KR20110033242A - 면역원성이 감소된, 인자 ⅷ 뮤테인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N-연결된 당화가 감소되고, 면역원성이 감소된 것인, 변형된 인자 Ⅷ 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예를 들면, 혈우병을 앓는 환자를 치료하기 위해 변형된 인자 Ⅷ 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역원성이 감소된, 인자 Ⅷ 뮤테인{FACTOR Ⅷ MUTEINS WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}

본 출원은 2008년 6월 25일 출원된 미국 가출원 일련 번호 제61/075,494호 (상기 문헌의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 이점을 주장한다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 일반적으로 특정의 캡핑되지 않은 N-연결된 당화 부위에 돌연변이를 갖는, 돌연변이화된 인자 Ⅷ 분자 (인자 Ⅷ 뮤테인)에 관한 것이다. 이러한 뮤테인은 항원 제시 수지상 세포에 의해 이루어지는 흡수가 감소한 것으로 나타나고, 치료학적으로 사용될 때에는 감소된 면역원성을 나타낸다.

천연 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 방법을 통해 합성된 인간 치료제 단백질 (생물학적 물질)을 인간 환자에게 투여하게 되면, 이는 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 면역 반응은 최소한 피부 가려움증에서부터 치료학적 약물의 효능을 감소시키는 것까지 광범위하게 영향을 미칠 수 있고, 몇몇 경우에는 중증의 기관 기능 상실을 유발하거나 사망에 이르게 할 수 있다.

재조합 인자 Ⅷ (rFⅧ)으로 치료받는 환자 중 대략 30%는 면역 반응을 나타낸다. 이들 환자 중 약 ⅓은 인자 Ⅷ (FⅧ)에 대한 중화 항체 (nAb)를 제시하는데, 이들 항체는 FⅧ 요법의 효능을 방해할 수 있다 (문헌 [Ehrenforth, et al., Lancet 339:594-598, 1992]; [Gringeri, et al., Blood 102:2358-2363, 2003]). 상기 환자 군집에서 FⅧ을 고-투여량으로 투여하면 nAb의 효과를 감소시킬 수 있지만, 이는 고-투여량의 치료 요법과 관련된 순응도에 대한 부담과 비용면에서 있어서 바람직하지 못하다.

면역을 유도하는 항원 제시 세포 (APC)의 주요 유형은 수지상 세포 (DC)이다. DC는 다른 여러 유형의 세포-표면 수용체를 통해 단백질을 세포내이입시킬 수 있다. 세포내이입을 통해 단백질은 펩티드로 프로세싱되고, 개개의 펩티드들은 MHC 부류 II (MHCII) 단백질 상에 적재되고, 펩티드 MHCII 복합체가 세포 표면 상에 제시되게 된다 (문헌 [Trombetta, et al., Annu Rev Immunol 23:975-1028, 2005]). T 헬퍼 세포가 이들 펩티드를 인식하게 되면 하류 이벤트가 유도되고, 이를 통해 면역원성 및/또는 면역독성이 일어날 수 있다.

만노스 특이 수용체인 CD206이 APC에 의한 FⅧ의 흡수에서 중요한 역할을 한다고 최근 보고를 통해 제안되었다. FⅧ과 CD206 사이의 상호작용을 통해 FⅧ/CD206 복합체의 세포내이입이 이루어지고, rFⅧ 단백질이 펩티드로 분해된 후, MHC 부류 II 단백질이 APC 표면 상에 제시된다 (문헌 [Dasgupta, et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:8965-8970, 2007]). CD206은 다양한 친화도로 다수의 상이한 당질 구조체 (만노스, 푸코스, 및 N-아세틸글루코사민)를 인식하는 것으로 나타났다 (문헌 [Lee, et al., Science 295:1898-1901, 2002]). 그러나, 만노스 수용체 패밀리의 구성원들 중 CD206은 만노스에 대하여 가장 큰 친화도를 갖는 것으로 보인다. FⅧ은 캡핑된 당화 부위 (시알화에 의해 캡핑된 것), 및 캡핑되지 않은 당화 부위 (시알화되지 않는 것), 2가지 모두를 포함하는 것으로 나타났다 (문헌 [Kaufman, et al., J Biol Chem 263:6352-6362, 1988]; [Medzihradszky, et al., Anal Chem 69:3986-3994, 1997]). 캡핑되지 않은 부위는 만노스 잔기로 끝이 나는 바, 이에 상기 부위는 종종 만노스-종결 당화 부위로 명명되기도 한다. FⅧ 상의 캡핑되지 않은 부위가 만노스 잔기로 종결되기 때문에 이들은 CD206에 대한 인식 부위로서 작용할 수 있다.

캡핑된 당화, 또는 캡핑되지 않은 당화에 대한 잠재적인 부위는 FⅧ 분자 상의 N-연결된 당화 부위에 존재한다. N-연결된 당화는 아미노산 서열 모티프 N-X-S/T (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다) 내의 아스파라긴 잔기 상에서 일어난다. 성숙한 전장의 FⅧ은 24개의 추정의 N-연결된 당화 부위를 포함한다.

인간 FⅧ은 구조 도메인 A1-A2-B-A3-C1-C2를 포함한다 (문헌 [Thompson, Semin Hematol 29:11-22, 2003]). B 도메인이 결실된 FⅧ (BDD) 또한 혈우병 A에 대한 대체 요법으로서 효과가 있는 바, FⅧ 중 B 도메인은 비필수적이다.

B 도메인 내에는 19개의 추정의 N-연결된 당화 부위가 존재하는 바, 전체 B 도메인을 제거하면, BDD FⅧ (BDD) 중 아미노산 위치 41번, 239번, 582번, 1810번, 및 2118번의 5개의 잔류 N-연결된 당화 부위가 남게 된다. 보통은 아미노산 위치 239번, 1810번, 및 2118번의 N-연결된 당화 부위가 아미노산 위치 41번 및 582번보다 더 높은 수준의 N-연결된 당화를 나타낸다.

당화 패턴이 변경된 재조합 단백질의 생산은, 재조합 배양물로부터의 생산 수율에 있어서 잠재적인 하락 및/또는 재조합 단백질의 활성의 감소를 비롯한 몇가지 변화를 나타낸다.

당업계에서는 FⅧ 면역원성 문제를 인식하게 되었고, 그의 치료학적 효능을 개선시키고자 하는 목적을 가지고 FⅧ의 면역원성을 감소시키기 위한 다수의 접근법이 제안되었다.

FⅧ의 면역원성은 FⅧ을 알코올성 중합체, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜에 접합 (PEG화)시키면 감소될 수 있다 (미국 특허 번호 제4,970,300호). 미국 특허 번호 제7,351,688호에는 치료제 단백질, 예로서, FⅧ을 결합체, 예로서, 인지질과 복합화시키는 것이 개시되어 있다. 인간 FⅧ 분자 중 특정의 면역원성 부분이 돼지 FⅧ 서열로 대체된 것인, 인간/동물 FⅧ 하이브리드 분자는 인간에서 인간 FⅧ보다 더 작은 면역원성을 갖는 것으로 기술되었다 (예로서, 미국 특허 번호 제5,364,771호; 제6,180,371호; 제6,458,563호; 및 제7,012,132호 참조). FⅧ의 면역원성은 항-FⅧ 항체와 반응하는 것으로 알려져 있는 FⅧ 에피토프 내로 N-연결된 당화에 대한 추가 부위를 도입하면 감소될 수 있다 (미국 특허 번호 제6,759,216호).

제안된 또다른 전략법은, 항-FⅧ 항체와 결합하는 FⅧ 분자 중의 영역 내로 돌연변이를 도입함으로써 FⅧ의 면역원성을 감소시키는 것이다 (예로서, 미국 특허 번호 제7,211,559호; 제7,122,634호; 제7,033,791호; 제6,770,744호; 및 제6,376,463호).

FⅧ 뮤테인은, 위치 239번, 1810번, 1812번, 및 2118번을 비롯한, FⅧ 분자 중의 수개의 아미노산 위치에 시스테인 잔기를 도입하는 돌연변이를 포함하는데, 여기서 도입된 시스테인 잔기는 FⅧ 뮤테인의 PEG화에 대한 부위를 제공한다 (미국 특허 출원 공개 번호 20060115876 A1).

