KR20040106424A - 인자 ⅶ 또는 ⅶ에이 폴리펩티드 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인자 VII(FVII) 또는 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드의 신규한 폴리펩티드 변이체로, 위치 10과 32에 아미노산 치환체로 구성된 변이체로, 이 변이체는 Gla 도메인 외측에in vitro글리코실화 부위를 도입시킬 수 있는 당 부분을 추가 포함한다. 이와 같은 폴리펩티드 변이체는 특히 외상과 같은 응혈 관련 질환 치료에 특히 유용하다.

Description

인자 Ⅶ 또는 Ⅶ에이 폴리펩티드 변이체{FACTOR VII OR V11a POLYPEPTIDE VARIANTS}

혈액 응고는 다양한 혈액 성분(또는 인자)의 복잡한 상호작용으로 구성된 과정으로 종국에는 피브린 응혈이 된다. 일반적으로 "응고 연쇄반응"이라고 하는 과정에 참여하는 혈액 성분은 프로엔자임(proenzymes) 또는 자이모겐(zymogens) 즉, 활성 물질 작용에 의해 활성형으로 전환되는 효소적으로 비활성 단백질등이다. 이들 응고 인자들 중 하나가 FVII이다.

FVII는 간에서 합성되는 비타민 K-의존성 혈장 단백질로써 분자량이 53kDa인 단일 쇄 당단백질로 혈액으로 방출된다(Broze & Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255:1242-1247). FVII 자이모겐은 R152-I153의 단일 부위에서 단백질 전단에 의해활성형(FVIIa)으로 전환되고, 이는 하나의 이황화 다리에 의해 연결된 두 개 쇄가 된다. FVIIa와 조직 인자가 복합되어(FVIIa 복합체) 인자 IX 및 인자 X를 활성형으로 변환시킬 수 있고, 이어서 신속한 트롬빈 생산 및 피브린 형성을 유도한다(Osterud & Rapaport, Proc Nad Acad Sci USA 1977; 74:5260-5264).

FVII는 비타민 K-의존성 카르복실화 반응을 포함하는 전사후 변형을 하여, 분자의 N-단부에 10개의 γ-카르복시글루타민산 잔기를 가지게 된다. 따라서, SEQ ID No: 2에서 볼 수 있는 잔기 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 35는 FVII 활성에 중요한 Gla 도메인에 있는 γ-카르복시글루타민산 잔기이다. 다른 전사후 변형에는 각각 145 및 322번 위치에 자연 발생 N-글리코실화 부위에 당을 부착키는 것도 포함되고, 각각 52 및 60번 위치에 O-글리코실화 부분에 당을 부착시키는 것도 포함된다.

사람 FVII(hFVII)을 코딩하는 유전자는 염색체 13의 q34qter 9(de Grouchy et al., Hum Genet 1984; 66:230-233)에 메핑되어 있다. 여기에는 9개 엑손이 포함되고, 12.8Kb에 걸쳐있다(O'Hara et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:5158-5162). FVII의 유전자 조직과 단백질 구조는 다른 비타민-K 의존성 단백질과 유사한데; 엑손 la 및 lb는 시그날 서열을 인코드하고; 엑손 2는 프로펩티드 및 Gla 도메인을 인코드하고, 엑손 3은 짧은 소수성 부분을 인코드하고; exon 4와 5는 상피 생장 인자 형 도메인을 인코드하고; exon 6부터 8까지는 세린 프로테아제 촉매 도메인을 인코드한다(Yoshitake et al., Biochemistry 1985; 24: 3736-3750).

hFVIIa의 실험적인 3차원 구조에 대한 보고서도 있고(Pike et al., PNAS.U.S.A., 1999; 96:8925-30 and Keniball-Cook et al., J.Struct.Biol, 1999; 127:213-223); X-결정학 방법을 사용한 가용성 조직 인자와 복합된 hFVIIa의 3차원 구조에 대한 보고서도 있으며(Banner io et al., Nature, 1996; 380:41 and Zhang et al., J.Mol.Biol, 1999; 285: 2089); hFVII의 더 작은 단편의 3차원 구조에 대한 보고서도 있다(Muranyi et al., Biochemistry, 1998; 37:10605 and Kao et al., Biochemistry, 1999; 38:7097).

FVII의 일부 단백질-조작된 변이체에 대해 보고된 것도 있다(Dickinson & Ruf, J Bio Chem, 1997;272:19875-19879, Kemball-Cook et al., J Biol Chem, 1998; 273:85168521, Bharadwaj et al., J Biol Chem, 1996; 271:30685-30691, Ruf et al., Biochemistry, 1999; 3 8:1957-1966; WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; US 5,580,560.

BHK 또는 다른 포유류 세포에서 FVII의 발현에 대한 보고서도 있다(WO 92/15686, WO 91/11514, WO 88/10295) 및 진핵 세포에서 FVII와 kex2 엔도프로테아제의 공동 발현에 대해서도 보고된 바 있다(WO 00/28065).

사람의 재조합 FVIIa는 NovoSevenR로 시판되는 조제물이 있다. NovoSevenR는 혈우병 A 또는 B 환자에서 출혈을 치료할 수 있다고 명시되어 있다. NovoSevenR는 출혈에 효과적이고 신뢰할 수 있는 유일한 시판되는 rhFVIIa이다.

변형된 아르기닌 152 및 이소루이신 153이 있는 FVII 비활성형에 대해 W0 91/1154에서 언급하고 있다. 이들 아미노산은 활성 부위에 위치한다. WO 96/12800은 세린 프로테나제 저해물질에 의해 FVIIa를 비활성화시킨다고 설명하고 있으며;α-아미노산 기 I153의 FVIIa의 카르바밀화반응에 의해 비활성화된다고 Petersen et al., Eur J Biochem, 1999;261:124에서 설명하고 있다. 비활성화 형은 조직 인자에 결합 및 응혈 활성을 저해함에 있어서 야생형 FVII 또는 FVIIa와 경쟁할 수 있다. FVIIa 비활성형은 과응고 상태 예를 들면 폐혈증 환자의 심근경색 또는 혈전 쇼크를 치료하는데 이용할 수 있다고 제시하고 있다.

"Summary Basis for Approval for NovoSevenR", FDA 참고 번호 96에서는 rhFVIIa의 순환 반감기가 2.3시간으로 보고하고 있다. 원하는 치료요법적 또는 예방차원적 효과를 얻기 위해서는 상대적으로 높은 약량을 사용하고, 빈번하게 투여해야 한다. 결과적으로 적절한 약량 조절이 어렵고, 정맥으로 빈번하게 투여할 경우에 환자의 생활을 과중하게 제한할 수 있다.

외상과 같은 제어불가한 출혈을 치료하는 경우에, 인자 VIIa는 조직 인자에 결합하지 않고 인자 X를 활성화시켜 인자 Xa로 전환시키고, 이와 같은 활성화 반응은 주로 활성화된 혈액 혈소판에서 일어나는 것으로 보인다(Hedner. et al. Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2000; 11; 107-111). 그러나, hFVIIa 또는 rhFVIIa는 조직 인자 없이 인자 X에 대해 10배 낮은 활성을 갖고, 결과적으로 외상 환자의 조절불가한 출혈 치료에는 상대적으로 많은 hFVIIa 또는 rhFVIIa 약량이 요구된다. 따라서, 좀더 효과적으로(혈액 손실을 최소화시키기 위해) 조절불가한 출혈을 치료하기 위해, 조직 인자 없이 인자 X에 대해 높은 활성을 보유하고 있는 개선된 FVIIa 분자가 필요하다. 이와 같은 개선된 FVIIa 분자는 제어불가한 출혈의 경우에 투여하면, rhFVIIa와 비교하였을 경우에 응혈 시간이 줄어든다는 것을 알 수 있다(신속한 작용).

순환 반감기가 더 긴 분자는 필요 투여 횟수를 줄여줄 수 있을 것이다. 현재의 rhFVIIa 상품의 빈번한 투여와 연관하고, 개선된 치료 효과를 가지는 최적의 치료요법적 FVIIa 수준을 얻기위해서는 개선된 FVII- 또는 FVIIa-형 분자가 분명히 필요하다.

단백질의 순환 반감기를 증가시키는 한가지 방법은 단백질이 신장에서 제거되는 것을 줄이는 것이다. 단백질을 화학 기에 공액시키면, 단백질이 신장에서 제거되는 것을 감소시키는 것으로 보인다.

또한, 단백질에 화학적 기를 부착시키거나 아미노산 치환체에 이와 같은 기를 부착시키면 단백질 분해효소에 노출되는 경우 접촉에 의해 단백질 분해 효소로 인하여 단백질 분해를 효과적으로 차단할 수 있을 것이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 치료요법적 단백질 상품을 만드는데 이용되어온 화학 물질(기)중에 하나이다. WO 98/32466에서는 많은 다른 단백질중에 FVII를 폴레에틸렌 글리콜화시킬 수 있다고 하고 있으나, 이에 대한 다른 정보는 개재하지 않았다. WO 01/58935에서는 반감기가 증가된 FVII 또는 FVIIa 분자를 개발하기 위한 새로운 전략에 대해 설명하고 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 현대 rhFVIIa 치료의 또 다른 문제는 단백질 분해에 대해 분자의 불안정성이다. 단백질 분해는 동결건조된 상품과는 반대로 용액형태로 조제물을 만들 경우에 가장 큰 장애 요소가 된다. 안정한 가용성 물질을 얻는 경우에 환자가 취급하기가 훨씬 용이하고, 응급상황에서는 더 신속하게 작용하여 생명을 구할 가능성도 있다. 주요 단백질 분해 부위에서 부위 직접적인 돌연변이를 이용하여 단백질 분해를 막고자 하는 시도가 WO 88/10295에 기재되어 있다.

본 발명의 한 가지 목적은 순환 반감기가 더 길어진(따라서 필요 투여 횟수를 줄일 수 있는) 개선된 FVII 또는 FVIIa 분자를 제공하고, 이 분자들은 인자 X를 인자 Xa로 활성화시키는데, hfVIIa 또는 rhFIIa보다 훨씬 더 효과적이다(따라서 외상과 같은 제어불가능한 출혈을 좀 더 효과적으로 치료할 수 있다).

본 발명의 또 다른 목적은 생체 이용성이 증가된(예를 들면 정맥으로 투여하였을 경우에 rhFVIIa와 비교하였을 때 곡선 아래 면적이 증가된) 개선된 FVII 또는 FVIIa 분자를 제공하고, 이 분자들은 인자 X를 인자 Xa로 활성화시키는데, hfVIIa 또는 rhFIIa보다 훨씬 더 효과적이다(따라서 외상과 같은 제어불가능한 출혈을 좀 더 효과적으로 치료할 수 있다).

이와 같은 목적은 하기에서 제공하는 FVII 또는 FVIIa 변이체에 의해 실현될 수 있다.

본 발명은 신규한 인자 VII 또는 VIIa 폴리펩티드 변이체에 관계하는데, 이 변이체는 아미노산 서열 위치 10 과 32에 아미노산 치환체로 구성되고, 변이체는 in vivo 상태에서 도입된 N-글리코실화 부위에 당(sugar)이 공유결합에 의해 부착되어 있는 구성을 한다.

본 발명은 또한 이와 같은 폴리펩티드 변이체를 치료에 이용하는 것에 관계하는데, 특히 다양한 응고-관련 질환 치료에 이용하는 것에 관계한다.

발명의 개요

본 발명을 넓게 보면, 본 발명은 SEQ ID No: 2에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 hFVII 또는 hFVIIa에 대해 3-15개 아미노산 변형체로 구성된 아미노산 서열을 가지는 hFVII 또는 hFVIIa 폴리펩티드 변이체에 관계하고, 이때 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 위치 10 과 32에 아미노산 치환체로 구성되고, 변이체는 Gla 도메인의 외측에 위치한in vivo상태에서 도입된 N-글리코실화 부위에 당(sugar)이 공유결합에 의해 부착되어 있는 구성을 한다.

본 발명의 또 다른 측면에서 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 관계한다.

본 발명의 또 다른 측면에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현벡터에 관계한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 발현벡터로 구성된 숙주 세포에 관계한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체 및 약학적으로 수용가능한 담체 또는 부형체로 구성된 제약학적 조성물에 관계한다.

본 발명은 또한 약물로 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 변이체 또는 제약학적 조성물에 관계한다.

본 발명의 또 다른 측면은 하기 설명 및 첨부 청구범위에서 명백하게 나타난다.

발명의 상세한 설명

정의

본 발명은 다음의 정의를 적용한다.

"공액체"(또는 "공액된 폴리펩티드" 상호교환적으로 사용)는 고분자, 친지성 분자, 당 분자 또는 유기(organic) 유도 물질와 같은 한 개 이상의 비-폴리펩티드 분자에 한 개 이상의 폴리펩티드를 공유결합에 의해 부착시켜 만들어진 이형 분자(조성 또는 키메라형)을 말한다. 적절하게는 공액체는 혈액과 같은 생리 유체에 용해될 수 있는 관련 농도 및 조건에서 용해될 수 있다. 본 발명의 공액된 폴리펩티드의 예를 들자면 글리코실화된 또는 PEG화된 폴리펩티드이다.

"공유 부착" 또는 "공유적으로 결합된"이란 의미는 폴리펩티드 변이체와 비-폴리펩티드 부분이 서로 직접적으로 공유결합에 의해 결합되거나 중재 기 가령, 다리를 만드는 스페이스 또는 연결기를 통하여 간접적으로 공유적으로 결합되는 것을 말한다.

"비-폴리펩티드 부분"이란 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산 단량체로 구성된 펩티드 고분자와는 다른 분자를 말하는 것으로, 이 분자는 본 발명의 폴리펩티드 변이체의 부착기에 공액될 수 있다. 이와 같은 분자의 바람직한 예를 들면, 고분자, 당, 친지성 화합물 또는 유기 유도된 물질등이 포함된다. 본 발명의 내용에서 비-폴리펩티드 부분이 폴리펩티드의 부착기에 의해 공액된 변이체의 폴리펩티드 부분에 연결된다고 이해하면 된다. 상기에서 설명하는 바와 같이, 비-폴리펩티드 부분이 부착기에 직접 공유적으로 결합될 수 있고 또는 다리를 만드는 스페이스 또는 연결기와 같은 중재 기를 통하여 부착기에 간접적으로 결합될 수 있다.

"폴리머 분자"는 두 개 이상의 단량체가 공유 연결에 의해 형성된 분자를 말하는데, 이들 단량체는 아미노산 잔기가 아니며, 단, 폴리머가 사람 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질인 경우에는 예외이다. "폴리머"는 "폴리머 분자"와 상호교환적으로 이용된다. 이 용어는 또한in vivo글리코실화반응(예를 들면, 선택적으로 교차-연결제를 이용하여 폴리펩티드 변이체의 부착기에 탄화수소물 분자를 공유적으로 연결하는 통상의in vitro합성 글리코실화반응)에 의해 부착된 탄화수소물질이 포함된다.in vivo글리코실화반응은 하기에서 더 논하기로 한다.

"당 부분"은 한 개 이상의 모노사카라이드 잔기로 구성된 탄화수소를 포함하는 분자를 말하는 것으로,in vivo글리코실화반응에 의해 폴리펩티드 변이체에 부착할 수 있고, 글리코실화된 폴리펩티드 변이체 형으로 폴리펩티드 변이체 공액체를 만든다. "in vivo글리코실화반응"이란 in vivo에서 일어나는 당 부분의 결합을 말하는 것으로 예를 들면, 폴리펩티드 변이체의 발현에 이용되는 글리코실화 세포에서 전사후 공정동안, N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화반응을 말한다. 정확한 올리고사카라이드 구조는 대개 해당 글리코실화되는 기관에 따라 달라진다.

"N-글리코실화 반응 부위"는 서열 N-X-S/T/C을 가지는데, 이때 X는 프롤린을 제외한 임의 아미노산 잔기이고, N은 아스파라진이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 적절하게는 세린 또는 트레오닌이 되고, 가장 바람직하게는 트레오닌이다. 적절하게는 아스파라진에 대해 위치 +3에 아미노산은 프롤린 잔기가 아니다.

"O-글리코실화 반응 부위"는 세린 또는 트레오닌 잔기의 OH-기이다.

"부착기"는 폴리펩티드 변이체의 기능기를 나타내고, 특히 아미노산 잔기 또는 탄화수소 잔기로 폴리머 분자, 친지성 분자, 당 분자 또는 유기 유도 물질과 같은 비-폴리펩티드 분자에 부착할 수 있는 것들이다.

유용한 부착기와 이와 짝을 이루는 비-폴리펩티드 부분은 하기 표에서 볼 수 있다.

[표 1]

부착기	아마노산	비-폴리펩티드부분 예시	공액방법활성화된 PEG	참고문헌
-NH2	N-단부,Lys	교분자;가령 PEG + 아미드 또는 이민기	mPEG-SPA트레실화된 mPEG	Shearwater Inc.Delgado et al,critical reviews in Therapeutic Drug Carrier systems9(3,4):249-304(1992)
-COOH	C-단부,Asp, Glu	고분자, 가령 PEG + 에스테르 또는아미기탄화수소부분	mPEG-Hzin vitro 결합	Shearwater Inc.
-SH	Cys	폴리머, 가령 PEG + 이황화, 말레이미드 또는 비닐설폰기탄화수소 부분	PEG-비닐설폰PEG-말레이미드in vitro 결합	Shearwater Inc.Delgado et al, critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems9(3,4):249-304(1992)
-OH	Ser,Thr,Lys, OH-	당부분PEG + 에스테르, 에테르, 카르바메이트, 카르보네이트	in vivo O-연결된 클리코실화 반응
-CONH2	N-글리코실화반응의 일부 Asn	당부분고분자, PEG	in vivo N-글리코실화반응
방향족잔기	Phe, Tyr, Trp	탄화수소부분	in vitro 결합
-CONH2	Gln	탄화수소부분	in vitro 결합	Yan and Wold,Biochemistry, 1984, Jul 31:23(16):3759-65
알데히드 케톤	산화된올리고사카라이드	고분자, 가령 PEG,PEG-하이드라지드	PEG화	Andresz et al., 1978, Makromol. Chem.179:301, WO 92/16555, WO 00/23114
구아니디노	Arg	탄화수소부분	In vitro 결합	Lundblad and Noyes, Chimical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc.,Florida, USA
이미다졸 링	His	탄화수소부분	In vitro 결합	구아니딘에 대해

in vivoN-글리코실화 반응에서, "부착기"는 N-글리코실화 부위(서열 N-X-S/T/C을 가지는데, 이때 X는 프롤린을 제외한 임의 아미노산 잔기이고, N은 아스파라진이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 적절하게는 세린 또는 트레오닌이 되고, 가장 바람직하게는 트레오닌이다)로 구성된 아미노산 잔기를 나타내는 것으로 구애받지 않고 사용된다. N-글리코실화반응 부위의 아스파라진 잔기가 글리코실화반응 동안에 당 부분이 결합되는 것이나 이와 같은 결합은 N-글리코실화부위에 다른 아미노산 잔기가 존재하지 않으면 일어나지 않는다.

따라서, 비-폴리펩티드 부분이 당인 경우에, 공액은 in vivo N-글리코실화 반응에 의해 이루어지고, 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변경과 연관하여 사용하였을 때, "비-폴리펩티드 부분에 부착기로 구성된 아미노산 잔기"는 in vivo N-글리코실화 부위로 구성된 한 개 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열내 in vivo 글리코실화 부위 기능을 하는 방식으로 변경된다는 것을 의미한다.

본 출원에서, 아미노산 이름 및 원소 명(가령, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, 0, C, 등)은 IUPAC 명명법(아미노산 및 펩티드의 IUPAC 명명법 및 약어(잔기 이름, 원소 이름 등), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) together with their corrections in Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985))을 근거하여 Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)에서 정의하고 있는 것을 이용한다.

"아미노산 잔기"는 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루타민산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소루이신(Ile 또는 I), 리신(Lys 또는 K), 루이신 (Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라진(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Gln 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세인(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Val 또는 V), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y) 잔기로 구성된 군에 포함된 아미노산을 말한다.

