ES2355713T3 - Variantes polipeptídicas del factor vii o viia. - Google Patents

Abstract

Una variante polipeptídica del Factor VlI (FVII) o Factor Vlla (FVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3 - 15 modificaciones de aminoácidos con relación al Factor VII humano (hFVII) o Factor Vlla humano (hFVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, en la que la secuencia de aminoácidos de la variante comprende sustituciones de aminoácido en las posiciones 10 y 32 en la SEQ ID NO:2 y en la que un resto de azúcar está unido de manera covalente a al menos un sitio introducido de N-glicosilación in vivo localizado en el dominio Gla, en el que al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por a sustitución en la SEQ ID NO:2 seleccionada entre el grupo que consiste en A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315A+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N y D334N.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a variantes polipeptídicas novedosas de los polipéptidos del factor VII (FVII) o factor Vlla (FVlla) polipéptidos, donde dichas variantes comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 10 y 32 y donde dichas variantes además comprenden un resto de azúcar unido de manera covalente a un sitio introducido in 5 vivo de N-glicosilación .

La presente invención también se refiere al uso de tales variantes polipeptídicas en terapia, en particular para el tratamiento de una diversidad de trastornos relacionados con la coagulación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La coagulación de la sangre es un proceso que consiste en una interacción compleja de diversos componentes 10 (o factores) de sangre que eventualmente da como resultado un coágulo de fibrina. En general, los componentes de sangre que participan en lo que se ha mencionado como la "cascada de coagulación" son proenzimas y zimógenos, es decir proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten en una forma activa por la acción de un activador. Uno de dichos factores de coagulación es FVII.

FVII es una proteína de plasma dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre 15 como una glicoproteína de de una sola cadena con un peso molecular de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255: 1242 - 1247). El zimógeno FVII se convierte en una forma activada (FVlla) mediante escisión proteolítica en un único sitio, R152-I153, que da como resultado dos cadenas ligadas por un único puente disulfuro. FVlla en complejo con el factor tisular (complejo FVlla) es capaz de convertir tanto el factor IX como el factor X en sus formas activadas, seguido de las reacciones que conducen a una rápida producción de trombina y formación de fibrina (Østerud & 20 Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5260 - 5264).

FVII se somete a modificaciones después de la traducción, incluyendo la carboxilación dependiente de la vitamina K que da como resultado diez restos de ácido γ-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. De este modo, el número de resto 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 25 26,29 y 35 mostrado en la SEQ ID NO:2 son ácidos γ-carboxiglutámicos en el dominio Gla importante para la actividad de FVII. Otras modificaciones después de la traducción 25 incluyen unión de resto de azúcar a dos sitios de N-glicosilación de origen natural en la posición 145 y 322, respectivamente, y dos sitios de O-glicosilación de origen natural en la posición 52 y 60, respectivamente.

El gen que codifica FVII humano (hFVII) se ha mapeado para el cromosoma 13 en q34- qter 9 (de Grouchy et al., Hum Genet 1984; 66: 230 - 233). Contiene nueve exones y extensiones de 12,8 Kb (O'Hara et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 5158 - 5162). La organización génica y estructura de proteína FVII son similares a las de otras 30 proteínas procoagulantes dependientes de la vitamina K, con exones 1a y 1b que codifican la secuencia de señal; exón 2 el propéptido y dominio Gla; exón 3 una corta región hidrófoba; exones 4 y 5 los dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico; y exón 6 a 8 el dominio catalítico de la serina proteasa (Yoshitake et al., Biochemistry 1985; 24: 3736 - 3750).

Existen reseñas sobre estructuras experimentales de tres dimensiones de hFVlla (Pike et al., PNAS. Estados 35 Unidos., 1999; 96: 8925 - 30 y Kemball-Cook et al., J. Struct. Biol, 1999; 127: 213 - 223); de hFVlla en complejo con el factor de tejido soluble usando procedimientos cristalográficos de rayos X (Banner et al., Nature, 1996; 380: 41 y Zhang et al., J. MoI. Biol, 1999; 285: 2089); y de fragmentos más pequeños de hFVl1 (Muranyi et al., Biochemistry, 1998; 37: 10605 y Kao et al., Biochemistry, 1999; 38: 7097).

Se han reseñado algunas variantes modificadas por ingeniería de proteína de FVII véase, por ejemplo, 40 Dickinson & Ruf, J Bio Chem, 1997; 272: 19875 - 19879, Kemball-Cook et al., J. Biol Chem, 1998; 273: 8516 - 8521, Bharadwaj et al., J Biol Chem, 1996; 271: 30685 - 30691, Ruf et al., Biochemistry, 1999; 38: 1957 - 1966; documentos WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; US 5.580.560.

Shah et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 14 de abril de 1998; 95 (8): 4229 -34, y Nelsestuen et al., J Biol Chem. 26 de octubre de 2001; 276 (43): 39825 - 31 reseñan estudios funcionales que comparan el Factor Vlla de tipo salvaje 45 con un mutante de Factor Vlla que tiene mutaciones en las posiciones 10 y 32 (P10Q/032E).