따라서, 치료제 단백질, 예로서, 항원 제시 수지상 세포에 의해 이루어지는 흡수가 감소한 것으로 나타나고, 감소된 면역원성을 나타내는 FⅧ이 예를 들면, 혈우병과 같이 FⅧ 요법을 필요로 하는 환자에 대하여 유용한 치료법을 제공할 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은 FⅧ 분자의 아미노산 위치 41-43번, 239-241번, 582-584번, 1810-1812번, 및 2118-2120번에 존재하는 하나 이상의 천연적으로 발생된 캡핑되지 않은, N-연결된 당화 서열 모티프 내에 돌연변이를 포함하는 재조합 FⅧ 분자를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 위치 41번, 239번, 1810번, 1812번, 또는 2118번에 시스테인 잔기를 도입하지 않는 것이다. 이들 돌연변이는, rFⅧ 분자가 당화 수행능이 있는 숙주 세포에서 발현될 때, 돌연변이화된 부위가 당화되지 못하게 한다. 하나의 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 위치 239-241번, 1810-1812번, 및 2118-2120번 중 하나 이상에 존재한다.

또다른 실시태양에서, FⅧ 분자는 B 도메인이 결실된 FⅧ 뮤테인 (BDD 뮤테인)이다. 캡핑되지 않은 N-연결된 당화 부위에 치환을 포함하는 BDD 뮤테인은 상대적으로 높은 수준으로 재조합적으로 발현되는 것으로 밝혀졌으며, BDD 뮤테인은 돌연변이화되지 않은 BDD와 유사하거나, 그에 비하여 증가된 수준으로 활성을 나타낸다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 rFⅧ 분자를 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는, 당화 수행능이 있는 숙주 세포를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 당화 수행능이 있는 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 FⅧ 분자, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 당업계에서 통상적인 것과 같이, 상기 조성물은 보관을 위해 동결건조될 수 있고, 투여를 위해 액체로 재구성될 수 있다.

추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 FⅧ 요법을 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의, 본 발명의 재조합 FⅧ 분자를 투여하는 단계를 포함하는, FⅧ 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.

도 1은 시험관내에서 수지상 세포 (DC)에 의한 전장의 rFⅧ 및 탈당화된 전장의 rFⅧ (탈당화된 FⅧ)의 흡수를 입증하는 것이다. 탈당화시키기 전에, FACS 분석에 의해 검출하기 위해 rFⅧ을 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지하였다. rFⅧ을 60분 동안 엔도-F1을 사용하여 탈당화시키고, 30분 동안 DC와 함께 공배양한 후, 세척하였다. 이어서, DC에 의한 FⅧ 및 탈당화된 FⅧ의 흡수를 FACS에 의해 분석하였다. 탈당화된 FⅧ의 흡수를 FⅧ의 흡수에 대한 상대적인 값으로 나타내었는데, 여기서 FⅧ의 흡수를 100%로 두었다. 탈당화된 FⅧ과 FⅧ을 비교하는 비대응 스튜던트 T-검정법(unpaired Student's T-test)을 실시하였다; ^** FⅧ에 대한 p < 0.01.
도 2는 B 도메인이 결실된 FⅧ (BDD), 및 3개의 BDD 뮤테인 (N239Q, N2118Q, N239Q/N2118Q)의 활성 (2a) 및 농도 (2b)를 나타낸다. 사용된 명명법은 표시된 위치에서 아미노산 치환이 이루어졌음을 나타내는 것으로, 예를 들면, N239Q는 상기 분자 중 아미노산 위치 239번의 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 것을 나타낸다. N239Q, N2118Q, 및 N239Q/N2118Q를 코딩하는 BDD 뮤턴트 작제물로 HKB11 세포를 따로따로 형질감염시켰다. 단백질 발현 후, 조절된 배지를 발색성 분석법에 의해서는 활성에 관해 분석하고 (2a), 농도는 형질감염 후 96시간이 경과하였을 때 ELISA에 의해서 분석하였다 (2b).
도 3은 수지상 세포 (DC)에 의한 전장의 rFⅧ, B 도메인이 결실된 FⅧ (BDD), 및 N-당화 부위 BDD 단일 (N2118Q), 및 이중-뮤테인 (N239Q/N2118Q)의 흡수를 보여준다. DC를 4℃ (4C) 및 37℃ (37C)에서 30분 동안 FⅧ, BDD, BDDN2118Q, 또는 BDD N239Q/N2118Q와 함께 공배양하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 세포 추출물 중 FⅧ, BDD, BDD N2118Q, 및 BDD N239Q/N2118Q의 농도 (pM)를 ELISA에 의해 측정하였다. N2118Q 및 N239Q/N2118Q와, FⅧ 및 BDD를 비교하는 비대응 스튜던트 T-검정법을 실시하였다; ^** FⅧ 및 BDD, 2가지 모두에 대한 p < 0.01.
도 4는 N2118Q에 대해서 FⅧ-특이 T-세포 클론 BO1-4에 의해 이루어지는 감소된 IFNγ (4a) 및 증식 (4b) 반응을 보여준다. 간략하면, FⅧ, BDD, 또는 N2118Q를 24시간 동안 DC와 함께 인큐베이션시킨 후, FⅧ-특이 T-세포 클론과 함께 공배양하였다. 24시간 후에 ELISA에 의해 IFNγ 반응을 측정하였다. 6일 후에 3H-티미딘 혼입을 조사함으로써 증식 반응을 측정하였다. N2118Q와, FⅧ 및 BDD를 비교하는 비대응 스튜던트 T-검정법을 실시하였다; ^** FⅧ 및 BDD, 2가지 모두에 대한 p < 0.01.

본 발명은 기술된 특정의 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 작제물, 및 시약으로 한정되는 것이 아니며, 상기의 것은 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 기술하기 위한 것이며, 첨부되는 특허청구범위에 의해서만 한정이 되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

본원 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나"("a," "an") 및 "그"("the")라는 것은 문맥을 통해 명확하게 달리 명시되지 않는 한, 복수의 개념을 언급한다는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 아미노산"을 언급하였다면, 이는 하나 이상의 아미노산을 언급하는 것이며, 당업자가 알고 있는, 상기의 등가물 등도 포함하는 것이다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법, 장치, 및 물질이 본 발명을 실시 또는 시험함에 있어 사용될 수는 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 물질을 이제 기술하고자 한다.

본원에서 언급한 모든 공개 문헌 및 특허는 본원에서 기술하는 발명과 관련하여 사용될 수 있는 것으로서, 공개 문헌에서 기술하고 있는 작제물 및 방법론과 같은 것을 기술 및 개시하고자 하는 목적으로 본원에서 참고로 인용된다. 상기 및 본원 전문에서 논의되는 공개 문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전의 상기 개시 내용만을 제공한다. 본원에서 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 상기 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 승인하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.

정의

편의상, 본 명세서, 실시예, 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 특정 용어 및 어구의 의미를 하기에서 제공한다.

인자 Ⅷ (FⅧ)은 간에 의해 합성되고, 혈류로 방출되는 당단백질이다. 트롬빈에 의해서 활성화되면, 복합체로부터 해리되어 응고 캐스캐이드 중의 다른 응고 인자와 상호작용을 하고, 결국에는 혈전을 형성시킨다. 대립유전자 변이체도 가능하지만, 인간의 전장의 FⅧ은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다. 본 정의는 천연 형태의 FⅧ 뿐만 아니라, 재조합 형태의 FⅧ도 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 출원의 폴리펩티드를 언급할 때, "뮤테인" 및 "변이체"라는 용어는 생물학적 작용 또는 활성을 보유하는, 본 폴리펩티드의 뮤테인 및 변이체를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, B 도메인이 결실된 FⅧ (BDD)은 FⅧ의 B 도메인 중 14개의 아미노산을 제외한 전부가 결실된 것을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다. B 도메인의 처음 4개의 아미노산 (SFSQ, 서열번호: 2)이 B 도메인의 마지막 10개의 잔기에 연결되어 있다 (NPPVLKRHQR, 서열 번호: 3) (문헌 [Lind, et al, Eur. J. Biochem. 232:19-27, 1995]). 본원에서 사용되는 BDD는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는다. BDD 폴리펩티드의 일례는 미국 특허 출원 공개 번호 20060115876 A1 (본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

본원에서 FⅧ 분자를 기술하기 위해 사용되는 "돌연변이"란, 코딩된 뮤테인 중 적어도 하나의 아미노산이 차이가 나게 하고, 당화 모티프를 제거하여 돌연변이화된 분자 중 상기 모티프에서 N-연결된 당화가 일어나지 못하게 하는, N-연결된 당화 서열 모티프를 코딩하는 핵산에서의 적어도 하나의 치환을 의미한다. "돌연변이"라는 용어는 또한 돌연변이화된 핵산으로부터 생성된, 변화된 모티프도 포함한다.

하기 실시예에서 뮤테인은 당업계의 통상적인 방식에 따라 명명된다. 뮤턴트를 명명하는 규정은 서열번호: 1로 제공되는 성숙한 전장의 FⅧ에 대한 아미노산 서열을 토대로 한다. 예를 들면, 돌연변이 N239Q는 아미노산 위치 239번의 아스파라긴이 글루타민으로 바뀌었음을 나타내는 것이다.

