分の数、ＰＥＧ半分のサイズを 変更することによって、患者の特定のニーズに合うよう究極的融通性を与えるべ く、クリアランス速度（すなわちタンパク質の半減期）を変動させることができ る。 システイン−ＰＥＧ化タンパク質が利用される場合、日々の摂取法は一般に、 天然、組換え型又はＰＥＧ化タンパク質についての用量の範囲内になくてはなら ない。正常な用量は、投与経路に応じて最高約１ｇの合計量で、０．１〜１００ マイクログラムの間で変動することができる。特定のタンパク質についての特定 の用量に関する指針は、未変性タンパク質及び／又は従来の方法によってＰＥＧ 化タンパク質のいずれかの投与に関する文献の中で提供されている。例えばフィ ブリン凝塊形成の予防のための抗トロンビン3.の投与についての指針は、米国特 許第５，２９２，７２４号及び５，１８２，２５９号の中に見い出すことができ ；毒物中毒になった個体の治療におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の投与につ いての指針は米国特許第５，１４０，００８号及び第４，８１６，４３９号の中 に見ることができ；局所的潰瘍の治療におけるｈＧＨの投与のための指針は、米 国特許第５，００６，５０９号の中に見い出すことができ；貧血症の治療のため の（ＥＰＯ）の投与及びＥＰＯの肺投与についての指針は、米国特許第５，３５ ４，９３４号中に見い出され；汎血球減少症の治療のためのＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳ Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ及びマルチ−ＣＳＰの投与についての指針は、米国特許第５，１ ９８，４１７号に見い出すことができ；鉄の過負荷を治療するためのＥＰＯの投 与についての指針は米国特許第５，０１３，７１８号中に見られ；異常ヘモグロ ビン症の治療におけるＥＰＯの投与についての指針は米国特許第４，９６５，２ ５１号に見い出すことができ；糖尿病の治療のためのインシュリンの投与につい ての指針は、米国特許第４，４７８，８２２号の中に見い出すことができ；新生 物の治療のためのアスパラギナーゼの送出しについての指針は、米国特許第４， ４７８，８２２号及び４，４７４，７５２号の中に見られ；腫瘍の治療における Ｌ−アスパラギナーゼの投与についての指針は、米国特許第５，２９０，７７３ 号の中に見られ；外傷部位の処置のためのクリオゲル包帯内でのプロスタグラン ジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２アルファ、プロス タグランジンＩ２、ペプシン、パンクレアチン、レニン、パパイン、トリプシン 、パンクレリパーゼ、キモパパイン、ブロメライン、キモトリプシン、ストレプ トキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化体、フィブリノリシン 、デオキシリボヌクレアーゼ、スチライン、コラゲナーゼ、アスパラギナーゼ、 又はヘパリンの投与についての指針は、米国特許第５，２６０，０６６号の中に 見い出すことができ；リポソーム内でのスーパーオキシドジスムターゼ、グルコ セレブロシダーゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェ ロン（アルファ、ベータ及びガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５ 、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファ又はＴＮＦ−ベータ）及びコロニ ー刺激因子（ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）の投与についての指針は米国 特許第５，２２５，２１２号の中に見い出すことができ；新生物形成病巣の治療 におけるアスパラギナーゼ又はインシュリンの投与についての指針は、米国特許 第４，９７８，３３２号の中に見い出すことができ；腫瘍成長の低減におけるア スパラギナーゼの投与についての指針は米国特許第４，８６３，９１０号の中に 見い出すことができ；移植体拒絶の防止における抗体の投与についての指針は米 国特許第４，６５７，７６０号及び５，６５４，２１０号に見い出すことができ ；Ｔ細胞突然変異誘発、細胞障害性Ｔ細胞の誘発、天然キラー細胞活性の増大、 インターフェロン−ガンマの誘発、細胞性免疫の回復又は増強及び細胞媒介抗腫 瘍活性の増大を含む免疫調節状況に対する療法としてのインターロイキン−１の 投与についての指針は、米国特許第５，２０６，３４４号に見い出すことができ ；腫瘍の治療におけるインターロイキン−２の投与についての指針は、米国特許 第４，６９０，９１５号の中に見い出すことができ；さらに、ガン化学療法とし ての造血の刺激及び免疫障害の治療におけるインターロイキン−３の投与につい ての指針は、米国特許第５，１６６，３２２号の中に見い出すことができる。 上述の全ての米国特許は、その中で記述されている特定のタンパク質及び／又 はＰＥＧ化タンパク質の投与において提供される指針に関して、本明細書に参考 として内含されている。 いくつかのＰＥＧ化タンパク質は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によってすで に使用承認を受けている。これらのＰＥＧ化タンパク質としては、ｈＧＨ、イン シュリン、インターフェロン−アルファ２Ａ、インターフェロン−アルファ２Ｂ 、ｔＰＡ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、及びＰＥＧ化タンパク質を内含するＢ型肝炎ワ クチンがある（Nucci et al.前掲書中）。 ＰＥＧ化タンパク質は療法において有用なものであることから、ＰＥＧ化のた めのアミノ酸残基の正確な選択を可能にし、かくして未修正の親タンパク質の活 性を保持するＰＥＧ化タンパク質の生成の可能性を増大させる、特異的部位での ＰＧＥ添加タンパク質の生成方法に対する明らかなニーズが存在する。 ＰＮ−１は血漿中に大量に発見されず、まず第一に組織内で機能しうる、とい うことが指摘される。ＰＮ−１の高親和性ヘパリン結合部位は、表面及び周囲の 細胞外基質上に硫酸化されたプロテオグリカンを内含する結合組織及び細胞にＰ Ｎ−１を局在化させるのに役立つと思われる。かくして、ＰＮ−１の一次的役割 は、血液ではなく組織内でのタンパク質分解活性を調節することにあると思われ る。ＰＮ−１は脳組織中を周回することから、本発明のもう１つの態様には、末 梢又は中枢神経の再生を容易にするためＰＮ−１変異体又はキメラタンパク質を 含む本発明の製剤を送り出すことが関与している。炎症及び創傷の治療における ＰＮ−１の使用のための製剤形態、投与経路及び用量については、米国特許第５ ，２０６，０１７号、５，１９６，１９６号；及び５，１１２，６０８号の中で 記述されており、その各々は、ＰＮ−１を用いたこのような治療方法が記述され ているかぎりにおいて、参考として本書中に内含されている。 一般に、経口送り出し系統によりキメラタンパク質又はプロテアーゼネキシン −１及びその変異体といった大きいタンパク質化合物を投与することによって望 ましい結果を得ることは不可能である。このようなタンパク質は、一般にＧＩ路 内で消化され（特別な担体を伴って処方されているのでないかぎり）、このよう な消化のためそのもとの形状で心臓血管系の中に入ることはない。キメラタンパ ク質、ＰＮ−１変異体、及び／又はこれらのタンパク質のシステイン−ＰＥＧ化 の態様は、筋内又は静脈内といったあらゆるタイプの注射によって投与でき、か くしてＧＩ路を回避できる。その他の投与様式としては、膏薬及び／又は局所用 クリーム組成物によって提供される経皮投与及び経粘膜投与が含まれる。経粘膜 投与には、鼻粘膜と接触しこれらの膜を通して直接心臓血管系の中へ拡散する経 鼻製剤の中にキメラタンパク質、プロテアーゼネキシン−１変異体及び／又はシ ステイン−ＰＥＧ化タンパク質を含む鼻内噴霧製剤形態が含まれる。ＰＥＧ化タ ンパク質は、膜を横断する高い能力を有する可能性があり、かくして体内により 容易に進入できる。肺内送り出し用のエアゾル内にキメラタンパク質、ＰＮ−１ 変異体を含む製剤形態も、点眼薬の形での送り出しのための眼科用製剤の中にキ メラタンパク質又はＰＮ−１変異体が含まれている眼内送出し系と同様に、本発 明において考慮されている。 以上に提案されている投与方法のいずれも、さまざまな異なる製剤形態で提供 することができる。製剤形態は、キメラタンパク質又はＰＮ−１変異体を全身的 にか又は特定の部位に対して提供するように設計することができる。さらに、製 剤形態は、できるかぎり早急にか又は持続放出又は限時放出の形でキメラタンパ ク質又はＰＮ−１変異体を提供するように設計できる。例えば、創傷の治ゆ及び 炎症の防止を連続的に補助する目的で創傷部位にキメラタンパク質又はＰＮ−１ 変異体をゆっくりと放出することのできる局所的重合体製剤全体に本発明のキメ ラタンパク質又はＰＮ−１変異体を含有させるか又は分配させた局所的製剤形態 を作り出すことができた。 上述の通り、心臓血管系の中にキメラタンパク質、ＰＮ−１変異体及び／又は システイン−ＰＥＧ化タンパク質を導入するために、さまざまな異なる仕方で本 発明の異なる製剤形態を投与することができる。