Existen reseñan sobre la expresión de FVII en BHK u otras células de mamíferos (documentos WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y co-expresión de FVII y kex2 endoproteasa en células eucarióticas (documento WO 00/28065).

Las preparaciones comerciales de FVlla recombinante humano se venden como NovoSeven®. NovoSeven® 50 está indicada para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rhFVlla para el tratamiento eficaz y fiable de episodios de hemorragia disponibles en el mercado.

Una forma inactiva de FVII en la que arginina 152 y / o isoleucina 153 es / están modificadas se ha reseñado en el documento W091/1154. Estos aminoácidos están localizados en el sitio de activación. El documento WO 96/12800 describe inactivación de FVlla por un inhibidor de serina proteinasa; inactivación por carbamilación de FVlla en el grupo 55 α-aminoácido I153 se ha descrito por Petersen et al., Eur J Biochem, 1999; 261 :124 - 129. La forma inactivada es

capaz de competir con FVII o FVlla de tipo salvaje que se une al factor de tejido tisular e inhibir la actividad de coagulación. La forma inactivada de FVlla se sugiere que se use para el tratamiento de pacientes que están en estados hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis, en riesgo de infarto de miocardio o de apoplejía trombótica.

Una semivida de rhFVlla circulante de 2.3 horas se reseñó en "Summary Basis for Approval for NovoSeven®", número de referencia de FDA 96-0597. Relativamente altas dosis y la administración frecuente son necesarios para 5 alcanzar y mantener el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Como una consecuencia de regulación de dosis adecuada es difícil obtener y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones de en la forma de vida del paciente.

En relación con el tratamiento de hemorragia sin controlar, tal como trauma, se cree que el factor Vlla es capaz de activar el factor X al factor Xa sin unirse al factor tisular, y esta reacción de activación se cree que se produce 10 principalmente en las plaquetas de sangre activadas (Hedner et al. Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2000; 11; 107 - 111). Sin embargo, hFVlla o rhFVlla tiene una baja actividad hacia el factor X en la ausencia del factor tisular y, por consiguiente, tratamiento de hemorragia sin controlar, por ejemplo en pacientes con trauma, requiere dosis relativamente altas y múltiples de hFVlla o rhFVlla. Por lo tanto, con el fin de tratar las hemorragias no controladas más eficazmente (para minimizar la pérdida de sangre) existe necesidad de moléculas de FVlla mejoradas, que posean una 15 alta actividad hacia el factor X en la ausencia del factor tisular. Tales moléculas de FVlla mejoradas mostrarán un tiempo de coagulación reducido (o acción más rápida) cuando se compara con rhFVlla cuando se administra asociado a hemorragias sin controlar.

Una molécula con una semivida de circulación más larga disminuiría el número de administraciones necesarias. Dada la asociación del producto de rhFVlla actual con inyecciones frecuentes, y el potencial para obtener 20 niveles de FVlla terapéuticos más óptimos con efecto terapéutico potenciado simultáneo, existe una clara necesidad de moléculas de tipo FVII- o FVlla mejoradas.

Una forma de incrementar la semivida en circulación de una proteína es asegurar que la eliminación renal de la proteína se reduce. Esto se puede lograr mediante conjugación de la proteína a un resto químico, que es capaz de conferir eliminación renal reducida para la proteína. 25

Además, la unión de un resto químico a la proteína o sustitución de aminoácidos expuestos a proteolisis puede bloquear de manera eficaz una enzima proteolítica del contacto que conduce a la degradación proteolítica de la proteína. Polietilen glicol (PEG) es uno de tales restos químicos que se han usado en la preparación de productos proteína terapéuticos. El documento WO 98/32466 sugiere que FVII, entre muchas otras proteínas, pueden estar PEGiladas pero no contienen ninguna información adicional al respecto. El documento. WO 01/58935 describe una nueva 30 estrategia que desarrolla moléculas de FVII o FVlla que tienen inter alia una semivida aumentada.

Como se ha indicado anteriormente, otro problema en el tratamiento actual de rhFVlla es la inestabilidad relativa de la molécula con relación a la degradación proteolítica. La degradación proteolítica es un obstáculo principal para obtener una preparación en solución en oposición al producto liofilizado. La ventaja de obtener una preparación soluble estable es más fácil de manejar por el paciente, y en el caso de emergencias, acción más rápida, que 35 potencialmente puede llevar a salvar vidas. Los intentos para prevenir degradación proteolítica por la mutagénesis dirigida al sitio en los sitios proteolíticos principales se han descrito en el documento WO 88/10295 .

Un objeto de la presente invención es proporcionar moléculas de FVII o FVlla mejoradas (variantes de FVII o FVlla) con una semivida en circulación más alarga (disminuyendo por lo tanto el número de administraciones necesarias) y que son capaces de activar el factor X a factor Xa (sin unirse al factor tisular) de manera más eficaz que hFVlla o 40 rhFVlla (siendo capaz por lo tanto de tratar hemorragias no controladas, tal como un trauma, de manera más eficaz).