아미노산 위치를 확인하는데 이용되는 용어는 다음과 같이 설명할 수 있다; I205는 위치 205가 SEQ ID No: 2의 아미노산에 이소루이신 잔기가 차지하고 있다는 것을 말한다. I205T는 위치 205의 이소루이신 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되었다는 것을 말한다. 또는 치환을 다르게는 "/"로 표시하는데, 예를 들면, I205S/T는 위치 205의 이소루이신 잔기가 세린 또는 트레오닌 잔기로 치환되었다는 것을 말한다. 다중 치환은 "+"로 나타내는데, 예를 들면, K143N+N145T는 위치 145에 리신이 아스파라진으로, 위치 145의 아스파라진이 트레오닌으로 치환되었다는 것을 의미한다. 추가로 아미노산이 삽입되는 경우에는 다음과 같은 방식으로 나타낸다; A3(4번 위치에)이 삽입되는 경우에 A3AY(이는 위치 4에 티로신 잔기가 삽입된다는 것을 나타낸다). 아미노산 잔기 결손은 *로 나타낸다. 예를 들면, 위치 172에 발린 잔기가 결손되는 경우에는 V172*로 나타낸다. 삽입 및 치환이 동시에 일어나는 경우는 다음과 같이 나타낸다. 위치 175에 알라닌 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되고, 이어서 위치 175 다음에 루이신 잔기가 삽입되는 경우 A175TL이라고 나타낸다.

다른 언급이 없는 한, 여기에서 말하는 아미노산 번호는 hFVII/hFVIla 폴리펩티드(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열을 기준한다.

특정 돌연변이를 설명할 때 사용되는 "~와 다른"이란 특정 아미노산 차이와 별도로 추가 차이가 존재할 수 있다는 것을 의미한다.

예를 들면, N-글리코실화 부위를 in vivo 도입에 추가하여(Gla 도메인의 외부에), 폴리펩티드는 이와 같은 아미노산 잔기 도입과 연관이 없는 다른 변형을 포함할 수도 있다. 유사한 방식으로, 인지질 막 결합 친화성을 증가시키는 것을 목적으로 Gla 도메인에서 실행된 변형에 추가하여, 폴리펩티드는 이와 같은 효과에 필수적이지 않는 다른 변형도 포함할 수 있다.

따라서, 여기에서 설명하는 아미노산 변형에 추가하여, 본 발명의 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 필요하다면 다른 치환, 삽입 또는 결손과 같은 또 다른 변형을 포함할 수 있다. 이와 같은 또 다른 변형에는 N- 또는 C- 말단이 한 개 이상의 아미노산 잔기(예를 들면 1-10개 아미노산 잔기)로 절단되거나 N- 또는 C-말단에 한 개 또는 그 이상의 여분 잔기가 추가 예를 들면, C-말단 또는 그 부근에 시스테인이 도입되거나 N-말단에 메티오닌 잔기가 추가되는 경우, 그리고 "보존성 아미노산 치환" 예를 들면, 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 친수성 아미노산, 방향족 아미노산과 같은 유사한 특징을 가지는 아미노산 군내에서 치환이 일어나는 것과 같은 치환 등이 예가 된다.

이와 같은 보존성 아미노산 치환의 예는 하기 표에서 볼 수 있다.

[표 2]

1	알라닌(A) 글리신(G) 세린(S) 트레오닌(T)
2	아스파르트산(DE) 글루타민산(E)
3	아스파라진(N) 글루타민(Q)
4	아르기닌(R) 히스티딘(H) 리신(K)
5	이소루이신(I) 루이신(L) 메티오닌(M) 발린(V)
6	페닐알라닌(F) 티로신(Y) 트립토판(W)

"Gla 도메인 외측의 다른 변형"이란 단락에서 다른 추가 변형의 예를 기재하고 있다.

"뉴클레오티드 서열"이란 두 개 또는 그이상의 뉴클레오티드 분자로 된 연속적인 띠를 말한다. 뉴클레오티드 서열에는 게놈, cDNA, RNA, 반합성 및 합성 기원의 서열 또는 이들의 임의 복합된 것이 될 수 있다.

"폴리메라제 사슬 반응' 또는 'PCR'은 예를 들면, 미국 특허 4,683,195에서 설명하는 것과 같이in vitro에서 원하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 일반적인 방법을 말한다. 일반적으로, PCR 방법은 주형 핵산에 선호적으로 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 프라이머 연장 합성을 위한 반복 과정을 말한다.

"벡터"는 숙주 세포 게놈에 합체될 수 있는 또는 숙주 세포내에서 복제할 수 있는 능력을 가진 플라스미드 또는 다른 뉴클레오티드 서열을 말하는 것으로, 이와 같은 벡터의 능력은 양립할 수 있는 숙주 세포(벡터-숙주 시스템)과 함께 상이한 기능을 수행하는데 이용할 수 있는데, 뉴클레오티드 서열의 클로닝 실행, 예를 들면 서열의 사용가능한 양을 만들거나, 서열에 인코드된 유전자 생성물의 발현에 관여하거나, 숙주 세포의 게놈내로 유전자 서열을 합체시키는데 이용된다. 벡터에는 실행하는 기능에 따라 상이한 성분을 포함할 수 있다.

"세포", "숙주 세포", "세포주", "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용할 수 있는데, 이와 같은 용어에는 세포 생장 또는 배양으로부터 생성되는 후손 세포도 포함된다.

"형질변환" 및 "형질감염"은 세포로 DNA를 도입하는 과정을 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다.

"작용가능하게 연결된"이란 의미는 효소적 결찰등의 수단에 의해 두 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열이 공유적으로 결합하는 것을 말하는데, 이때, 서로에 대한 배열이 각 서열이 정상적인 기능을 할 수 있는 상태를 말한다. 예를 들면, 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프레프로테인(preprotein)으로 발현되는 경우에, 프리시퀀서 또는 분비 리더(secretory leader)를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 작용가능하게 연결되었다 할 것이고, 서열의 전사에 영향을 준다면 프로모터 또는 인헨서가 코딩 서열에 작용가능하게 연결되었다 할 것이고, 해독을 실행하도록 위치를 잡고 있다면 리보좀 결합 부위에 코딩 서열이 작용가능하도록 연결되었다고 할 것이다. 일반적으로 "작용가능하도록 연결된"이란 의미는 연결된 뉴클레오티드 서열이 접해있고, 분비 리더(secretory leader)인 경우에 접해있고, 리딩상(reading phase)에 있는 것을 의미한다. 통상의 제한 효소 부위에서 결찰에 의해 연결이 이루어진다. 이와 같은 부위가 존재하지 않는 경우에 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터 또는 링커를 표준 재조합 DNA 방법과 함께 이용한다.

본 발명의 내용에서, "변형" 또는 "아미노산 변형"은 아미노산 측쇄의 치환, 아미노산 잔기의 치환, 아미노산 잔기의 결손 또는 아미노산 잔기 삽입을 모두 포함한다.

"돌연변이" 또는 "치환"은 여기에서 호환적으로 이용되었다.

"도입"이란 기존의 아미노산 잔기를 대체시키기 위해 아미노산 잔기를 도입시키는 것을 말하거나 또는 추가로 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 말한다.

"제거"란 또 다른 아미노산 잔기에 의해 제거할 아미노산 잔기를 대체시키거나 또는 제거될 아미노산을 치환없이 없애는 것을 말한다.

"FVII" 또는 "FVII 폴리펩티드"는 단일 쇄의 FVII 분자를 말한다. FVII 폴리펩티드의 한 예는 SEQ ID No: 2에서 나타낸 야생형 사람 FVII(hFVII)이다. 그러나, "FVII 폴리펩티드"에는 SEQ ID No: 2의 변이체 또는 단편과 같은 hFVII-유사 분자, 특히 SEQ ID No: 2와 비교하였을 때, 1-15 예를 들면 1-10개 변형중 적어도 한 개를 가지는 서열로 된 변이체가 포함된다.

"rFVIIa" 또는 "FVIla 폴리펩티드"는 적어도 활성화된 두 개 쇄를 가지는 FVIIa 분자를 말한다. SEQ ID No: 2의 아미노산 서열이 FV11a 아미노산 서열을 설명하는데 사용되는 경우에, 단일 쇄의 R152와 I153사이에 펩티드 결합이 절단되었고, 이 쇄중 하나는 아미노산 잔기 1-152로 구성되고, 다른 쇄는 아미노산 잔기 153-406로 구성된다.

"rFVII" 또는 "rFVIIa"는 재조합 기술에 의해 만들어진 FVII 및 FVIIa 폴리펩티드를 말한다.

"hFVII" 및 "hFVIIa"는 SEQ ID No: 2의 아미노산 서열을 가지는 각 사람의 야생형 FVII 및 FVIIa을 말한다. NovoSeven?가 rhFVIIa의 한 가지 예가 된다.

여기에서 사용된 바와 같이, "Gla 도메인"은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1 내지 45를 포함한다.

따라서, "Gla 도메인의 외측에 위치한"이란 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 46-406을 포함한다.

"TF" 및 "TFPI"는 조직 인자 및 조직 인자 경로 저해물질을 의미한다.

"프로테아제 도메인"은 N-말단으로부터 헤아려서 잔기 1530406의 잔기를 말한다.

"촉매 부위"는 폴리펩티드 변이체의 S344, D242, H193으로 3성분 촉매를 말한다.

"모체"는 본 발명에 따라 변형/개량될 분자를 말한다. 본 발명에 의해 변형될 모체 폴리펩티드는 임의 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드가 될 수 있고, 이들은 사람이 아닌 포유류에서 유도될 수도 있지만, 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 hFVII 또는 hFVIIa가 좋다. "변이체"는 모체 폴리펩티드와 한 개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드, 보통 3-15개 아미노산 잔기(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 아미노산 잔기)가 상이한 폴리펩티드 예를 들면, 3-8 또는 3-5개와 같이 3-10개 범위의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드가 된다. 환원하면, "변이체"에는 모체 폴리펩티드에 대해 일반적으로 3-15개 아미노산 잔기(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 아미노산 잔기)가 상이한 폴리펩티드 예를 들면, 3-8 또는 3-5개와 같이 3-10개 범위의 아미노산 변형 잔기를 포함한다. 본 내용에서, "변형"이란 삽입, 결손, 치환 및 이의 복합적인 것을 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 변이체는 Gla 도메인의 10 및 32(Gla 도메인에 위치한)에 변형되고, Gla의 외측의 한 위치에 변형이 있어 적어도 3개 위치에서 변형된다. 이때 적어도 한 개 변형은 in vivo N-글리코실화 반응 부위를 만든다.

"응고 활성"이란 여기에서 설명하고 있는 "응고 검사"에서 측정되는 활성을 말한다. 본 발명의 활성형 변이체에 의한 "응고 활성"을 나타내기 위해, 여기에서 설명하는 "응고 검사"를 하였을 때, rhFVIIa의 응고 활성의 적어도 10%를 가져야 한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 활성형 변이체는 rhFVIIa의 응고 활성의 적어도 20%, 예를 들면, 30%, 40%, 좀더 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70%, 좀더 바람직하게는 적어도 80%, 90%의 활성을 가진다. 구체예에서, 활성형 변이체는 rhFVIIa의 75 내지 125% 응고 활성을 가지는 등의 rhFVIIa와 동일한 응고 활성을 실제 가진다.

"아미드 분해 활성"이란 여기에서 설명하는 "아미드 분해 검사"에서 측정되는 활성을 의미한다. 본 발명의 활성형 변이체의 "아미드 분해 활성"은 여기에서 설명하는 "아미드 분해 검사"에서 측정하였을 때, rhFVIIa의 아미드 분해 활성의 적어도 10%를 보유해야 한다. 본 발명의 활성형 변이체는 rhFVIIa의 아미드 분해 활성의 적어도 20%, 예를 들면, 30%, 40%, 좀더 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70%, 좀더 바람직하게는 적어도 80%, 90%의 활성을 가진다. 구체예에서, 활성형 변이체는 rhFVIIa의 75 내지 125% 아미드 분해 활성을 가지는 등의 rhFVIIa와 동일한 아미드 분해 활성을 실제 가진다.

본 내용에서, "활성"이란 FX 또는 FXa를 활성화시키는 변이체와 연관하여 사용된다. 이와 같은 활성은 "FX 활성화 활성" 또는 "FXa 생성 활성"이라고 한다.

"증가된 FX 활성화 활성" 또는 "증가된 FXa 생성 활성"은 본 발명의 활성형 변이체가 rhFVIIa과 비교하였을 때 FX 또는 FXa를 활성화시키는 능력이 통계학적으로 유의성있는 수준으로 증가되었다는 것을 말한다. 본 발명의 활성형 변이체가 어느 정도 증가된 FX 활성화 활성을 보유하는 지는 여기에서 설명하는 "TF-독립적 인자 X 활성화 검사"로 편리하게 측정할 수 있다.

"더 강력한 응고" 또는 "증가된 응고 강도"는 비교가능한 조건하에서 측정하였을 때, 폴리펩티드 변이체의 응고 강도가 rhFVIIa에 발휘되는 강도에 대해 통계적으로 유의적인 정도로 증가되었다는 것을 말한다. 이와 같은 효과는 여기에서 설명하는 "Thrombogram Assay"로 측정하여 본 발명의 활성형 변이체에 의해 발휘되는 곡선 아래 면적(AUCthrom)으로 측정할 수 있다. 유사한 방식으로, "증가된 AUC_throm"는 여기에서 설명하는 "Thrombogram Assay"로 측정하여 본 발명의 활성형 변이체에 의해 발휘되는 곡선 아래 면적이 rhFVIIa에 발휘되는 것에 비하여 통계적으로 유의적인 정도로 증가되었다는 것을 말한다.

"Tmax"는 "Thrombogram Assay"에서 최대 트롬빈 활성 수준을 얻는데 소요되는 시간을 말한다.

주어진 물질에 대해 사용된 "면역원성"은 면역계로부터 반응을 유도하는 물질의 능력을 말한다. 면역 반응은 세포 또는 항체 중재 반응이다(Roitt: Essential hnmunology (8 th Edition, Blackwell) for further definition of immunogenicity) 보통 감소된 항체 반응성은 면역원성이 감소되었다는 것을 나타낸다. 감소된 면역원성은in vivo또는in vitro에서 당분야에 공지된 임의 적절한 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

"in vivo기능성 반감기"는 폴리펩티드의 활성이 초기 값의 50%가 되는 시간 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성의 50%가 체내 또는 표적 기관에 존재하는 시간을 통상 의미한다.

in vivo기능성 반감기를 결정하는 또 다른 대안으로 "혈청 반감기" 체내로부터 제거되기 전 혈청 또는 혈류에 폴리펩티드의 50%가 순환되는 시간을 말한다. 혈청 반감기를 측정하는 것은in vivo기능성 반감기를 결정하는 것보다는 훨씬 용이하고, 혈청 반감기는in vivo기능성 반감기의 우수한 지표가 된다. 혈청 반감기에 또 다른 대안적인 용어는 "혈장 반감기", "순환 반감기", "혈청 제거", "제거 반감기"등이 포함된다. 망상내피계(RES), 신장, 쥐라, 간, 조직인자, SEC 수용체 및 다른 수용체 중개된 제거, 특이적 또는 비특이적 단백질분해중 한가지 이상의 작용에 의해 폴리펩티드가 제거된다. 보통, 제거과정은 크기(사구체의 여과에 걸리는 크기에 대래), 전하, 부착된 탄화수소 쇄, 단백질에 대한 세포 수용체 존재 등에 따라 달라진다. 존속시키는 능력은 전구응고, 단백질 분해성 또는 수용체 결합 활성에서 선택된다.in vivo기능 반감기 및 혈청 반감기는 당분야에 공지된 임의 적절한 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

in vivo기능 반감기 및 혈청 반감기에서 이용된 "증가된"이란 의미는 변이체의 폴리펩티드 관련 반감기가 필적한 정도의 조건에서 측정되었을 때, rhFVIIa의 것에 비하여 통계학적으로 유의성있게 증가되었다(일반적으로 토끼, 돼지, 원숭이, 쥐와 같은 실험동물에서 특정하였을 때)는 것을 나타낸다.

"AUC_iv," 또는 "정맥으로 투여하였을 경우에 곡선 아래 면적"은 쥐의 정맥으로 폴리펩티드 변이체를 투여하였을 경우에 특히 혈청-시간 곡선에서 활성 아래 면적을 의미한다. 일반적으로, 측정된 활성은 여기에서 정의된 것과 같이 "응고 활성"을 말한다. 실험적으로 활성-시간 점이 측정되었다면, AUC_iv,는 GraphPad Prism 3.01과 같은 컴퓨터 프로그램으로 편리하게 계산할 수 있다. 상이한 분자(가령, 본 발명의 변이체와 rhFVIIa와 같은 기준이 되는 분자)간에 직접적인 비교를 하기 위해서는 동일한 활성양을 투여해야 한다. 결과적으로, AUCiv-수치는 일반적으로 표준화시키고(주사한 양에서 차이를 보정), 투여된 양은 AUCiv/약량으로 나타낸다.

"단백질 분해에 대한 감응성 감소" 필적할만한 조건하에서 hFVIIa 또는 rhFVIIa와 비교하였을 때 단백질 분해에 대한 감응성이 폴리펩티드 변이체는 감소되었다는 말한다. 적절하게는 단백질 분해는 적어도 10%(예를 들면 10-25% 또는 10-50%), 적어도 25%(예를 들면, 25-50%, 25-75%, 25-100%), 좀더 바람직하게는 적어도 35%, 적어도 50%(예를 들면 50-75% 또는 50-100%), 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 75%(예를 들면 75-100%) 또는 적어도 90% 감소된다. 가장 바람직하게는 단백질 분해는 적어도 100% 감소된다.

"신장 제거"란 신장에 의한 사구체 여과, 관(tubular) 방출 또는 관 세포에서 분해에의해 일어나는 제거를 말한다. 신장 제거는 폴리펩티드의 크기(직경), 유체역학적 용적, 대칭, 모양/견고성, 전하등을 포함하는 폴리펩티드의 특징에 따라 달라진다. 보통 신장 제거에 차단치는 분자량이 약 67kDa으로 간주한다. 신장 제거정도는in vivo검사에서 정립된 적절한 방법으로 확인할 수 있다. 일반적으로 신장 제거는 환자에 라벨된(방사능 라벨된 또는 형광 라벨된) 폴리펩티드를 투여하여 소변을 받아 뇨에 있는 라벨 활성을 측정하여 결정한다. 신장 제거 감소는 필적할만한 조건하에서 rhFVIIa와 같은 상응하는 기준에 대비하는 값을 측정한다. 바람직하게는 폴리펩티드의 신장 제거 비율은 rhFVIIa에 비교하였을 때 적어도 50%, 75%, 가장 적절하게는 적어도 90% 감소되었다.

"분자의 표면에 노출된 폴리펩티드의 측쇄의 최소 25%" 및 "분자의 표면에 노출된 폴리펩티드의 측쇄의 최소 50%"는 실시예 1에서 정의하고 계산하는 방법도 상술하고 있다.

"분자의 표면에 노출된 폴리펩티드의 측쇄의 최소 25%" 및 "분자의 표면에 노출된 폴리펩티드의 측쇄의 최소 50%"란in vivoN-글리코실화 부위 도입과 연관하여 사용되는데, 당(sugar)이 실제 부착되는 위치에 아미노산 측쇄의 표면 접근성을 말하는 것이다. 많은 경우에, 당이 실제 부착되는 아스파라진 잔기에 대해 +2 위치에 세린 또는 트레오닌를 도입할 필요가 있을 것이고(물론 이 위치에 세린 또는 트레오닌이 차지하지 않는 경우), 분자 표면에 노출되는 측쇄가 25% 또는 50% 미만이 되도록 세린 또는 트레오닌 잔기가 도입되는 이들 위치는 숨겨지게 된다.

"조직 인자 결합 부위", "활성 부위 부분", "활성 부위 결합 틈의 봉우리"는 실시예 1을 참고하고, 실시예 1에서 상기 언급한 부분/부위를 결정한다.

"소수성 아미노산 잔기"에는 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린 (V), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)과 같은 아미노산 잔기들이 포함된다.

"음전하를 띄는 아미노산 잔기"에는 아스파르트산(D) 및 글루타민산(E)가 포함된다.

"양전하를 띄는 아미노산 잔기"에는 리산(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)이 포함된다.

본 발명의 변이체

넓은 의미에서 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 3-15개 아미노산 잔기가 변형된 FVII 또는 FvIIa 폴리펩티드에 관계하고, 이때 변이체의 아미노산 서열은 위치 10 및 32에 아미노산 치환체로 구성되고, Gla 도메인의 외측에 위치한in vivoN-글리코실화반응으로 도입된 부위에 당(sugar)이 결합된다.

모체 FVII 폴리펩티드의 상기 두 부분에서 실행된 변형은 다음과 같은 목적을 수행한다.