キメラタンパク質、ＰＮ−１変 異体及び／又はシステイン−ＰＥＧ化タンパク質は、一般に例えば、タンパク質 分解活性の遮断；腫瘍の成長又は転移の阻害；創傷の治ゆ及び／又は神経繊維再 生の促進；タンパク質欠損状態（例えば糖尿病）のための代償療法；細菌、真菌 又はウイルスの成長阻害；免疫応答の増強；骨髄基幹細胞の成熟の誘発（例えば 骨髄移植における）；血液凝固の調節；炎症の治療；又は細菌性敗血症及び内毒 素性ショックの治療；アルブミン又はヘモグロビンの置換（例えば輸血を置換す るため）に関するさまざまな目的のために投与される。特に、キメラタンパク質 、ＰＮ−１変異体及び／又はこれらのタンパク質のシステイン−ＰＥＧ化の態様 を 含む静脈内製剤形態は、その血栓崩壊防止効果で有用なものであり、従って、発 作及び／又は心臓発作時の補助及び防止及び／又は軽減のために投与することが できる。 実施例 以下の例は、本発明のＰＮ−１変異体をいかに製造し使用するかについての完 全な開示及び説明を当業者に与えるべく提供されるものであり、発明者が自らの 発明とみなしているものの範囲を制限することを意図したものではない。会合速 度定数及び温度といった与えられた明細に関する精度を確保するための努力が払 われてきたが、幾分かの実験上の誤差及び偏差を考慮すべきである。製剤形態例 に関しては、部は重量部であり、温度読取り値はすべて摂氏温度単位であり、全 ての実験は大気圧又はその前後で行なわれた。 実施例Ａ ＰＮ−１の合成 ＰＮ−１は、本明細書に参考として内含されているScott，R.W et al.，J．Bi ol．Chem （1985）260; 7029-7034により詳細に記述されているとおりヘパリン− アガロース上でのアフィニティクロマトグラフィとそれに続くゲル排除クロマト グラフィにより、微粒子担体培養内でヒト包皮線維芽細胞によって調整された無 血清培地から、均質性が得られるまで精製された。当然のことながら、親和力結 合のためヘパリンを含んでいるその他のクロマトグラフィ支持体又はｃｍセファ ロース又はＳ−セファロースといったその他の基質も同様に使用可能である。精 製されたタンパク質は、沈降平衡分析法に基づく４２〜４３kdのＭＴを示すか、 又はゲル排除クロマトグラフィから見積られた４７kdのＭＴを示す。精製された 材料は、トロンビン、ウロキナーゼ及びプラスミンを伴うドデシル硫酸ナトリウ ム安定の複合体の形成；プロテアーゼ活性の阻害、トロンビンのヘパリン増強さ れた阻害；及びヘパリン感受性反応におけるプロテアーゼ−ＰＮ複合体の細胞結 合を含む、調整培地中に内含された時点でＰＮ−１が示す特性を示している。分 離され精製されたプロテアーゼネキシンのＮ末端アミノ酸配列は、最初の３４の アミノ酸について以下のものであることが決定された： 本発明のＰＮ−１変異体は、上述の仕方で分離され、そして精製された純粋な ＦＮ−１を利用することによって合成することができる。この変異体は、Ｐ１及 びＰ１’部位で精製されたＰＮ−１タンパク質を分割し、この部位にあるアルギ ニン、セリン又は両方の残基を望ましい非極性置換残基と置換することによって 得ることができる。望ましい残基を望ましい非極性残基と置換した後、当業者に とっては既知のプロトコルを利用してセグメントを融合させることができる。か かる方法は、本発明の変異体を得る目的に利用できたものの、幾分かわずらわし いものであり、しかも、抽出し精製できるＰＮ−１の量が非常に少ないことから 極めて制限されている。従って、上述の手順を利用することはできたが、これが 本明細書中で開示されているＰＮ−１又は変異体を製造する好ましい方法という わけではない。ＰＮ−１及びその変異体は一般には、以下で記述するとおり、組 換え型技術を利用して産生される。 実施例Ｂ ＰＮ−１の一般化された組換え型合成 組換え型技術を利用してプロテアーゼネキシン−１を産生する方法が、プロテ アーゼネキシン−１を産生する上で利用される組換え型技術を開示するべく本書 に参考として内含されている欧州公開特許出願８７３０４９１２６号の中で開示 されている。手順は、ＰＮ−１変異体を得るべくこの開示を読んだ当業者によっ て修正され得る。 完全ヒトＰＮ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡを、包皮線維芽細胞ＤＮＡ ライブラリから得た。このクローンの検索には、未変性タンパク質の中で決定さ れたアミノ酸配列に基づいたプローブが利用された。クローニングされたｃＤＮ Ａは、担体ベクターからコーディング配列を切除しそれを適切な発現システム内 へ連結させることによって、原核生物及び真核生物の両方の組換え型細胞の中で の発現に導くことができる。 ＰＮ−１は（発現系の選択に応じて、処理できるか又はできないものである） ＭｅｔＮ末端アミノ酸が先行する成熟タンパク質として直接産生させることもで きるし、又は望ましい付加的なあらゆるＮ末端又はＣ末端配列に対する融合タン パク質として産生させることもできるし、あるいは、独自の配列又は例えば細菌 ラクタマーゼ遺伝子又はインシュリン又は成長ホルモンといった分泌されたヒト 遺伝子と結びつけられた既知のシグナル配列などによって提供される非相同配列 である１つのシグナル配列が先行する場合には成熟タンパク質として分泌させる こともできる。部位特異的突然変異誘発により望ましいコーディング配列に関し て適当な場所で適切な制限部位を提供するための手段は充分に理解されており、 従ってコーディング配列には、シグナル配列又は融合配列への付着又は発現ベク ター内への付着のための適切な部位を備えることができる。 細菌宿主が選択された場合、タンパク質がグリコシル化されていない形で産生 されることになる可能性が高い。ＰＮ−１が「成熟」タンパク質として細胞内で 産生されるならば、Ｎ末端メチオニンは部分的にのみ処理されるか又は全く処理 されない可能性がある。したがって、産生されたタンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを 含む可能性がある。細胞内で又はかかる細菌宿主から分泌されたものとして産生 されたタンパク質の修正は、ジスルフィド結合を切断し再形成するための技術又 はその他の翻訳後のex vivo処理技術を使用して再生することによって多糖物質 を提供することにより行なうことができる。タンパク質が哺乳動物又はその他の 真核生物宿主の中で産生される場合、細胞環境は、翻訳後の処理がin vivoで起 こりうるようなものであり、グリコシル化された形態のタンパク質が産生される 可能性が最も高い。 組換え型細胞は、問題の宿主にとって適当な条件下で培養され、タンパク質は 、発現様式によって決定される通り、細胞リゼイトからか又は培地から回収され る。タンパク質の精製は、Scott，R.W．et al.，J．Biol Chem（前出）によって 開示されているものと類似する方法を用いてか又は当該技術分野において既知の その他の手段によって達成できる。 ＰＮ−１の産生についてコードするＤＮＡセグメントがひとたび細菌宿主の中 に挿入されたならば、当然そのセグメントの数多くのコピーを、その細菌を成長 させることによってクローニングすることができる。セグメントは、分断された 細胞を遠心分離に付すことによってＤＮＡを抽出し、次に抽出されたＤＮＡを酵 素消化に付しその結果としてゲル電気泳動及びプロッティングといった分離プロ セスに消化済みＤＮＡを付すことによって望ましいセグメントを得るようにする 従来の方法を利用することによって、細菌から抽出することができる。その後、 アルギニン及び／又はセリンについてコードするコドンを望ましい非極性アミノ 酸残基の産生についてコードする新しいコドンで置換するため、ＰＮ−１の産生 についてコードするセグメントを従来の組換え型方法に付すことができる。この ような組換え型セグメントがひとたび産生されたならば、望ましいＰＮ−１変異 体の産生を得るため上述の要領でベクター及び宿主内へこれらを再度挿入するこ とができる。当業者にとって既知のものであるさまざまなベクター及び宿主系を 使用することができる。 さらに、組換えにより産生されたＰＮ−１を用い、次に、望ましい「Ｒ」基（ 例えばセリン３４６の−ＯＨ）だけを非極性「Ｒ」基（例えば−ＣＨ₂ＣＨ₂−ｓ −ＣＨ₃）で置換してＰＮ−Ｍｅｔ₃₄₆変異体を得ることによってＰＮ−１変異体 を作ることができるということが指摘される。このような「Ｒ」基の置換は、当 業者にとって既知のものである公開されたプロトコルを用いて実施できる。 実施例Ｃ バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞内での組換え型ＰＮ−１変異体の産生 ｃ．１．プラスミド発現ベクターの構築 昆虫細胞の体内でＰＮ−１及び／又はＰＮ−１変異体を産生するためには、ｃ ＤＮＡ配列をまずｐＡＣ３７３といった適当なプラスミド発現ベクター内に挿入 しなければならない。この挿入のための適切な制限部位は、標準的部位特異的突 然変異誘発手順によって作り出すことができる。適当な発現ベクターに必須の特 性としては、ｐＡＣ３７３のポリヘドロン遺伝子プロモータといった転写プロモ ータ及びバキュロウイルスゲノムへの組換えを導くためのフランキング相同配列 が含まれる。このプラスミドベクター内に存在するポリヘドロン遺伝子からのも のといったポリアデニル化シグナルが組換え型遺伝子の発現にとって必要である 場合もあればそうでない場合もある。転写プロモータそして場合によってはポリ アデニル化シグナルを含む調節配列に並置された、E．