Otro objeto de la presente invención es proporcionar moléculas de FVII o FVlla mejoradas (variantes de FVII o FVlla) con una biodisponibilidad aumentada (tal como un aumento de Área bajo la Curva cuando se compara con rhFVlla cuando se administra por vía intravenosa) y que son capaces de activar el factor X a factor Xa (sin unirse al factor tisular) de manera más eficaz que hFVlla o rhFVlla (siendo por lo tanto capaces de tratar hemorragias no 45 controladas, tal como un trauma, de manera más eficaz).

Estos objetos se reúnen en las variantes de FVII o FVlla proporcionadas en el presente documento.

BREVE DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

En su aspecto más amplio la presente invención se refiere a una variante polipeptídica de FVII o FVlla que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3 - 15 modificaciones de aminoácido con relación a hFVl1 o hFVlla 50 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, en la que dicha secuencia de aminoácidos de la variante comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 10 y 32 y en la que un resto de azúcar está unido de manera covalente a un sitio de N-glicosilación introducido in vivo localizado fuera del dominio Gla, como se especifica en la reivindicación 1.

Otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la variante polipeptídica de 55 la invención.

En un aspecto adicional más la invención se refiere a un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención o el vector de expresión de la invención.

En incluso un aspecto adicional la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la 5 variante polipeptídica de la invención, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto más de la invención se refiere a la variante polipeptídica de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para uso como un medicamento.

Aspectos adicionales de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción más adelante así como de las reivindicaciones anexas. 10

DIVULGACIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

En el contexto de la presente solicitud e invención se aplican las siguientes definiciones:

La expresión "conjugado" (o de manera indistinta "polipéptido conjugado") pretende indicar una molécula heterogénea (en el sentido de compuesto o quimérico) formada por la unión covalente de de uno o más polipéptido (s) a uno o más 15 restos no polipeptídicos tal como moléculas de polímero, compuestos lipófilos, restos de azúcar o agentes de derivación orgánicos. Preferiblemente, el conjugado es soluble a concentraciones y condiciones relevantes, es decir, soluble en fluidos biológicos tal como sangre. Ejemplos de polipéptidos conjugados incluyen polipéptidos glicosilados y / o PEGilados.

La expresión "unión covalente" o "unido de manera covalente " significa que la variante polipeptídica y el resto 20 no polipeptídico están unidos o bien directamente de manera covalente entre si, o están unidos de manera covalente indirectamente a través de de un resto o restos de intervención, tales como un puente, espaciador, o resto o restos de unión.

La expresión "resto no polipeptídico" pretende significar una molécula, diferente de un polímero peptídico compuesta de monómeros de aminoácido y unidos conjuntamente mediante enlaces peptídicos, dicha molécula es 25 capaz de conjugarse a un grupo de unión de la variante polipeptídica de la invención. Los ejemplos preferidos de tales moléculas incluyen moléculas de polímero, restos de azúcar, compuestos lipófilos o agentes de derivación orgánicos. Cuando se usa en el contexto de una variante conjugada se entenderá que el resto no polipeptídico está unido a la parte polipeptídica de la variante conjugada mediante un grupo de unión del polipéptido. Como se ha explicado anteriormente, el resto no polipeptídico puede estar unido directamente de manera covalente al grupo de unión o puede estar unido 30 indirectamente de manera covalente al grupo de unión mediante un resto o restos de intervención, tales como un espaciador de puente o resto o restos de engarce.

Una "molécula de polímero" es una molécula formada por enlace covalente de dos o más monómeros, en la que ninguno de los monómeros es un resto de aminoácido, excepto cuando el polímero es albúmina humana u otra proteína abundante en plasma. La expresión "polímero" se puede usar indistintamente con la expresión "molécula de 35 polímero". La expresión también pretende cubrir moléculas de carbohidrátos unidas por glicosilación in vitro, es decir, una glicosilación sintética realizada in vitro implicando normalmente unión covalente de una molécula de carbohidrato a un grupo de unión de la variante polipeptídica, usando opcionalmente un agente de reticulación. La glicosilación in vitro se describe en detalle además más adelante.

La expresión "resto de azúcar" pretende indicar una molécula que contiene carbohidrato que comprende uno o 40 más restos de monosacárido, capaces de unirse a la variante polipeptídica (para producir un conjugado de variante polipeptídica en la forma de una variante polipeptídica glicosilada) mediante glicosilación in vivo. La expresión "glicosilación in vivo" pretende significar cualquier unión de un resto de azúcar que se produce in vivo, es decir, durante el proceso después de la traducción en una célula de glicosilación usada para la expresión de la variante polipeptídica, por ejemplo, mediante glicosilación ligada a N y ligada a O. La estructura de oligosacárido exacta depende, hasta un 45 grado grande, de organismo de glicosilación en cuestión. Un "sitio de N-glicosilación " tiene la secuencia N-X-S/T/C, en la que X es cualquier resto de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es o bien serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y más preferiblemente treonina. Preferiblemente, el resto de aminoácido en la posición +3 con relación al resto de asparagina no sea un resto de prolina.

Un "sitio de O-glicosilación" es el grupo OH de un resto serina o treonina. La expresión "grupo de unión" 50 pretende indicar un grupo funcional de la variante polipeptídica, en particular de su resto de aminoácido o un resto carbohidrato, capaz de unirse a un resto no polipeptídico tal como una molécula de polímero, una molécula lipófila, un resto de azúcar o un agente de derivación orgánico. Los grupos de unión útiles y sus restos no polipeptídicos correspondientes son evidentes a partir de la tabla más adelante.