일례로 FⅧ 뮤테인은 아미노산의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 당업계에서 보존적 치환이란, 하나의 아미노산이 유사한 특성을 가지는 또다른 아미노산으로 치환되는 것으로서 이해되고 있으며, 그 일례로는 알라닌→세린; 아르기닌→리신; 아스파라긴→글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트→글루타메이트; 글루타민→아스파라긴; 글루타메이트→아스파르테이트; 글리신→프롤린; 히스티딘→아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신→류신 또는 발린; 류신→발린 또는 이소류신; 리신→아르기닌; 메티오닌→류신 또는 이소류신; 페닐알라닌→티로신, 류신 또는 메티오닌; 세린→트레오닌; 트레오닌→세린; 트립토판→티로신; 티로신→트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린→이소류신 또는 류신인 변이를 포함한다.

특정 아미노산에 대한 1문자 약어, 그에 상응하는 아미노산, 및 3문자 약어는 하기와 같다: A, 알라닌 (Ala); C, 시스테인 (Cys); D, 아스파르트산 (Asp); E, 글루탐산 (Glu); F, 페닐알라닌 (Phe); G, 글리신 (Gly); H, 히스티딘 (His); I, 이소류신 (Ile); K, 리신 (Lys); L, 류신 (Leu); M, 메티오닌 (Met); N, 아스파라긴 (Asn); P, 프롤린 (Pro); Q, 글루타민 (Gln); R, 아르기닌 (Arg); S, 세린 (Ser); T, 트레오닌 (Thr); V, 발린 (Val); W, 트립토판 (Trp); Y, 티로신 (Tyr); 및 노르류신 (Nle).

본원에서 사용되는 바, 단백질 및 폴리펩티드는 동의어이다.

폴리펩티드의 당화로는 전형적으로 N-연결된 당화 또는 O-연결된 당화가 있다. N-연결된이란 당질 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 의미한다. 트리펩티드 서열인 Asn-X-Ser 및 Asn-X-Thr ("N-X-S/T") (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 당질 부분이 Asn의 측쇄에 효소적으로 부착되는데 필요한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중 상기의 트리펩티드 서열 (또는 모티프)들 중 어느 하나가 존재한다면 잠재적으로 N-연결된 당화 부위가 형성되게 된다.

이들 서열 모티프 (N-X-S/T)는 N-연결된 당화에 필요한 것이기 때문에 수개의 다른 유형의 돌연변이가 상기 부위에서의 N-연결된 당화를 방해할 수 있다. 이러한 돌연변이로는, 예를 들면, 아스파라긴 잔기 (N)가 또다른 잔기에 의해서 치환된 것, 두번째 잔기 (X)가 프롤린으로 치환된 것, 또는 세번째 잔기 (S/T)가 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 것을 포함한다.

예를 들어, 세번째 위치에 있는 트레오닌이 세린으로 치환된 것과 같은, N-연결된 당화 서열 모티프에서의 특정의 치환은 모티프 내의 당화를 방해하지 않을 것이다. 당업자는 어떤 치환이 돌연변이화된 당화 부위에서 당화가 일어나지 못하게 방해하는지 또는 그렇지 않은지를 쉽게 판단할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 돌연변이는 모티프 (N-X-S/T)의 1번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 유사한 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민으로 치환된 것일 수 있다. N-연결된 당화 부위 중 아스파라긴 잔기를 글루타민 잔기로 대체함으로써, 일반적으로는 상기 위치의 천연 분자의 극성 및 소수성(hydropathy)은 유지하면서 상기 부위에서 당화가 일어나지 못하게 저해시킬 수 있다.

또다른 실시태양에서, 돌연변이는 위치 239번의 아스파라긴이 글루타민 잔기로 치환된 것이다 (N239Q). 또다른 실시태양에서, 돌연변이는 위치 2118번의 아스파라긴이 글루타민 잔기로 치환된 것이다 (N2118Q). 추가의 실시태양에서, 돌연변이는 위치 239번 및 2118번의 아스파라긴이 글루타민 잔기로 치환된 것이다 (N239Q/N2118Q).

본 발명의 rFⅧ 분자는 전장의 FⅧ 분자일 수 있거나, 또는 그의 작용성 변이체가 FⅧ 분자의 아미노산 위치 41-43번, 239-241번, 582-584번, 1810-1812번, 및 2118-2120번에서 일어나는 서열 모티프 중 하나에서의 당화를 방해하는 돌연변이를 포함한다면, 본 발명의 rFⅧ 분자는 그의 작용성 변이체일 수 있다. 활성이 유지된다면, FⅧ 분자는 임의로 기타 다른 아미노산 위치에서도 돌연변이화될 수 있다. 시스테인 잔기는 시스테인 결합을 비롯한 원치않는 반응을 형성할 수 있기 때문에 FⅧ 분자에서의 돌연변이는 시스테인 잔기를 뮤테인에 도입하지 않아야 한다.

하나의 실시태양에서, FⅧ 분자는 B 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실이 된, B 도메인이 결실된 변이체 (BDD)이다. BDD는 B 도메인에서 발견되는 N-연결된 당화 부위 중 하나 이상을 보유할 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제4,868,112호 및 EP294910 참조). 또다른 실시태양에서, BDD는 본질적으로 B 도메인 전부를 포함하지 않는다. "본질적으로 전부"라는 것은 적어도 상기 부위가 B 도메인 내에 존재하는 공지된 당화 부위 모두를 포함한다는 것을 의미한다. BDD에 대한 상기 실시태양의 일례는 FⅧ의 B 도메인 중 14개의 아미노산을 제외한 전부가 결실된 아미노산 서열을 가지는 BDD FⅧ 분자이다. B 도메인의 처음 4개의 아미노산이 B 도메인의 마지막 10개의 잔기에 연결되어 있다 (예로서, 미국 출원 공개 번호 20060115876 참조). 별법으로, BDD에는 B 도메인 전체가 존재하지 않을 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제6,130,203호 참조).

아미노산 서열 변경은 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 상응하는 핵산 서열을 변형시키는 것과 같은 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발 기법은 당업계에 주지되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Zoller et al., (DNA 3:479-488, 1984)] 또는 [Horton, et al., (Gene 77:61-68, 1989, pp. 61-68)]에 기재되어 있다. 예를 들면, FⅧ 뉴클레오티드 서열은 스트라타진 c퀵체인지™ II(Stratagene cQuickChange™ II) 부위-지정 돌연변이유발 키트 (캘리포니아주 라호야 스트라타진 코포레이션(Stratagene Corporation))를 사용함으로써 돌연변이화될 수 있다. 돌연변이유발이 성공적으로 이루어졌는지는 DNA 서열을 분석함으로써 확인할 수 있고, 상기 돌연변이를 포함하는 적절한 단편을, 예를 들면, 하이그로마이신 B (Hyg B: Hygromycin B)에 대하여 내성을 부여하는 포유동물 발현 벡터 중 FⅧ 골격 내로 전달할 수 있다. 전달 후, 돌연변이에 대한 서열을 다시 확인할 수 있다. 따라서, FⅧ의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용함으로써 최상의 변경(들)을 도입할 수 있다. 유사하게, 특이적인 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 사용함으로써 DNA 작제물을 제조하는 방법이 당업자에게 주지되어 있다 (예로서, 문헌 [PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA] 참조).

FⅧ을 코딩하는 핵산 작제물 또한 예를 들면, 문헌 [Beaucage, et al., (Gene Amplif. Anal. 3:1-26, 1983)]에 기재되어 있는 포스포라미디트 방법과 같은 확립된 표준 방법에 의해 합성적으로 제조할 수 있다. 포스포라미디트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드를 예를 들면, 자동 DNA 합성기에서 합성하고, 정제하고, 어닐링시키고, 적합한 벡터에서 클로닝시킨다. FⅧ을 코딩하는 DNA 서열은 또한 예를 들면, 문헌 미국 특허 번호 제4,683,202호; 또는 [Saiki, et al., (Science 239:487-491, 1988)]에 기재되어 있는 바와 같이, 특이적인 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 제조될 수 있다. 또한, 핵산 작제물은 표준 기법에 따라서, 전체 핵산 작제물의 다양한 부분에 상응하는, (적절하게) 합성, 게놈, 또는 cDNA 기원의 단편 결찰에 의해 제조된, 혼합형의 합성 및 게놈, 혼합형의 합성 및 cDNA, 또는 혼합형의 게놈 및 cDNA 기원의 것일 수 있다.