coli のβ−ガラクトシダ ーゼ遺伝子といった標識遺伝子がベクター内に含まれていることもあるが、対流 した遺伝子の発現にとって必須のことではない。 ｃ．２．組換え型バキュロウイルスの作製 ＰＮ−１標的遺伝子を含む発現プラスミドと野生型バキュロウイスルＤＮＡの 間の相同組換えによって、キメラバキュロウイルスが作り出される。プラスミド 及び野生型バキュロウイルスＤＮＡを、リン酸カルシウム技術により同時沈降さ せ、感染を受けていないSpodoptera frugiperda(Ｓｆ９)昆虫細胞に付加する。 トランスフェクションから４〜７日後に、細胞は、細胞変性形態を示し、ウイル ス感染によって標準的に産生される核閉塞体を内含することになる。野生型及び 組換え型の両方のウイルスを含む細胞無しの培地を収穫する。 ｃ．３．キメラバキュロウイルスの同定及び分離 ウイルスのクローナル分離株は、アガロースが重ねて置かれたＳｆ９細胞単層 上でのプラーク精製により、この同時トランスフェクション株から得ることがで きる。分析のためのプラーク候補は、閉塞体について陰性であるプラーク形態に よって同定されることになる。発現プラスミドがβ−ガラクトシダーゼといった 標識遺伝子を含んでいる場合には、組換え型プラークは、アガロース平板培養培 地内の５−ブロモ−４−クロリル−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシ ド（Ｘ−ｇａｌ）といった色素産生基質から生成された青色によって表示される ことになる。マルチウェル皿の中での細胞の接種のために、採収したプラークを 使用する。標準的な活性又は免疫検定を用いて、組換え型ＰＮ−１の発現につい て、結果として得られた細胞リゼイト及び感染した細胞の上清を評価することが できる。陽性のウェルには、野生型の汚染のない純粋な組換え型ウイルス株を得 るため、さらなるプラーク精製の回数が必要とされる可能性がある。 ｃ．４．ＰＮ−１のバッチ産生 Ｓｆ９細胞は、ExCell(J.R．Scientific)といった無血清の低タンパク質培地 内で成長に対し適合させられる。穏やかに遠心分離することによって細胞を懸濁 培養から収集し、細胞１個あたり１つのウイルスプラーク形成単位の多数の感染 を用いて、１mlにつき１，０００万個の細胞の濃度でウイルス接種物を含む新鮮 培地の中で再懸濁させる。２時間後、培養を新鮮培地で５倍に希釈し、２〜３日 間インキュベートさせる。この時間の経過後、遠心分離により細胞をペレット化 し、調整培地を収穫する。ＰＮ−１を、標準的な手段によって、細胞を含まない 上清から精製する。 ＰＮ−１の変異体は、上述のものと同じ方法で作製し産生させることができる 。 ｃ．５．昆虫細胞由来のＰＮ−１の特徴づけ バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞内で産生されるＰＮ−１は、およそ ４２，０００Kdの分子量をもつグリコシル化されたタンパク質である。Ｎ末端ア ミノ酸配列は、成熟した哺乳動物の細胞のＰＮ−１のものと同一であり、このこ とはシグナル配列の適正な処理を表わしている。ヘパリンの速度増強効果を含め た、比活性とトロンビン及び会合速度論の関係は、真正ＰＮ−１からは識別でき ない。 実施例Ｄ 封入体又は可溶性形態中での大腸菌における組換え体ＰＮ−１変異体の産生 Ｄ．１． ＰＮ−１のクローニング ＰＮ−１のクローニング及び発現が記載されている（McGrogan，et al.,（198 8）Bio/Technology）。それぞれＮｄｅＩ及びＢｃｌＩ部位を生じる以下のオリ ゴヌクレオチド： ＰＮＰＣＲ−前進 5'TG.GAA.GGA.CAT.ATG.AAC.TGG.CAT.CTC ＰＮＰＣＲ−復帰 5'TCT.TTT.GTA.TAC.TGA.TCA.GGG.TTT.GT を用いてＣＨＯ発現ベクターからＰＣＲにより、ＰＮ−１に対する遺伝子を生成 した。その結果生じた断片をＮｄｅＩ及びBｃｌＩで切断して、ｐＧＥＭＥＸ− １ベクター（Promega）中にサブクローニングした。 ｐＧＥＭＥＸ大腸菌発現ベクターは３つのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを 含有する。Ｔ７プロモーターを遺伝子１０リーダー断片から上流に位置させた。 我々はｐＧＥＭＥＸから遺伝子１０領域を除去したが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラ ーゼ結合部位並びにＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩクローニング部位を保持した。これ を成し遂げるために、部分ＮｄｅＩ消化とその後のクレノウ充填及び再結紮によ り、ｐＧＥＭＥＸ中の３２５１のＮｄｅＩ部位を除去した。このプラスミドはｐ Ｔ７−ＮＫと呼ばれる。ｐＴ７−ＮＫをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断して、遺 伝子１０融合タンパク質領域を除去した。線状ベクターを単離し、ＰＣＲ生成Ｐ Ｎ−１線状断片と結紮し、上記のようにＮｄｅＩ及びＢｃｌＩで切断した。この プラスミドはｐＴ７ＰＮ−１と呼ばれる。ＰＮ−１に関する全コード領域をシー ケンシングすることにより、正確な配列を確証した。 ＰＣＲ及びそれぞれＮｄｅＩ及びＳａｌＩ部位を有する以下のオリゴ体： ＰＣＲＭＥＴ前進 5'GAT.ATA.CAT.ATG.TCC.CAC.TTC.AAT.CCT.CTG ＰＣＲＭＥＴ復帰 5'GGG.GGC.ACT.TGT.CGA.CCC.ACA.CCG.GAA を用いて原シグナル配列を除去した。これは、原信号に取って代わり得る６９０ 塩基対断片、並びに開始コドン（Ｍｅｔ）を有するＰＮ−１のアミノ末端の一部 及びＰＮ−１のアミノ末端を生成した。再びシーケンシングにより正確な配列を 確証した。その結果生じるタンパク質の発現は、封入体中で又は可溶性タンパク 質として細胞内で生じると予測される。 Ｄ．２． ＰＮ−１の突然変異誘発 プラスミドｐＴ７ＰＮ１は、一本鎖ＤＮＡの産生のためのｆｌ ｏｒｉを有す る。したがって、Kunkelの方法（Kunkel，T.A.(1988)：Nucleic Acids and Mole cular Biology(Eckstein，F.，Lillcy，D.M.J．Eds.)Vol.2，p.124，Springer-V erlag，Berlin and Heidelberg）による部位指向性突然変異誘発のための鋳型と して用いられるｓｓＤＮＡの産生のために、ｐＴ７ＰＮ１を大腸菌ＣＪ２３６株 中で形質転換した。 突然変異体生成のための一般的論拠は、４つの一般的方法に基づいている。 第一の方法では、Ｐ４〜Ｐ４’領域における単一アミノ酸置換は、部位指向性 突然変異誘発により生成される。概して、Ｐ１部位での置換は最も劇的な効果を 有する。しかし、活性部位領域内の他の残基での置換は、セリンプロテアーゼに よる速度定数に関連して変化を示す。 第二の方法では、他のセルピンの活性部位領域に見いだされる配列をＰＮ−１ 上にグラフトした。活性部位でどの位多くの配列を変化させて特異性及び反応速 度を変化させねばならないかを調べるためには、多数の組合せを作らねばならな い。Ｐ４〜Ｐ４’領域は最も重要であることが一般に判明しているが、しかしこ の領域外のアミノ酸残基はプロテアーゼ阻害に顕著な作用を及ぼし得た。 第三の方法では、特に良好な基質であることが分かっている配列を加えるか又 は用いてＰＮ−１の配列を置換する。これらの突然変異体を作る前には、これら の変化がＰＮ−１の阻害作用を害し、タンパク質分解の阻害剤から基質中にＰＮ −１を引き離すか否かは明らかではなかった。事実、サブチリシンに対する良好 な基質配列であるＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＰｈｅのＰＮ−１への取込みは、サ ブチリシンにより特によく切断される分子を生じる。しかし、このアプローチに 基づいた哺乳類セリンプロテアーゼの良好な阻害剤であるＰＮ−１変異体がここ に得られた。 第四の方法では、ファージ表示系を用いて最適阻害剤配列を生成し得る。ＰＮ −１は標的プロテアーゼと共有的相互作用を形成するため、親ＰＮ−１分子より 緊密に結合する突然変異体を選択していないことが重要である。むしろ、ファー ジ表示性変異体ＰＮ−１ライブラリーを短時間だけ固定標的プロテアーゼと相互 作用させてより迅速に標的プロテアーゼと結合するＰＮ−１変異体を選択する。 したがって、迅速結合変異体のみが選択される。これはファージ表示系の新規の 用途である。 以下のオリゴヌクレオチドを用いて、配列の最後に示したプロテアーゼに特異 的な突然変異体を生成した： Ｄ．３．大腸菌におけるプロテアーゼＮｃｘｉｎ変異体の発現及び精製 ＪＭ１０９（ＤＥ３）は、誘導ｌａｃプロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリ メラーゼをコードする遺伝子の染色体のコピーを含有する。ｐＴ７ＰＮ−１（又 はＰＮ−１の変異体）を含有するＪＭ１０９（ＤＥ３）を２ xＹＴ＋０．２％グ ルコース＋１００mg/ml カルベニシリン中で２８〜３２℃で一夜増殖させた。低 温及び高栄養含有溶液は、増殖性接種体を生成するのに役立つ。接種物を１：２ ５０〜１：５００に希釈して、振盪フラスコ中でＯＤ600−１に、又は２６〜３ ７℃で発酵器中で−５０に増殖させ、０．１〜１．０mMで４〜１６時間、ＩＰＴ Ｇで誘導した。