Grupo de unión

Aminoácido Ejemplos de resto no polipeptídico Procedimiento de conjugación / -PEG activado Referencia

-NH2

N-terminal, Lys Polímero, por ejemplo, PEG, con grupo amida o imina mPEG - SPA mPEG tresilado Shearwater Inc. Delgado et al, critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9 (3,4): 249 - 304 (1992)

-COOH

C-terminal, Asp, Glu Polímero, por ejemplo, PEG, con grupo éster o amida Resto de carbohidrato Acoplamiento In vitro mPEG-Hz Shearwater Inc.

-SH

Cys Polímero, por ejemplo, PEG, con grupo disulfuro, maleimida o vinilsulfona Resto de carbohidrato Acoplamiento In vitro PEG-vinilsulfona PEG-maleimida Shearwater Inc. Delgado et al, critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9 (3,4): 249 - 304 (1992)

-OH

Ser, Thr, Lys, OH- Resto de azúcar PEG con éster, éter, carbamato, carbonato Glicosilación ligada a O In vivo

-CONH2

Asn como parte de un sitio de N-glicosilación Polímero de Resto de azúcar, por ejemplo PEG N-Glicosilación In vivo

Resto aromático

Phe, Tyr, Trp Resto de carbohidrato Acoplamiento In vitro

-CONH2

Gln Resto de carbohidrato Acoplamiento In vitro Yan and Wold, Biochemistry, 1984, 31 de julio; 23 (16): 3759 - 65

Cetona aldehído

Oligosacárido oxidado Polímero, por ejemplo, PEG, PEG-hidrazida PEGilación Andresz et al., 1978, Makromol. Chem. 179:301, documento WO 92/16555, documento WO 00/23114

Guanidino

Arg Resto de carbohidrato Acoplamiento In vitro Lundblad and Noyes, Chimical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc., Florida, Estados Unidos

Anillo imidazol

His Resto de carbohidrato Acoplamiento In vitro Como para guanidina

Para la N-glicosilación in vivo, la expresión "grupo de unión" se usa en forma no convencional para indicar los restos de aminoácido que constituyen un sitio de N-glicosilación (con la secuencia N-X-S/T/C, en la que X es cualquier resto de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es o bien serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y lo más preferiblemente treonina). Aunque el resto de asparagina del sitio de N-glicosilación es uno 5 al que se une el resto de azúcar durante la glicosilación, tal unión no se puede lograr salvo que otros restos de aminoácido del sitio de N-glicosilación estén presentes.

De acuerdo con lo anterior, cuando el resto no polipeptídico es un resto de azúcar y la conjugación se va a lograr mediante N-glicosilación in vivo, la expresión "resto de aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico" como se usa en conexión con alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido se ha de entender como que significa uno o más restos de aminoácido que constituyen un sitio de N-glicosilación in vivo se van a alterar de tal manera que un sitio funcional de N-glicosilación in vivo se introduce en la secuencia de aminoácidos. 5

En la presente solicitud, los nombres de aminoácido y nombres de átomos (por ejemplo, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, etc.) se usan como se define por el Banco de Datos de Proteínas (PDB) (www.pdb.org) basada en la nomenclatura de IUPAC (Nomenclatura y Simbolismo de IUPAC para Aminoácidos y Péptidos (nombres de restos, nombres de átomos, etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9 - 37 (1984) asociado a sus correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)). 10

La expresión "resto de aminoácido" pretende indicar un resto de aminoácido contenido en el grupo que consiste en restos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o O), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), Lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W), y tirosina (Tyr o Y). 15

La terminología usada para identificar posiciones de aminoácidos se ilustra como sigue: I205 indica que la posición 205 está ocupada por un resto de isoleucina en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. I205T indica que el resto de isoleucina de la posición 205 se ha sustituido con un resto de treonina. Las sustituciones alternativas se indican con un "/", por ejemplo, I205S/T significa una secuencia de aminoácidos en la que isoleucina en la posición 205 está sustituida o bien con serina o treonina. Las sustituciones múltiples se indican con un "+", por 20 ejemplo, K143N+N145T significa una sustitución del resto de Lisina en la posición 143 con un resto de asparagina y una sustitución del resto de asparagina en la posición 145 con un restos de treonina. La inserción de un resto de aminoácido adicional se indica de la siguiente forma: Inserción de un resto de tirosina después de A3 (es decir en la posición 4) se indica por A3AY (que conduce a la inserción de un resto de tirosina en la posición 4). Una supresión de un resto de aminoácidos se indica por un asterisco. Por ejemplo, supresión de un resto de valina en la posición 172 se indica por 25 V172*. La inserción y sustitución simultánea se indica de la siguiente forma: Sustitución de un resto de alanina en la posición 175 con un resto de treonina seguido de la inserción de un resto de leucina después de la posición 175 se indica A175TL.