Gla 도메인의 외측 위치에서 일어난 변형(in vivoN-글리코실화반응 부위 도입)은 변이체의 AUCiv,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기가 rhFVIIa의 것과 비교하였을 때 증가되는 특정에 바람직하다.

모체 폴리펩티드의 Gla 도메인에서 실행되는 변형은 생성된 분자의 인지질 막 결합 친화성을 증가시키게 하고, 생성된 분자가 FX 또는 FXa를 활성화시키는 개선된 능력을 가지게 하고, 더 강한 응고가 형성되도록 하는데 적절하다.

임의 특정 이론에 한정을 하지 않고, 막 친화성의 증가는 다른 응고 인자, 특히 FX에 매우 근접한 활성화된 폴리펩티드 변이체가 국소적으로 더 높은 농도를 가지도록 하는 것으로 보인다. 따라서, FX에 대해 활성화된 FXII 변이체의 분자 비율이 단순히 더 크기 때문에 FXa 에 대한 FX의 활성 비율이 더 클 것이다. FX 활성화 비율이 증가되면 활성 트롬빈의 양이 더 많아지게되고, 따라서 피브린의 교차 결합 비율도 더 커지게 된다.

따라서, 본 발명의 적절한 구체예에서, 모체 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드가 변형되어 생성된 활성 폴리펩티드 변이체는 rhFVIIa와 비교하였을 때 다음의 특징을 가진다:

i) 생체 이용성(AUC_iv) 증가, 인지질 막 결합 친화력 증가;

ii) 생체 이용성(AUC_iv) 증가, FX를 FXa로 활성화시키는 능력의 증가;

iii) 생체 이용성(AUC_iv) 증가, 더 강력한 응고를 만들 수 있는 능력(AUCthrom 증가);

iv) 생체 이용성(AUC_iv) 증가, T_max감소;

v) in vivo 기능 반감기 증가 및 인지질 막 결합 반감기 증가;

vi) in vivo 기능 반감기 증가 및 FX에서 FXa로 활성화시키는 능력의 증가;

vii) in vivo 기능 반감기 증가 및 더 강한 응고 생성(증가된 AUC_throm);

viii) in vivo 기능 반감기 증가 및 T_max감소;

ix) 혈청 반감기 증가 및 인지질 막 결합 친화력 증가;

x) 혈청 반감기 증가 및 FX에서 FXa로 활성화시키는 능력의 증가;

xi) 혈청 반감기 증가 및 더 강한 응고를 만드는 능력(증가된 AUC_throm);

xii) 혈청 반감기 증가 및 T_max감소.

결론적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드 변이체를 이용한 치료는 현재 이용되는 rhFVIIa 화합물(NovoSeven?)과 비교하였을 때, 투여 약량의 감소, 주사 빈도 감소, 응고 강도 증가, 신속한 작용등의 많은 장점을 제공한다.

따라서, 본 발명의 적절한 변이체는 활성형이며, rhFVIIa와 비교하였을 때, 생쥐의 정맥으로 변이체를 투여하는 경우에 특히 곡선 아래 면적이 증가되었다(AUC_iv).

따라서, 본 발명의 적절한 변이체는 활성형으로 rhFVIIa와 비교하였을 때, 생쥐의 정맥으로 변이체를 투여하는 경우에 특히 곡선 아래 면적이 증가되었다(AUC_iv). 좀더 구체적으로, 생쥐에 정맥으로 투여하는 경우에 본 발명의 변이체는 활성형인 경우의 AUC_iv가 rhFVIIa의 AUC_iv과 비교하면 적어도 그 비율이 1.25가 되고, 예를 들면, 1.5, 1.75, 바람직하게는 2, 3, 좀더 바람직하게는 4, 5 정도가 된다.

이와 같은 효과는 rhFVIIa와 비교하였을 때in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기를 증가시키는 것에 상응한다(반드시 그럴 필요는 없지만).

따라서, 본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, 활성형 변이체의in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기와 rhFVIIa의in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기의 비율은 적어도 1이 된다. 좀더 적절하게는 활성형 변이체의in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기와 rhFVII 또는 rhFVIIa의in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기의 비율은 적어도 1.5, 1.75, 2, 좀더 바람직하게는 3, 4, 5가 된다.

인지하는 바와 같이, 본 발명의 변이체는 상기 설명된 기능(가령, AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기 증가에 추가하여, rhFVIIa와 비교하여 인지질 막 결합 친화력 증가, FX를 FXa로 활성화시키는 능력 증가, 더 강한 응고를 만드는 능력(AUC_throm증가), T_max감소시키는 능력을 보유한다.

따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 폴리펩티드 변이체는 AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기 증가에 추가하여, rhFVIIa와 비교하여 인지질 막 결합 친화력 증가되었다. 당업자에 공지된 방법, 가령, BiacoreR 검사(K. Nagata, and H. Handa (Ads.), Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions, Springer-Verlag, Tokyo, 2000, Chapter 6 entitled "Lipid-Protein Interactions")를 이용하여 막 결합 친화력을 측정할 수 있다. 또는, WO 99/20767의 실시예 1에서 설명하는 것과 같은 방법으로 막 결합 친화력을 측정할 수 있다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 폴리펩티드 변이체는 AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기 증가에 추가하여, rhFVIIa와 비교하였을 때, TF-독립적인 방법 예를 들면 여기에서 설명하고 있는 "TF-독립적인 인자 X 활성화 검사" 검사하였을 때, FX 활성화 활성이 증가되었다. 특히, 활성형 폴리펩티드 변이체의 FX 활성화 활성과 rhFVIIa의 FX활성화 활성 비율은 "TF-독립적인 인자 X 활성화 검사"로 측정하면 적어도 1.25가 된다. 좀더 바람직하게는 활성형 폴리펩티드 변이체의 FX 활성화 활성과 rhFVIIa의 FX활성화 활성 비율은 "TF-독립적인 인자 X 활성화검사"로 측정하면 적어도 1.5, 1.75, 2, 좀더 바람직하게는 적어도 3, 4, 적어도 5, 더욱 바람직하게는 6, 7, 8, 가장 바람직하게는 9 내지 10이 된다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 폴리펩티드 변이체는 AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기 증가에 추가하여, rhFVIIa와 비교하였을 때, 더 강력한 응혈을 만든다. 이 효과는 여기에서 설명하고 있는 "Thrombogram Assay"를 이용하여 측정할 수 있는데, 곡선 아래 면적의 증가(AUCthrom 증가)로 확인할 수 있다. AUC_throm는 또한 "전체 트롬빈 작용"으로 나타내는데, 이는 형성된 응혈 강도를 측정하는 것으로 구성된다. 좀더 구체적으로, 본 발명의 활성형 변지체에 의해 생성되는 AUCthrom와 rhFVIIa에 의해 생성되는 AUC_throm간의 비율은 "Thrombogram Assay"를 이용하여 측정하였을 때, 적어도 1.15가 된다. 좀더 바람직하게는 비율은 적어도 1.2, 1.25, 1.3, 좀더 바람직하게는 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 적어도 1.8, 1.9 또는 2가 된다.

본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, 폴리펩티드 변이체는 AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기 증가에 추가하여, rhFVIIa와 비교하였을 때,더 빠른 작용을 한다. 이와 같은 효과는 여기에서 설명하고 있는 "Thrombogram Assay"를 이용하여 측정할 수 있는데, 트롬빈 수준이 최대치(T_max)로 도달하는데 소요되는 시간의 감소로 나타낸다. 따라서, 적절한 변이체는 활성형 변이체의 T_max와 rhFVIIa의 T_max비율이 "Thrombogram Assay"를 이용하여 측정할 경우 최대 0.9 가령, 0.8, 0.7, 바람직하게는 0.6 내지 0.5가 된다.

Gla 도메인의 외측에 위치한 in vivo N-글리코실화 반응 부위 도입

WO 01/58935에서는 AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 또는 혈청 반감기 증가를 유도하는 여러 가지 방법에 대해 설명하고 있다. WO 01/58935에 설명하고 있는 변이체는 개선된 FVII 또는 FVIIa를 만드는 일반적으로 새로운 전력을 나타낸 것으로 본 발명의 모체 FVII 또는 FVIIa에도 이용될 수 있다.

변형될 위치는 조직 결합 부위의 외측에 위치한 FVII 또는 FVIIa의 일부분에서 선택하거나 활성 결합 부위 틈의 봉우리 외측에 위치한 FVII 또는 FVIIa의 일부분에서 선택할 수 있다. 이들 부위/부분은 실시예 1에서 확인되었다. 그러나, 특정 상황, 예를 들면 비활성형 폴리펩티드를 원하는 경우에는 이들 부위에 또는 근접하여 변형을 하면 유익할 수도 있다. 예를 들면, FVII 또는 FVIIa의 활성 부위 부분 또는 부위 결합 틈의 봉우리에 한 개 이상의in vivoN-글리코실화 부위를 도입하는 것도 유익할 수 있다. 활성 부위 부분, 조직 인자 결합 부위, 활성 부위 결합 틈의 봉우리는 실시예 1에서 정의하고, 다음 잔기들로 구성된다; I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358,T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400, F405(활성 부위 부분);

L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325, R379(조직 인자 결합 부위); 그리고

N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321, T370(활성 부위 결합 틈의 봉우리).

모체 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드에 Gla 도메인의 외측에 변형될 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 10개를 넘지 않는다(SEQ ID NO:2에 나타난 아미노산 서열과 비교하여). 적절하게는 FVII 또는 FVIIa 변이체는 SEQ ID NO:2에 아미노산 잔기 46-406에서 1-10개 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열로 구성되는데, 일반적으로는 1-8개 또는 2-8개 잔기, 예를 들면, 1-5, 2-5, 1-4 또는 1-3개 아미노산 잔기가 상이한 서열로 구성되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 46-406에서 1, 2, 3개 아미노산 잔기가 상이한 서열로 구성된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체에는 1-10개(추가 또는 도입된)in vivoN-글리코실화 부위를 포함하는데, 일반적으로 1-8 또는 2-8개(추가 또는 도입된)in vivoN-글리코실화 부위 예를 들면, 1-4 또는 1-3(추가 또는 도입된)in vivoN-글리코실화 부위, 1, 2, 3개(추가 또는 도입된)in vivoN-글리코실화 부위를 포함한다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드 변이체에는 1-10개(추가 또는 도입된) 당(sugar) 부분을 포함하는데, 일반적으로 1-8 또는 2-8개(추가 또는 도입된) 당(sugar) 부분 예를 들면, 1-4 또는 1-3(추가 또는 도입된) 당(sugar) 부분, 1, 2, 3개(추가 또는 도입된) 당(sugar) 부분을 포함한다. 도입된 당(sugar) 부분은 도입된in vivoN-글리코실화 부위에 공유적으로 결합된다는 것을 인지할 것이다.

본 발명의 내용에서, "자연 발생적인 글리코실화 부위"는 N145, N322, S52, S60 위치에 글리코실화 부위를 포함한다. 유사한 방식으로 "자연 발생적으로 생성되는in vivo O-글리코실화 부위"에는 S52와 S60 위치가 포함되고, 이에 반하여 "in vivoN-글리코실화 부위"에는 N145, N322가 포함된다.

한 개이상의 당이in vivoN-글리코실화 부위에 공유적으로 부착된 것으로 구성된 한 개 이상의 폴리펩티드 변이체를 만들기 위하여, 폴리펩티드 변이체는 글리코실화 부위에서 당(올리고사카라이드)를 부착시킬 수 있는 숙주 세포에서 발현되거나 대안으로in vivo글리코실화되어야 한다. 글리코실화반응을 하는 숙주 세포의 예는 "당 부분에 결합"이라는 제목의 단락에서 제공한다.

in vivo글리코실화 부위를 도입하는 위치로는 표면에 노출되는 측쇄의 25%를 가지는 아미노산 잔기(실시예 1에서 정의한 바와 같은)로 구성된 위치가 포함되나 이에 한정하지 않으며, 이와 같은 위치는 표면에 노출되는 측쇄의 25%를 가지는 아미노산 잔기(실시예 1에서 정의한 바와 같은)로 구성된다. 일반적으로,in vivo글리코실화 부위는 치환에 의해 도입되나, 삽입도 고려할 수 있다. 이 위치는 조직 인자 결합 부위 또는 활성 부위 부분 또는 활성 부위 틈의 외측에 위치한 분자의 일부분에서 선택하는 것이 바람직하다. "표면에 노출되는 측쇄의 25%"는in vivo글리코실화 부위 도입과 연계하여 사용될 때, 이 용어는 당 부분이 실제 부착되는 위치에 아미노산 측쇄에 표면 근접성을 말한다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 많은 경우에, 당이 실제 부착되는 아스파라진 잔기에 대해 +2 위치에 세린 또는 트레오닌를 도입할 필요가 있을 것이고(물론 이 위치에 세린 또는 트레오닌이 차지하지 않는 경우), 분자 표면에 노출되는 측쇄가 25% 미만이 되도록 세린 또는 트레오닌 잔기가 도입되는 이들 위치는 숨겨지게 된다.

in vivo글리코실화 부위를 만드는 이와 같은 치환의 특정한 그리고 바람직한 예는 다음 군에서 선택된 치환체가 포함될 수 있다; A51N, G58N, T106N. K109N. G124N. K143N+N145T. A175T. I205S, I205T. V253N. T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N 및 이의 복합체.

좀더 바람직하게는 다음의 군에서 선택되는 치환에에 의해in vivo글리코실화 부위가 도입된다; A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+Nl45T, A175T, I205T, V253N. 5T267N+S269T, S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N, D334N 및 이의 복합체. 좀더 바람직하게는 다음의 군에서 선택되는 치환에에 의해in vivo글리코실화 부위가 도입된다; T106N, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T 및 이의 복합체, 특히 I205T.

한 구체예에서 치환에 의해 오직 한 개in vivo글리코실화 부위가 도입된다. 또 다른 구체예에서, 치환에 의해 두 개 또는 그 이상의in vivo글리코실화 부위가 도입된다. 두 개 또는 그 이상의in vivo글리코실화 부위를 만드는 적절한치환에는 다음의 군에서 선택된다; A51N+G58N, A51N+TI06N, A51N+KlO9N, A51N+GI24N, A51N+Kl43N+NI45T, A51N+Al75T, A51N+I205T, A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+TI06N. G58N+KI09N, G58N+Gl24N, G58N+KI43N+Nl45T, G58N+Al75T, G58N+1205T. G58N+V253N, G58N+T267N+S269T. G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+KlO9N. T106N+GI24N, T106N+Kl43N+Nl45T, T106N+Al75T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T. T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N. K109N+Gl24N, K109N+Kl43N+NI45T, K109N+Al75T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+Nl45T, G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T. G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N. K143N+N145T+Al75T, K143N+N145T+I205T, K143N+Nl45T+V253N, K143N+Nl45T+T267N+S269T, K143N+Nl45T+S314N+K316T, K143N+Nl45T+R315N+V317T, K143N+NI45T+K316N+G318T, K143N+Nl45T+G318N, K143N+Nl45T+D334N, A175T+1205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T. A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N. I205T+T267N+S269T. I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N. I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T,V253N+K316N+G31ST, V253N+G318N, V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N, G318N+D334N. 좀더 바람직하게는 치환체는 다음의 군에서 선택된다; T106N+Al75T, T106N+1205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, V253N+T267N+S269T. 좀더 바람직하게는 T106N+I205T, T106N+V253N, I1205T+T267N+S269T에서 선택된다.

또 다른 구체예에서, 치환에 의해 3개 또는 그 이상의in vivo글리코실화 부위를 도입하였다. 이와 같은 3개 또는 그 이상의in vivo글리코실화 부위를 만드는데 적절한 치환체로는 I205T+ V253N+T267N+S269T 및 T106N+I205T+V253N에서 선택될 수 있다.

상기에서 논의 한 바와 같이,in vivo글리코실화 부위는 여기에서 정의하고 있는 활성 부위 부분과 활성 부위 결합 틈의 봉우리의 일부 또는 조직 인자 결합 부위의 일부를 형성하는 위치를 제외한 부위에 도입되는 것이 적절하다. 이와 같은 글리코실화 변이체는 하기에서 정의하는 바와 같이 활성 폴리펩티드 변이체에 주로 속하는 것으로 확인되었다.

상기 논의된 위치에in vivo글리코실화 부위를 도입시키는 또 다른 방법은 동일한 위치에 시스테인 잔기를 치환 또는 삽입에 의해 도입시킬 수 있고, 이때 이위치에는 도입된 시스테인 잔기가 mPEG와 같은 PEG의 비-폴리펩티드 부분에 공유적으로 결합된다. 따라서, 시스테인 잔기가 도입되는 위치를 예를 들면, 표면에 노출된 측쇄가 최소 25%인 아미노산 잔기를 위치를 포함하나(실시예 1에서 정의한 바와 같은) 이에 한정시키지 않으며, 예를 들면, 표면에 노출된 측쇄가 최소 50%인 아미노산 잔기를 위치를 포함한다(실시예 1에서 정의한 바와 같은). 이 위치는 조직 인자 결합 부위 또는 활성 부위 부분 또는 활성 부위 틈 봉우리 외측에 위치하는 분자의 일부분에서 선택하는 것이 바람직하다. 이들 위치/부분들은 실시예 1에서 확인된 바 있다. 따라서,in vivo글리코실화 부위 부위를 도입하는 것에 대해서 필요한 변경을 가하여 시스테인 잔기 도입에 적용할 수 있다.

상기 단락에서 논의된 Gla 도메인의 외측에 위치한 변형에 Gla 도메인에 한 개 이상의 변형이 복합될 수 있다(하기 "GLA 도메인에서 변형" 단락을 참고).

Gla 도메인에서의 변형

본 발명의 변이체는 Gla 도메인의 외측에in vivo글리코실화 부위를 도입하는 것에 추가하여, Gla 도메인에 적어도 2개 치환체, 즉, 위치 10 및 32에 치환체로 구성된다.

WO 99/20767 및 WO 00/66753에서는 인지질 막 결합 친화력을 증가시키는 여러 적절한 변형에 대해 기재하고 있다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 위치 10에 치환체는 K32E이다. 또 다른 본 발명의 적절한 구체예에서, 변이체는 P1OQ+K32E 치환체로 구성된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 변이체는 위치 10과 32에 P1OQ+K32E 치환체를 추가하는데 이어, Gla 도메인에 한 개의 추가 변형을 포함한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, Gla 도메인에 추가 변형은 위치 33에 아미노산 치환으로 구성된다. 적절하게는 소수성 아미노산 예를 들면, D33I, D33L, D33M, D33V, D33F, D33Y, D33W, 특히 D33F을 위치 33에 치환으로 도입시키는 것이다. 따라서, 한 가지 특정 구체예에서 변이체는 P1OQ+K32+D33F로 구성된다.

본 발명의 적절한 구체예에서, Gla 도메인에 추가 변형은 위치 3과 4사이에 적어도 한 개 아미노산 잔기가 삽입된 것이다. 삽입된 아미노산 잔기는 소수성 아미노산 잔기가 적절하다. 가장 적절하게는 삽입은 A3AY이다. 따라서, 본 발명의 다른 구체예에서 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E 또는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F로 구성된다.

본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, Gla 도메인에 추가 변형은 위치 34에서 이루어진다. 치환에 의해 위치 34에 음전하를 띄는 아미노산이 도입된다. 좀더 적절하게는 치환체는 A34E이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 변이체는 P1OQ+K32E+A34E, P1OQ+K32E+D33F+A34E, A3AY+P1OQ+K32E+A34E, 또는 A3AY+P1 OQ+K32E+D33F+A34E이다.

Gla 도메인에는 다른 위치, 특히 8, 11, 28에 R28F 또는 R28E 변환을 포함할 수 있다. 한편, 막 결합 성질이 손상될 정도로 Gla 도메인이 변형되어서는 안된다. 따라서, γ-카르복실화될 잔기에는 변형이 일어나지 않는 것이 바람직하고, 잔기 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 35에는 이와 같은 변형이 일어나지 않는 것이 바람직하다. 유사하게 일반적으로 비-폴리펩티드 부분 예를 들면, 당, PEG기를 Gla 도메인내에 도입시키는 것은 바람직하지 않다. 결과적으로in vivo글리코실화부위를 만드는 Gla 도메인내에는 변형을 만들지 않는 것이 바람직하다.

마지막으로, 이 단락에서 논의하고 있는 Gla 도메인은 상기에서 설명하는 "Gla 도메인외부에 위치하는in vivo글리코실화 부위" 제목의 단락에서 설명하는 한 개 이상의 변형과 복합되어야 한다.