遠心分離により細菌を収集し、１０mM ＴＲＩＳ，pH８，１mM ＥＤＴＡ中に再懸濁して、高圧均質化により壊砕した。遠心分離により封入体を 収集し、１M ＮａＣｌ、０．０５％トリエチルアミンで洗浄し、迅速希釈により ６Ｍグアニジン溶液からタンパク質を再生した。ＰＮ−１は、ＦａｓｔＳセファ ロース上で捕獲して精製し、０．６M ＮａＣｌで溶離して、０．２５M ＮａＣｌ に希釈し、ＦａｓｔＱセファロース上を通して、内毒素を除去し、ＦａｓｔＳセ ファロース上で再捕獲して０．６M ＮａＣｌ又は０．２５〜１M ＮａＣｌ勾配で 溶離した。 あるいは、ＰＮ−１は、発酵条件を調整することにより大腸菌内で可溶性形態 で生成し得る。この操作により、封入体物質の付随的損失に伴って発酵温度が３ ７℃から２６℃に低下した場合、可溶性ＰＮ−１の収量が増大する。これは、原 ＰＮ−１を大腸菌に付加した場合ＰＮ−１は殺菌性であるため、全く予期せぬ知 見である。可溶性ＰＮ−１を精製するために、遠心分離及び濾過により、あるい はポリエチレンイミン又はBiacryl TMのようなポリカチオンで処理したのちに遠 心分離及び濾過することにより、壊砕工程からの細胞上清を清澄化して、可溶性 タンパク質を上記のように精製した。可溶性物質の生成には多数の利点がある： 即ちタンパク質が正確に折り畳まれることがより確実で、再生工程がなく、バッ チからバッチへの再現性がより大きいことである。 ＰＮ−１の生産量は、細胞ペースト１ｇ当たり約５０mgであった。これは、１ ＯＤ600の細胞密度での生産量約５０mg/l又は発酵物１リットル当たり可溶性 ＰＮ−１が２．５ｇに相当する。これは、ＰＮ−１生産の技術状態において実質 的増進を示す。 Ｄ．４．ＰＮ−１変異体に関する活性検定 標準検定においてトロンビンを阻害する能力に関して再生又は可溶性タンパク 質を調べた。要するに、ＰＮ−１変異体の連続２倍希釈液を微小滴定プレートウ ェルに付加（５０μl／ウェル）し、その後３０μg／mlヘパリン溶液５０μl、 次いで５０μl中１ＮＩＨ単位のトロンビンを加えた。これらを２５℃で１５分 間インキュベートした。０．６２５mg/mlのＳ−２２３８（Kabi Pharmaceutical s）を５０μl加えて残留トロンビン活性を測定した。基質Ｓ−２４４４を用いて ウロキナーゼを、基質Ｓ−２３９０を用いてプラスミンを、基質Ｓ２２８８を用 いてｔＰＡを、基質Ｓ−２２２２又はＳ−２７６５を用いてＸａ因子を、基質Ｓ −２３０２を用いてカリクレインを、ｓ−ＡＡＰＶ−ｐｎａ（Sigma）を用いて ヒト好中球エラスターゼを、ｓ−ＡＡＰＦ−ｐｎａ（Sigma）を用いてカテプシ ンＧを阻害する能力に関して、同様の方法で、ヘパリンを加えて又は加えずに、 ＰＮ−１変異体を試験した。 等モル量の各タンパク質（上記のように滴定により確定）を組合せることによ り適切な阻害剤−プロテアーゼ組合せに関して、１秒から４時間までの種々の時 間（適宜）、二次速度会合定数を確定し、活性損失を追跡調査した。その結果生 じた曲線からｔ1/2を概算した。等式ｌｎ２／（ＰＮ−１）ｘ ｔ1/2に従ってｋ_assoc を概算した。あるいは、対数（標準化活性）対時間のプロットの勾配から 見かけの一次速度定数を確定した。見かけの一次速度定数を使用したＰＮ−１（ 又は変異体）濃度で割って、二次速度定数を算出した。 実施例Ｅ ＡＴＦ−ＰＮ１キメラの生成 このキメラを生成するために、我々は先ず、それぞれＮｄｅＩ及びＭｌｕＩ部 位を生成するオリゴヌクレオチド： ＡＴＦ．前進 5'GGT.GAT.CAT.ATG.AGC.AAT.GAA.CTT.CAT.CAA ＡＴＦ．復帰 5'TTT.AGG.ACG.CGT.CTG.CGC.CAT.CTG.CTC.AGT.CAT.G を用いてＰＣＲによりｕＰＡのアミノ末端断片をクローニングした。その結果生 じた断片をＮｄｅＩ及びＭｌｕＩで切断し、同一酵素で切断したｐＴ７ＰＮ１中 にサブクローニングして、シグナル配列を移動した。このプラスミドをｐＴ７Ａ ＴＦ−ＰＮ１と呼ぶ。Ｔ７染料プライマー系（ＡＢＩ）を用いて自動シーケンシ ングにより、正確な配列を立証した。 ウロキナーゼ受容体結合領域を保持する多少短めのＡＴＦ−ＰＮ１を生成する ために、以下のオリゴヌクレオチド： 5'CAC.TGT.GAA.ATA.GAT.A AC．GCG.TAA.ACC.TGC.TAT.GAG. を用いてコドン４８での部位指向の突然変異誘発によりＭｌｕＩ部位（下線）を 導入して、ＡＴＦ48−ＰＮ１を作った。その結果生じたプラスミドをＭｌｕＩで 切断して３００bpセグメントを除去し、結紮した。 ＡＴＦ−ＰＮ１の突然変異誘発 プラスミドｐＴ７ＡＴＦ−ＰＮ１は、一本鎖ＤＮＡの産生のためのｆｌ ｏｒ ｉを有する。したがって、Kunkelの方法（Kunkel，T.A.(1988)：Nucleic Acids and Molecular Biology(Eckstein，F.，Lillcy，D.M.J．Eds.)Vol.2，p.124，Sp ringer-Verlag，Berlin and Heidelberg）による部位指向の突然変異誘発のため の鋳型として用いられるｓｓＤＮＡの産生のために、ｐＴ７ＡＴＦ−ＰＮ１を大 腸菌ＣＪ２３６株中で形質転換した。さらに、標準分子生物学技法を用いて、ｐ Ｔ７ＡＴＦ−ＰＮ−１中に当該ＰＮ−１変異体をサブクローニングし得る。 ＡＴＦ−ＰＮ１の発現及び精製 その結果生じたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株中で形質転換し、 振盪フラスコ中でＯＤ600−１に、又は発酵器中で−５０に増殖させ、０．１〜 １．０mMで２６〜３７℃で４〜１６時間、ＩＰＴＧで誘導した。遠心分離により 細菌を収集し、１０mMＴＲＩＳ，pH８，１mMＥＤＴＡ中に再懸濁して、高圧均質 化により壊砕した。遠心分離により封入体を収集し、１M ＮａＣｌ、０．０５％ ＴＥＡで洗浄し、６Ｍグアニジン溶液からタンパク質を再生した。ＦａｓｔＳセ ファロース上で捕獲して精製し、０．６M ＮａＣｌで溶離して、０．２５M Ｎａ Ｃｌに希釈し、ＦａｓｔＱセファロース上を通して、内毒素を除去し、Ｆａｓｔ Ｓセファロース上で再捕獲して０．６M ＮａＣｌ又は０．２５〜１M ＮａＣｌ勾 配で溶離した。あるいは、遠心分離及び濾過により壊砕工程からの細胞上清を清 澄化して、可溶性タンパク質を上記のように精製した。 ＡＴＰ−ＰＮ１に関する活性検定 標準検定においてトロンビンを阻害する能力に関して再生又は可溶性タンパク 質を調べた。要するに、ＡＴＰ−ＰＮ１の連続２倍希釈液を微小滴定プレートウ エルに付加（５０μl／ウェル）し、その後３０μｇ／mlヘパリン溶液５０μl、 次いで５０μl中１ＮＩＨ単位のトロンビンを加えた。これらを２５℃で１５分 間インキュベートした。０．６２５mg/mlのＳ−２２３８（Kabi Pharmaceutical s）を５０μl加えて残留トロンビン活性を測定した。基質Ｓ−２４４４を用いて ウロキナーゼを、又は基質Ｓ−２３９０を用いてプラスミンを用いてカテプシン を阻害する能力に関して、同様の方法で、ヘパリンを加えずに、ＡＴＦ−ＰＮ１ を試験した。 ＥＬＩＳＡにより測定した場合の可溶性形態のウロキナーゼ受容体と結合する 能力、又はウロキナーゼと可溶性ウロキナーゼ受容体との結合を阻害する能力に 関して、再生又は可溶性タンパク質を試験した。さらにｕＰＡ受容体を発現する ＨＴ１０８０、Ｕ９３７又はＴＨＰ−１のような細胞と結合するｕＰＡ又はＤＦ Ｐ／ＰＭＦＳ処理ｕＰＡを阻害する能力に関して、ＡＴＦ−ＰＮ１を調べた。 実施例Ｆ システイン−ＰＥＧ化タンパク質の生成 Ｆ．１ マレイミド−ＰＥＧ試薬の調製 以下の： １）メトキシポリエチレンアミン（２０μmol）（分子量５，０００）１００m g ２）２０μmol γ−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ル（ＧＭＢＳ） ３）１００mMＣａｐｓ緩衝液，pH１０．０ ２ml を混合することにより、マレイミド−ＰＥＧを調製した。上記の成分（特に１） 及び２））の量及び指示容量は、変化し得る。例えば、メトキシポリエチレンア ミン対ＧＭＢＳの比の差が１０〜１００倍まで変わることは差し支えない。普通 は、ＧＭＢＳに対して約２倍余分の上記１）が好ましい。種々の緩衝液をＣａＰ ｓの代わりに用い得るが、Ｔｒｉｓ緩衝液は反応を抑制するので、この混合物中 にはＴｒｉｓ緩衝液は用いないことが重要である。使用する緩衝液のpHはかなり 変化し得るが、pH８．０の緩衝液よりpH１０．０の緩衝液のほうが好ましい。さ らに、上記の混合物は補助溶剤としてＤＭＳＯを５０％まで含有してもよい。反 応混合物がジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ−メルカプトエタノール（βＭ Ｅ）のような還元剤を含有しないことが特に重要である。 混合物を３７℃で３０分間インキュベートしたが、反応温度は４℃と低くても よく、反応時間は１時間まで又はそれ以上延長し得る。インキュベーション後、 １２mgのＴｒｉｓ遊離塩基又はエタノールアミンを混合物に加えて、ＮＨ3部分 を抑制した。この抑制工程は省いてもよい。 ２０mMＴｒｉｓ（pH７．４）、１００mMＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎで平 衡化させたＰＤ−１０カラム（Ｇ−２５）（BioRad）を通す溶離により、反応混 合物を精製する。溶離液を０．