Salvo que se indique de otra manera, la numeración de restos de aminoácido realizada en el presente documento se realiza con relación a la secuencia de aminoácidos del polipéptido hFVII/hFVlla (SEQ ID NO:2). 30

La expresión "difiere de" como se usa en relación con mutaciones específicas se pretende para permitir diferencias adicionales que están presentes aparte de la diferencia de aminoácido especificada. Por ejemplo, además de la introducción de los sitios de N-glicosilación in vivo (localizados fuera del dominio Gla), el polipéptido puede comprender otras modificaciones que no se relacionan con la introducción de tales restos de aminoácido. De una forma similar, además de las modificaciones realizadas en el dominio Gla que pretende el incremento de la afinidad de unión a 35 membrana de fosfolípido, el polipéptido puede contener otras modificaciones que no están necesariamente relacionadas con este efecto.

De este modo, además de las modificaciones de aminoácido descritas en el presente documento, se entenderá que la secuencia de aminoácidos de la variante polipeptídica de la invención puede, si se desea, contener otras alteraciones, es decir, otras sustituciones, inserciones o supresiones. Éstas pueden, por ejemplo, incluir rotura del 40 extremo N- y / o C- por uno o más restos de aminoácido (por ejemplo, por 1-10 restos de aminoácido), o adición de uno o más restos extra en el extremo N- y / o C-, por ejemplo, adición de un resto de metionina en el extremo N- o introducción de un resto de cisteína casi o en el extremo C-, así como "sustituciones de aminoácidos conservadoras", es decir, sustituciones realizadas dentro de los grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y 45 aminoácidos aromáticos.

Ejemplos de tales sustituciones conservadoras se muestran en la tabla más adelante.

1

Alanina (A) Glicina (G) Serina (S) Treonina (T)

2

Ácido aspártico (D) Ácido glutámico (E)

3

Asparagina (N) Glutamina (Q)

4

Arginina (R) Histidina (H) Lisina (K)

5

Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V)

6

Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W)

Todavía otros ejemplos de modificaciones adicionales se describen en la sección titulada "Otras modificaciones fuera del dominio G/a" más adelante.

La expresión "secuencia de nucleótidos" pretende indicar un tramo consecutivo de dos o más moléculas de 50 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser de ADNc, ARN, genómico, de origen semisintético o sintético, o cualquiera de sus combinaciones.

La expresión "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" en general se refiere a un procedimiento para la amplificación de una secuencia de nucleótidos deseada in vitro, como se describe, por ejemplo, en el documento US 4.683.195. En general, el procedimiento de PCR implica ciclos repetidos de síntesis de extensión de cebador, usando cebadores de oligonucleótidos capaces de hibridarse preferentemente a un ácido nucleico de molde.

La expresión "vector" se refiere a un plásmido u otras secuencias de nucleótidos que son capaces de 5 replicarse dentro de una célula huésped o que se integra en el genoma de la célula huésped, y como tal, are son útiles para realizar diferentes funciones junto con células huésped compatibles (un sistema vector-huésped): para facilitar la clonación de la secuencia de nucleótidos, es decir, para producir cantidades utilizables de la secuencia, para dirigir la expresión del producto génico codificado por la secuencia y para integrar la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula huésped. El vector contendrá diferentes componentes dependiendo de la función que vaya a realizar. 10

"Célula", "Célula huésped", "línea celular" y "cultivo de células" se usan indistintamente en el presente documento y tales términos se deben entender que incluyen la progenie que se produce a partir del crecimiento o cultivo de una célula.

"Transformación" y "transfección" se usan indistintamente para referirse al procedimiento de introducción de ADN en una célula. 15

"Unido de manera operativa" se refiere a la unión covalente de dos o más secuencias de nucleótidos, por medio de unión enzimática o de otra manera, en una configuración con relación a otra de manera que se puede realizar la función normal de las secuencias. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una presecuencia o guía secretora está unido de manera operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido: un promotor o potenciador está unido de manera 20 operativa a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; un sitio de unión a ribosoma está unido de manera operativa a una secuencia de codificación si está posicionado de manera que facilite la traducción. En general, "unido de manera operativa" significa que las secuencias de nucleótidos que están unidas son contiguas y, en el caso de una guía secretora, contigua y en fase de lectura. La unión se lleva a cabo mediante ligación a sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos 25 sintéticos, junto con procedimientos de ADN recombinante.

En el contexto de la presente invención las expresiones "modificación" o "modificación de aminoácido" pretende cubrir el reemplazo de una cadena lateral de aminoácido, substitución de un resto de aminoácido, supresión de un resto de aminoácido y / o inserción de un resto de aminoácido.

Las expresiones "mutación" y "sustitución" se usan indistintamente en el presente documento. 30

La expresión "introducir" se refiera a la introducción de un resto de aminoácido por sustitución de un resto de aminoácido existente o, de manera alternativa, por inserción de un resto de aminoácido adicional.

La expresión "eliminar" se refiere a la eliminación de un resto de aminoácido por sustitución del resto de aminoácido a eliminar por otro resto de aminoácido o, de manera alternativa, por supresión (sin sustitución) del resto de aminoácido a eliminar 35

La expresión "FVII" o " polipéptido de FVII" se refiere a una molécula de FVII proporcionada en forma de una única cadena. Un ejemplo de un polipéptido de FVII es FVII humano de tipo salvaje (hFVII) mostrado en la SEQ ID NO:2. Sin embargo, se debe entender, que la expresión "polipéptido de FVII" también cubre las moléculas de tipo hFVII, tales como fragmentos o variantes de la SEQ ID NO:2, en particular variantes en las que la secuencia comprende al menos una, tal como 1 - 15, por ejemplo, 1 - 10, modificaciones de aminoácido cuando se compara con la SEQ ID 40 NO:2.