FⅧ을 코딩하는 DNA 서열은 재조합 DNA 방법을 사용함으로써 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터를 선택하는 것은 대개 상기 벡터를 도입시키고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터 또는 통합형 벡터일 수 있다. 자율적으로 복제하는 벡터는 염색체외의 엔티티로서 염색체 밖에 존재하고, 그것의 복제는 염색체 복제와는 독립적으로 이루어지며, 그러한 예로는 예를 들어, 플라스미드가 있다. 통합형 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것인 벡터이다.

벡터는 변형된 FⅧ을 코딩하는 DNA 서열이 전사, 번역, 또는 DNA 프로세싱에 필요한 추가의 세그먼트, 예로서, 프로모터, 종결인자, 및 폴리아데닐화 부위에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래될 수 있거나, 그 둘 모두의 요소를 포함할 수 있다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 세그먼트가, 예를 들어, 전사는 프로모터에서 개시되어 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열로 진행되는 것과 같은 그들의 의도된 목적으로 일제히 작용하도록 정렬된 것을 가리킨다.

FⅧ을 발현시키는 데 사용하기 위한 발현 벡터로는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내며, 숙주 세포에 대해 동종성이거나 또는 이종성인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래된 것일 수 있는 임의의 DNA 서열일 수 있다. 포유동물 세포에서 DNA의 전사를 지시하기 위한 프로모터의 예로는 예를 들면, SV40 프로모터 (문헌 [Subramani, et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981]), MT-I (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (문헌 [Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]), CMV 프로모터 (문헌 [Boshart, et al., Cell 41:521-530, 1985]), 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 (문헌 [Kaufman et al., Mol. Cell Biol, 2:1304-1319, 1982])가 있다.

FⅧ을 코딩하는 DNA 서열은 또한 필요하다면, 적합한 종결인자에 작동가능하게 연결될 수 있다 (문헌 [Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]; [Alber et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:419-434, 1982]; [McKnight, et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985]). 발현 벡터는 또한 삽입 부위의 하류에 위치하는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호로는 SV40 유래의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 Elb 부위로부터 유래된 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 종결인자 (문헌 [DeNoto, et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981])를 포함한다. 발현 벡터는 또한 인핸서 서열, 예로서, SV40 인핸서를 포함할 수 있다.

FⅧ 또는 FⅧ 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열, 프로모터, 종결인자, 및 임의의 기타 다른 서열을 결찰시키고, 상기를, 복제에 필요한 정보를 포함하고 있는 적합한 벡터 내로 삽입시키는 데 사용되는 방법은 당업자에게 주지되어 있다 (예로서, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989]).

FⅧ 뮤테인을 코딩하는 핵산을 포함하는 적합한 발현 벡터를 당화 수행능이 있는 세포 내로 도입시킬 수 있다. 이어서, ELISA에 의해 FⅧ 발현을 분석할 수 있고, 종래 분석법, 예로서, 코테스트(Coatest) 발색성 분석법 (오하이오주 웨스트체스터 소재의 디아파마(diaPharma))에 의해 분석할 수 있다.

포유동물 세포를 형질감염시키고, 세포 내로 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법은 예를 들면, 문헌 [Kaufman, et al., (J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982)]; [Southern, et al., (J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982)]; [Loyter, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426, 1982)]; [Wigler, et al., (Cell 14:725-731, 1978)]; [Corsaro, et al., (Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981)], [Graham, et al., (Virology 52:456-467, 1973)]; 및 [Neumann, et al., (EMBO J. 1:841-845, 1982)]에 기재되어 있다. 클로닝된 DNA 서열을 예를 들면, 리포펙션, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 미세주입법, 원형질체 융합법, 인산칼슘 침전법, 레트로바이러스 전달법, 전기천공법, 세포 초음파처리법, 레이저 조사요법, 자기장을 사용한 형질감염법(magnetofection), 자연적인 형질전환법, 및 바이오리스틱 형질전환법(biolistic transformation) (예로서, 문헌 [Mehier-Humbert, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 57:733-753, 2005] 참조)에 의해 배양된 포유동물 세포 내로 도입할 수 있다. 외인성 DNA를 발현하는 세포를 확인하고 선별하기 위해 일반적으로는 선별가능한 표현형 (선별가능한 마커)을 부여하는 유전자를, 관심의 대상이 되는 유전자 또는 cDNA와 함께 세포 내로 도입할 수 있다. 선별가능한 마커로는 예를 들면, 예로서, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신 (Hygromycin B, Hyg B), 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대해 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 선별가능한 마커는 증폭될 수 있는 선별가능한 마커일 수 있는데, 이를 통해 마커 및 외인성 DNA 서열이 연결되었을 때에 마커 및 외인성 DNA가 증폭될 수 있다. 일례의 증폭될 수 있는 선별가능한 마커로는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 아데노신 데아미나제를 포함한다. 적합한 선별가능한 마커를 선별하는 것은 당업계의 숙련가의 범위 내에 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제5,238,820호 참조).

세포를 DNA로 형질감염시킨 후, 상기 세포를 적절한 성장 배지 중에서 성장시켜 관심의 대상이 되는 유전자를 발현시킨다. 본원에서 사용되는 바, "적절한 성장 배지"라는 용어는 세포의 성장과, FⅧ 또는 FⅧ 뮤테인의 발현에 필요한 영양소 및 기타 다른 성분들을 함유하는 배지를 의미한다 (예로서, 미국 특허 번호 제5,171,844호; 제5,422,250호; 제5,422,260호; 제5,576,194호; 제5,612,213호; 제5,618,789호; 제5,804,420호; 제6,114,146호; 제6,171,825호; 제6,358,703호; 제6,780,614호; 및 제7,094,574호 참조).

배지는 일반적으로 예를 들면, 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질, 및 성장 인자를 포함한다. 이어서, 안정한 방식으로 선별가능한 마커를 발현하는 세포의 성장을 선별하기 위해 약물 선별을 적용한다. 증폭될 수 있는 선별가능한 마커로 형질감염된 세포에 있어서, 약물 농도는 클로닝된 서열의 증가된 카피 수에 대하여 선별되도록 증가시킬 수 있고, 이로써, 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 이어서, 안정하게 형질감염된 세포의 클론은 FⅧ 또는 FⅧ 뮤테인의 발현에 대하여 스크리닝된다.

예를 들면, 형질감염된 세포를, 5% FBS로 보충된 성장 배지 중 50 ㎍/mL Hyg B를 사용한 선별압하에 놓을 수 있다. Hyg B에 대해 내성을 띠는 콜로니를 선별하고, FⅧ 발현에 대하여 스크리닝한다. 이어서, 안정한 형질전환체를 재조합 발현을 위한 배양 배지 중에 적응시킨다. FⅧ 뮤테인의 생성과 발현은 수개의 공개 문헌에 기재되어 있다 (예로서, 미국 출원 공개 번호 20060115876; [Kaufman, et al., J Biol Chem 263:6352-6362, 1988]; [Hironaka, et al., J Biol Chem 267:8012-8020, 1992]) 참조).

본 발명에서 사용하기 위한 포유동물 세포주에 대한 예로는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK), HKB11 세포 (문헌 [Cho, et al., J. Biomed. Sci, 9:631-638, 2002]), 및 HEK-293 (ATCC CRL 1573; 문헌 [Graham, et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977]) 세포주가 있다. 추가로, 래트 Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMK-1 (ATCC CCL 139), Hep-G2 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 및 CHO-DUKX 세포 (문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980])를 비롯한, 기타 다른 세포주 다수가 본 발명에서 사용될 수 있다.

특정 세포주는 재조합 단백질을 당화시킬 수 있고, 본원에서는 이러한 세포주를 "당화 수행능이 있는" 세포주로 지칭한다. 당화 수행능이 있는 세포주의 일례로는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Center) (ATCC 번호 CRL-12568)으로부터 입수가능한 HKB11이 있다. 본 발명에서 유용한 기타 다른 당화 수행능이 있는 세포주로는 COS-1, CHO, HEK293, 및 BHK 세포를 포함한다.

FⅧ 뮤테인을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 포함하는 재조합 배양물을 적합한 조건하에서 성장시킴으로써 뮤테인을 발현시키고 회수한다. 하나의 실시태양에서, FⅧ 뮤테인을 숙주 세포에 의해 분비된 형태로 발현시킬 수 있고, 성장 배지로부터 회수할 수 있고, 임의로는 추가로 정제하여 제약 제품을 생산할 수 있다.