５ml分画中に収集し、５０％ＴＣＡで沈殿させる ことによりマレイミド−ＰＥＧ試薬の産生に関して検定した。次に、その結果生 じたマレイミド−ＰＥＧ（Ｍａｌ−ＰＥＧ）試薬を用いて、ＰＥＧをシステイン 残基（単数又は複数）に付着させることにより選定タンパク質を修飾する。 Ｆ．２ マレイミド−ＰＥＧとタンパク質との反応 タンパク質をマレイミドＰＥＧ試薬と反応させる前に、精製タンパク質を、Ｄ ＴＴ又はβＭＥを含有しない任意の適切な緩衝液中に約２００μｇ／ml〜１mg/m lの濃度に希釈した。通常、緩衝液は２０mMＰＩＰＥＳ，pH６．７５、０．６M ＮａＣｌ及び１％グリセロールで構成された。約１０μl〜４０μlの希釈タンパ ク質をＰＥＧ化反応に用いた。２０mMＴｒｉｓ（pH７．４）、０．１M ＮａＣｌ 及び０．０１％Ｔｗｅｅｎから成る緩衝液１０μl中に約１μlのマレイミド−Ｐ ＥＧを含有する溶液１０μlずつを移入することにより、Ｆ．１項に記載のマレ イミド−ＰＥＧ試薬を連続２倍希釈液中に希釈した。マレイミド−ＰＥＧ対タン パク質の比は、所望のタンパク質の好ましいレベルのＰＥＧ化によって変化し得 る。タンパク質に対して２０倍まで過剰量のマレイミド−ＰＥＧが試薬とタ ンパク質のシステイン残基との特異的反応を提供した。 タンパク質及びマレイミド−ＰＥＧを室温で１時間インキュベートしたが、こ の反応は４℃でより長い時間で実施してもよい。反応した混合物の試料を、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥにより分析して、完全カップリングに必要な最小量のマレイミド− ＰＥＧ試薬を確定し得る。 上記の反応を用いて、マレイミド−ＰＥＧ対タンパク質の適正比を確定し、次 いで商業的に許容可能な量のＰＥＧ化タンパク質を産生するまで評価決定し得る 。 Ｆ．３ （マレイミド）₂−ＰＥＧ試薬の調製 以下の： １）ポリエチレンビス（アミン） ２）２０μmol γ−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （ＧＭＢＳ） ３）１００mMＣａｐｓ緩衝液，pH０．０ ２ml を混合することにより、（マレイミド）₂−ＰＥＧを調製した。上記の成分（特 に１）及び２））の量及び指示容量は、変化し得る。例えば、１）対２）の比の 差が１０〜１００倍まで変わることは差し支えないが、上記１）に対して過剰の ＧＭＢＳが好ましく、通常は約２倍過剰である。種々の緩衝液をＣａＰｓの代わ りに用い得るが、Ｔｒｉｓ緩衝液は反応を抑制するので、この混合物中にはＴｒ ｉｓ緩衝液は用いないことが重要である。使用する緩衝液のpHはかなり変化し得 るが、pH８．０の緩衝液よりpH１０．０の緩衝液のほうが好ましい。さらに、上 記の混合物は補助溶剤としてＤＭＳＯを５０％まで含有してもよい。反応混合物 がジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ−メルカプトエタノール（βＭＥ）のよ うな還元剤を含有しないことが特に重要である。 混合物を３７℃で３０分間インキュベートしたが、反応温度は４℃と低くても よく、反応時間は１時間まで又はそれ以上延長し得る。インキュベーション後、 １２mgのＴｒｉｓ遊離塩基又はエタノールアミンを混合物に加えて、ＮＨ3部分 を抑制した。この抑制工程は省いてもよい。 ２０mMＴｒｉｓ（pH７．４）、１００mMＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎで平 衡化させたＰＤ−１０カラム（Ｇ−２５）（BioRad）を通して溶離して、反応混 合物を精製した。溶離液を０．５ml分画中に収集し、５０％ＴＣＡで沈殿させる ことにより（マレイミド）₂−ＰＥＧ試薬の産生を検定した。次に、その結果生 じた（マレイミド）₂−ＰＥＧ（Ｍａｌ−ＰＥＧ）試薬を用いて、ＰＥＧをシス テイン残基（単数又は複数）に付着させることにより選定タンパク質を修飾した 。 Ｆ．４ （マレイミド）₂−ＰＥＧとタンパク質との反応 タンパク質を（マレイミド）₂−ＰＥＧ試薬と反応させる前に、精製タンパク 質（例えば位置９９にシステインを含有するＰＮ−１突然変異体）を、ＤＴＴ又 はβＭＥを含有しない任意の適切な緩衝液中に約２００μg/ml〜１mg/mlの濃度 に希釈した。普通は、緩衝液は２０mMＰＩＰＥＳ，pH６．７５、０．６ＭＮａＣ ｌ及び１％グリセロールで構成された。約１０μl〜４０μlの希釈タンパク質を ＰＥＧ化反応に用いた。２０mMＴｒｉｓ（pH７．４）、０．１M ＮａＣｌ及び０ ．０１％Ｔｗｅｅｎから成る緩衝液１０μl中に約１μlの（マレイミド）₂−Ｐ ＥＧを含有する溶液１０μlずつを移入することにより、Ｆ．１項に記載の（マ レイミド）₂−ＰＥＧ試薬を連続２倍希釈液中に希釈した。マレイミド−ＰＥＧ 対タンパク質の比は、所望のタンパク質の好ましいレベルのＰＥＧ化によって変 化し得る。 タンパク質及び（マレイミド）₂−ＰＥＧを室温で１時間インキュベートした が、この反応は４℃でより長い時間で実施してもよい。反応した混合物の試料を 、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、完全カップリングに必要な最小量の（マレ イミド）２−ＰＥＧ試薬を確定し得る。 上記の反応を用いて、（マレイミド）₂−ＰＥＧ対タンパク質の適正比を確定 し、次いで商業的に許容可能な量のＰＥＧ化タンパク質を産生するまで評価決定 し得る。 実施例Ｇ システイン−ＰＥＧ化ＰＮ−１の変異体（IV型変異体）の生成 Ｇ．１：システインとの置換のためのＰＮ−１のアミノ酸残基Ｑ選定 ＰＮ−１αおよびＰＮ−１βは、第９９および１４０アミノ酸残基の位置にＮ −グリコシル化部位を有する。したがって、これらの部位を、これらの位置の一 方または双方のアスパラギンをシステインで置換する部位指向性変異誘発のため に選択した。 ＰＮ−１と相同なタンパク質中の対応する部位でのグリコシル化された残基の 存在に基づいて、ＰＮ−１の３部位をシステインとの置換のために選んだ。アミ ノ酸残基Ｄ１９２は、それぞれＰＮ−１と相同であるアンギオテンシンおよびRa ｂＯＲＦ１というタンパク質が、ＰＮ−１のこの残基に対応するアミノ酸でＮ− グリコシル化されていることから、システインとの置換に選んだ。アミノ酸残基 Ｅ２３０は、ＰＮ−１と相同であるヒヒのα₁−抗トリプシン（α₁−ＡＴ）が、 ＰＮ−１のこの残基に対応するアミノ酸でグリコシル化されていることから、シ ステインとの置換に選んだ。アミノ酸残基Ｈ２５２は、ＰＮ−１と相同なもう一 つのタンパク質であるα₂−抗プラスミン（α₂−ＡＰ）が、対応する残基でグリ コシル化されていることから、システインとの置換に選択した。 その他のアミノ酸残基は、Ｘ線結晶学によって決定された限りでのＰＮ−１の 三次元構造内でのアミノ酸の位置に基づいて（図３）、システインとの置換に選 んだ。システイン置換に選んだアミノ酸残基の近似的位置を、対応するそれらの アミノ酸残基番号で示す。本実施例での変異誘発のために同定された特定のアミ ノ酸残基は、アミノ酸の明らかな溶媒接近可能性、およびそのタンパク質中の他 のアミノ酸との明らかに少ない相互作用に基づいて選択した。 Ｇ．２：ＰＮ−１のシステインに対する部位指向性突然変異 Ｄ．２項に記載の部位指向性変異誘発を用いて、上記に選んだ突然変異をＰＮ −１αで発生させた。これらの実験にはＰＮ−１αを用いたが、ＰＮ−１βにお ける同じ突然変異は、これらのほとんど同一のタンパク質間でアミノ酸配列が同 一である領域に、すべての突然変異を導入したのと同じ効果を与えるようである 。略述すると、一本鎖ＤＮＡの生成のためのｆｌｏｒｉを有するプラスミドｐＴ ７ＰＮ１に、ＰＮ−１をコード化しているＤＮＡを挿入した。次いで、このプラ スミドを、Kunkelの方法［T.A．Kunkel（1988年）、Nucleic Acids and Molecul ar Biology（F．Eckstein、D.M.J．Lilley編）、第２巻124ページ、Springer Ve rlag社、ドイツ国ベルリンおよびハイデルベルグ］による部位指向性変異誘発の 鋳型として用いる一本鎖ＤＮＡを生成するために、大腸菌ＣＪ２３６株中で形質 転換した。 ＰＮ−１のコード化領域内で特定の突然変異を発生させるのに用いたオリゴヌ クレオチドは、下記のとおりである： 突然変異体は、未変性タンパク質中のアミノ酸残基に対する一文字コード、ＰＮ −１のアミノ酸配列内でのそのアミノ酸の位置番号、およびその部位で置換され たアミノ酸残基に対する一文字コードに従って命名される。例えば、突然変異体 Ｓ１Ｃは、１位のセリンがシステインで置換されたＰＮ−１タンパク質を生成す る。上記突然変異体のそれぞれについて、上の配列は野生型ＰＮ−１の配列を示 すが、下の配列は、突然変異体のコーディング配列に導入された突然変異を示す 。太字のヌクレオチドは、野生型に対して変化している。二重下線を施したコド ンは、システインのために新たに導入されたコドンである。突然変異させたＤＮ Ａ配列中の下線を施した配列は、突然変異体のヌクレオチド配列に導入されたか 、またはそれから削除された制限酵素部位を示す。これらの制限部位の導入また は 削除は、その部位のコード化されているアミノ酸配列を変化させないが、ＰＮ− １コーディング配列へのオリゴヌクレオチド配列の組込みのために、部位指向性 変異誘発に付されたＤＮＡを有するクローンをふるい分けする手段を提供する。 望みの突然変異の導入は、制限酵素分析によって確認した。 