다음에는 "복합"이란 변이체의 특정예를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+TI06N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+1205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+TlO6N+1205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+Tl 06N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+1205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+T1O6N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY4+P1OQ+K32E+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+T106N+1205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는A3AY+P1OQ+K32E+T1O6N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+T106N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는P1OQ+K32E+D33F+Al75T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K3 2E+D3 3F+1205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D3 3F+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+TI06N+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+T106N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D3 3F+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+T106N.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는A3AY+P1OQ+K32E+D33F+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+T1O6N+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+T1O6N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+T106N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는P1OQ+K32E+A34E+T106N+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+T106N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+A34E+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+T106N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+T106N+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 P1OQ+K32E+D33F+A34E+T106N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는P1OQ+K32E+D33F+A34E+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+T1O6N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+T106N+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+T106N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+A34E+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+T106N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+A175T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+T267+S269T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+T106N+I205T로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+T106N+V253N로 구성된다.

본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E+I205T+T267N+S269T로 구성된다.

Gla 도메인 외측에 다른 변형

상기 단락에서 설명한 본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체에는 폴리펩티드의 고유 활성을 증가시키는 것으로 이미 공지된 돌연변이체도 포함되는데, 예를 들면 WO 02/22776에서 설명하는 것들도 포함된다.

바람직한 치환체의 예는 V158D, E296D, M298Q, L305V, K337A에서 선택된 치환체도 포함된다. 좀더 적절하게는 치환체는 V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A, Vl58D+E296D+M298Q+K337A, V158D+E296D+M298Q+L305V, V158D+E296D+M298Q, M298Q+L305V+K337A, L305V, K337A에서 선택된다.

상기 단락에서 설명한 것 이외에 본 발명의 또 다른 한 구체예에서, FVII 또는 FVIIa 변이체에는 TFPI에 의해 저해를 감소시키는 것으로 이미 공지된 돌연변이체도 포함된다. 한 예를 들면, Neuenschwander et al, Biochemistry, 1995; 34:8701에서 설명하는 K341Q 치환체도 포함된다.

또한, 변이체에는 TF 결합 친화력을 증가시키는 것으로 보이는 변형이 포함될 수도 있다. 이와 같은 변형의 예를 들면, L39E. L39Q, L39H, 142K, I42R, S43H, S43Q, K62E, K62R, L65Q, L65S, F71D, F7lY, F7lE, F71Q, F7lN, E82Q, E82N, E82K, F275H등에서 선택된 것이 포함된다. 상기에서 지적한 바와 같이, 변이체에는 보존성 아미노산 치환체도 포함된다.

비-폴리펩티드 부분

본 발명의 내용을 근거하여, 당업자는 다른 부착기로 구성된 아미노산 잔기를 상기에서 설명한 동일한 방식으로 이용하여in vivo글리코실화 부위에 치환에 의해 모체 화합물에 도입시킬 수도 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 산성기로 구성된 한 개 이상의 아미노산 잔기(글루타민산 또는 아스파르트산), 티로신, 또는 리신을 상기에서 설명한 위치로 도입시킬 수 있다. 특히, 상기에서 설명한 위치에 한 개 이상의 시스테인 잔기를 도입시킬 수 있다.

상기에서 지적한 바와 같이 공액된 변이체의 비-폴리펩티드 부분은 폴리머 분자, 친지성 화합물, 당 부분(in vivo글리코실화에 의해), 유기 유도 물질에서적절히 선택된다. 이들 모든 물질은 변이체 폴리펩티드에 원하는 성질 가령, AUC_iv증가,in vivo기능 반감기 증가, 혈장 반감기 증가 등의 성질을 제공한다. 변이체 폴리펩티드는 통상 한 가지 형태의 비-폴리펩티드 부위에만 공액되나, 두 가지 이상 상이한 형태의 비-폴리펩티드 부분에도 공액될 수 있는데, 예를 들면 폴리머 분자와 당 분자가 함께, 친지성 기와 당 분자가 함께, 유기 유도 물질과 당 분자가 함께, 친지성 기와 폴리머 분자등이 함께 공액될 수 있다. 두 개이상의 상이한 비-폴리펩티드 부분에 공액은 동시에 또는 순차적으로 일어난다.

본 발명의 공액된 변이체를 만드는 방법

다음 단락에서 "친지성 화합물에 공액", "폴리머 분자에 공액", "당 부분에 공액", "유기 유도화 물질에 공액"에서 특정 형태의 비-폴리펩티드 부분에 공액에 대해서 설명한다.

일반적으로 본 발명에 따른 공액된 변이체는 변이체 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건하에서 적절한 숙주 세포를 배양하고, 변이체 폴리펩티드를 회수하여 만들 수 있는데, 이때, a) 변이체 폴리펩티드는 적어도 한 개의 N- 또는 O-글리코실화 부위로 구성되고, 숙주 세포는in vivo글리코실화를 할 수 있는 진핵 숙주 세포이고; b)변이체 폴리펩티드는in vitro에서 비-폴리펩티드 부분에 공액된다.

공액은 부착된 비-폴리펩티드 부분의 수, 분자의 크기 및 분자의 형태(분자가 선형 또는 분지형일 경우), 폴리펩티드에서 부착 부위에 대해 최적의 분자를 만들도록 고안된다는 것을 인지할 것이다. 비-폴리펩티드 부분의 분자량은 수득될 원하는 효과에 근거하여 선택되는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 공액의 1차 목적이 고분자량(신장에서 제거를 감소시키기 위해)의 공액 변이체를 얻는 것이라면, 통상적으로 원하는 분자량을 얻기위해 가능한 한 분자량이 큰 비-폴리펩티드 부분으로 공액시키는 것이 바람직하다. 차폐 효과가 높아야 하는 경우에, 충분한 수의 분자량이 적은(예를 들면, 분자량이 약 300Da 내지 약 5kDa 범위, 분자량이 300Da내지 2kDa까지 범위) 비-폴리펩티드 부분을 이용하면 된다.

폴리머 분자에 공액

변이체 폴리펩티드에 결합되는 폴리머 분자는 일반적으로 분자량 범위가 300-100,000Da, 예를 들면 500-20,000Da, 500-15,000Da, 바람직하게는 2-12kDa, 가장 바람직하게는 3-10kDa 범위의 천연 또는 합성 동종-폴리머 또는 이종(hetero)-폴리머와 같은 임의 적절한 폴리머가 된다. 특정 분자량과 연관하여 "약"이란 용어를 사용하고 있는 경우에, 이 의미는 대략의 평균 분자량을 말하는 것으로, 주어진 고분자를 준비하는데 특정 분자의 분자량 분포를 말한다.

동종-폴리머의 예를 들면, 폴리올(가령, poly-OH), 폴리아민(예를 들면, polyNH2), 폴리카르복실산(예를 들면, poly-COOH)등이 될 수 있다. 이종-폴리머는 하이드록실기 및 아민기와 같은 상이한 결합 군으로 구성된 폴리머이다.

적절한 폴리머 분자에는 폴리에킬렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 분지쇄 PEGs과 같은 폴리알킬렌 글리콜(PEG)를 포함하는 폴리알킬렌 옥시드(PAO), 폴리-비닐 알코올(PVA), 폴리-카르복실레이트, 폴리-(비닐프롤리돈), 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스티렌-co-말레산 무수물, 카르복시메틸-덱스트란을포함하는 덱스트란 및 면역원성을 감소시키거나,in vivo기능성 반감기 또는 혈청 반감기를 감소시키는데 적절한 임의 바이오폴리머가 될 수 있다. 일반적으로, 폴리알킬렌 글리콜-유도된 폴리머는 생체 접합성, 비-독성, 비-항원성, 미-면역원성으로, 다양한 수용성 성질을 가지며, 생체로부터 용이하게 배출될 수 있다.

PEG는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드에 비교하여 교차 연결을 잘 알 수 있는 몇 개의 반응 기를 보유하기 때문에 적절한 폴리머 분자이다. 특히, 단가기능기(nonfunctional) PEG는 결합 화학이 상대적으로 간단하여(폴리펩티드상에 부착기에 공액시 단 한 개의 반응기만 이용되기 때문에) 관심이 집중된다. 결과적으로, 교차-연결 위험이 제거되기 때문에, 생성된 공액 변이체는 좀더 균질하게 되고, 변이체 폴리펩티드와 폴리머 분자의 반응을 더 용이하게 제어할 수 있다.

변이체 폴리펩티드에 폴리머 분자를 공유적으로 부착시키기 위해, 폴리머 분자의 하이드록실 말단 기는 활성형 즉, 반응성 기능기(예를 들면, 1차 아미노기, 하이드라지드(HZ), 티올, 숙시네이트(SUC), 숙시니미딜 숙시네이트(SS), 숙시니미딜 숙시나미드(SSA), 숙시니미딜 프로피오네이트(SPA), 숙시니미딜 부티레이트(SBA), 숙시니미딜 카르복시메틸레이트(SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트(BTC), N-하이드록시숙시니미드(NHS), 알데히드, 니트로페닐카르보네이트(NPC), 트레실레이트(TRES)를 포함하는) 형태로 제공되어야 한다. 활성화된 폴리머 분자는 시판되는 것을 이용할 수 있는데, 예를 들면, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA, 또는 PolyMASC Pharmaceuticals p1c, UK에서 시판되는 것이 적절하다.

대안으로, 폴리머 분자는 WO 90/13540에서 설명하는 것과 같이 당 분야에 공지된 방법으로 활성화될 수 있다. 본 발명에 이용할 수 있는 활성화된 선형 또는 분지형 폴리머 분자의 특정예는 the Shearwater Polymers, Inc. 1997 and 2000 Catalogs(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and lo pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, incorporated herein by reference)에서 기술하고 있다.

활성화된 PEG 폴리머는 다음과 같은 선형 PEGs를 포함한다; NHS-PEG(예를 들면, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG), NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, MAL-PEG, PEG2-NHS와 같은 분지쇄 PEGs 및 US 5,932,462 및 US 5,643,575에서 설명하고 있는데, 이들 두 가지 모두 참고문헌으로 첨부된다. 또한, 여기에서 언급하는 공보에는 유용한 폴리머 분자 또는 PEG화 화학에 대해 기술하고 있다: US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5112,614, US 5,219,564, WO 92/165555 WO 94/041935 WO 94/147585 WO 94/17039, WO 94/182475 WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,565, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503, EP 154 316.

시스테인 잔기에 결합시키는데 특별히 적합한 활성화된 PEG 폴리머의 예를 들면, 다음과 같은 선형 PEGs가 포함되는데, 비닐설폰-PEG (VS-PEG), 적절하게는 비닐설폰-mPEG(VS-mPEG); 말레이미드-PEG(MAL-PEG), 적절하게는 말레이미드-MPEG (MAL-mPEG), 오르소피리딜-디설파이드-PEG(OPSS-PEG), 적절하게는 오르소피리딜-디설파이드-mPEG(OPSS-mPEG). 일반적으로 PEG 또는 mPEG 폴리머는 약 5kDa, 10kD, 12kDa, 20kDa의 크기를 가진다.

폴리펩티드 변이체와 활성호된 폴리머 분자의 공액은 임의 통상적인 방법을 이용하면 되는데, 다음의 참고문헌에 기재된 방법을 이용하면 된다(또한 이문헌들은 폴리머 분자를 활성화시키는 적절한 방법도 설명하고 있다)Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor, (1991). "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong(1992), "chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC press, Boca Ratio; G.T. Hermanson et al.,(1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.).

당업자는 이용되는 활성화 방법 및 공액 화학은 변이체 폴리펩티드의 부착기(상기에서 제시한 것과 같은), 폴리머의 기능기(예를 들면 아민, 하이드록실, 카르복실, 알데히드, 설파드릴, 숙시니미딜, 말레이미드, 비닐설폰, 할로아세테이트)에 따라 달라진다. PEG화 반응은 변이체 폴리펩티드상이 모든 이용가능한 부착기 공액체로 향하거나(예를 들면, 폴리펩티드의 표면에 노출된 부착기)이거나 US5,985,265에서 설명하는 것과 같은 N-말단 아미노기 또는 시스테인 잔기와 같은 한 개 이상의 특정 부착기로 향한다. 또한, 공액은 1 단계 또는 단계적인 방식으로 이루어진다(WO 99/55377).

상기에서 설명하는 것과 같은 시스테인 잔기에 PEG화를 위해, FVII 또는 FVIIa 변이체를 통상 디티로트레톨(DDT)와 같은 환원제로 PEG화하기 전에 처리한다. 환원제는 염을 제거하는 방법과 같은 통상의 방법으로 제거하면 된다. 시스테인 잔기에 PEG 공액은 최고 16시간동안 4℃ 내지 25℃와 같은 온도를 변화시키면서 pH6-9의 적절한 완충액에서 실시한다.

PEG화 반응은 부착되는 PEG 분자의 숫자, 이와 같은 분자의 크기 및 형태(선형 또는 분지형), 변이체 폴리펩티드에 부착 부위에 대해 최적의 분자를 만들 수 있도록 해야한다. 이용되는 폴리머의 분자량은 원하는 효과에 따라 선택하면 된다.

단백질 상에 단일 부착기(N-말단 아미노기)에만 공액하는 것과 연관하여, 선형 또는 분지형이 되는 폴리머 분자는 10-25kDa 범위 분자량 예를 들면 15-25kDa 예를 들면, 20kDa의 분자량을 가지는게 유리하다.

통상적으로, 폴리머 공액은 폴리머 분자와 이용가능한 많은 폴리머 부착 기가 반응할 수 있는 조건하에서 실행한다. 폴리펩티드에 대하여 적절한 과량의 폴리머를 이용하면 가능하다. 일반적으로 폴리펩티드에 대한 활성화된 폴리머 분자의 몰비는 최고 1000-1인데, 예를 들면, 200-1, 100-1이 된다. 일부 경우에 적절한 반응을 얻기 위해 몰 비율을 다소 낮아지게 할 수 있는데, 예를 들면, 50-1, 10-1, 5-1, 2-1, 1-1이 될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 폴리펩티드에 링커를 이용하여 폴리머 분자를 결합시키는 것도 고려할 수 있다. 적절한 링커는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 적절한 링커를 예로 들면, 염화 시아누린산이다(Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24,375-378).

공액에 이어, 공지된 방법, 예를 들면, 반응 혼합물에 1차 아민을 첨가하여 잔류 활성화된 폴리머 분자를 차단시키고, 적절한 방법을 이용하여 생성된 비활성 폴리머 분자를 제거한다.

변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열, 이용될 활성화된 PEG 화합물의 성질, 특이적인 PEG화 조건(예를 들면 폴리펩티드에 대한 PEG 몰비 포함)에 따라, PEG화 정도를 다양하게 할 수 있고, 변이체 폴리펩티드에 대한 높은 비율의 PEG를 가지는 고도의 PEG 반응을 얻을 수 있다. 임의 주어진 PEG화 반응으로 생성된 PEG화된 변이체 폴리펩티드는 약간 상이한 PEG화를 가지는 공액된 폴리펩티드 분포로 구성된다.

당 부분에 결합

한 개 이상의 글리코실화 부위로 구성된 FVII 분자의in vitro글리코실화 반응을 얻기 위해, 변이체 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 글리코실화된는 진핵 발현 숙주내로 삽입해야 한다. 발현 숙주 세포는 곰팡이(필라멘드성 곰팡이 또는 이스트), 곤충 또는 동물 세포, 유전자 전이 식물 세포에서 선택할 수 있다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, BHK 또는 HEK, 예를 들면, HEK 293,세포와 같은 포유류 세포, SF9 세포와 같은 곤충세포, 또는 사카로미세스 세르비시에(S. cerevisiae) 또는 피치아 파스트로리스(Pichia pastoris)와 같은 이스트 세포, 또는 상기에서 이미 언급된 숙주 세포중 임의 것에서 선택될 수 있다.

변이체 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 당 부분(덱스트란과 같은)을in vitro공유 결합은 WO 87/05330 및 Aplin etl al., CRC Crit Rev. Biochem, pp. 259-306, 1981에서 설명하는 방법을 이용할 수 있다. 트란스글루뮤타제(TGases)를 이용하여 단백질- 및 펩티드-결합된 Gln 잔기에 당을in vitro결합시킬 수 있다. 트란스글루뮤타제(TGases)는 소위 교차-연결 반응에서 제공자의 아민기를 단백질- 및 펩티드-결합된 Gln 잔기로 옮기는 것을 촉매한다. 제공자의 아민 기는 리신 잔기의 8-아미노기와 같은 단백질 또는 펩티드에 결합된 것이 될 수 있고 또는 작은 또는 큰 유기 분자의 일부분이 될 수도 있다. 트란스글루뮤타제(TGases)-촉매된 교차 연결에서 아미노 제공자로 작용하는 작은 유기 분자를 예로 들자면, 푸트레신 (1,4-디아미노부탄)이 된다.

트란스글루뮤타제(TGases)-촉매된 교차 연결에서 아미노 제공자로 작용하는 더 큰 유기 분자를 예로 들자면, 아민 함유 PEG(Sato et al., 1996, Biochemistry 35, 13072-13080)가 된다.

일반적으로, TGases는 매우 특이성이 큰 효소로써 단백질의 표면에 노출된 모든 Gln-잔기가 아미노를 포함하는 물질에 TGase-촉매된 교차 연결에 접근가능한 것은 아니다. 반대로, 일부 Gln-잔기들은 TGase 기질로 자연스럽게 기능을 하나, TGase 기질에 어느 Gln-잔기가 좋은 지를 조절하는 정확한 변수에 대해서는 아직밝혀지지 않고 있다. 따라서, TGase-촉매된 교차 연결 반응에 민감한 단백질을 감소시키기 위해서는 TGase 기질로 기능을 하는 것으로 잘 알려진 아미노산 서열 부분에 첨가는 편리한 위치에서 하는 것이 필수적이다. 몇 가지 아미노산은 아주 우수한 TGase 기질인 것으로 알려져 있는데, 예를 들면, 기질 P, 엘라핀, 피브리노겐, 피르로넥틴, α2-플라스민 저해물질, α카제인, P-카제인등이 된다.

유기 유도체 물질에 공액

변이체 폴리펩티드의 공유 변형은 유기 유도화 물질과 변이체 폴리펩티드의 한 개 이상의 부착 기를 반응시켜 실행할 수 있다. 절절한 유도화 물질 및 방법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기는 가장 흔하게는 α-할로아세테이트(이에 상응하는 아민), 예를 들면, 클로로아세트산 또는 클로로아세타미드와 반응하여 카르복실메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 브로모트리플로오르아세톤, α-브로모-β-(4-이미다조일)프로피온산, 크롤로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파아드, 메틸 2-피리딜 디 설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 클로로-7-니트로벤조-2-옥소-1,3-디아졸과 반응시켜 유도화시킨다. 히스티딜 잔기는 디에틸피로카르보네이드 pH5.5-7.0과 반응시켜 유도화시키는데, 그 이유는 이 물질은 히스티딜 측쇄에 의해 매우 특이적이기 때문이다. 파라-브로모페나실 브로마이드도 유용하다. 이 반응은 pH6.0의 0.1M 코카딜레이트 나트륨에서 적절하게 실행한다. 리시닐 및 아미노 말단 잔디는 숙신 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응된다. 이와 같은 물질을 이용한 유도화는 리시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 가진다. α-아미노를 포함하는 잔기를 유도화시키는데 다른 적절한 시약에는 메틸 피콜이미데이트와 같은 이미도에스테르, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠설폰산, O-메틸리소우레아, 2,4-펜탄디온 및 글리옥실레이트와 트란스아미나제-촉매된 반응 등이 포함된다. 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산데온 및 닌하이드린 가운데 통상의 한 개 내지 몇 개 시약을 이용한 반응에 의해 아르지닐 잔기가 변형된다. 아르지닌 잔기의 유도화 반응은 구아니딘 기능기의 pKa값이 크기 때문에 알칼리 조건에서 실행해야 한다.