FⅧ 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 회수한 후, 크로마토그래피법 (예로서, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기 배제 크로마토그래피), 전기영동 방법 (예로서, 분취성 등전 초점화 (IEF), 분별 용해도 (예로서, 황산암모늄 침전)), 추출 (예로서, 문헌 [Protein Purification, Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조), 또는 그의 다양한 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 정제할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 폴리펩티드는 항-FⅧ 항체 칼럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 추가의 정제는 예로서, 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 종래의 화학적 정제 수준에 의해 달성될 수 있다. 기타 다른 정제 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 변형된 FⅧ 폴리펩티드의 정제에 적용될 수 있다 (예로서, 문헌 [Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982] 참조).

일반적으로, "정제된"이라는 것은 분획화를 통해 각종의 기타 다른 성분들은 제거되고, 실질적으로 그의 발현된 생물학적 활성은 유지하고 있는 것인 단백질 또는 펩티드 조성물을 지칭하여야 한다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이러한 표현은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주성분을 형성하는 것인, 예로서, 조성물 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 이상의 단백질이 구성 요소가 되는 것인 조성물을 지칭하여야 한다.

폴리펩티드의 정제도를 측량하는 각종 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법으로는 예를 들면, 활성 분획의 특이 활성도를 측정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 예시적인 방법은 분획의 특이 활성도를 계산하고, 상기 활성도를 개시 추출물의 특이 활성도와 비교함으로써 순도 정도를 계산하되, 여기서 이는 "-배 정제 수"에 의해 평가된다. 활성량을 나타내는 데 사용되는 실제 단위도 물론 특정의 분석 기법에 따라 달라질 것이다.

재조합 FⅧ은 상업적 규모로 생산될 수 있다. 임의의 적합한 배양 방법 및 배양 배지를 사용하여 본 발명의 방법으로 세포를 배양할 수 있다. 적합한 배양 방법, 조건, 및 배지는 세포 배양 분야에서 주지되어 있다. 배취식 및 연속식 발효 방법, 현탁법 및 부착성 배양법이든, 예를 들면, 마이크로캐리어 배양 방법 및 교반 탱크 및 기포 발효조를 적절히 사용할 수 있다. 숙주 세포를 예로서, 발효 베쓸과 같은 임의 유형의 배양 장비에서 배양할 수 있다. 세포를 부착성 세포 배양물로서, 또는 현탁액 세포 배양물로서 배양할 수 있다. 재조합 단백질을 발현하는 세포의 현탁 세포 배양을 위한 장비는 당업자에게 잘 알려져 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제7,294,484호; 제7,157,276호; 제6,660,501호; 및 제6,627,426호). 일반적으로, 부착성-독립형 세포 배양을 위한 원리, 프로토콜, 장비, 및 실시 기법은 문헌 [Chu, et al. (Curr Opin Biotechnol 12:180-7, 2001] 및 [Warnock, et al. (Biotechnol Appl Biochem 45:1-12, 2006)]에서 살펴볼 수 있다.

세포를 배양하는 데 사용되는 배양 배지로는 공지의 이용가능한 각종의 성장 배지를 포함할 수 있다. 혈청이 보충된 배지든 무혈청 배지이든 어느 것이나 사용될 수 있다. 치료제 단백질의 생산을 위해 배지는 무혈청 배지 및/또는 단백질 무함유 배지일 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제5,804,420호 및 제7,094,574호; WO 97/05240; 및 EP 0 872 487 참조).

제약 조성물

본 발명은 또한 치료학적 유효량의, 본 발명의 FⅧ 뮤테인, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 비경구 투여용의 제약 조성물에 관한 것이다. 제약상 허용가능한 담체는 활성 성분에 첨가됨으로써 제제의 제법화 또는 안정화에 도움을 주고, 환자에게 유의적인 독성의 부작용을 유발하지 않는 물질이다. "제약상 또는 약물학상 허용가능한"이라는 어구는, 동물 또는 인간에게 투여되었을 때, 부작용, 알레르기, 또는 기타 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용가능한 담체"로는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 활성인 물질을 위해 상기와 같은 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 주지되어 있다. 보충적인 활성 성분 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

본 발명의 조성물은 고전적인 제약 제제를 포함한다. 본 발명에 따른 이와 같은 조성물의 투여는 임의의 보편적인 경로를 통해 이루어질 수 있다. 제약 조성물은 예를 들면, 정맥내, 진피내, 근육내, 피하, 또는 경피 전달에 의한 것과 같은 임의의 종래 방법에 의해 피험체 내로 도입될 수 있다. 치료는 단일 투약, 또는 일정 기간 동안에 걸쳐 다회 투약하는 것으로 구성될 수 있다.

주사용으로 사용하기에 적합한 제약 제형으로는 멸균 수성 액제 또는 분산제, 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 분제를 포함한다. 제형은 멸균성을 띠어야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유체성을 띠어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서는 안정적이어야 하며, 미생물, 예로서, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해서도 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예로서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 수크로스, L-히스티딘, 폴리소르베이트 80, 또는 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들면, 코팅제, 예로서, 렉시틴의 사용에 의해, 분산액인 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지되어야 한다. 미생물의 작용은 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로산 등과 같은 각종의 항균제 및 항진균제에 의해 막을 수 있다. 주사용 조성물은 예를 들면, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡착 지연용 제제를 조성물 중에 사용함으로써 주사용 조성물의 흡착을 지연시킬 수 있다.

FⅧ 제약 조성물은 또한 벌크화제, 안정화제, 완충제, 계면활성제, 염화나트륨, 칼슘 염, 및 기타 다른 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 부형제는 동결건조된 제제 및 액상 제제 중의 FⅧ의 안정성을 최대화시키기 위해서 선택될 수 있다.

벌크화제로는 예를 들면, 만닛톨, 글리신, 알라닌, 및 하이드록시에틸 전분 (HES)을 포함할 수 있다. 안정화제는 당, 예로서, 수크로스, 트레할로스, 및 라피노스, 당 알코올, 예로서, 소르비톨 및 글리세롤, 또는 아미노산, 예로서, 아르기닌을 포함할 수 있다.

FⅧ 분자는 동결건조되는 동안 일어나는 pH 변화에 의해 불리한 영향을 받을 수 있기 때문에 완충제 물질을 상기 제제 중에 포함할 수 있다. pH는 동결건조되는 동안 6 내지 8 사이의 범위, 예로서, pH 약 7로 유지될 수 있다. 완충화제는 완충제로서 작용할 수 있는 수행능을 가진, 임의의 생리학적으로 허용가능한 화학적 엔티티 또는 화학적 엔티티들의 조합물일 수 있으며, 그 예로 히스티딘, Tris, BIS-Tris 프로판, 1,4-피페라진디에탄설폰산 (PIPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산 (MOPS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 및 N-[카르바모일메틸]-2-아미노에탄-설폰산 (ACES)을 포함한다.

멸균 주사용 액제는, 상기 열거된 각종의 기타 다른 성분들과 함께 활성 화합물 (예로서, FⅧ 뮤테인)을 필요한 양만큼 적절한 용매 중에 혼입시키고, 필요에 따라, 여과 멸균 처리함으로써 제조할 수 있다.

일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질과 상기 열거된 것으로부터 필요시되는 기타 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클 내로 각종의 멸균처리된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 멸균 주사용 액제의 제조를 위한 멸균 분제의 경우, 그의 제조 방법으로는 예를 들면, 활성 성분과, 그의 상기 멸균 여과처리된 액제로부터 임의의 추가의 원하는 성분으로 이루어진 분제를 생산하는 진공-건조법 및 냉동-건조법을 포함한다.

제조시, 액제는 투약 제형과 화합성인 방식으로, 치료학적 유효량인 양으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "치료학적 유효량"은 혈류 중 또는 표적 조직 중에 폴리펩티드를 원하는 수준으로 제공하는 데 필요한 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 정확한 양은 다수의 인자들, 예를 들면, 특정의 FⅧ 뮤테인, 치료학적 조성물의 성분 및 물리학적 특징, 대상 환자 군집, 전달 방식, 개별 환자의 고려 사항 등에 따라 달라질 수 있고, 이는 본원에서 제공하는 정보에 기초하여 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

제제는 예로서, 주사용 액제 등과 같이 다양한 투여 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수성 액제로 비경구적으로 투여하기 위해서는 예를 들어, 액제는 필요한 경우에는 적합하게 완충처리되어야 하며, 액상의 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성을 띠어야 한다. 이러한 특정의 수성 액제는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여를 위해 특히 적합하다.

피하, 정맥내, 근육내 등에 적합한 제제; 적합한 제약 담체; 및 제조 기법 및 투여 기법은 당업계에 주지되어 있는 방법들 중 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다 (예로서, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20^th edition, 2000] 참조).

FⅧ의 제약 조성물의 예는 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,047,249호, 제5,656,289호, 제5,665,700호, 제5,690,954호, 제5,733,873호, 제5,919,766호, 제5,925,739호, 제6,835,372호, 및 제7,087,723호에 개시되어 있다.