記載されたとおりの部位指向性変異誘発による第一の突然変異の導入によって 、多数のシステイン置換残基を有する突然変異体のＰＮ−１タンパク質を生成し た。制限酵素解析によって第一の突然変異の挿入を確認した後、異なるオリゴヌ クレオチドを用いて、ＤＮＡを二回目の部位指向性変異誘発に付した。例えば、 Ｎ９９Ｃオリゴヌクレオチドによる部位指向性変異誘発、およびコーディング配 列での新たに導入されたＨｐａＩ部位の存在の確認によって、二重突然変異体で あるＮ９９Ｃ；Ｎ１４０Ｃを生成した。次いで、Ｎ９９Ｃ突然変異体のＤＮＡを 、Ｎ１４０Ｃオリゴヌクレオチドによる二回目の部位指向性変異誘発に付した。 下記の表Ｇ．５Ａには、これらの手法、および上記のオリゴヌクレオチドを用い て生成した単一、二重および三重突然変異体を列挙している。 Ｄ．３項に記載したとおりに、突然変異体のＰＮ−１タンパク質をコード化し ているＤＮＡを発現させ、発現したタンパク質を精製した。Ｇ．３：ＰＮ−１およびＰＮ−１突然変異体とマレイミド−ＰＥＧ試薬との反応 上記のＰＮ−１およびＰＮ−１突然変異体を精製した後、Ｆ．２の全体プロト コルに従って、Ｐ．１に記載したマレイミド−ＰＥＧ試薬と各タンパク質とを反 応させた。例えば、下記のプロトコルを用いて、突然変異体Ｎ９９Ｃ；Ｎ１４０ Ｃをシステイン−ＰＥＧ化した。 精製したＮ９９Ｃ；Ｎ１４０Ｃタンパク質は、pH６．７５の２０ミリモルＰＩ ＰＥＳ、０．６モルＮａＣｌ、１％グリセリン中で約２００μg／mlの濃度に希 釈した。希釈したタンパク質約４０μl（０．２５ナノモル）をＰＥＧ化反応に 用いた。Ｆ．１項に記載したマレイミド−ＰＥＧ試薬を、pH７．４の２０ミリモ ルのトリス、０．１モルＮａＣｌおよび０．０１％Tweenで構成される１０μlの 体積の緩衝液へのマレイミド−ＰＥＧ約２μlから開始して、１０μlの移転を用 いる一連の２倍希釈で希釈した。この反応は、ＰＮ−１のシステイン部位の数の ＰＥＧ化に必要とされるより２倍過剰なマレイミド−ＰＥＧ試薬を含有した。 Ｎ９９Ｃ；Ｎ１４０Ｃタンパク質とマレイミド−ＰＥＧの混合物を、室温で１ 時間インキュベートした。反応した混合物のそれぞれの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによって分析した。このゲルの分析は、未修飾Ｎ９９Ｃ；Ｎ１４０ＣのＰＮ− １の相対分子量で移動する帯域は、タンパク質に対するマレイミド−ＰＥＧの比 率が増加するにつれて消滅することを明らかにした。したがって、試料中の未修 飾Ｎ９９Ｃ；Ｎ１４０ＣのＰＮ−１の量が、マレイミド−ＰＥＧの濃度の上昇と ともに消滅するにつれて、約５，０００MWの増大する間隔を有する分子量で移動 する独自の帯域が出現した。こうして、ＰＮ−１の変異体の反応は、Ｎ９９Ｃ； Ｎ１４０ＣのＰＮ−１の変異体で利用できるシステインの最大数である、ＰＮ− １の１分子あたり２ＰＥＧ単位まで増加する数のタンパク質１分子あたりのＰＥ Ｇ単位を有する、独自のシステイン−ＰＥＧ化タンパク質を生成した。 相対分子量が５，０００MWの間隔で増大するタンパク質を表す独自の帯域は、 システイン残基へのＰＥＧの結合に対するマレイミド−ＰＥＧ反応の特異性の証 拠である。この反応が、システイン以外の残基のＰＥＧ化を招いたのであれば、 タンパク質のスメアがゲル上に出現して、不定数のＰＥＧ部分を含むタンパク質 の存在を示したであろう。 Ｄ．４に記載した検定法を用いて、２：１というマレイミド−ＰＥＧ試薬対タ ンパク質の比率で反応させたシステイン−ＰＥＧ化タンパク質の試料を、活性に ついて試験した。この試料は、システイン−ＰＥＧ化タンパク質を主として含有 し、未修飾ＰＮ−１の少なくとも１００％の活性を保有した。このＰＥＧ化タン パク質の比活性は、反応混合物中に存在するマレイミド−ＰＥＧ試薬の量の増加 とともに上昇した（図４）。これらのデータは、活性の上昇は、ＰＥＧ修飾の増 大の際に見出されることが多く、それは、ＰＥＧ化ＰＮ−１の溶解度および／ま たは活性の上昇の結果として生じ得ることを示唆する。Ｇ．４：慣用の方法を用いたＰＥＧ化ＰＮ−１の突然変異体の生成（比較例） 上記で得られた結果を当技術に公知のＰＥＧ化法と比較するために、米国特許 第5,122,614号明細書中でZalipskyが記載したのと類似の方法を用い、活性化炭 酸エステルとしてZalipskyが用いたＰＥＧのＮ−スクシンイミド炭酸エステルを 、ＰＥＧのパラニトロフェノール炭酸エステルに置き換えて、Ｎ９９Ｃ；Ｎ１４ ０ ＣのＰＮ−１の変異体をＰＥＧ化した。用いたプロトコルは、それ以外は同一で ある。反応には、１：１〜１００：１の範囲の活性化ＰＥＧ対ＰＮ−１突然変異 体（Ｎ９９Ｃ；Ｎ１４０Ｃ）の比率を用いた。 ＰＥＧ化試薬の希釈物を含有する反応させた混合物のそれぞれの試料を、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによって分析した。このゲルの分析は、未修飾のＰＮ−１の変異体 の分子量で移動するタンパク質の量は、反応に用いたZalipskyのＰＥＧ試薬の濃 度の上昇とともに減少することを明らかにした。しかし、本発明の方法を用いて 形成された独自の帯域とは対照的に、未修飾タンパク質が消滅するにつれて、様 々な、増加する分子量のタンパク質のスメアが出現した。慣用の方法で生成され たＰＥＧ化タンパク質は、タンパク質１分子あたり様々な数のＰＥＧ部分を含ん でいて、ＰＥＧの付着が無秩序であり、また様々な位置に対していかなる数のリ ジン残基も修飾されたことを示唆する。 Ｄ．４に記載した検定法で、様々なレベルのＰＥＧ修飾を有する試料を、活性 について試験した。データは、マレイミド−ＰＥＧ／タンパク質の反応混合物中 に存在するマレイミド−ＰＥＧ試薬の量が増加するにつれて、タンパク質の比活 性が低下することを示す（図４）。このことは、慣用の方法を用いたＰＥＧ修飾 のレベルの上昇は、タンパク質の活性の低下を招くことを示唆する。Ｇ．５：システイン−ＰＥＧ化されたＰＮ−１およびＰＮ−１の突然変異体の活 性 形成された特定のＰＮ−１の突然変異体、およびシステイン−ＰＥＧ化された 突然変異体を表Ｇ．５Ａに示す。ＰＮ−１の部位指向性突然変異体タンパク質の それぞれとともに野生型ＰＮ−１も、Ｆ．２に記載したプロトコルを用いたシス テイン−ＰＥＧ化によって修飾した。Ｄ．４に記載した検定法を用いて、野生型 ＰＮ−１、ＰＮ−１の部位指向性突然変異体のそれぞれ、ならびにシステイン− ＰＥＧ化された野生型および突然変異体のタンパク質の活性を決定した。 ＰＮ−１についてここに記載した突然変異は、いかなるセルピン（serpin）に も導入でき、セルピンタンパク質族の成員間の相同性に起因して、実質的に類似 の効果が期待される。Ｇ．６：システイン−ＰＥＧ化されたＰＮ−１およびＰＮ−１の突然変異体の半 減期に関する試験 いかなるタンパク質の循環半減期も、当技術に周知の標準的方法を用いて測定 するできる。例えば、ＰＥＧで修飾した放射性タンパク質をマウス、ラットまた はウサギに注射する。様々な時間に血液を採取し、循環中に残留するタンパク質 の量を、シンチレーション計数法によって決定する。これに代えて、ＰＥＧで修 飾したＰＮ−１をマウス、ラットまたはウサギに注射する。様々な時間に血液を 採取し、ウロキナーゼ阻害活性を測定する。ある場合には、循環中に残留するタ ンパク質の量は、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるような抗体 反応を用いて測定できる。Ｇ．７：システイン−ＰＥＧ５ＰＮ−１の投与 上記のシステイン−ＰＥＧ化ＰＮ−１および／またはシステイン−ＰＥＧ化Ｐ Ｎ−１突然変異体は、ＰＮ−１が治療上役立つとして指示される各種の疾患状態 の治療に用いてよい。例えば、これらのタンパク質は、米国特許第5,196,196号 明細書に記載のとおり、傷口を手当てするための包帯に組み込んでよく、該特許 は、傷口の手当て材料にＰＮ−１を用いること（例えば、投与の量および経路） に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。これに代えて、システイン− ＰＥＧ化ＰＮ−１および／またはシステイン−ＰＥＧ化ＰＮ−１突然変異体を、 米国特許第5,206,017号および第5,326,562号明細書に記載のとおり、炎症および 関節炎の治療のための薬剤学的組成物に活性成分として組み込んでもよく、該特 許は、そのような状態の治療にＰＮ−１を用いること（例えば、投与の量および 経路）に関して、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる。 実施例Ｈ システイン−ＰＥＧ化エリトロポイエチン（ＥＰＯ）の生成 Ｈ．１：システイン置換のためのアミノ酸残基の選定 エリトロポイエチン（ＥＰＯ）のアミノ酸配列は下記のとおりである： このタンパク質の最初の２７アミノ酸（イタリック体で示す）は、ＥＰＯのシ グナル配列である。上記に太字で示し、かつ下線を施したアミノ酸残基（Ｎ２４ 、Ｎ３８およびＮ８３）は、未変性ＥＰＯタンパク質のＮ−グリコシル化の部位 である。そのため、これらの部位をシステイン残基との置換に選び、その後、Ｐ ＥＧ化によって修飾する。Ｈ．２：ＥＰＯの部位指向性変異誘発 成熟ＥＰＯタンパク質についてコード化している完全なヌクレオチド配列は、 当技術において公知であり、GenBankから入手可能である。Ｄ．２に記載のとお り、成熟ＥＰＯタンパク質をコード化しているＤＮＡをクローン化し、部位指向 性変異誘発に付す。