La expresión "FVlla" o "Polipéptido de FVlla" se refiere a una molécula de FVlla proporcionada en su forma de dos cadenas activada. Cuando la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 se usa para describir la secuencia de aminoácidos de FVlla se entenderá que el péptido unido entre R152 y 1153 de la forma de única cadena se ha escindido, y que una de las cadenas comprende restos de aminoácido 1 - 152, la otra cadena restos de aminoácido 153 45 - 406.

Las expresiones "rFVII" y "rFVlla" se refieren a FVII y Polipéptidos de FVlla producidos por técnicas recombinantes.

Las expresiones "hFVII" y "hFVlla" se refieren a FVII y FVlla de tipo salvaje humanos, respectivamente, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 50

Las expresiones "rhFVII" y "rhFVlla" se refieren a FVII y FVlla de tipo salvaje humanos, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, producida por medios recombinantes. Un ejemplo de rhFVlla es NovoSeven®.

Cuando se usa en el presente documento, la expresión "dominio de Gla " pretende cubrir restos de aminoácido no. 1 a 45 de la SEQ ID NO:2. 55

De acuerdo con lo anterior, la expresión "localizado fuera del dominio de Gla" cubre restos de aminoácidos no. 46 - 406 de la SEQ ID NO:2.

La abreviaturas "TF" y "TFPI" significa Factor tisular e inhibidor de la ruta del Factor tisular, respectivamente.

La expresión "dominio de proteasa" se usa respecto a los restos 153 - 406 contados a partir del extremo N.

La expresión "sitio catalítico" se usa para significar la triada catalítica que consiste en S344, D242 y H193 de la 5 variante polipeptídica.

La expresión "precursor" pretende indicar la molécula a modificar/mejorar de acuerdo con la presente invención. Aunque el polipéptido precursor a modificar por la presente invención puede se cualquier FVII o Polipéptido de FVlla, y de esta manera se deriva de cualquier origen, por ejemplo, un origen mamífero no humano, se prefiere que el polipéptido precursor sea hFVl1 o hFVlla 10

Una "variante" es un polipéptido, que difiere en uno o más restos de aminoácido de su polipéptido precursor, normalmente en 3 - 15 restos de aminoácido (por ejemplo, en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 restos de aminoácido), tal como en 3 - 10 restos de aminoácido, por ejemplo, en 3 - 8 ó 3-5 restos de aminoácido. En otras palabras, una "variante" típicamente contiene 3 - 15 modificaciones de aminoácido (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 modificaciones de aminoácido), tal como 3-10 modificaciones de aminoácido, por ejemplo, 3 - 8 ó 3 - 15 5 modificaciones de aminoácido con relación al polipéptido precursor. En el presente contexto, la expresión "modificación" abarca inserciones, supresiones, sustituciones y sus combinaciones. Se entenderá que una variante polipeptídica de acuerdo con la presente invención se modificará en al menos tres posiciones, a saber en al menos la 10 y 32 (localizada en el dominio Gla) y en al menos una posición localizada fuera del dominio de Gla, donde dicha al menos una modificación crea un sitio de N-glicosilación in vivo, como se especifica en la reivindicación 1. 20

La expresión "actividad de coagulación" se usa para significar la actividad medida en el “ensayo de coagulación" descrito en el presente documento. Con el fin de mostrar "actividad de coagulación" una variante de la invención, en su forma activada, debe tener al menos 10% de la actividad de coagulación de rhFVlla cuando se ensaya en el “ensayo de coagulación" descrito en el presente documento. En una realización preferida de la invención la variante, en su forma activada, tiene al menos 20% de la actividad de coagulación of rhFVlla, tal como al menos 30%, 25 por ejemplo, al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, tal como al menos 60%, por ejemplo, al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%, tal como al menos 90% de la actividad de coagulación de rhFVlla cuando se ensaya en el "Ensayo de coagulación" descrito en el presente documento. En una realización interesante la variante, en su forma activada, tiene sustancialmente la misma actividad de coagulación que rhFVlls, tal como una actividad de coagulación de 75 - 125% de la actividad de coagulación de rhFVlla. 30

La expresión "actividad amidolítica" se usa para significar la actividad medida en el "Ensayo amidolítico" descrito en el presente documento. Con el fin de mostrar la "actividad amidolítica" una variante de la invención, en su forma activada, debe tener al menos 10% de la actividad amidolítica de rhFVlla cuando se ensaya en el "Ensayo amidolítico" descrito en el presente documento. En una realización preferida de la invención la variante, en su forma activada, tiene al menos 20% de la actividad amidolítica de rhFVlla, tal como al menos 30%, por ejemplo, al menos 35 40%, más preferiblemente al menos 50%, tal como al menos 60%, por ejemplo, al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%, tal como al menos 90% de la actividad amidolítica de rhFVlla cuando se ensaya en el "Ensayo amidolítico" descrito en el presente documento. En una realización interesante la variante, en su forma activada, tiene sustancialmente la misma actividad amidolítica que rhFVlls, tal como una actividad amidolítica de 75-125% de la actividad amidolítica de rhFVlla. 40

En el presente contexto, la expresión "actividad" también se usa variantes con la capacidad de activar FX a FXa. Esta actividad también denota "actividad de actividad de FX " o "actividad de generación de FXa".