치료 방법

포유동물에서 상기 확인된 병태의 치료에 대한 효능을 측정하는 데 사용되는 주지의 분석에 기초하고, 그리고, 상기 결과를 이들 병태를 치료하는 데 사용되는 공지의 약제가 갖는 결과와 비교함으로써, 각각의 원하는 적응증을 치료하기 위한, 본 발명의 뮤테인의 유효 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 이들 병태들 중 하나의 치료에서 투여되는 활성 성분의 양은 사용되는 특정 폴리펩티드 및 투여 단위, 투여 방식, 치료 기간, 및 치료받는 환자의 연령 및 성별, 및 치료되는 병태의 성질 및 정도와 같은 고려 사항에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.

관련된 투여량 반응 데이타와 함께 혈액 응고 수준을 특정하는 확립된 분석법의 사용을 통해 적절한 투여량을 확정할 수 있다. 약물의 작용을 변형시킬 수 있는 인자, 예를 들면, 약물의 특이 활성, 손상의 중증도, 및 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 섭식, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간, 및 기타 다른 임상 인자를 고려하면서, 주치의에 의해 최종 투여 요법이 결정될 수 있다.

본원에 기술된 조성물을 사용하여 FⅧ의 기능적 결함 또는 FⅧ 결핍, 예로서, FⅧ의 결합 특성의 변경, FⅧ의 유전적 결합, 및 FⅧ의 혈장 농도와 관련된 임의의 출혈성 질병을 치료할 수 있다. FⅧ의 유전적 결합은 예를 들면, FⅧ을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중의 염기의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 출혈성 질병은 혈우병일 수 있다. 상기 출혈성 질병의 증상으로는 예를 들면, 중증 코피, 구강 점막 출혈, 혈관절증, 혈종, 지속성 혈뇨, 위장관 출혈, 복막뒤 출혈, 혀/인두뒤 출혈, 두개내 출혈, 및 외상-관련 출혈을 포함한다.

본 발명의 조성물은 예방학적 적용을 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, FⅧ 뮤테인을 질환 상태에 걸리기 쉽거나, 또는 다르게는 질환 상태의 위험이 있는 피험체에게 투여함으로써 피험체 본인의 응고성 수행능을 증진시킬 수 있다. 상기와 같은 양은 "예방학적 유효량"으로 정의될 수 있다. 예방을 위해 FⅧ 뮤테인을 투여하는 것은, 혈우병을 앓는 환자가 이제 막 수술을 받으려 할 때, 수술하기 1 내지 4시간 전에 본 폴리펩티드를 투여하는 것과 같은 상황을 포함한다. 추가로, 폴리펩티드는 임의로 혈우병을 앓지 않는 환자에서 비조절성 출혈에 대한 예방제로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 예를 들면, 폴리펩티드는 수술하기 이전에 비조절성 출혈의 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 혈우병 환자에서 FⅧ 뮤테인의 제약 조성물을 환자의 정맥내로 주입함으로써 FⅧ 결핍에 기인하는 비조절성 출혈 (예로서, 동맥내, 두개내, 또는 위장관 출혈)을 치료할 수 있다.

일례로서, 시험관내에서의 FⅧ의 혈액응고제 활성을 사용하여 인간 환자에 주입하기 위한 FⅧ의 투여량을 계산할 수 있다 (문헌 [Lusher, et al., New Engl J Med 328:453-459, 1993]; [Pittman, et al., Blood 79:389-397, 1992]; [Brinkhous, et al., Proc Natl Acad Sci 82:8752-8755, 1985]). 하나의 실시태양에서, FⅧ 뮤테인의 투여를 통해 환자에서 달성하고자 하는 혈장 FⅧ 수준은 정상 수준의 30-100% 범위일 수 있다.

또다른 실시태양에서, 조성물은 약 5 내지 50 단위/kg (체중)의 범위, 또는 10-50 단위/kg (체중)의 범위의 투여량으로, 또는 20-40 단위/kg (체중)의 투여량으로 정맥내로 투여될 수 있다. 치료는 필요에 따라 조성물을 1회로 정맥내 투여하는 형태를 취할 수 있거나, 장기간에 걸쳐 주기적 또는 연속적으로 투여하는 형태를 취할 수 있다. 간격 빈도는 (중증의 혈우병을 앓는 환자에서는) 약 8 내지 24시간 범위이고, 치료 지속 기간은 1 내지 10일 범위, 또는 출혈 에피소드가 해소될 때까지이다.

본 발명의 FⅧ 뮤테인은 또한 생체내에서도 발현될 수 있는데, 즉, 상기 뮤테인은 유전자 요법을 위해서 사용될 수 있다. 생체외에서 FⅧ 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)로 세포를 공학처리할 수 있고, 이어서, 상기 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 상기 공학처리된 세포를 제공할 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 세포를 공학처리할 수 있다. 당업계의 기술 내에 포함되어 있는 일반 분자 생물학적 기법 및 재조합 DNA 기법을 사용하여 투여하고자 하는 유전자를 단리시키고, 정제할 수 있다. 이어서, 단리된 유전자를 적절한 클로닝 벡터 (예로서, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 백시니아, 헤르페스바이러스, 배큘로바이러스 및 레트로바이러스, 파보바이러스, 렌티바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터) 내로 삽입할 수 있다. 전달하고자 하는 유전자의 코딩 서열을 발현 제어 서열, 예로서, 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 종결 부위, 및 기타 다른 신호 서열에 작동가능하게 연결시킬 수 있다.

치료학적 벡터를 환자 내로 직접 전달할 수 있는데, 이러한 경우에는 환자가 벡터 또는 전달 복합체에 직접 노출되게 되고, 또는 간접적으로 전달될 수도 있는데, 이러한 경우에는, 세포를 먼저 시험관내에서 벡터로 형질전환시킨 후에, 환자 내로 이식시키게 된다. 이러한 두 접근법은 각각 생체내 및 생체외 유전자 요법으로서 알려져 있다. 예를 들면, 나형(naked) DNA를 직접 주사함으로써, 또는 미세입자 충격요법 (예로서, 유전자 총)을 사용함으로써 생체내에 치료학적 벡터를 직접 투여할 수 있다.

잠재적으로 치료학적 성질을 띠는 유전자를 정의된 세포 군집으로 전달하는 수개의 방법이 공지되어 있다 (예로서, 문헌 [Mulligan, Science 260:926-31, 1993] 참조). 이러한 방법으로는 예를 들면: 1) 직접적인 유전자 전달 (예로서, 문헌 [Wolff, et al., Science 247:1465-68, 1990] 참조); 2) 리포좀-매개 DNA 전달 (예로서, 문헌 [Caplen, et al., Nature Med 3:39-46, 1995]; [Crystal, Nature Med. 1:15-17, 1995]; [Gao and Huang, Biochem Biophys Res Comm 179:280-85, 1991] 참조); 3) 레트로바이러스-매개 DNA 전달 (예로서, 문헌 [Kay, et al., Science 262:117-19, 1993]; [Anderson, Science 256:808-13, 1992]); 4) DNA 바이러스-매개 DNA 전달을 포함한다. 상기 DNA 바이러스로는 아데노바이러스 (예로서, Ad-2 또는 Ad-5 기반 벡터), 헤르페스 바이러스 (예로서, 단순 헤르페스 바이러스 기반 벡터), 및 파보바이러스 (예로서, 아데노-관련 바이러스 기반 벡터, 예로서, AAV-2 기반 벡터) (예로서, 문헌 [Ali, et al., Gene Therapy 1:367-84, 1994]; 미국 특허 번호 제4,797,368; 미국 특허 번호 제5,139,941호 참조)를 포함한다. 유전자 요법에 관한 기타 다른 방법은 문헌 [Goldspiel, et al., (Clin Pharm 12:488-505, 1993)]; [Wu and Wu (Biotherapy 3:87-95, 1991)]; [Tolstoshev (Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573-596, 1993)]; 및 [Morgan and Anderson, (Ann Rev Biochem 62:191-217, 1993)]에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 것으로서, 재조합 DNA 기술 분야에서 보편적으로 알려져 있는 방법은 문헌 [Ausubel, et al., (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993)]; [Kriegler, (Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990)]; [Dracopoli, et al., (Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY, 1994)]; 및 [Colosimo, et al., (Biotechniques 29:314-324, 2000)]에 기재되어 있다.