システインとの残基Ｎ２４、Ｎ３８およびＮ８３の置換のた めのオリゴヌクレオチドは、下記のとおりである： 太字で示し、かつ下線を施した残基は、野生型ＥＰＯのＤＮＡ配列に対して異 なり、かつＥＰＯのアミノ酸配列に導入しようとするシステインのコドンを表す ヌクレオチドを示す。 Ｎ２４、Ｎ３８、Ｎ８３、またはこれらの部位の組合せ（例えば二重および三 重突然変異体）にシステイン残基を有する突然変異体ＥＰＯタンパク質を、当技 術に周知の手法を用いて、記載のとおり生成、発現、かつ精製する。Ｈ．３：システイン−ＰＥＧ化ＥＰＯ、およびシステイン−ＰＥＧ化ＥＰＯ突然 変異体の生成 Ｆ．２に記載したプロトコルを用いて、精製したＥＰＯの突然変異体であるＮ ２４Ｃ、Ｎ３８Ｃ、Ｎ８３Ｃ、およびこれらの突然変異の組合せを有する突然変 異体をシステイン−ＰＥＧ化に付す。反応させたタンパク質の試料をＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥで分析して、ＰＥＧ化の程度はもとより、完全にＰＥＧ化されたタンパク 質を生成するのに必要なマレイミド−ＰＥＧ試薬の最小量も決定する。 当技術に公知のプロトコルを用いて、システイン−ＰＥＧ化された野生型ＥＰ Ｏはもとより、システイン−ＰＥＧ化されたＥＰＯ突然変異体の活性も試験する 。 実施例Ｉ システイン−ＰＥＧ化ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の生成 Ｉ．１：システイン置換のためのアミノ酸残基の選定 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のヌクレオチド配列、アミノ酸配列および三次元 構造は、当技術に周知である［例えば、Cunningham およびWells（1989年）、S cience、第244巻1,081〜1,085ページを参照されたい］。その上、その受容体に 結合したｈＧＨの三次元構造も公知である［De Vosら（1992年）、Science、第2 55巻306〜312ページ］。システインとの置換のためのアミノ酸残基は、アミノ酸 残基の溶媒接近可能性、アミノ酸残基がそれと作用し合える他のアミノ酸残基に 近接していること、および受容体との結合に重要なことが公知であるｈＧＨの領 域からの残基の距離に基づいて選ぶ［Cunningham およびWells（1989年）、Sci ence、第244巻1,081〜1,085ページ］。Ｉ．２：ｈＧＨの部位指向性変異誘発 上記で選んだアミノ酸残基の場所にシステイン残基を導入するように、部位指 向性変異誘発のためのオリゴヌクレオチドを設計する。部位指向性変異誘発は、 Ｄ．２に記載のとおりに実施する。次いで、得られたｈＧＨのＤＮＡを発現ベク ターに挿入し、得られたタンパク質を大腸菌または他の適切な宿主で発現させる 。次いで、得られたｈＧＨ突然変異体のタンパク質を、当技術に公知の方法に従 って精製する。Ｉ．３：システイン−ＰＥＧ５ｈＧＨ化の生成 次いで、Ｆ．２に概説した方法を用いて、ｈＧＨの突然変異体タンパク質をシ ステイン−ＰＥＧ化に付す。マレイミド−ＰＥＧとｈＧＨの突然変異体タンパク 質とを反応させた混合物の試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、システイン− ＰＥＧ化の最適条件（例えば、望みのＰＥＧ化されたｈＧＨの突然変異体タンパ ク質を与えるのに必要なマレイミド−ＰＥＧ試薬の最小量）を決定する。 次いで、CunninghamおよびWells［前出］に記載のとおり、修飾されたタンパ ク質が、断端されたｈＧＨの精製された受容体に結合できる能力について検定す ることによって、システイン−ＰＥＧ化ｈＧＨタンパク質を活性について試験す る。 実施例Ｊ システイン−ＰＥＧ化架橋結合によるヘモグロビンの生成 ヘモグロビンは、２本の「ａ」鎖と２本の「ｂ」鎖とで構成される四量体タン パク質複合体である。ヘモグロビンの「ａ」および「ｂ」鎖はもとより、２「ａ 」および２「ｂ」鎖で構成されるヘモグロビンの四量体複合体のアミノ酸配列も 周知である。溶媒接近可能であり、かつ他の側鎖と最小限に接触している適切な アミノ酸残基を、システインに対する部位指向性変異誘発のために選ぶ。次いで 、「ａ」および「ｂ」鎖の突然変異体を発現させ、精製し、そして四量体を形成 させる。次いで、上記Ｆ．４に記載のとおり、この突然変異体四量体複合体を様 々なレベルの（マレイミド）₂−ＰＥＧ試薬と反応させる。この反応は、非常に 希薄なヘモグロビンレベルで実施して、最小数の分子間架橋結合で四量体形態の ヘモグロビンを安定化するための分子間架橋結合を形成することができる。これ に代えて、より高いヘモグロビン濃度で反応を実施して、ヘモグロビン分子の凝 集体を安定化するための、より高レベルの分子間架橋結合を招くこともできる。 本発明は、特定のプロテアーゼネキシン−１の変異体、およびそのようなもの を含む配合物を参照して説明してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱 することなしに、様々な変更を実施してよく、かつ等価のものに置き換えてよい ことが、当業者によって理解されなければならない。その上、本発明の特定の状 況、材料、補形薬、ＰＮ−１変異体、工程、目的に至る単数または複数の工程段 階、精神および範囲に適合させるように、多くの変更を施してよい。そのような 変更はすべて、これに付記された請求の範囲内にあるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 9/96 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ 9/99 9051−4Ｃ 37/54 ＡＤＵ 15/09 9051−4Ｃ 37/02 ＡＣＢ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，Ｂ Ｇ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロテアーゼネキシン−１の変異体であって、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ １’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’よりなる群から選ばれる位置のアミノ酸残基が、 その位置に天然に存在するアミノ酸残基とは異なる天然アミノ酸残基で置換され ている変異体。 ２．変異体が、プロテアーゼネキシン−１と比較して異なるプロテアーゼ特異性 を、および／または特定のプロテアーゼについてプロテアーゼネキシン−１と比 較して上昇した率の会合定数を有する、請求の範囲１記載のプロテアーゼネキシ ン−１の変異体。 ３．プロテアーゼネキシン−１の変異体であって、プロテアーゼネキシン−１の 活性部位アミノ酸残基が、プロテアーゼネキシン−１以外のセリンプロテアーゼ 阻害剤の同数の活性部位アミノ酸残基で置換されている変異体。 ４．セリンプロテアーゼ阻害剤が、抗トロンビンIII、ヘパリン補因子II、α− １抗トリプシン、α−１プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害 剤Ｉ、IIおよびIII、α−２抗プラスミン、カリクレイン結合タンパク質ならび にＣ１阻害剤よりなる群から選ばれる、請求の範囲３記載の変異体。 ５．プロテアーゼネキシン−１の活性部位のＰ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、 Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’位のアミノ酸残基が、下記： よりなる群から選ばれるアミノ酸配列で置換されている請求の範囲３記載の変異 体。 ６．プロテアーゼネキシン−１の変異体であって、プロテアーゼネキシン−１の 活性部位の３個またはそれ以上のアミノ酸残基が、与えられたプロテアーゼに特 異的な基質配列を含む異なるアミノ酸残基で置換されている変異体。 ７．与えられたプロテアーゼが、エラスターゼ、カテプシンＧ、Ｃ１エステラー ゼ、トロンビン、カリクレイン、およびXa因子、IXa因子、XIa因子、XIIa因子、 VIIIa因子、Ｖ’因子、活性化プロテインＣ、トリプシン、キモトリプシンより なる群から選ばれる請求の範囲６記載の変異体。 ８．少なくとも１個がシステインである３個もしくはそれ以上のアミノ酸を含む タンパク質またはその一部であって、ポリエチレングリコールが該システインの チオ基に共有結合しているタンパク質またはその一部。 ９．少なくとも１システイン残基を有する天然に存在するタンパク質のアミノ酸 配列を含む修飾されたタンパク質であって、該修飾が、ポリエチレングリコール と該タンパク質のシステイン残基とを結合させることを含む修飾されたタンパク 質。 １０．ポリエチレングリコールとタンパク質とを結合させる方法であって、 所望のタンパク質を同定し、ポリエチレングリコールとタンパク質とを結合さ せる部位を決定する段階と、 ポリエチレングリコールを該タンパク質のシステイン残基のチオ基に共有結合 させ、ポリエチレングリコールと該タンパク質とを該部位で結合させる段階と、 を含む方法。 １１．システイン残基がタンパク質中に天然の状態で存在する請求の範囲１０記 載の方法。 １２．