또한, 이들 시약들은 리신 및 아르기닌, 구아니디노 기의 군과 반응할 수 있다. 카르복실 측쇄 군(아스파르틸 또는 글루타밀)은 카르보디이미드(R-N=C=N-R')와의 반응에 선택적으로 변형될 수 있는데, 이때 R 및 R'는 상이한 알킬 군, 예를 들면 1-사이클로헥실-3-(2-몰로리닐-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸페닐)카르보디이미드가 된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모니움 이온과 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

친지성 화합물에 공액

변이체 폴리펩티드와 친지성 화합물은 서로 직접적으로 또는 링커를 이용하여 공액될 수 있다. 친지성 화합물은 포화 또는 불포화 지방산, 지방산 디케톤, 테르펜, 프로스타글라딘, 비타민, 카로테노이드, 스테로이드와 같은 천연 화합물이 되거나, 탄산, 알코올, 아민, 한 개이상의 알킬, 아릴, 알케닐 또는 다른 다중 불포화 화합물을 가지는 설폰산이 될 수 있다. 변이체 폴리펩티드와 친지성 화합물의 공액은 당분에에 공지된 기술 예를 들면, Bodanszky in Peptide Synthesis, JohnWiley, New York, 1976 및 WO 96/12505에서 설명하는 방법을 이용하여 링커를 이용하여 일어날 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체를 만드는 방법

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 당분에 공지된 임의 적절한 방법을 이용하여 만들 수 있다. 이와 같은 방법에는 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드를 만든 후에 적절하게 형질변환 또는 형질감염된 숙주에서 발현시키는 방법이 포함된다. 바람직하게는 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 감마카르복실화되는 숙주 세포가 된다.

그러나, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 비록 효과측면에서는 떨어지기는 하아 화학적 합성 또는 화학적 합성과 재조합 DNA기술을 복합시켜 만들 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에서 나타낸 아미노산 서열과 hFVII와 같은 모체 FVII를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 분리 또는 합성하여 만들고, 뉴클레오티드 서열을 변형시켜 효과적으로 관련 아미노산 잔기를 도입(삽입 또는 치환) 또는 제거(결손 또는 치환)할 수 있다.

뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따른 부위-직접적인 돌연변이에의해 통상적으로 변형될 수 있다. 또는, 뉴클레오티드 서열은 화학적 합성 예를 들면 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 만들 수 있는데, 이때, 올는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 근거하여 고안하고, 선호적으로는 재조합 폴리펩티드가 만들어지는 숙주 세포에서 선호하는 5개 코돈을 선택하여 만든다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 인코드하는 몇 가지 작은 올리고뉴클레오티드를 합성하고,PCR, 결찰 및 결찰 사슬 반응(LCR)(Barany, PNAS 8 8:189-193, 199 1)을 이용하여 합체한다. 개별 올리고뉴클레오티드에는 일반적으로 상보적인 어셈블리를 위해 5' 또는 3'에 오버행(overhangs)을 포함한다.

또 다른 뉴클레오티드 서열 변형 방법을 이용하여 상당한 처리량의 폴리펩티드 변이체를 만드는데, 예를 들면, US 5,093,257에서 설명하는 동종 크로스-오버 연관된 방법, 두 개 이상의 동종 뉴클레오티드 서열간에 재조합에 의해 시작 뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때 상당수의 뉴클레오티드 변화를 가지는 새로운 뉴클레오티드 서열을 만드는 유전자 셔플링(shuffling) 방법이 있다. 유전자 셔플링(또는 DNA 셔플링으로 공지된)에는 1회 이상의 무작위 단편화과정(Fragmentation)과 뉴클레오티드 서열의 재합체, 원하는 성질을 가지는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 선별하는 스크리닝 과정이 관계한다. 상동성 근거한 핵산 셔플링이 일어나도록 하기 위해서는 뉴클레오티드 서열의 관련 부분이 바람직하게는 적어도 50% 동일, 60%, 좀더 바람직하게는 70%, 80%가 동일하여야 한다. 재조합은in vitro또는in vivo에서 일어날 수 있다.

적절한in vitro유전자 셔플링 방법은 Stemmer et al. (1 994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA; vol. 9 1, pp. 10747-1075 1; Stemmer (1 994), Nature, vol. 370. pp. 389-391; Smith (1994), Nature vol. 370, pp. 324-325; Zhao et al., Nat. Biotechnol. 1998. Mar; 16(3): 258-61; Zhao H. and Arnold, FB, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25. No. 6 pp. 1307.1308; Shao et al., Nucleic Acids Research 1998, Jan 15; 26(2): pp. 681-83; WO 95/17413에서 설명하고 있다.

적절한in vivo유전자 셔플링 방법은 WO/07205에서 설명한다.in vitro또는in vivo재조합에 의한 핵산 서열의 돌연변이 생성을 위한 다른 기술에 대해서는 WO 97/20078 및 US 5,837,458에서 설명하고 있다. 특이적인 셔플링 기술에는 "패밀리 셔플링", "합성 셔플링" 및 "in silico셔플링"이 포함된다.

패밀리 셔플링은 상이한 종에서 얻은 상동성 유전자 패밀리를 한 개 이상의 셔플링을 거치게 하고 연속하여 스크리닝 또는 선별을 거치는 과정이 연관된다. 패밀리 셔플링은 Crameri et al(1998), Nature, vol.391,pp288-291; Christians et al. (I 999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 259-264; Chang et al. (I 999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 793 -797; and Ness et al. (1 999), Nature Biotechnology, vol. 17. 893-896에 설명하고 있다.

합성 셔플링은 관심 대상의 상동성 유전자를 배열한 것에 근거하여 합성 올리고뉴클레오티드를 오버래핑하는 라이브러리를 제공한다. 합성에 의해 만들어진 올리고뉴클레오티드를 재조합시키고, 생성된 재조합 핵산을 스크리닝하여, 원하는 경우에 추가 셔플링에 이용한다. 합성 셔플링 기술은 WO 00/42561에서 설명하고 있다.

In silico셔플링은 DNA 셔플링 과정을 말하는 것으로, 컴퓨터 시스템을 이용하거 실행하거나 모델링하여, 핵산을 물리적으로 저절할 필요성을 부분적으로 또는 완전하게 해소한다.in silico셔플링에 대한 기술은 WO 00/42561에서 설명하고 있다.

일단 어셈블리되면(합성, 부위 직접적인 돌연변이 생성 또는 또 다른 방법에 의해), 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 재조합 벡터에 삽입시키고, 원하는 형질변환된 숙주세포에서 FVII를 발현시키는데 필수적인 제어 서열에 작용가능하도록 연결시킨다.

여기에서 설명하는 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 모든 벡터 및 발현 제어 서열이 동등한 기능을 발휘하지는 못한다는 것을 물론 인지해야 한다. 모든 숙주도 동일한 발현시스템과 동일한 수준으로 기능을 발휘하지는 못한다.

그러나, 당업자는 과도한 실험없이 이들 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주에서 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 벡터선택에 있어서, 벡터가 숙주에서 복제하거나 또는 염색체내에 합체되어야 하기 때문에 숙주를 반드시 고려해야 한다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 제어하는 능력, 벡터에 의해 인코드된 항생제 마커와 같은 임의 다른 단백질의 발현도 고려해야 한다. 발현 제어 서열을 선택함에 있어서, 다양한 인자들도 고려해야 한다. 이와 같은 인자들에는 서열의 상대적인 강도, 제어성, 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열과의 적합성, 특히 2차 구조에 대한 적합성등이 고려되어야 한다. 숙주는 선택된 벡터와의 적합성, 핵산 서열에 의해 인코드된 생성물의 독성, 분비 특성, 정확하게 폴리펩티드 변이체로 폴드되는 능력, 배양 및 발효 요건, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 생성물의 정제 용이성등을 고려하여 숙주를 선택해야 한다.

재조합 벡터는 자가 복제 벡터, 예를 들면, 염색체외부 존재물로 있는 벡터가 될 수 있는데, 이들의 복제는 염색체 복제와는 독립적으로, 예를 들면 플라스미드가 된다. 또는 벡터가 숙주 세포는 숙주 세포 게놈으로 통합되어, 통합된 염색체와 함께 복제한다.

벡터는 발현 벡터가 적절한데, 이때 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 전사에 요구되는 추가 단편에 작용가능하도록 연결된다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되는 것이 일반적이다. 여기에서 언급하는 숙주 세포에서 발현을 하기 위한 적절한 발현 벡터는 시판되는 것이거나 문헌에서 설명하는 것들이다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터에는 SV40, 소 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스와 같은 발현 조절 벡터로 구성된다. 특이적인 벡터에는 pCDNA3.1(+)＼Hyg(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 pCI-neo(Stratagene, La Jola, CA, USA)가 있다. 이스트 세포에 유용한 발현 벡터에는 2μ 플라스미드 및 이의 유도체, POT1 벡터(US 4,931,373), pJS037 벡터(Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, 및 pPICZ A, B, C(Invitrogen)등이 포함된다. 곤충 세포에 유용한 벡터에는 pVL941, pBG311(Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 및 pMelbac(Invitrogen)등이 포함된다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터에는 공지의 박테리아 플라스미드, 예를 들면, 대장균(E. coli)에서 얻은 pBR322, pET3a, pET12a(Novagen Inc., WI, USA)을 포함하는 플라스미드, RP4와 같은 광범위한 숙주 범위의 플라스미드, 파아지 DNAs 예를 들면, 람다 파아지의 여러 가지 유도체, 예를 들면, NM989 그리고, M13과 같은 다른 DNA 파아지, 필라멘트성 단일 가닥 DNA 파아지등이 포함된다.

본 발명에 이용할 수 있는 다른 벡터에는 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 핵산이 다수의 복제를 위해 증폭을 허용하는 것도 포함된다. 이와 같은 증폭가능한 벡터는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, DHFR 증폭을 통하여 증폭이 가능한 벡터(Kaufman, U.S. Pat. No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) 및 글루타민 합성효소("GS") 증폭이 가능한 벡터가 포함된다(US 5,122,464 and EP 338,841).

재조합 벡터에는 해당 숙주에서 벡터가 복제할 수 있는 DNA 서열이 추가 포함될 수 있다. 이와 같은 서열의 예로는 SV40 복제 기원(숙주 세포가 포유류인 경우에)이 있다. 숙주 세포가 이스트 세포인 경우에, 벡터가 복제가능하도록 하는 서열은 이스트 플라스미드 2μ 복제 유전자 REP1-3 및 복제 원점이 된다.

벡터에는 선택 마커를 포함할 수 있는데, 선택 마커의 유전자 생성물은 숙주 세포에 결점을 보완해주는데, 예를 들면, 디하이드로폴레이크 환원효소(DHFR) 또는 쉬조사카로미세즈 폼베(Schizosaccharomyces pombe) TPI 유전자(P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130), 또는 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 하이그로마이신, 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 유전자등이 될 수 있다. 사카로마이세스 세르비시에(Saccharomycescerevisiae)의 경우에 선택 마커에는ura3 및leu2 등이 포함된다. 필라멘트성 곰팡이의 경우에, 선택 마커에는amdS, pyrG, arcB, niaD, sC등이 포함된다.

"조절 서열"은 본 발명의 폴리펩티드 변이체 발현에 필수적인 또는 유익한 모든 성분이 포함된다. 각 조절 서열은 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 핵산 서열에 고유한 것이거나 외부에서 도입된 것일 수도 있다. 이와 같은 조절 서열에는 리더 서열, 폴리아데닐화반응 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 인헨서 또는 상류 활성화 서열, 시그날 펩티드 서열, 전사 종료 서열이 될 수 있다. 최소한 조절 서열에는 프로모터가 포함된다.

다양한 발현 조절 서열이 본원 발명에 이용될 수 있다.

이와 같은 유용한 발현 조절 서열에는 전술한 발현 벡터와 연합된 발현 조절 서열 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스 및 이의 다양한 복합체의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 임의 서열이 포함된다.

포유류 세포에 전사에 관계하는 적절한 조절 서열로는 SV40 초기 또는 후기 프로모터, 아데노바이러스 2 메이져 레이트 프로모터(adenovirus 2 major late promoter)와 같은 아데노바이러스, MT- 1(메탈로티오닌 유전자) 프로모터, 사람의 사이토메갈로바이러스 이미디어트 초기(immediate early) 유전자 프로모터(CMV), 사람 연장 인자 1α(EF-1α) 프로머터, 초파리 최소 열 쇼크 단백질 70 프로모터라우스 살코마 바이러스(RSV) 프로모터, 사람 유비퀴톤 C(UbC) 프로모터, 사람 생장 호르몬 종료인자, SV40 또는 아데노바이러스 Elb 부위 폴리아데닐화 반응 시그날 및 Kozak 콘센선스 서열(Kozak, M. JMOI Biol 1987 Aug 20; 196(4):947-50) 등이포함된다.

포유류 세포에서 발현을 개선시키기 위해, 합성 인트론을 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 5' 비해독 부위에 삽입할 수 있다. 합성 인트론의 예를 들면, 플라스미드 pCI-Neo(Promega Corporation, WI, USA)에서 얻을 수 있는 삽성 인트론이 된다.

곤충 세포에서 전사에 관여하는 적절한 조절 서열로는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 폴리헤드로시스 바이러스계 단백질 프로모터, 베큘로바이러스 이미데이트 초기 유전자 I 프로모터, 베큘로바이러스 39K 지연된 초기 유전자 프로모터, SV40 폴리아데닐화 반응 서열등이 포함된다. 이스트 숙주 세포에 이용되는 적절한 제어 서열로는 이스트 α-메이팅 시스템의 프로모터, 이스트 트리오즈 포스페이트 이소메라제(TPI) 프로모터, 이스트 글리코라이틱 유전자 또는 알코올 디하이드로게나제 유전자에서 얻은 프로모터, ADH2-4c 프로모터, 유도성 GAL 프로모터 등이 포함된다. 필라멘터성 곰팡이 숙주 세포에 이용할 수 있는 적절한 조절 서열로는 ADH3 프로모터, 종료물질, 아스터질러스 오리제(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제 트리오즈 포스페이스 이소메라제 또는 알칼리 프로테아제, A. 나이져(A. niger) α아밀라제, 또는 A. 니듈란스(A. nidulans) 글루코아밀라제, A. 니듈란스(A. nidulans) 아세타아미다제, 리조뮤코어 미하이(Rhizomucor miehei) 아스파르트 프로테나제 또는 리파제, TP11 종료물질 및 ADH3 종료물질 등이 포함된다.

박테리아 숙주 세포에 이용할 수 있는 절절한 조절 서열에는lac시스템,trp시스템,TAC또는TRC시스템의 프로모터, 람다 파아지의 주요 프로모터 부분등이 포함된다.

시그날 펩티드의 유무는 발현될(세포내 또는 세포외 폴리펩티드) 폴리펩티드 변이체 생산에 이용되는 발현 숙주 세포에 따라 달라지고, 분비가 가능한지에 대해서 달라진다. 필라멘트성 곰팡이에 이용하기 위해, 시그날 펩티드는 보통 아스퍼질러스 종(아밀라제 또는 글루코아밀라제)(Aspergillus sp. amylase or glucoarnylase) 유전자, 리조뮤코어 미하이(Rhizomucor miehei) 리파제 또는 프로테아제 또는 휴미코라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파제를 인코드하는 유전자에서 유도될 수 있다. 시그날 펩티드는 A. 오리자(A. oryzae) TAKA 아밀라제, A. 나이져(A. niger) 중성 α-아밀라제, A. 나이져(A. niger) 산-안정 아밀라제 또는 A. 나이져(A. niger) 글루코아밀라제를 인코드하는 유전자에서 유도할 수 있다. 곤충에 이용하기 위해서는 시그날 펩티드는 곤충 유전자(WO 90/05783) 예를 들면, 레피도프테란 만두카 섹타(Lepidopteran manduca sexta) 아디포카이네틱 호르몬 전구물질(US 5,023,328), 꿀벌 멜리틴(Invitrogen), 엑디스테로이드(eedysteroid) UDP글루코실트란스퍼라제(egt)(Murphy et a[., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993) 또는 사람 판크레아틱 리파제(hpl)(Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997)에서 유도된 것들을 이용할 수 있다. 포유류 세포에 이용하기 위한 적절한 시그날 펩티드는 hFVII 또는 쥐 Ig 카파 경쇄 시그날 펩티드(Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89-104) 등이 될 수 있다. 이스트 세포에 이용하기 위해, 적절한 시그날 펩티드는 S. 세레비시에(S. cereviciae)(US4,870,008), 변형된 카르복시펩티드 시그날 펩티드(L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), 이스트 BAR1 시그날 펩티드(WO 87/02670), 이스트 아스파르트 프로테아제 3(YAP3) 시그날 펩티드(M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127137), 합성 리더 서열 TA57(WO98/32867)에서 얻은 α인자 시그날 펩티드가 적절한 것으로 발견된다. 대장균(E. coli) 세포에 이용하기 위해 적절한 시그날 펩티드는 시그날 펩티드ompA(EP581821)인 것으로 밝혀졌다.

부위 직접적인 돌연변이 생성, 합성, PCR 또는 다른 방법에 의해 준비된 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열에는 선택적으로 시그날 펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 폴리펩티드 변이체가 발현되는 세포로부터 분비되는 경우에 시그날 펩티드가 존재한다. 이와 같은 시그날 펩티드가 존재하는 경우에 폴리펩티드 변이체 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인지된다. 시그날 펩티드는 보통 hFVII와 연합되거나 또는 시그날 펩티드는 hFVII이외의 다른 소스 예를 들면, 사람 야생형 비타민 K-의존성 폴리펩티드와 통상 연합된 소스가 될 수 있다. 또한 시그날 펩티드는 숙주세포에서 통상적으로 발현되는 것이 될 수 있고 또는 숙주 세포에서 통상적으로 발현되는 것이 아닐 수도 있다. 따라서, 시그날 펩티드는 대장균(E. coli)와 같은 세균에서 유도되는 원핵성이거나 포유류, 곤충, 이스트에서도서 유도되는 것과 같이 진핵성일 수도 있다.

폴리펩티드 변이체를 생산하는데 이용되는 임의 적절한 숙주는 세균(특정한 것은 없지만), 곰팡이(이스트 포함), 식물, 곤충, 포유류, 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주, 유전자 전이 동식물등이 된다. 세균 숙주 세포로는 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 및 B. 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 그램 양성 균 또는 대장균(E. coli)와 같은 그램 음성균이 포함된다. 세균 숙주 세포내로 벡터를 도입은 컴피턴트 세포(Young and Spizizin, 1961, Journal ofBacteriology 81: 823829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 197 1, Journal ofMolecular Biology 56: 209-22 1)를 이용한 원형질 형질 변환(Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 전기천공(Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), 컨쥬게이션(Koehler and Thorne, 1987, Journal ofBacteriology 169: 5771-5278)등에 의해 영향을 받는다.

적절한 필라멘트성 곰팡이 숙주 세포에는 아스퍼질러스 종, 예를 들면, A. 오리자(A. oryzae), A. 나이져(A. niger), A. 니듈란(A. nidulans), 퓨사리움(Fusarium) 또는 트리코데르마(Trichoderma) 등이 포함된다. 곰팡이 세포는 원형질 형성, 원형질 형질변환, 동지된 방식으로 세포벽재생등이 관여하는 공정에 의해 형질변환한다. 아스퍼질러스 숙주 세포의 형질변환을 위한 적절한 방법은 EP 238 023 및 US 5,679,543에서 설명하고 있다. 퓨사리움(Fusarium) 종을 형질변환시키는데 적절한 방법은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 및 WO 96/00787에서 설명하고 있다. 적절한 이스트 숙주 세포를 예로 들면, 사카로마이세스 종 예를 들면, S. 세르비시에(cerevisiae), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 클리베로마이세스(Klyvermyces), 피치아(Pichia), 예를 들면, 피치아 파스토리스(P. pastoris) 또는 피치아 메탄올리카(P. methanolica), 한세뉼라 폴리몰파(H.Polymorpha)와 같은 한세뉼라 또는 야로위아(Yarrowia) 등이 포함된다. Becker and Guarente,InAbelson, J.N. and Simon, M.I., editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzyniology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75: 1920: 및 Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA (in the product protocol for tile YeastmakerTm Yeast Transformation System Kit)에서 설명하는 과정을 이용하여 이스트를 형질변환시킬 수 있다. 적절한 곤충 숙주 세포에는 레피도프테라(Lepidoptora) 세포 주 예를 들면, 스포도프테라 후르기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9 또는 Sf21) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusioa ni) 세포(High Five)(US 5,077,214)가 포함된다. 곤충 세포의 형질변환 및 이형 폴리펩티드 생성은 Invitrogen에서 설명하는 것과 같이 실행할 수 있다. 적절한 숙주 세포의 예는 차이니즈 햄스터 오바리(CHO) 세포주(CHO-K1; ATCC CCL-61), 그린 원숭이 세포주(COS)(COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); 생쥐 세포(NS/O), 아기 햄스터 신장(BHK) 세포주(ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-10), 사람 세포(HEK 293 (ATCC CRL- 1573)) 및 조직 배양물의 식물 세포등이 포함된다. 추가 적절한 세포주는 당분야에 공지되어 있고, 이는 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland와 같은 공공 기탁기관에서 제공하는 것을 이용할 수 있다. 또한, CHO 세포와 같은 포유류 세포를 변형시켜, 시알리트란스퍼라제 예를 emfuas, 1,6-시알리트란스퍼라제(US 5,047,335)를 발현시켜 폴리펩티드 변이체에 개선된 글리코실화 반응을 제공할 수도 있다.