La expresión "actividad de activación FX incrementada" o "actividad de generación de FXa incrementada" se usa para indicar que una variante de la invención, en su forma activada, tiene una capacidad aumentada significativamente de activar FX a FXa cuando se compara con rhFVlla o. Hasta qué grado de una variante de la 45 invención (en su forma activada) tiene una actividad de activación por FX se puede determinar de manera conveniente en el "ensayo de activación de Factor X independiente de TF" descrito en el presente documento.

La expresión "coagulación más fuerte" o "resistencia a coagulación aumentada" se usa para indicar que la resistencia del coágulo generado por la variante polipeptídica está significativamente aumentada con relación al generado por rhFVlla como se determina en condiciones comparables. Este efecto se puede determinar como el Área 50 Bajo la Curva (AUCtrom) generada por la variante de la invención, en su forma activada, cuando se ensaya en el "Ensayo de trombograma" descrito en el presente documento. De una forma similar, la expresión " AUCtrom aumentada" se usa para indicar que el Área Bajo la Curva generada por la variante (en su forma activada) aumenta de manera estadísticamente con relación a la generada por rhFVlla como se determina en condiciones comparables y cuando se mide en el "Ensayo de Trombograma" descrito en el presente documento 55

La expresión "Tmax" se usa acerca del tiempo para obtener el nivel de actividad de trombina máxima en el "Ensayo de Trombograma" .

La expresión "inmunogenicidad" como se usa junto con una sustancia dada pretende indicar la capacidad de la sustancia de inducir una respuesta del sistema inmune. La respuesta inmune puede ser una respuesta mediada por célula o anticuerpo (véase, por ejemplo, Roitt: Essential Immunology (8ª Edición, Black-well) para definición adicional de inmunogenicidad). Normalmente, reactividad de anticuerpo reducida será una indicación de inmunogenicidad reducida. La inmunogenicidad reducida se puede determinar mediante el uso de cualquier procedimiento adecuado conocido en 5 la técnica, por ejemplo, in vivo o in vitro.

La expresión "semivida funcional in vivo" se usa en su significado normal, es decir, el tiempo al que el 50% de la actividad biológica del polipéptido está todavía presente en el cuerpo/órgano diana, o el tiempo al que la actividad del polipéptido es 50% del valor inicial.

Como una alternativa para determinar la semivida funcional in vivo, "semivida en suero" se puede determinar, 10 es decir, el tiempo al que el 50% del polipéptido circula en el plasma o torrente sanguíneo antes de eliminarse. La determinación de la semivida en suero es a menudo más simple que la determinación de la semivida funcional in vivo y la magnitud de semivida en suero es usualmente una buena indicación de la magnitud de semivida funcional in vivo. De manera alternativa las expresiones para semivida en suero incluyen "semivida en plasma", "semivida circulante", "eliminación en suero", "eliminación en plasma " y "semivida de eliminación". El polipéptido se elimina por la acción de 15 uno o más de los sistemas reticuloendoteliales (RES), riñón, bazo o hígado, por factor tisular, receptor SEC u otra eliminación mediada por receptor, o mediante proteolisis específica o no específica. Normalmente, la eliminación depende del tamaño (relativa al corte de filtración glomerular), carga, cadenas de carbohidrato unidas, y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad a retenerse se selecciona normalmente entre actividad de unión procoagulante, proteolítica o al receptor. La semivida funcional in vivo y la semivida en suero se pueden determinar 20 mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica

La expresión "aumentado" como se usa en la semivida funcional in vivo o semivida en suero se usa para indicar que la semivida relevante de la variante polipeptídica está aumentada estadísticamente de manera significativa con relación a la de rhFVlla como se determina en condiciones comparables (determinada típicamente en un animal experimental, tales como ratas, conejos, cerdos o monos). 25

La expresión "AUCiv" o "Área Bajo la Curva cuando se administra por vía intravenosa" se usa en su significado normal, es decir, como el área bajo la curva de la actividad en suero, donde la variante polipeptídica se ha administrado por vía intravenosa, en particular cuando se administra por vía intravenosa en ratas. Típicamente, la actividad medida es la "actividad de coagulación" como se define en el presente documento antes. Una vez que los momentos de actividad experimental se han determinado, la AUCiv se puede calcular de manera conveniente mediante un programa de 30 ordenador, tal como GraphPad Prism 3.01.