通常は存在しないシステイン残基を含むようにタンパク質を変化させ、該 追加したシステイン残基にポリエチレングリコールを共有結合させる請求の範囲 １０記載の方法。 １３．ポリエチレングリコールを結合させる部位が、タンパク質の溶媒接近可能 領域内にある請求の範囲１２記載の方法。 １４．グリコシル化される部位でシステイン残基を有するようにタンパク質を変 化させる請求の範囲１２記載の方法。 １５．多数のシステイン残基を有するようにタンパク質を変化させる請求の範囲 １２記載の方法。 １６．ポリエチレングリコールが少なくとも２個のタンパク質反応性部分を含む 請求の範囲１０記載の方法。 １７．ポリエチレングリコールが２００〜１０，０００の分子量である請求の範 囲１０記載の方法。 １８．所望のタンパク質がプロテアーゼネキシン−１である請求の範囲１０記載 の方法。 １９．所望のタンパク質がプロテアーゼネキシン−１の変異体であって、該変異 体は、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’よりなる 群から選ばれる位置のアミノ酸残基が、その位置に天然に存在するアミノ酸残基 とは異なる天然アミノ酸残基で置換されている請求の範囲１０記載の方法。 ２０．所望のタンパク質が、プロテアーゼネキシン−１の活性部位の少なくとも １アミノ酸残基がプロテアーゼネキシン−１以外のセリンプロテアーゼ阻害剤の 同数の活性部位アミノ酸残基で置換されている、プロテアーゼネキシン−１の変 異体である請求の範囲１０記載の方法。 ２１．所望のタンパク質が、プロテアーゼネキシン−１の活性部位の３個または それ以上のアミノ酸残基が、与えられたプロテアーゼに特異的な基質配列を含む 異なるアミノ酸残基で置換されている、プロテアーゼネキシン−１の変異体であ る、請求の範囲１０記載の方法。 ２２．少なくとも１システイン残基を有する天然に存在するプロテアーゼネキシ ン−１タンパク質のアミノ酸配列を含む、修飾されたプロテアーゼネキシン−１ であるタンパク質であって、該修飾が、ポリエチレングリコールと該タンパク質 のシステイン残基とを結合させることを含む修飾されたタンパク質。 ２３．プロテアーゼネキシン−１のアミノ酸配列を含む、プロテアーゼネキシン −１の修飾された変異体であって、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、 Ｐ３’およびＰ４’よりなる群から選ばれる位置のアミノ酸残基が、その位置に 天然に存在するアミノ酸残基とは異なる天然アミノ酸残基で置換されていて、か つ該配列は少なくとも１システイン残基を有し、該修飾が、ポリエチレングリコ ールと該タンパク質のシステイン残基とを結合させることを含む修飾された変異 体。 ２４．変異体が、プロテアーゼネキシン−１と比較して異なるプロテアーゼ特異 性を、および／または特定のプロテアーゼについてプロテアーゼネキシン−１と 比較して上昇した率の会合定数を有する、請求の範囲２３記載のプロテアーゼネ キシン−１の修飾された変異体タンパク質。 ２５．プロテアーゼネキシン−１の修飾された変異体であって、プロテアーゼネ キシン−１の活性部位のアミノ酸残基がプロテアーゼネキシン−１以外のセリン プロテアーゼ阻害剤の同数の活性部位アミノ酸残基で置換されていて、かつ該変 異体タンパク質のアミノ酸配列は少なくとも１システイン残基を有し、該修飾が 、ポリエチレングリコールと該タンパク質のシステイン残基とを結合させること を含む修飾された変異体。 ２６．セリンプロテアーゼ阻害剤が、抗トロンビンIII、ヘパリン補因子II、α −１プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤Ｉ、IIおよびIII 、 α−２抗プラスミン、カリクレイン結合タンパク質ならびにＣ１阻害剤よりなる 群から選ばれる請求の範囲２５記載の修飾された変異体。 ２７．プロテアーゼネキシン−１の活性部位のＰ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’ 、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’位のアミノ酸残基が、下記： よりなる群から選ばれるアミノ酸配列で置換されていて、かつ変異体タンパク質 は少なくとも１システイン残基を有し、該修飾が、ポリエチレングリコールと該 タンパク質のシステイン残基とを結合させることを含む請求の範囲２５記載の修 飾された変異体。 ２８．プロテアーゼネキシン−１の修飾された変異体であって、プロテアーゼネ キシン−１の活性部位の３個またはそれ以上のアミノ酸残基が、与えられたプロ テアーゼに特異的な基質配列を含む異なるアミノ酸残基で置換されていて、かつ 該変異体タンパク質のアミノ酸配列は少なくとも１システイン残基を有し、該修 飾が、ポリエチレングリコールと該タンパク質のシステイン残基とを結合させる ことを含む修飾された変異体。 ２９．与えられたプロテアーゼが、エラスターゼ、カテプシンＧ、Ｃ１エステラ ーゼ、トロンビン、カリクレイン、およびXa因子、IXa因子、XIa因子、XXIa因子 、VIIIa因子、Ｖ’因子、活性化プロテインＣ、トリプシンおよびキモトリプシ ンよりなる群から選ばれる請求の範囲２８記載のプロテアーゼネキシン−１の修 飾された変異体。 ３０．下記の一般構造式： Ｒ₁−Ｓ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｒ₂ ［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、それぞれ独立に、アミノ酸配列であり、Ｓは、それぞ れ、Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれのシステイン残基のチオ基であり、ＰＥＧはポリエ チレングリコールである］ を有する化合物。 ３１．Ｒ₁およびＲ₂が、それぞれ独立に、約６〜約１，０００個のアミノ酸を含 む請求の範囲３０記載の化合物。 ３２．ポリエチレングリコールが２００〜１０，０００の分子量である請求の範 囲３０記載の化合物。 ３３．Ｒ₁およびＲ₂が同一である請求の範囲３０記載の化合物。 ３４．Ｒ₁がヘモグロビンａ鎖であり、Ｒ₂がヘモグロビンｂ鎖である請求の範囲 ３０記載の化合物。 ３５．下記の一般構造式： Ｒ₁−（Ｓ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｒ₂）_n ［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、それぞれ独立に、アミノ酸配列であり、Ｓは、Ｒ₁お よびＲ₂のそれぞれのシステイン残基のチオ基であり、ＰＥＧはポリエチレング リコールである］ を有する化合物。 ３６．ポリエチレングリコールが２００〜１０，０００の分子量である請求の範 囲３５記載の化合物。 ３７．Ｒ₁およびＲ₂が同一である請求の範囲３５記載の化合物。 ３８．Ｒ₁がヘモグロビンａ鎖であり、Ｒ₂がヘモグロビンｂ鎖である請求の範囲 ３７記載の化合物。 ３９．請求の範囲１記載のプロテアーゼネキシン−１の変異体をコードしている ＤＮＡ配列。 ４０．請求の範囲２記載のプロテアーゼネキシン−１の変異体をコードしている ＤＮＡ配列。 ４１．請求の範囲４記載のプロテアーゼネキシン−１の変異体をコードしている ＤＮＡ配列。 ４２．請求の範囲５記載のプロテアーゼネキシン−１の変異体をコードしている ＤＮＡ配列。 ４３．請求の範囲８記載のキメラプロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列。 ４４．薬剤学上許容され得る担体と、請求の範囲１記載のプロテアーゼネキシン −１の変異体とを含む薬剤学的組成物。 ４５．薬剤学上許容され得る担体と、請求の範囲２記載のプロテアーゼネキシン −１の変異体とを含む薬剤学的組成物。 ４６．薬剤学上許容され得る担体と、請求の範囲４記載のプロテアーゼネキシン −１の変異体とを含む薬剤学的組成物。 ４７．薬剤学上許容され得る担体と、請求の範囲５記載のプロテアーゼネキシン −１の変異体とを含む薬剤学的組成物。 ４８．変異体タンパク質を製造する方法であって、 第一の天然に存在するタンパク質の受容体結合領域のアミノ酸をコードしてい るＤＮＡを、該第一のタンパク質とは異なる第二のタンパク質またはその生体活 性部分のアミノ酸をコードしているＤＮＡに接続する段階と； 該ＤＮＡを適切な宿主中で発現させる段階と； を含む方法。 ４９．第二のタンパク質が、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’ 、Ｐ４’よりなる群から選ばれる位置のアミノ酸残基が、その位置に天然に存在 するアミノ酸残基とは異なる天然アミノ酸残基で置換されているＰＮ−１の変異 体である、請求の範囲４８記載の変異体。 ５０．受容体結合領域が、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、IX因子、Ｘ因子、プロテイン Ｃ、表皮増殖因子およびＥＧＰ様ドメインよりなる群から選ばれる第一のタンパ ク質に由来する、請求の範囲４８記載の方法。 ５１．受容体結合領域がウロキナーゼのアミノ末端断片である、請求の範囲５０ 記載の方法。 ５２．受容体結合領域が、ウロキナーゼの第１〜１３５番または第１〜８７番ア ミノ酸を含むアミノ末端断片である請求の範囲５１記載の方法。 ５３．薬剤学上許容され得る担体、および請求の範囲８記載のタンパク質または その一部を含む薬剤学的組成物。