분비를 증가시키기 위해, 엔드프로테아제, 특히, PACE(쌍을 이룬 염기 아미노산 전환 효소)(US 5,986,079), Kex2 엔도프로테아제(WO 00/28065)와 함께 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 만드는 것도 관심 대상이 될 수 있다.

포유류 숙주 세포로 외생 DNA를 도입시키는 방법에는 인산칼륨 중개된 프랜드펙션, 전기천공, DEAE-덱스트란 중개된 트랜스팩션, 리포좀 중개된 트란스펙션, 바이러스성 벡터 및 Life Technologies Ltd, Paisley, UK에서 설명하는 Lipofectamin 2000을 이용하는 트랜스펙션등이 포함된다. 이들 방법은 당업자에 공지된 것으로 Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA에서도 설명되어 있다. 포유류 세포 배양은 Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, USA and Harrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997에서 확립한 방법을 이용하여 실행할 수 있다.

본 발명의 생산 방법에서, 세포는 당업자에 공지된 방법을 이용한 폴리펩티드 변이체 생산에 적합한 영양 배지에 배양한다. 예를 들면, 세포를 교반 플라스크 배양, 실험실 또는 산업시설의 발효기에서 폴리펩티드가 발현되고 분리될 수 있는 적절한 배지 및 조건하에서 소규모 또는 대규모 발효(연속, 배치(batch), 페드-배치(fed-batch) 또는 고형상 발효 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 탄소, 질소 및 무기 염으로 구성된 적절한 영양 배지에서 공지의 과정을 이용하여 실시한다.적절한 배지는 시판업자의 것을 이용하거나 공지 조성에 따라 만들 수 있다(catalogues of the American Type Culture Collection). 폴리펩티드 변이체가 영양 배지로 분비되는 경우에, 폴리펩티드를 배지로부터 바로 회수할 수 있다. 폴리펩티드 변이체가 분비되지 않는 경우에, 세포 용해물질로부터 회수할 수 있다.

생성된 폴리펩티드 변이체는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 변이체를 통상적인 방법 예를 들면, 원심분리, 여과, 추출, 스프레이 건조, 기화, 침전등의 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는 방법에 의해 영양 배지로부터 회수할 수 있다.

폴리펩티드는 당분야에 공지된 과정을 이용하여 정제할 수 있는데, 예를 들면, 크로마토그래피(이온교환, 친화력, 소수성, 크로마토포커스, 크기 추출), 전기영동적인 과정(예비 등전점 포커스), 차등 용해(암모늄 설페이트 침전), HPLC, 추출(Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

본 발명의 단일 쇄 폴리펩티드 변이체를 정제하여 문헌에서 설명하는 여러 방법(Broze and Majerus, 1980, J. Biol. Chem. 255:1242-47 and Hedner and Kisiel, 1983, J.Clin.Invest. 71.183 6-4 1)으로 두 사슬 폴리펩티드 변이체로 활성화시킬 수 있다. 단일 쇄 폴리펩티드 변이체를 정제하는 또 다른 방법은 US 5,700,914에서 설명하는 것과 같이 정제과정동안에 Zn이온을 결합시키는 것이다. 적절한 구체예에서, 폴리펩티드 변이체는 단일 쇄 폴리펩티드 변이체로 정제할 수 있다. 단일 쇄 폴리펩티드 변이체는 고정된 효소(인자 Ila, IXa, Xa, XIIa)이용 또는 양전하를 띄는 이온 교환 매트릭스 또는 이와 유사한 방법을 이용하여 자가활성화시킬 수 있다.

폴리펩티드 변이체를 우선 단일 쇄형으로 정제하고, 그 다음 PEG화(원하는 경우에 시키고, 마지막으로 Pedersen et al, 1989, Biochemistry 28: 9331에서 설명하는 방법중 한 가지 방법을 이용하여 활성화시킨다. 활성화시키기전에 PEG화시키면 유익한 점은 R152-I153의 절단에 의해 새로운 아미노 단부의 PEG화를 피할 수 있다. D242와 I153의 아미노단부에 수소결합 형성이 활성화에 필수적이기 때문에 이와 같은 새로운 아미노 단부의 PEG화로 인하여 분자를 비활성화시킬 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물 및 이의 용도

본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 조성물, 특히 본 발명의 폴리펩티드 변이체 및 약학적으로 수용가능한 담체 또는 이의 부형제로 구성된 조성물에 관계한다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체 또는 약학 조성물은 의약물로 이용될 수 있다.

여기에서 언급하는 개선된 성질로 인하여, 본 발명의 폴리펩티드 변이체 또는 본 발명의 약학 조성물은 외상 환자, 혈소판 감소증 환자, 항-응고 치료를 받는 환자, 정맥류 출혈이 있는 경변 환자, 상위 위장 출혈 환자, 직립 간 이식 환자 또는 간 절개(수혈 없이 외과술을 하기 위한) 환자에서 제어불가능한 출혈을 치료하는데 특히 유용하다.

외상은 외부 물질에 의해 살아있는 조직에 손상이 있는 것으로 정의한다. 미국에서는 사망으로 이르는 제4위 원인이 되며, 경제적으로도 큰 부담이 된다.

외상은 블런드(blunt) 형 또는 침투형으로 분류할 수 있다. 블런트형 회상은내부 압박, 기관 손상, 내부 출혈로 이어지는 반면에, 침투성 외상(물질이 체내로 침투하여 조직, 혈관, 기관을 파괴하는)은 외부 출혈로 나타난다.

외상의 결과인 출혈이 연속적인 문제의 원인이 된다. 예를 들면, 생리학적 보상 기작은 초기 말초 및 장간막 혈관 수축으로 시작되어 혈액이 중추 순환계로 돌리게 한다. 순환이 복원되지 않는다면, 혈액량감퇴증(부적절한 관주로 인하여 여러 기관 기능상실)이 일어난다. 신체상에 조직에 산소가 부족하기 때문에, 혐기성 대사과정이 시작된다. 그러나, 동시에 젖산이 혈액 pH를 떨어뜨리고, 대산 산성화가 일어난다. 산성화가 심각하거나 수정되지 않는다면, 환자에서 다수 시스템의 기능이 상실되어 사망하게 될 수 있다.

외상 환자의 대부분이 사고 장소의 환경 여건, 부적절한 보호 등으로 인하여 응급실에 도착하였을 때 저온증을 나타낼 수 있지만, 정맥내 유체 투여, 지속적인 출혈로 저온증이 악화될 수 있다. 응고 인자 결손은 혈액 손실 또는 수혈로 인한 것이다. 다만, 산독증 및 냉각법은 혈액 응고 기작을 방해한다. 따라서, 응혈이상증은 외과적 출혈 부위를 차단할 수 있고, 자동 출혈 제어를 방해할 수도 있다. 냉각법, 응혈이상증, 산독증은 사망에 이르는 세 가지 요소로 특징된다.

외상은 몇가지 원인에 의해 발생된다. 예를 들면, 교통사고에 의해 여러 가지 형태의 외상으로 나타난대. 일부 교통사고는 침투성 외상으로 나타나지만, 많은 교통사고는 머리와 몸에 블런트 외상을 입히게된다. 그러나, 이와 같은 다양한 형태의 외상은 결국 환자에 응혈이상을 가져온다.

교통사고는 미국에서 사막 사고의 주요 원인이 된다. 매년 미국에서 교통사고로 인하여 42,000명이상 사망한다. 많은 외상 환자가 사고 지점에서 사망하거나 응급실에 도착하기전에 또는 운반시에 준의료 봉사자의 처리를 받게된다.

또 다른 예로는 총격 상처이다. 총격 상처는 상당한 출혈이 발생할 수 있는 외상이다. 이러한 상처는 침투성 외상으로 몸통 또는 사지 신체로 탄환이 통과될 때 조직을 파괴한다. 미국에서는 약 40,000명이 매년 총격으로 사망한다.

또 다른 예는 낙상이다. 낙상은 교통사과와 유사한 외상 프로파일을 초래한다. 딱딱한 물체로 떨어지거나 높은 곳에서 떨어짐으로써 침투성 또는 감속 블런트 외상을 유도한다. 미국에서 낙상은 사고로 인한 주요 사망원인이 되고, 약 13,000명이 사망한다.

또 다른 예는 기계적인 사고가 있다. 미국에서는 적은 수이지만 기계 사고로 인하여 인명하고가 나는데, 기계에 받히거나 끼이는 경우이다. 수치는 많지 않지만 2000명 정도의 인명사고로 무시할 것은 못된다.

또 다른 예로는 찔린 상처이다. 찔린 상처는 침투성 손상으로 과다 출혈의 원인이 된다. 찔린 상처에서 손상을 가장 잘 받는 기관은 간, 장, 결장이다.

간 유조직에 반복적으로 장시간 손상을 받게 되는 경우 종국에 생기는 병이간 경변이다. 최종적으로 간 소엽의 정상적인 조직을 유지하지 못하는 재생 모듈을 분리시켜 간 기능을 악화시키는 광범위하게 섬유성 조직이 형성되는 것이다. 환자는 비타민 K-의존성 응혈 인자 부족으로 인하여 장시간의 프로트롬빈 시간을 가진다. 병리유전학적으로, 간 경변은 상당히 반복되는 간 세포 손상으로 인하여 만성 간 손상의 최종 통상 경로로 간주된다. 간 경변은 만성 알코올 중독, 만성 바이러스 간염(A, B, C, D형) 및 자가면역성 간염과 같은 직접적인 간 손상 뿐만 아니라 1차 담즙 경변, 1차 경화성 담관염, 담관 폐쇄등과 같은 간접 손상으로 인하여 발생한다. 경변 원인으로 흔한 것은 아니지만, 방광 섬유증, 알파-10안티트립신 결핍, 혈액색소침착증, 윌슨 병, 갈락토오즈 혈증, 글리코겐 저장 질환과 같은 유전병으로 인하여 직접적인 간 손상으로 인한 경우도 포함된다.

말기 간 경변 환자에 주로 이식은 적합한데, 이는 질병 치료에 주요 중재과정이 된다. 이식을 하기 위해서는 환자는 Child's B 또는 C로 분류하고, 선별을 위해 추가 기준에도 맞아야 한다. 작년 미국에서만, 4,954명이 이식을 했다.

매년 절제술을 받는 환자에서 6,000회 출혈이 있었던 것으로 추정한다. 이는 이식 수와 비교하면 상당히 높은 듯하나 이 과정이 남은 과정이라는 것을 보여주는 것이다.

정맥류 출혈에 정확한 자료를 얻기는 힘들다. 공지의 주요 인자는 진단시에 대상 부전 환자의 약 60%에서 정맥류가 있고, 보전 환자의 30%에서 정맥류가 있는데, 정맥류가 있는 환자의 약 30%는 출혈을 경험하였고, 정맥류 출혈을 경험하였고, 정맥류 출혈은 약 30% 치사율 위험이 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 응혈 형성이 필요한 질병 또는 질환 치료를 위한 약물 제조에 본 발명의 폴리펩티드 변이체에 관계한다. 본 발명의 다른 한 측면은 응혈이 필요한 질병 또는 질환을 가지는 포유류를 치료하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 치료를 요하는 환자에 폴리펩티드 변이체 또는 본 발명의 약학 조성물 효과량을 투여하는 것으로 구성된다.

혈소판감소증은 골수 생산의 감소, 지라의 부골 형성, 혈소판의 과속화된 파괴와 같은 세가지 기작중 한 가지에 의해 발생된다.

혈소판감소증은 출혈의 위험인자로, 혈소판 주입으로 출혈을 감소시킬 수 있다. 예방차원의 혈소판 주입의 시작은 10,000/㎕이다. 열이나 감염이 없는 환자의 경우 5000/㎕이면 자발적인 출혈을 충분히 막을 수 있다. 침투성 과정의 경우에 50,000/㎕가 통상적인 표적 수준이다.

반복되는 수혈후에 혈소판에 대해 항체가 발생하는 환자에서는 출혈을 조절하기가 정말 어렵다.

응혈이 일어나야 좋은 질병으로는 뇌출혈과 같은 출혈 뿐만 아니라 외상과 같은 심각한 제어불가능한 출혈 환자를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 또한, 생체 이식환자, 절제 환자, 정맥류 출혈 환자등도 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체를 치료요법적 효과량으로 환자에 투여하는데, 보통 NovoSevenR과 같은 rFVII로 치료하는데 이용되는 것과 같은 수준의 약량 또는 이보다 낮은 약량을 이용한다. "치료요법적으로 효과량"이란 투여하였을 때 상황에 대해 원하는 효과를 얻는데 충분한 약량을 의미한다. 정확한 약량은 환경에 따라 달라지나, 공지의 기술을 이용하여 당업자가 바로 정할 수 있는 수준이다. 보통 약량은 치료하고자 하는 질환 또는 상태의 심각성을 경감시키거나 확산을 막을 수 있는 양을 말한다. 당분야에 숙지의 지식을 가진 자는 본 발명의 폴리펩티드 변이체 또는 조성물이 질병, 약량, 투여 일정, 폴리펩티드 변이체 또는 조성물을 단독으로 투여할 것인지 또는 다른 치료제와 복합하여 투여할 것인지에 따라, 조성물의 혈장반감기, 환자의 전반적인 건강 상태에 따라 달라진다는 것을 인지할 것이다. 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 변이체 또는 조성물은 응고 질환을 정상화시키는데 충분한 약량, 효과량으로 투여한다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 약학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 투여된다. "약학적으로 수용가능한"이란 투여받는 환자에 부적절한 효과를 주지않는 담체 또는 부형제를 말한다. 이와 같은 약학적으로 수용가능한 담체 및 부형제는 당분야에 공지되어 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, I 8th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. FrokJaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Phan-naceutical Press [2000]).

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 공지의 방법을 통하여 약학 조성물로 조제될 수 있다. 적절한 조제 방법은 Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin (Mark Publ. Co., l6th Ed., 1980)에서 설명하고 있다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 "그 상태"로 또는 염형태로 이용될 수 있다. 적절한 염에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간과 같은 알칼리 또는 알칼리 토금속염이 되나 이에 국한시키지는 않는다. 이들 염 또는 복합체는 결정 또는 무정형 구조로 존재한다.

본 발명의 약학 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 복합하여 투여될 수있다. 이들 물질은 동일한 약학 조성물의 일부로 결합되거나 본 발명의 폴리펩티드 변이체와 별도로 투여될 수 있는데, 동시에 투여되거나 또 다른 치료 과정에 따라 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드 변이체 또는 약학 조성물은 다른 치료법의 어쥬번트(adjuvant)로 이용될 수 있다.

본 발명의 목적이 되는 "환자"는 사람 및 다른 포유류가 모두 포함된다. 따라서, 본 발명의 인간 의학 및 수의학에도 응용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체로 구성된 약학 조성물은 액체, 겔, 냉동동결된 또는 압착 고체형 등 다양한 향태로 만들어질 수 있다. 적절한 형태는 치료될 특정 상태에 따라 달라질 수 있는데, 이는 당업자가 잘 결정할 수 있는 것이다.

특히, 본 발명의 폴리펩티드 변이체로 구성된 약학 조성물은 냉동동결된 또는 안정한 가용성 형으로 만들어질 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 공지의 다양한 과정을 이용하여 냉동 동결시킬 수 있다. 여기에서 설명하는 것과 같이 단백질 분해 부위를 차단 또는 제거하여 폴리펩티드 변이체를 안정된 용액형으로 만들 수 있다. 안정된 가용성 물질로 만들면 환자가 다루기가 훨씬 용이하고, 응급상황에서는 신속하게 작용하여 생명을 구할 가능성도 있다. 적절한 형태는 치료될 특정 상태에 따라 달라질 수 있는데, 이는 당업자가 잘 결정할 수 있는 것이다.

본 발명의 조성물 투여는 다양한 경로를 통하여 이루어지는데, 예를 들면, 경구, 피하, 정맥, 대뇌, 비강, 경피, 복막, 근육, 폐, 질, 직장, 안구내, 또는 다른 적절한 방식이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 정맥 볼루스 주사도 가능하나, 펌프 또는 피하주입등을 통하여 조제물을 주입을 통하여 연속적으로 투여할 수도 있다. 일부 경우에 조제물은 용액 또는 스프레이를 통하여 직접 제공할 수도 있다.

비경구투여

약학 조성물의 적절한 예는 비경구투여를 위한 용액이다. 많은 경우에, 약학 용액 조성물은 약상으로 제공되어 바로 사용하기에 적절한데, 장관외 조성물(parenteral formulations)은 동결 또는 냉동 동결된 형으로 제공될 수 있다. 전자의 경우에 조성물을 사용전에 녹여야 한다. 후자의 경우는 다양한 저장 상태에 포함된 활성 화합물의 안정성을 높이는데 흔히 사용되는 것으로써, 당업자는 냉동 동결된 조제물이 액체보다는 일반적으로 더 안정적이라는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 냉동 동결된 조제물은 한가지 이상의 약학적으로 수용가능한 희석제 예를 들면 주사용 증류수 또는 멸균 생리염용액을 첨가하여 사용하기 전에 재구성된다.

비경구투여의 경우에, 냉동 동결된 조제물로 보관할 수 있도록 만든 후, 원하는 순도를 가지는 폴리펩티드 변이체와 당분야에서 전형적으로 이용되는 한 가지 이상의 수용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제, 예를 들면, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장액화제, 비-이온성 계면활성제, 합성 세제, 항산화제, 다른 기타 첨가제(이런 모든 것을 "부형제"라고 함)와 적절하게 혼합하여 용액으로 한다.

완충제는 생리학적 상태에 근접하도록 pH를 유지시키는데 도움이 된다. 이는 약 2mM 내지 약 50mM 범위의 농도가 일반적이다. 본 발명에 사용하기에 적절한 완충제에는 유기산 및 무기산이 포함되는데, 예를 들면, 구연산 완충액(구연산 1나트륨-구연산2나트륨 혼합물, 구연산-구연산3나트륨 혼합물, 구연산-구연산1나트륨혼합물 등), 숙신산 완충액(예를 들면, 숙신산-숙신산 1 나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산2나트륨 혼합물 등). 타르타르염 완충액(예를 들면, 타르타르산-타르타르산 나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산 칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화 나트륨 혼합물 등), 퓨마르산 완충액(예를 들면, 퓨마르산-퓨마르산 1나트륨 혼합물, 퓨마르산-퓨마르산 2나트륨 혼합물, 퓨마르산 1나트륨-퓨마르산 2나트륨 혼합물 등), 글루코네이트 완충액(예를 들면, 글루코닌산-글루코닌산 나트륨염 혼합물, 글루코닌산-수산화나트륨 혼합물, 글루코닌산-글루코닌산 칼륨 혼합물 등), 옥살레이트 완충액(예를 들면 옥살산-옥살산 나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산 칼륨 혼합물 등), 락테이트 완충액(예를 들면, 젖산-젖산 나트륨 혼합물, 젖산-수산화나트륨 혼합물, 젖산-젖산 칼륨 혼합물 등), 아세테이트 완충액(예를 들면, 아세트산-아세트산 나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등이 포함된다. 추가로 인산염 완충액, 히스티딘 완충액, ㅆTris와 같은 트리메틸아민염 등이 될 수도 있다.

안정화제는 치료제를 안정화시키는 물질 또는 용기 벽에 부착되거나 변성을 막는 벌크제(BULKING)에서부터 첨가제에 이르기 까지 광범위한 부형제를 말한다. 전형적인 안정화제는 상기에서 나열한 것과 같이 폴리하이드릭(polyhydric) 당 알코올; 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티만, 알라닌, 오미틴, L-루이신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌 등과 같은 아미노산, 락토즈, 트레할로즈, 스타치오스, 만니톨, 솔비톨, 자이리톨, 리비톨, 미오이노시톨, 알락티톨, 글리세롤; 아미노산 폴리머; 당을 포함하는 환원제 예를 들면, 요소. 글루타티온,티오틱산, 티오글리콜레이트 나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤, 티오설페이트 나트륨; 저분자량 폴리펩티드(예를 들면 10개 미만 잔기); 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 면역글로빈과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 실로즈, 만노즈, 과장, 포도당과 같은 1당류; 락토즈, 말토즈, 슈크로즈와 같은 2당류; 라피노즈와 같은 3당류; 덱스트란과 같은 다당류와 같은 유기 당 또는 당 알코올 등이 될 수 있다. 안정화제는 일반적으로 활성 단백질 중량당 0.1 내지 10,000 부 범위로 존재한다.