관심의 대상이 되는 유전자를 전달하기 위한 특정의 벡터 시스템을 선택하는 것은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 적합한 유전자 요법 벡터가 본 실시태양에 따라 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 상기 벡터를 작제하는 기법은 공지되어 있다 (예로서, 문헌 [Anderson, Nature 392:25-30, 1998]; [Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1998] 참조). 벡터를 표적 부위로 도입시키는 것은 공지된 기법을 사용함으로써 달성될 수 있다.

적합한 유전자 요법 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 바이러스 프로모터 (예로서, 레트로바이러스 LTR, SV40 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 호흡기 세포 융합 바이러스 프로모터, B19 파보바이러스 프로모터, 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (문헌 [Miller, et al., Biotechniques 7:980-990, 1989]에 기재), 세포성 프로모터 (예로서, 히스톤, pol III, 및 β-액틴 프로모터), 및 유도성 프로모터 (예로서, MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 및 열 충격 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업자에게는 적합한 프로모터를 선택하는 것이 본원에 포함되어 있는 교시로부터 자명해질 것이다.

그로부터 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 것인 레트로바이러스로는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예로서, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방암 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용하여 패키징 세포를 형질도입시킴으로써 생산자 세포주를 생성할 수 있다. 형질감염된 것일 수 있는 패키징 세포의 예로는 문헌 [Miller (Human Gene Therapy, 1:5-14, 1990)]에 기재되어 있는 것과 같은 PE501, PA317, PA12, VT-19-17-H2, 및 DAN 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 패키징 세포를 형질도입시킬 수 있다. 그러한 수단으로는 전기천공, 리포좀 사용, 및 CaPO₄ 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한가지 대안으로, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀 내로 캡슐화시킬 수 있거나, 또는 지질과 커플링시킬 수 있고, 이후 숙주에게 투여할 수 있다. 생산자 세포주는 본 발명의 뮤테인을 코딩하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 이어서, 그러한 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 시험관내에서든 또는 생체내에서든 진핵성 세포를 형질도입시킬 수 있다. 형질도입된 진핵성 세포는 본 발명의 뮤테인을 코딩하는 핵산 서열(들)을 발현시킬 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵성 세포로는 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포 뿐만 아니라, 조혈성 줄기 세포, 간세포, 섬유모세포, 근육모세포, 각질세포, 내피 세포, 및 기관지 상피 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 FⅧ 뮤테인을 코딩하는 DNA는 예로서, 혈우병과 같은 질병을 위한 유전자 요법에서 사용된다. 본 실시태양에 따라, 본 발명의 FⅧ 뮤테인을 코딩하는 DNA를 사용하는 유전자 요법은 그를 필요로 하는 환자에게 진단과 함께 동시에 또는 진단 후 즉시 제공될 수 있다.

본원에 기술된 뮤테인, 물질, 조성물, 및 방법은 본 발명의 대표적인 예로서 의도되는 것이며, 본 발명의 범주는 본 실시예의 범주로 제한되는 것이 아님을 이해하여야 할 것이다. 본 발명은 개시된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법을 변형시킴으로써 실시될 수도 있고, 그러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

하기 실시예는 본원에 기술된 본 발명의 설명하기 위해 제시되는 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예

본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록 하기 위하여, 하기 실시예를 기술한다. 이러한 실시예는 단지 설명을 목적으로 한 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본원에서 언급한 모든 공개 문헌은 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

실시예 1. 수지상 세포에 의한 FⅧ의 세포내이입

시험관내에서 DC에 의한 흡수에 대하여 FⅧ 당화가 미치는 효과를 측정하였다. 먼저, FACS 분석을 위해 전장의 rFⅧ을 표지화한 후, 탈당화시켰다. FACS 분석을 위한 rFⅧ의 표지화를 위해 PBS (pH 9) 중 6 ㎍의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)를 100 ㎍의 탈당화된 FⅧ에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 혼합시켰다. 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2% 수크로스, 및 100 ppm 트윈®-80 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노올레이트)으로 구성된 용액 (pH 7.5) 중에서 50 K 막을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 투석시킴으로써 접합되지 않은 FITC를 제거하였다. 브래드포드(Bradford) 분석법에 의해 FⅧ 농도를 측량하고, 발색성 분석법에 의해 FⅧ 활성을 측정하였다. 이어서, 단백질은 변성시키지 않으면서 N-연결된 올리고당을 특이적으로 절단하는 것인 엔도글리코시다제 F1 (엔도-F1)을 사용하여 표지된 rFⅧ을 효소적으로 탈당화시켰다. rFⅧ을 37℃에서 1시간 동안 엔도-F1과 함께 인큐베이션시켰다. rFⅧ을 50 K 막에 주입하고, 4℃에서 2시간 동안 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2% 수크로스, 및 100 ppm 트윈®-80으로 구성된 용액 (pH 9)에서 대하여 투석시켰다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 탈당화를 확인하였다.

수지상 세포 (DC)를 생성하기 위해, 3% 인간 AB 혈청, 20 ng/mL GM-CSF 및 10 ng/mL IL-4로 보충된 RPMI 1640 배지 (유타주 로건 소재의 하이클론/써모 사이언티픽(Hyclone/Thermo Scientific)) 중에서 부착성 단핵구를 5일 동안 배양하였다. 유세포 분석법에 의해 DC 생육성을 확인하였다. 5% CO₂ 및 95% 대기의, 가습화된 세포 인큐베이터 중 37℃에서 모든 세포를 배양하였다. DC에 의한 흡수에 대하여 탈당화된 rFⅧ이 미치는 효과를 측정하기 위해, DC를 탈당화된 rFⅧ과 함께 30분 동안 인큐베이션시키고, 인큐베이션 후에는 FACS를 이용하여 DC에 의한 FⅧ의 흡수에 관하여 분석하였다. 도 1은 DC에 의한 FⅧ의 흡수가 엔도-F1에 의한 탈당화 후에 유의적으로 감소하였음을 보여준다. 이러한 결과는 DC에 의한 FⅧ의 흡수가 적어도 부분적으로는 N-당화에 의존한다는 것을 나타내며, 추가로, 상기와 같은 흡수는 N-연결된 캡핑되지 않은 올리고당을 인식하는 CD206에 의해 매개된다는 것을 제안한다.

실시예 2. HKB11 세포에서의 FⅧ 뮤테인의 발현

BDD FⅧ, 및 상기 BDD FⅧ의 3가지 뮤테인을 HKB11 세포에서 발현시켰다. BDD FⅧ은 B 도메인 중 14개의 아미노산을 제외한 전부가 결실된 것을 포함하였으며, 이에 B 도메인의 처음 4개의 아미노산이 B 도메인의 마지막 10개의 잔기에 연결되어 있었다. 하나의 BDD FⅧ 뮤테인은 위치 239번의 아스파라긴이 글루타민으로 단일 치환된 것 (N239Q)을 포함하였고, 또다른 것은 위치 2118번의 아스파라긴이 글루타민으로 단일 치환된 것 (N2118Q)을 포함하였으며, 세번째 것은 상기 두 돌연변이 모두 (N239Q/N2118Q)를 포함하였다.

제조사의 설명서에 따라 리포펙트아민™ 2000(Lipofectamine™ 2000) (캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 HKB11 세포를 BDD FⅧ 및 BDD FⅧ 뮤테인 발현 플라스미드로 일과적으로 형질감염시켰다. HKB11 세포를 BDD 및 BDD 뮤테인 플라스미드로 일과적으로 형질감염시키고, 상기 세포로부터 얻은 상등액을 발색성 분석법에 의해서는 FⅧ 활성에 관해, 그리고 ELISA에 의해서는 FⅧ 농도에 관해 시험하였다. 3가지 뮤테인의 특이 활성도는 돌연변이화되지 않는 형태로 각 당화 부위를 포함하고 있는 BDD와 유사한 것으로 나타났다 (도 2a). N2118Q 뮤테인은 BDD와 유사한 발현 수준을 나타낸 반면, N239Q 및 N239Q/N2118Q 뮤테인 발현 수준은 각각 BDD보다 대략 25% 및 50% 더 낮았다 (도 2b). 따라서, 본 예시적인 시스템에서 몇몇 뮤테인의 수율은 감소되었지만, 그럼에도 불구하고, 뮤테인은 유용한 양으로 회수되었다.

실시예 3. 수지상 세포에 의한 FⅧ 뮤테인의 흡수 감소

실시예 1에 기술된 바와 같이, 수지상 세포 (DC)에 의한 FⅧ의 흡수는 FⅧ 상의 만노스-종결 글리칸과 CD206의 상호작용에 의해 매개된다고 판단되었기 때문에 DC의 N239Q/N2118Q BDD 뮤테인을 흡수하는 능력을 시험하였다. 하기 기술된 바와 같이 DC를 제조하였다. 2명의 기증자로부터 얻은 DC를 풀링한 후, 전장의 rFⅧ, BDD FⅧ (실시예 2에 기술), 또는 N239Q/N2118Q BDD 뮤테인과 함께 공배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트의 웰 중에서 30분 동안 공배양하였다. 각 웰당 최종 부피는 100 ㎕였고, rFⅧ, BDD, 또는 뮤테인의 최종 농도는 10 nM이었다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 대조군으로서 유사한 흡수 분석법을 4℃에서 수행하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 300 g으로 원심분리하여 세포를 펠릿화시켰다. 배지를 흡인시키고, 빙냉 PBS/10 mM EDTA/0.01% 트윈®-80을 사용하여 3회에 걸쳐 세포를 세척하였다. 이어서, 4℃에서 15분 동안 프로테아제 저해제를 포함하는 사이토부스터(Cytobuster)™ 완충액 (위스콘신주 메디슨 소재의 노바겐(Novagen))을 웰당 25 ㎕씩 사용하여 세포 펠릿을 용해시켰다. 플레이트를 10분 동안 300 g으로 원심분리한 후, ELISA하였다. ELISA (코네티컷주 스탬퍼드 소재의 아메리칸 다이어그노스티카(American Diagnostica))를 위해, 세포 추출물을 1/25로 희석하였다. 재조합 단백질로부터 FⅧ 및 BDD에 대한 표준 곡선 (80 내지 1.25 μmolar)을 작성하였다. 제조사의 설명서에 따라 ELISA를 수행하였다.

도 3은 DC에 의한 N2118Q 뮤테인 및 N239Q/N2118Q FⅧ 뮤테인의 흡수가 rFⅧ 및 BDD의 흡수보다 유의적으로 더 낮다는 것을 나타낸다.

BDD 2118Q의 약동학적 성질에 관한 연구에서 스프라그 다우리(Sprague Dawley)계 수컷 래트 (n=4) 내로 0.05 mg/kg의 BDD N2118Q 뮤테인을 정맥내로 주사하였다. 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 BDD N2118Q의 농도를 측정하였다. 래트 중 단일 뮤턴트의 반감기는 4.4 ± 0.7시간으로, BDD와 유사하였다.

실시예 4. FⅧ-특이 T-세포 클론의 시험관내 IFNγ 반응 감소

N2118Q 흡수 감소가 FⅧ에 대한 T-세포 활성을 감소시켰는지 여부를 시험하기 위해 FⅧ-특이 T-세포 클론 BO1-4에 의한 IFNγ의 분비를 시험하였다 (도 4a). HLA-매칭된 DC를 자가 혈장 중 37℃에서 24시간 동안 FⅧ, BDD, 또는 N2118Q와 함께 24시간 동안 인큐베이션시켜 DC가 각 단백질을 흡수하고, 프로세싱하고, 제시할 수 있도록 하였다. 이어서, DC를 37℃에서 24시간 동안 FⅧ-특이 T-세포 클론 (T-세포:DC의 비=10:1)과 함께 공배양하였다. 이어서, 상등액 (50 ㎕)을 수집하고, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의한 IFNγ의 측정을 위해 상기 상등액을 2배로 희석시켰다.

실시예 5. FⅧ-특이 T-세포 클론의 시험관내 증식 반응 감소

N2118Q 흡수 감소가 FⅧ에 대한 반응으로 T-세포 증식을 감소시켰는지 여부를 시험하기 위해 FⅧ-특이 T-세포 클론 BO1-4에 의한 IFNγ의 분비를 시험하였다 (도 4b). HLA-매칭된 DC를 자가 혈장 중 37℃에서 24시간 동안 FⅧ, BDD, 또는 N2118Q와 함께 24시간 동안 인큐베이션시켜 DC가 각 단백질을 흡수하고, 프로세싱하고, 제시할 수 있도록 하였다. 이어서, DC를 37℃에서 FⅧ-특이 T-세포 클론 (T-세포:DC의 비=10:1)과 함께 공배양하였다. 3일째, 추가의 36시간 동안 20 μCi의 3H-티미딘 (티미딘)을 첨가하였다. 세포를 수거하고, 티미딘 혼입에 대해 시험하였다.

도 4a 및 4b는 N2118Q에 대해서 BO1-4 T-세포 클론에 의해 이루어지는 IFNγ 및 증식 반응이 유의적으로 감소하였음을 보여준다. 이러한 데이타는, DC에 의한 N2118Q 흡수 감소가, FⅧ 펩티드를 FⅧ-특이 T-세포 클론에 제시할 수 있는 DC의 능력을 감소시킨다는 개념을 입증한다.

상기 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌과 특허는 본원에서 참고로 인용된다. 기술된 본 발명의 방법에 대한 다양한 수정 및 변형이 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.

본 발명이 특정 실시태양과 관련하여 기술되었지만, 청구하고자 하는 본 발명이 상기와 같은 특정 실시태양으로 과도하게 제한되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 생화학 분야 또는 관련 분야의 당업자에게는 명백한 것으로서, 본 발명을 수행하기 위해 실시되는 상기 기술된 방식에 관한 다양한 수정은 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 당업자는 단지 통상의 실험만을 사용함으로써 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시태양에 대한 다수의 등가물을 이해하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물도 하기 특허청구범위에 포함되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare LLC Aswad, Fred Harkins, Rick Liu, Hsiao-Lai Murphy, John E Wu, Faye Zhu, Ying <120> FACTOR VIII MUTEINS WITH REDUCED IMMUNOGENICITY <130> MSB-7332 <150> US 61/075,494 <151> 2008-06-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met 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Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly 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Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn 770 775 780 Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800 His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 810 815 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val 835 840 845 Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser 865 870 875 880 Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895 Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 900 905 910 Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925 Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940 Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 Arg Ala His Gly 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1370 1375 1380 Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser 1385 1390 1395 Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser 1400 1405 1410 Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val 1415 1420 1425 Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu 1430 1435 1440 Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu 1445 1450 1455 Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys 1460 1465 1470 Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys 1490 1495 1500 Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515 Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1520 1525 1530 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 1545 Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560 Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu 1565 1570 1575 Glu Trp 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Phe 1970 1975 1980 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1985 1990 1995 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 2015 2020 2025 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2255 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The first four amino acids for the B-domain of human Factor VIII sequence <400> 2 Ser Phe Ser Gln 1 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The last ten amino acids for the B-domain of human Factor VIII sequence <400> 3 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 1457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from human Factor VIII sequence <400> 4 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln 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Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1445 1450 1455

Claims (21)

1. 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 하나 이상의 천연적으로 발생된 N-연결된 당화 부위 아미노산 서열 내에 도입함으로써 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이는 N-연결된 당화 부위가 당화되지 못하도록 하는 것인, 재조합 인자 Ⅷ 분자.
2. 제1항에 있어서, N-연결된 당화 부위 아미노산 서열이 인자 Ⅷ 분자의 아미노산 위치 41-43번, 239-241번, 582-584번, 1810-1812번, 및 2118-2120번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
3. 제2항에 있어서, 아미노산 위치가 239-241번, 1810-1812번, 및 2118-2120번인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
4. 제2항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 위치 239번, 위치 1810번, 및 위치 2118번에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
5. 제2항에 있어서, 돌연변이가 위치 239번 및 1810번에 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
6. 제2항에 있어서, 돌연변이가 위치 239번 및 2118번에 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
7. 제2항에 있어서, 돌연변이가 위치 1810번 및 2118번에 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 치환을 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
9. 제8항에 있어서, 치환이 위치 239번의 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 치환을 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
10. 제8항에 있어서, 치환이 위치 1810번의 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 치환을 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
11. 제8항에 있어서, 치환이 위치 2118번의 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 치환을 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
12. 제8항에 있어서, 치환이 치환 N239Q 및 N2118Q를 포함하는 것인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅷ 분자가 B 도메인이 결실된 인자 Ⅷ 분자인 재조합 인자 Ⅷ 분자.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 인자 Ⅷ 분자를 코딩하는 단리된 핵산.
15. 제14항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
16. 제15항의 발현 벡터를 포함하는 당화 수행능이 있는 숙주 세포.
17. 제16항의 당화 수행능이 있는 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물.
18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 인자 Ⅷ 분자를 포함하는 제약 조성물.
19. 제20항에 있어서, 보관을 위해 동결건조되고, 투여를 위해 액체로 재구성될 수 있는 조성물.
20. 인자 Ⅷ 요법을 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 인자 Ⅷ 분자, 또는 제18항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인자 Ⅷ 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법.
21. 인자 Ⅷ 요법을 필요로 하는 환자에게 인자 Ⅷ 분자를 코딩하는 치료학적 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인자 Ⅷ 요법을 필요로 하는 환자를 유전자 요법에 의해 치료하는 방법.
    

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