보존제는 미생물의 생장을 지연시키기 위해 첨가되는데 일반적으로 약 0.2%- 1%(w/v)의 양으로 첨가된다. 본 발명에 이용할 수 있는 적절한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할로겐화물(염화 벤잘코늄, 브롬화 벤잘코늄, 오오드화 벤잘코늄), 알킬 파라벤 예를 들면, 메틸, 프로필 파라벤, 카테콜, 세조르치놀, 사이클로섹사놀, 3-펜타놀 등이 포함된다.

등장화 물질이란 액체 조성물의 등장성을 가지도록 첨가하는데, 예를 들면, 폴리하이드릭 당 알코올, 적절하게는 트리하이드릭 또는 고차 당 알코올 가령, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자이리톨, 솔비톨, 만니톨등이 포함된다. 폴리하이드릭 알코올은 0.1wt% 내지 25wt% 일반적으로, 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여 1wt% 내지 5wt%정도로 존재한다.

비-이온성 계면활성제 또는 세제(가습제)는 치료제를 용해시키는 것을 도울뿐아니라 교반에 의해 유도되는 응집으로부터 치료요법적 폴리펩티드를 보호하기위해 첨가한다. 또한, 조성물의 폴리펩티드 변성없이 표면 스트레스를 차단시킬 수 있다. 적절한 비-이온성 계면활성제에는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), PI-유로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(Tween-20, Tween-80 등)이 포함된다.

추가 기타 부형제에는 벌크제 또는 충진제(예를 들면 전분), 킬레이트제( EDTA), 항산화제(아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 공용매등이 포함된다.

활성 성분은 또한 마이크로캡슐내에 포집될 수 있는데, 이때 이러한 캡슐은 coascervation 기술 또는 계면 중합화 반응 예를 들면, 콜로이드성 약물 시스템(가령, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멸젼, 나노입자, 나도캡슐) 또는 마크로에멸젼에 하이드록시메틸셀룰로오즈, 젤라틴, 폴리-(메틸메타아크릴레이트) 마이크로캡슐을 계면 중합화시켜 만든다. 이와 같은 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, supra에서 설명하고 있다.

in vivo투여에 이용하기 위한 비경구 투여 조제물은 멸균되어야 한다. 멸균 여과 막을 통하여 여과시켜 바로 멸균시킬 수 있다.

지연 방출 조제물

지연 방출 조제물의 예로는 폴리펩티드 변이체를 포함하는 고체 반투성 매트릭스가 있다. 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 적절한 형태를 하고 있다. 지연 방출 매트릭스에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타아크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루타민산과 에틸-L-글루타메이트 공중합체, 비-분해성 에틸렌비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, ProLeaseR technology 또는 Lupron DepotR (주사용 마이크로스페어는 락트산-글리콜산 공중합체와 루프로리드 아세테이드로 구성), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티릭산 등이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트, 락트산-글리콜산과 같은 폴리머는 최고 100일까지 또는 그 이상의 장시간동안 분자 방출할 수 있어, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간에 단백질을 방출한다. 포집된 폴리펩티드는 장시간동안 체내에 남아있고, 이들은 37℃에서 수준에 노출되면 변성 또는 응집되어 생물학적 활성을 상실하고, 면역원성에 변화가 올 수도 있다. 관련 기작에 따라 안정화를 위해 이상적인 전략을 짜야 한다. 예를 들면, 응집 기작이 티오-이황화 결합 상호작용을 통하여 분자간 S-S 결합 형성으로 인한 것이 발견되면, 설파하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 냉동 동결시키고, 적절한 첨가제를 이용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 폴리머 매트릭스 조성물을 만들어 안정화시킬 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 추가 설명하나, 이에 국한시키지는 않는다.

재료 및 방법

접근가능한 표면적(ASA)

컴퓨터 프로그램 엑세스(B. Lee and F.M.Richards, J. MoI.Biol. 55: 379-400 (1971)) version 2 (C 1983 Yale University)를 이용하여 구조에서 각 원자의 접근가능한 표면적(ASA)을 계산할 수 있다. 이 방법은 일반적으로 1.4Å 프로브-크기를 이용하는데, ASA는 프로브 중심에 의해 형성되는 면적으로 정의한다. 이 계산을 하기 전에 모든 물 분자 및 모든 수소 원자를 좌표로부터 제거해야하고, 그 이유는 다른 원소는 단백질에 직접 관계하지 않기 때문이다.

측쇄의 분취 ASA

측쇄의 분취 ASA는 측쇄 원자의 ASA 합을 연장된 Ala-x-Ala-삼중 펩티드에서 이들 잔기 형의 측쇄 원자의 ASA를 나타내는 수지로 나누어 계산한다(Hubbard, Campbell & Thornton (1 99 1) J.Mol.Biol.220,507-53 0). 예를 들면, CA 원자는 글리신 잔기의 측쇄 일부로 간주하나 나머지 잔기에 대해서는 아니다. 다음의 표는 측쇄에 대한 표준 100% ASA로 나타낸 것이다.

Ala	69.23Å2		Leu	140.76Å2
Arg	200.35Å2		Lys	162.50Å2
Asn	106.25Å2		Met	156.08Å2
Asp	102.06Å2		Phe	163.90Å2
Cys	96.69Å2		Pro	119.65Å2
Gln	140.58Å2		Ser	78.16Å2
Glu	134.61Å2		Thr	101.67Å2
Gly	32.28Å2		Trp	210.89Å2
His	147.00Å2		Tyr	176.61Å2
Ile	137.91Å2		Val	14.14Å2

구조에서 감지되지 않은 잔기는 유연성 부분에 있는 잔기로 간주하여 100% 노출을 가지는 것으로 정의한다. 위치 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 35에서 감마-카르복시 글루타민 산은 100% 노출된 것으로 정의하였다.

원자간의 거리 결정

원자간의 거리는 InsightIIR v. 98.0, MSI INC와 같은 분자 그래픽 소프트웨어를 이용하여 용이하게 측정하였다.

활성 부위 부분

활성 부위 부분은 촉매성 삼원소(잔기 H193, D242, S344)에서 임의 원자의 10Å내에 적어도 한 개 원자를 가지는 임의 잔기로 정의한다.

조직 인자 결합 부위 결정

TF 결합 부위는 TF 결합시에 접근가능한 표면이 변화된 모든 잔기로 구성된 것으로 정의한다. 이는 적어도 2가지 ASA 계산을 이용하여 측정하는데, 한 가지는 리간드/수용체 복합체에 분리된 리간드 상에서의 계산과 다른 하나는 완전한 리간드/수용체 복합체상에서 계산하는 것이다.

단백질 분해에 대한 감소된 감응성을 측정하는 방법

US 5,580,560의 실시예 5에서 설명하는 검사를 이용하여 단백질 분해를 측정하는데, 단백질 분해는 자가 단백질 분해가 된다.

또한, 방사능라벨된 샘플을 이용한in vivo모델에서 혈액 샘플을 취하여 본 발명의 폴리펩티드 변이체와 rFVIIa와 비교하고, SDS-PAGE 및 오토라디오그래피를 하여 감소된 단백질 분해를 테스트한다.

단백질분해성 분해를 측정하는데 이용된 검사에는 무관하게, "감소된 단백질 분해성 분해"는 코마시 착색된 SDS-PAGE 겔의 겔 스캔에 의해 측정하였을 때 또는 하기에서 설명하는 조직 인자 독립 활성 검사를 이용하여 야생형과 비교하였을 때 보존된 촉매 활성으로 측정하였을 때 rhFVIIa에 의해 수득된 것과 비교하여 절단시에 측정가능치가 감소된 것을 말한다.

폴리펩티드 변이체의 분자량 측정

폴리펩티드 변이체의 분자량은 SDS-PAGE, 겔 여과, 웨스턴 블락, 매트릭스 지원 레이져 탈착 질량 스펙트로스코피 또는 균형 원심분리, 예를 들면, SDS-PAGE (Laeramli, U.K., Nature Vol 227 (1970), pp. 680)등이 있다.

TF-독립 인자 X 활성화 검사

이 검사는 Nelsestuen et al., J Biol Chem, 2001; 276:39825의 페이지 39826에 상세하게 설명하고 있다.

간략하게 설명하면, 검사를 받을 분자(hFVIIa, rhFVIIa 또는 본 발명의 활성형)를 인지질 원(포스파티딜콜린, 포스파티딜세린-8:2 비율 또는 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올-4:2:4 비율)과 인자 X/Tris 완충액(BSA 함유)에 혼합한다. 특정 배양 시간 후에, 과량의 EDTA를 첨가하여 반응을 종료시킨다. 인자 Xa의 농도는 발색 기질(S-2222, Chromogenix)을 첨가한 후에 405㎚에서 흡수도의 변화로 측정한다. 배경을 보정한 후에, rhFVIIa(awt)의 조직 인자 독립 활성은 10분후의 흡수도 변화로 결정할 수 있고, 본 발명 폴리펩티드 변이체의 조직 인자 독립 활성(Avariant)도 10분후의 흡수도 변화로 측정할 수 있다. 활성형 폴리펩티드 변이체와 rhFVIIa의 비율은 avariant/awt로 정의한다.

응혈 검사

응혈 활성은 1단계 검사로 측정하는데, 응고 시간은 Thrombotrack IV 응고측정계(MEDINOR)로 기록한다. FVII 결손된 사람 혈장(American Diagnostica)을 재구성하여, 15-20분간 실온에서 균질하게 한다. 50㎕ 혈장을 응고측정계 컵에 옮긴다.

hFVIIa, rhFVIIa 또는 변이체를 글리옥살린 완충액(5.7mM 바비투르산염, 4.3 mM 구연산나트륨, 117mM NaCl, 1mg/mL BSA, pH 7.35)에 희석시킨다. 샘플을 50㎕ 컵에 첨가하고, 2분간 37℃에서 배양시킨다.

트롬보플라스틴(MEDINOR)은 물로 재구성하여, CaCl2를 첨가한다. 반응은 4.5mM CaCl2를 포함하는 0.1㎖ 트롬보플라스틴을 첨가하여 개시한다.

PRISM 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석한다.

TF-독립성 응혈 검사

이 검사는 "응혈 검사"에서 설명한 것과 같이 실행하나 트롬보플라스틴을 추가하지는 않는다.

아미드분해(Amidolytic) 검사

작은 펩티드 기질을 변이체가 절단하는 능력에 대해 발색 기질S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아미드)를 이용하여 측정하였다. 아미드 분해 활성은 항-트롬빈 III(ATIII) 유무하에 측정할 수 있다.

HFVIIa, rhFVIIa 또는 변이체를 검사완충액(50mM Na-Hepes pH 7.5, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% BSA, lU/㎖ 헤파린)에 90nM로 희석시킨다. 또한, 가용성 TF(sTF)를 검사 완충액에 450nM로 희석시킨다. ATIII는 검사완충액에 900 nM로 희석시킨다. 120㎕ 검사 완충액을 20㎕ FVIIa 샘플, 20㎕ sTF, 20㎕ ATIII 또는 검사 완충액과 혼합한다. FVIIa, sTF, ATIII의 최종 농도는 각각 10, 50, 100nM이다. 실온에서 가볍게 교반시키면서 5분간 배양후에, 37℃에서 10분 추가 배양 후에, 반응은 S-2288 기질을 1 mM로 추가하여 개시하고, 405nm에서 흡수도는 몇 가지 위치에서 측정하여 결정한다.

트롬보그램 검사

사람 혈장에서 트롬빈 생성에서 hFVlla, rhFVIIa 또는 변이체의 효과를 Hemker et al. in Thromb Haeraost 2000; 83: 589의 589페이지에서 설명하는 변형된 검사를 이용하여 테스트한다. 간략하게 설명하면, 검사될 분자(hFVl1a, rhFVIIa 또는 변이체)를 정상적인 혈소판이 풍부한 혈장(PRP), 정상적인 혈소판이 부족한 혈장(PPP) 또는 FVH이 부족한 PPP와 혼합하는데, 재조합 사람 조직 인자(rTF), 재지질화된(relipidated) rTF 또는 다른 TF 소스(트롬보플라스틴)을 첨가하는 경우와 하지 않는 경우를 함께한다. 인지질 원(포스파티딜콜린, 포스파티딜세린-8:2 비율 또는 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올-4:2:4 비율)을 첨가할 수 있다.

형광생성 트롬빈 기질 및 염화칼슘을 첨가하여 반응을 개시한다. 형광을 연속적으로 측정하고, 트롬빈 아미드분해 활성은 형광 곡선의 기울기를 계산하여 게산된다(시간이 지남에 따라 형광이 증가됨). 이와 같은 방법으로, 최대 트롬빈 아미드 분해 활성이 수득되는 시간(Tmax)에 총 트롬빈 작용(곡선 아래 면적(AUQ))을 계산한다.

다음의 과정을 이용한다: PRP는 10분간 250g, 15℃에서 새로 빼낸 혈액을 원심분리하여 얻을 수 있다. 구연산(13mM 구연산3나트륨), 옥수수 트립신 저해물질(50-100㎍/㎖ 혈액), 구연산 및 옥수수 트립신 저해물질 복합물을 이용하여 혈액 응고를 저해시킬 수 있다. 혈소판 수는 완충액 또는 자가 혈소판이 부족한 혈정(PPP)를 이용하여 3x108/㎖로 조정한다. 10분간 1000g, 15℃에서 PRP를 이중 원심분리하면 PPP를 얻을 수 있다. PPP를 고형상에 결합된 FVII 특이적인 단클론 항체와 배양하면 FVII 방혈을 시킬 수 있다.

96웰 미량적정 플레이트의 웰당 80㎕ PRP를 첨가하여, 테스트받을 rhFVIIa 또는 변이체를 최종 농도 0.1 내지 100nM이 되도록 포함한 완충액 20㎕을 포함한다. rTF를 최종 농도가 1pM이 되도록 5㎕ 검사 완충액에 첨가한다. 검사 완충액은 20mM Hepes, 150mM NaCl, 60mg/㎖ BSA/증류수로 구성된다. 반응은 0.1M 염화 칼슘을 포함하는 기질 용액 20㎕를 첨가하여 개시한다. 검사 플레이트 및 시약은 37℃로 사전에 데우고, 반응은 이 온도에서 일어나도록 한다. 이용된 형광측정기는 BMG 형광측정계(390㎚에서 여기 필터, 460nm에서 방출 필터)를 이용한다. 형광은 30-180분간 20-40초 간격으로 96웰 깨끗한 바닥 플레이트의 각 웰에서 측정하였다. 데이터는 PRISM 소프트웨어를 이용한다.

ELISA 검사

FVII/FVIIa(또는 변이체) 농도는 ELISA를 이용하여 측정한다. 미량 적정 플레이트의 웰은 2㎍/㎖/PBS(웰당 100㎕)을 이용하여 프로테아제 도메인에 대한 항체로 피복한다. 실온에서 2시간 피복후에, 웰을 THF 완충액(100mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.2, 0.05% Tween-20)으로 4회 세척한다. 연속하여 200㎕ 1% 카제인(100mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.2을 이용한 2.0% 원액으로부터 희석한)을 각 웰에 첨가하여 블락킹시킨다. 실온에서 다시 1시간 배양 후에, 웰은 THF 완충액으로 4회 세척한다음 EGF-형 도메인에 대한 바이오틴-라벨된 항체(1㎍/㎕) 100㎕를 첨가한다.실온에서 다시 1시간 배양 후에, THF 완충액으로 4회 세척한 후, 100㎕ 스트렙타아비딘-말 양고추 냉이 과산화효소((DAKO A/S, Glostrup, Denmark, 1/10000 희석된)를 첨가하였다. 실온에서 추가 1시간 배양 후에, THF 완충액으로 4회 세척하고, 100㎕ TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Kem-en-Tech A/S, Denmark)를 첨가하였다. 암상태 실온에서 30분간 배양 후에, 100㎕ 1M H2SO4를 첨가하고, OD450㎚를 측정하였다. rhFVHa(NovoSevene)를 이용하는 표준 곡선을 준비한다.

또는, FVII/FVIIa 또는 변이체는 프로테아제 도메인을 통하기 보다는 Gla 도메인을 통하여 정량화시킬 수 있다. 이와 같은 ELISA 셋업에서, 웰은 EGF-형 도메인에 대한 항체로 하룻밤동안 피복시키고, 감지를 위해 칼슘-의존성 바이오틴라벨된 단클론항체 항-Gla을 이용한다(2㎕/㎖, 웰당 100㎕). 이와 같은 셋업에서, 5mM CaCl2를 THT 및 희석 완충액에 첨가한다.

전체 혈액 검사

전체 혈액 검사는 Elg et al. Thrombosis Res. 2001, 101(3):159-170에서 설명하는 것과 같이 실행한다.

재구성된 응혈 검사

재구성된 응혈 검사는 Van't Veer et al. Blood 2000, 95(4), 1330-1335에서 설명하는 것과 같이 실행한다.

실시예 1

Banner et.al., J Mol Biol, 1996; 285:2089에서 설명하는 가용성 조직 인자와 복합된 hFVIIa의 X-선 구조를 이 실시예에서 이용된다. 참고대상의 잔기 수는서열을 따르지는 않는다. 우리는 SEQ ID NO:2에 따른 서열 번호를 이용한다. 위치 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 35에 있는 감마-카르복시 글루타민 산은 GLU (3문자 약어) 또는 E(1문자 약어)로 명명한다. 잔기 143-152는 구조에 나타나지 않는다

표면 노출

방법에서 설명하고 있는 비표준 또는 손실 잔기의 접근성 정의와 함께 FVII 단편상에 분취 ASA 계산을 하면, 표면에 노출된 이들 측쇄의 25%이상을 가지는 다음의 잔기가 된다; Al, N2, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, F24, E25, E261 R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35, R36. K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I67, F71 L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109, S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131, E132, I140, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158, P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, I186, H193, K197, K199, N200, R202, N203, I205, S214, E215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251, V253, T255, D256, E265, R266, T267, E279, R271,F275, V276, R277,F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311,Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321, N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353, G354, Q366, G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404, P406(A1-S45는 Gla 도메인에 위치하고, 나머지 위치는 Gla 도메인의 외측에 있다).

다음의 잔기는 표면에 노출된 이들 측쇄의 50%이상을 가진다; A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107,T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131, E132, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249, Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, N301, M306, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, G318, D319 N322, E325, D334, K341, G354, G367, V371, E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404, P406(A1-S45는 Gla 도메인에 위치하고, 나머지 위치는 Gla 도메인의 외측에 있다).

조직 인자 결합 부위

ASA 계산을 하면, 사람의 FVII에서 다음 잔기의 ASA가 변화된다. 이들 잔기는 수용체 결합 부위로 구성된 것으로 정의한다: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, 142, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325, R379.

활성 부위 부분

촉매 삼원소(H193, D242, S344)에서 임의 원자로부터 10Å 떨어 거리에 적어도 한 개 원자를 가지는 임의 잔기로 정의한다: I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400, F405.

활성 부위 결합 틈의 봉우리

활성 부위 결합 틈 부분의 봉우리는 hFVIIa 구조 1FAK.pdb를 시각적으로 관찰하여 다음과 같이 정의한다: N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321, T370.

실시예 2

포유류에서 rhFVIIa 발현을 위한 발현 카세트 고안

고유의 짧은 시그날 펩티드(Hagen et al., 1986. PNAS 5 83:2412)와 hFVII를 인코드하는 전장 cDNA의 짧은 형이 포함된 SEQ ID NO: 1에서 나타낸 DNA 서열을 합성하여 포유류 세포에서 높은 발현을 실행시켰다. 우선, ATG 시작 코돈은 Kozak 콘센선스 서열(Kozak, M. JMol Biol 1987 Aug 20; 1 96(4):947-50)로 변형시켜, ATG 시작 코돈의 상류 콘센선스 서열에 완벽하게 일치되도록 한다. 둘째, 고유 cDNA의 오픈 리딩 프레임은 매우 발현이 잘되는 사람 유전자에 흔히 이용되는 코돈쪽으로 코돈 용도에 약간의 바이어스(bias)를 만들어 변형시켰다. 또한, 두 개 해복 종료 코돈을 오픈 리딩 프레임의 단부에 삽입시켜, 효과적으로 해독이 종료되도록 한다. 완전히 합성되고, 발현 최적화된 FVlI 유전자를 70-mer DNA 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리하여, 표준 PCR 기술을 이용하여 5'및 3'단부에BamHI 및HindIII 부위에 삽입되는 엔드 프라이머(end primers)을 이용하여 마지막으로 증폭시키면 다음과 같은 서열을 얻는다.

rhFVIIa의 발현 카세트를 포함하는 생성된 PCR 산물을 클로닝하기 위한 벡터는 pCINeo(Promega)로부터 인크론을 클로닝하여 만들 수 있다. pCI-Neo에서 합섭 인트론은 표준 PCR 조건 및 프라이머를 이용하여 증폭하면 332bp PCR 단편을 얻는다;

CBProFpr174: 5'- AGCTGGCTAGCCACTGGGCAGGTAAGTATCA -3'

CBProFpr175: 5'- TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT -3'

이 단편을NheI 및BamHI으로 잘라내어, pCDNA3.1/HygR(Invitrogen)내로 클로닝하면, PF#34가 생성된다.

hFVII 발현 카세트는 PF#34의BamHI 및HindIII 부위사이에 클론시켜, 플라스미드 PF#226를 얻는다.

실시예 3

CHO K1 세포에서 폴리펩티드 변이체의 발현

세포주 CHO K1(ATCC # CCL-61)는 MEMα, 10% FCS(Gibco/BRL Cat # 10091), P/S 및 5㎍/㎖ 피롤퀴논를 이용하여 T-25 플라스트에서 50% 합류되도록 접종하여, 합류될 때까지 생장하도록 한다. 합류 단세포 층에 상기에서 설명하는 관련 플라스미드 5㎍을 제조업자의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 트랜스펙션 물질(Life technologies)을 이용하여 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 후 24시간 후에 샘플을 취하여, hFVII의 EGF1 도메인을 인지하는 ELISA를 이용하여 정량화시킨다. 이 시점에서, 안정적인 형질변환체를 만들기 위한 목적으로 관련 선별(예를 들면 하이그로마이신 B)을 세포에 적용시킬 수 있다. CHO KI 세포을 이용하고 플라스미드상에 선별 표식으로 하이그로마이신 B 저항 유전자를 이용하는 경우에 1주일 이내에 통상 얻을 수 있다.

실시예 4

폴리펩티드 변이체를 안정적으로 발현시키는 CHO K1 세포 생성

CHO-K1 형질변환체 바이알을 해동시키고, 25㎖ MEMα, 10% FCS, 피롤퀴논(5 ㎍/㎖), 100U/I 페니실린, 100㎍/ℓ 스트렙토마이신을 포함하는 175㎠ 조직 플라스크에 접종시키고 24시간동안 생장시킨다. 세포를 수득하고, 각 세포 밀도가 ½-1 세포/웰로 96웰 미량적정 플레이트에 도말시켰다. 1주일 생장시킨 후에, 2100 세포 콜로니가 웰에 존재하고, 오직 한 개 콜로니만을 사진 웰을 라벨시켰다. 추가 2주후에, 한 개 콜로니만을 포함하는 모든 웰의 배지는 200㎕ 새로운 배지로 대체하였다. 24시간 후에, 배지 샘플을 빼내고, ELISA로 분석하였다. 많이 생산되는 클론을 선별하고, FVII 또는 변이체를 대규모로 만드는데 이용된다.

실시예 5

폴리펩티드 변이체의 정제 및 연속적인 활성화

다음과 같이 폴리펩티드 변이체를 정제시키고, 연속하여 FVII 및 FVII 변이체를 정제하였다. 4℃에서 다음의 과정을 실시하였다. 대규모 생산으로부터 수득된 배양물 배지는 30KDa 차단 Pellicon 막을 가지는 Millipore TFF 시스템으로 한외여과시켰다. 배지를 농축한 후에, 구연산염을 5mM로 첨가하고, pH는 8로 조절하였다. 필요한 경우에, 전도성을 10mS/cm로 낮춘다. 연속하여 샘플은 50mM NaCl, 10mM Tris pH 8로 평형을 이룬 Q-Sepharose FF 컬럼에 건다. 컬럼은 100mM NaCI, 10mM Tris, pH8.6으로 세척한 후에, 150mM NaCl, 10mM Tris pH8.6으로 세척하고, FVII는 1OmM Tris, 25mM NaCl, 35mM CaCl2, pH8.6으로 용출시켰다.

2단계 크로마토그래피에서, CNBr-활성화된 Sepharose FF에 대한 단클론 칼륨-의존성 항-Gla 도메인 항체를 결합시켜 친화력 컬럼을 만든다. 약 5.5mg 항체를 ㎖ 수지에 결합시킨다. 컬럼은 10mM Tris, 100 mM NaC1, 35mM CaCl2, pH7.5로 균형을 맞춘다. NaCl을 샘플에 100 mM NaCl의 농도로 첨가하고, pH는 7.4-7.6으로 저정한다. O/N 샘플 응용후에, 컬럼을 100mM NaCl, 35mM CaCl2, 10mM Tris pH 7.5, 로 세척하고, FVII 단백질을 100mM NaCl, 50mM 구연산염, 75mM Tris pH 7.5로 용출시켰다.

세 번째 크로마토그래피의 경우에 샘플의 전도성을 필요하다면 10mS/cm로 낮춘다음 pH를 8로 조절하였다. 샘플은 그 다음 Q-sepharose 컬럼(50mM NaCl, 1OmM Tris pH 8.6)에 겔 ㎖당 3-5㎎ 단백질 정도의 밀도로 제공하여 효과적인 활성화를 얻는다. 적용 후에, 컬럼을 50mM NaCl, 1OmM Tris pH 8.6으로 약 4시간 동안 세척하는데, 시간당 3-4배 컬럼 용적 양으로 흐르게 된다. FVII 단백질은 0-100% 500mM NaCl, 10mM Tris pH8.6 구배 농도를 이용하여 용출시킨다. FVII을 포함하는 분취물을 모은다.

최종 크로마토그래피 단계로, 전도성을 1OmS/cm로 낮춘다. 결과적으로, 샘플을 Q-sepharose 컬럼(140mM NaCl, 10mM 글리실글리신 pH 8.6으로 균형을 이룬)에 겔 ㎖당 3-5mg 단백질 농도로 제공한다. 그 다음 컬럼을 140mM NaCl, 10mM 글리실글리신 pH8.6으로 세척하고, FVII는 140mM NaCl,15mM CaCl2,lOmM 글리실글리신 pH8.6으로 용출시킨다. 용출물은 10mM CaCl2로 희석시키고, pH는 6.8-7.2로 조절한다. 마지막으로, Tween-80을 0.01%로 첨가하고, pH는 5.5로 조정하여 -80℃에 보관한다.

SEQUENCE LISTING <110> Maxygen ApS; Maxygen Holdings <120> Factor VII or VIIa Polypeptide Variants <130> 0259wo210 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1338 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (115)..(1335) <400> 1 atggtcagcc aggccctccg cctcctgtgc ctgctcctgg ggctgcaggg ctgcctggct 60 gccgtcttcg tcacccagga ggaagcccat ggcgtcctgc atcgccggcg ccgg gcc 117 Ala 1 aat gcc ttt ctg gaa gag ctc cgc cct ggc tcc ctg gaa cgc gaa tgc 165 Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys 5 10 15 aaa gag gaa cag tgc agc ttt gag gaa gcc cgg gag att ttc aaa gac 213 Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp 20 25 30 gct gag cgg acc aaa ctg ttt tgg att agc tat agc gat ggc gat cag 261 Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln 35 40 45 tgc gcc tcc agc cct tgc cag aac ggg ggc tcc tgc aaa gac cag ctg 309 Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu 50 55 60 65 cag agc tat atc tgc ttc tgc ctg cct gcc ttt gag ggg cgc aat tgc 357 Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys 70 75 80 gaa acc cat aag gat gac cag ctg att tgc gtc aac gaa aac ggg ggc 405 Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly 85 90 95 tgc gag cag tac tgc agc gat cac acg ggc acg aag cgg agc tgc cgc 453 Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg 100 105 110 tgc cac gaa ggc tat agc ctc ctg gct gac ggg gtg tcc tgc acg ccc 501 Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro 115 120 125 acg gtg gaa tac cct tgc ggg aag att ccc att cta gaa aag cgg aac 549 Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn 130 135 140 145 gct agc aaa ccc cag ggc cgg atc gtc ggc ggg aag gtc tgc cct aag 597 Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys 150 155 160 ggg gag tgc ccc tgg cag gtc ctg ctc ctg gtc aac ggg gcc cag ctg 645 Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu 165 170 175 tgc ggc ggg acc ctc atc aat acc att tgg gtc gtg tcc gcc gct cac 693 Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His 180 185 190 tgc ttc gat aag att aag aat tgg cgg aac ctc atc gct gtg ctc ggc 741 Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly 195 200 205 gaa cac gat ctg tcc gag cat gac ggg gac gaa cag tcc cgc cgg gtg 789 Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val 210 215 220 225 gct cag gtc atc att ccc tcc acc tat gtg cct ggc acg acc aat cac 837 Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His 230 235 240 gat atc gct ctg ctc cgc ctc cac cag ccc gtc gtg ctc acc gat cac 885 Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His 245 250 255 gtc gtg cct ctg tgc ctg cct gag cgg acc ttt agc gaa cgc acg ctg 933 Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu 260 265 270 gct ttc gtc cgc ttt agc ctc gtg tcc ggc tgg ggc cag ctg ctc gac 981 Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp 275 280 285 cgg ggc gct acc gct ctc gag ctg atg gtg ctc aac gtc ccc cgg ctg 1029 Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu 290 295 300 305 atg acc cag gac tgc ctg cag cag tcc cgc aaa gtg ggg gac tcc ccc 1077 Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro 310 315 320 aat atc acg gag tat atg ttt tgc gct ggc tat agc gat ggc tcc aag 1125 Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys 325 330 335 gat agc tgc aag ggg gac tcc ggc ggg ccc cat gcc acg cac tat cgc 1173 Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg 340 345 350 ggg acc tgg tac ctc acc ggg atc gtc agc tgg ggc cag ggc tgc gcc 1221 Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala 355 360 365 acg gtg ggg cac ttt ggc gtc tac acg cgc gtc agc cag tac att gag 1269 Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu 370 375 380 385 tgg ctg cag aag ctc atg cgg agc gaa ccc cgg ccc ggg gtg ctc ctg 1317 Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu 390 395 400 cgg gcc cct ttc cct tga taa 1338 Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 2 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer CBProFpr174 <400> 3 agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer CBProFpr175 <400> 4 tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t 31 2

Claims (59)

1. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 사람의 인자 VII(hFVII)또는 사람 인자 VII(hFVIIa)에 대해 3-15개 아미노산 변형으로 구성된 아미노산 서열을 가지는 인자 VII(hFVII)또는 사람 인자 VIIa(FVIIa) 폴리펩티드 변이체에 있어서, 변이체의 아미노산 서열은 위치 10 및 32에 아미노산 치환체를 가지고, 당 부분은 Gla 도메인의 외측에in vitro글리코실화 부위에 공유적으로 부착된 것을 특징으로 하는 인자 VII(FVII)또는 사람 인자 VIIa(hFVIIa) 폴리펩티드 변이체.
2. 제 1 항에 있어서, 위치 10에 치환체는 P1OQ인 것을 특징으로 하는 변이체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서 위치 32에 치환체는 K32R인 것을 특징으로 하는 변이체.
4. 전술한 어느 한 항에 있어서, 위치 10에 치환체는 P1OQ이고, 위치 32에 치환체는 K32R인 것을 특징으로 하는 변이체.
5. 전술한 어느 한 항에 있어서, 변이체는 Gla 도메인에서 적어도 한 가지 추가 아미노산 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
6. 제 5 항에 있어서, Gla 도메인의 추가 변형은 위치 33에 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
7. 제 6 항에 있어서, 소수성 아미노산 잔기는 위치 33에 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
8. 제 7 항에 있어서, 치환은 D33F인 것을 특징으로 하는 변이체.
9. 제 8 항에 있어서, 변이체는 치환 PlOQ+K32E+D33F을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
10. 제 5 내지 제9 항중 어느 한 항에 있어서, Gla 도메인의 추가 변형은 위치 3과 4사이에 적어도 한 개 아미노산 잔기가 삽입된 것으로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
11. 제 10 항에 있어서, Gla 도메인의 추가 변형은 위치 3과 4사이에 적어도 한 개 아미노산 잔기가 삽입된 것으로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
12. 제 10항 또는 11 항중 어느 한 항에 있어서, 소수성 아미노산 잔기가 위치 3과 4사이에 삽입된 것으로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
13. 제 12 항에 있어서, 삽입은 A3AY인 것을 특징으로 하는 변이체.
14. 제 13 항에 있어서, 변이체는 A3AY+P1OQ+K32E인 것을 특징으로 하는 변이체.
15. 제 13 항에 있어서, 변이체는 A3AY+P10Q+K32E+D33F인 것을 특징으로 하는 변이체.
16. 제 5 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서, Gla 도메인의 추가 변형은 위치 34에 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
17. 제 16 항에 있어서, 음전하를 띈 아미노산 잔기는 위치 34에 치환에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
18. 제 17 항에 있어서, 치환체는 A34B인 것을 특징으로 하는 변이체.
19. 제 18 항에 있어서, 변이체는 치환 P1OQ+K32E+A34E을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
20. 제 18 항에 있어서, 변이체는 치환 P1OQ+K32E+D33F+A34E을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
21. 제 18 항에 있어서, 변이체는 치환 A3AY+PlOQ+K32E+A34E을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
22. 제 18 항에 있어서, 변이체는 치환 A3AY+P1OQ+K32E+D33F+A34E을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
23. 제 5 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, Gla 도메인의 추가 변형은 위치 8, 11, 28에서 선택된 위치에 치환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
24. 제 23 항에 있어서, 위치 28에서 치환체는 R28F 또는 R28E인 것을 특징으로 하는 변이체.
25. 전술한 어느 한 항에 있어서, 위치 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 35에는 치환체를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 변이체.
26. 전술한 어느 한 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위를 치환에 의해 도입시키는 것을 변이체.
27. 제 26 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위는 실시예 1에서 정의한 것과 같은 표면에 노출된 측쇄의 적어도 25%를 가지는 아미노산 잔기를 포함하는 위치에 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
28. 제 27 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위는 실시예 1에서 정의한 것과 같은 표면에 노출된 측쇄의 적어도 50%를 가지는 아미노산 잔기를 포함하는 위치에 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
29. 제 26 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위는 A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+Nl45T, A175T. 1205S, I205T. V253N. T267N, T267N+S269T, S314N+K316S. S314N+K316T. R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T. G318N, D334N 및 이들의 복합에서 선택된 치환체에 의해 도입될 수 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
30. 제 29 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위는 A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+Nl45T. A175T, 1205T, V253N, T267N+S269T. S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N, D334N 및 이들의 복합에서 선택된 치환체에 의해 도입될 수 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
31. 제 30 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위는 T106N, A175T, I205T,V253N, T267N+S269T 및 이들의 복합에서 선택된 치환체에 의해 도입될 수 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
32. 제 16 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서,in vitro글리코실화 부위는 치환에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
33. 제 16 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서,in vitro두 개이상의 글리코실화 부위는 치환에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
34. 제 33 항에 있어서,in vitro두 개의 글리코실화 부위는 치환에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
35. 제 33 항 또는 제 34항에 있어서,in vitro두 개의 글리코실화 부위는 다음의 치환체에서 선택된 것에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.

    A51N+G58N, A51N+TI06N, A51N+KlO9N, A51N+GI24N, A51N+Kl43N+NI45T, A51N+Al75T, A51N+I205T, A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+TI06N. G58N+KI09N, G58N+Gl24N, G58N+KI43N+Nl45T, G58N+Al75T, G58N+1205T. G58N+V253N, G58N+T267N+S269T. G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+KlO9N. T106N+GI24N, T106N+Kl43N+Nl45T,T106N+Al75T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T. T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N. K109N+Gl24N, K109N+Kl43N+NI45T, K109N+Al75T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+Nl45T, G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T. G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N. K143N+N145T+Al75T, K143N+N145T+I205T, K143N+Nl45T+V253N, K143N+Nl45T+T267N+S269T, K143N+Nl45T+S314N+K316T, K143N+Nl45T+R315N+V317T, K143N+NI45T+K316N+G318T, K143N+Nl45T+G318N, K143N+Nl45T+D334N, A175T+1205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T. A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N. I205T+T267N+S269T. I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N. I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G31ST, V253N+G318N, V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N, G318N+D334N.
36. 제 35항에 있어서,in vitro두 개의 글리코실화 부위는 다음의 치환체T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T. A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N. I205T+T267N+S269T, V253N+T267N+S269T에서 선택된 것을 특징으로 하는 변이체.
37. 제 36 항에 있어서,in vitro두 개의 글리코실화 부위는 다음의 치환체 T106N+I205T, T106N+V253N, I205T+T267N+S269T에서 선택된 것을 특징으로 하는 변이체.
38. 제 26 내지 제37항중 어느 한 항에 있어서,in vitro세 개이상의 글리코실화 부위는 치환에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
39. 제 38 항에 있어서,in vitro세 개 글리코실화 부위는 치환에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 변이체.
40. 제 38 항 또는 제 39항중 어느 한 항에 있어서,in vitro두 개의 글리코실화 부위는 다음의 치환체 I205T+V253N+T267N+S269T 및 T106N+I205T+V253N에서 선택된 것을 특징으로 하는 변이체.
41. 전술한 어느 한 항에 있어서, 변이체는 활성인 인 것을 특징으로 하는 변이체.
42. 전술한 어느 한 항에 있어서, 활성형 변이체는 여기에서 설명하는 "아미드분해성 검사"로 검사하였을 때 rhFVIIa 아미드분해 활성의 적어도 10%를 보유하는 것을 특징으로 하는 변이체.
43. 전술한 어느 한 항에 있어서, 활성형 변이체는 여기에서 설명하는 "응혈 검사"로 검사하였을 때 rhFVIIa 응혈 활성의 적어도 10%를 보유하는 것을 특징으로 하는 변이체.
44. 제1 내지 제43항에 따라 정의된 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열.
45. 제44항에 따라 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
46. 제45항에 따라 정의된 발현벡터 또는 제 44항에 정의된 뉴클레오티드을 포함하는 숙주 세포.
47. 제46항에 있어서 숙주 세포는in vitro글리코실화 반응을 할 수 있는 감마카르복실화 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
48. 제1 내지 제43항에 따라 정의된 변이체와 약학적으로 수용가능한 담체 또는부형제를 포함하는 약학 조성물.
49. 의약으로 사용하기 위한 제1 내지 제43항에 따라 정의된 변이체 또는 제48항에 정의된 약학 조성물.
50. 제1 내지 제43항에 따라 정의된 변이체는 응혈이 일어나야 할 질병 또는 질환 치료 약물 제조에 사용되는 용도.
51. 제 50항에 있어서, 질환은 뇌출혈과 같은 출혈 뿐만 아니라 외상과 같은 심각한 제어불가능한 출혈 환자, 생체 이식환자, 절제 환자, 정맥류 출혈 환자 등에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
52. 제 51항에 있어서, 질병 또는 질환은 외상인 것을 특징으로 하는 용도.
53. 제 50항에 있어서, 질병 또는 질환은 블런트(Blunt) 외상인 것을 특징으로 하는 용도.
54. 제 50항에 있어서, 질병 또는 질환은 침투성(penetrative) 외상인 것을 특징으로 하는 용도.
55. 응혈 형성이 일어나는 것이 바람직한 질환 또는 질병을 지닌 포유류를 치료하는 방법에 있어서 제48항에 정의된 약학 조성물 또는 제1 내지 제43항에 정의된 변이체 효과량을 치료를 요하는 포유류에 투여하는 것으로 포함하는 치료 방법.
56. 제 55항에 있어서, 질병 또는 질환은 뇌출혈과 같은 출혈 뿐만 아니라 외상과 같은 심각한 제어불가능한 출혈 환자, 생체 이식환자, 절제 환자, 정맥류 출혈 환자 등에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
57. 제 56항에 있어서, 질병 또는 질환은 외상인 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제 57항에 있어서, 질병 또는 질환은 블런트(Blunt) 외상인 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제 57항에 있어서, 질병 또는 질환은 침투성(penetrative) 외상인 것을 특징으로 하는 방법.