Se entenderá que con el fin de preparar una comparación directa entre los valores de AUCiv de moléculas diferentes (por ejemplo, entre las variantes de la invención y una molécula de referencia tal como rhFVlla) se debe administrar la misma cantidad de actividad. Por consiguiente, los valores de AUCiv están típicamente normalizados (es decir corregidos para diferencias en la dosis inyectada) y expresados como AUCiv/dosis administrada. 35

La expresión "sensibilidad reducida a degradación proteolítica" principalmente pretende significar que la variante polipeptídica tiene sensibilidad reducida a la degradación proteolítica en comparación con hFVlla o rhFVlla como se determina en condiciones comparables. Preferiblemente, la degradación proteolítica se reduce en al menos 10% (por ejemplo, en 10 - 25% o en 10-50%), tal como al menos 25% (por ejemplo, en 25 - 50%, en 25 - 75% o en 25 - 100%), más preferiblemente en al menos 35%, tal como al menos 50%, (por ejemplo, en 50 - 75% o en 50 - 100%) 40 incluso más preferiblemente en al menos 60%, tal como en al menos 75% (por ejemplo, en 75 - 100%) o incluso al menos 90%. Lo más preferiblemente, la degradación proteolítica se reduce en al menos 100%.

La expresión "eliminación renal " se usa en su significado normal para indicar cualquier eliminación que tiene lugar por los riñones, por ejemplo, mediante filtración glomerular, excreción tubular o degradación en las células tubulares. La eliminación renal depende de las características físicas del polipéptido, incluyendo tamaño (diámetro), 45 volumen hidrodinámico simetría, forma/rigidez, y carga. Normalmente, un peso molecular de aproximadamente 67 kDa se considera que es un valor de corte para la eliminación renal. La eliminación renal se puede establecer mediante cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo in vivo establecido. Típicamente, la eliminación renal se determina mediante al administración de un polipéptido marcado (por ejemplo, radiomarcado o marcado por fluorescencia) a un paciente y midiendo la actividad de la marca en orina recogida del paciente. La eliminación renal reducida se determina 50 con relación a un polipéptido de referencia correspondiente, por ejemplo, rhFVlla, en condiciones comparables. Preferiblemente, la velocidad de eliminación renal de la variante polipeptídica se reduce en al menos 50%, preferiblemente en al menos 75%, y los más preferiblemente en al menos 90% comparado con rhFVlla.

Las expresiones "al menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" y "al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" se definen con referencia al Ejemplo 1, donde los 55 cálculos, etc. se describen en detalle.

Se debe indicar que cuando las expresiones "al menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" y "al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie de la molécula" se usan junto con la

introducción de un sitio de N-glicosilación in vivo estos términos se refieren a la accesibilidad a la superficie de la cadena lateral de aminoácido en la posición donde el resto de azúcar está realmente unido. En muchos casos será necesario introducir un resto de serina o de treonina en la posición +2 con relación al resto de asparagina al que el resto de azúcar está realmente unido (a excepción, de hecho, que esta posición ya esté ocupada por un resto de serina o de treonina) y estas posiciones, donde los restos de serina o treonina se introducen, se permite que estén enterrados, 5 es decir, que tenga menos de 25% o 50% de sus cadenas laterales expuestos a la superficie de la molécula.

Las expresiones "sitio de unión del factor tisular", "región de sitio activo" y "cresta de la grieta de unión al sitio activo" se definen con relación al Ejemplo 1 en el presente documento, en el que los sitios/regiones anteriormente mencionados se determinan.

La expresión "resto de aminoácido hidrófobo" incluye los siguientes restos de aminoácido: isoleucina (1), 10 leucina (L), metionina (M), valina (V), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

La expresión "resto de aminoácido cargado negativamente" incluye los siguientes restos de aminoácido: Ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E).

La expresión "resto de aminoácido cargado positivamente" incluye los siguientes restos de aminoácido: Lisina (K), arginina (R) e histidina (H). 15

Variantes de la invención

En su aspecto más amplio la presente invención se refiere a una variante polipeptídica de FVII o FVllA que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3 - 15 modificaciones de aminoácido con relación a hFVl1 o hFVlla que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, en la que dicha secuencia de aminoácidos de la variante comprende una sustitución de aminoácido en la posición 10 y 32 y en el que un resto de azúcar está unido de 20 manera covalente a un sitio de N-glicosilación introducido in vivo localizado fuera del dominio Gla, como se especifica en la reivindicación 1.

Las modificaciones realizadas en las dos regiones indicadas anteriormente del polipéptido de FVII precursor sirven para los siguientes propósitos:

las modificaciones realizadas en las posiciones localizadas fuera del dominio de Gla (introducción de sitio (s) de N-25 glicosilación in vivo) son preferiblemente de tal naturaleza como AUCiv, la semivida funcional in vivo y / o la semivida en suero de la variante resultante se incrementa comparada con rhFVlla.

Las modificaciones realizadas en el dominio de Gla del polipéptido precursor son preferiblemente de tal naturaleza que se logra una afinidad de unión a membrana de fosfolípido incrementada de la molécula resultante y / o de tal naturaleza que la molécula resultante tiene una capacidad mejorada para activar FX a FXa y / o de tal naturaleza 30 que se forma un coágulo más fuerte.

Sin estar limitado por ninguna teoría particular, actualmente se cree que la afinidad de membrana da como resultado una concentración local mayor de las variantes polipeptídicas activadas en proximidad estrecha con los otros factores de coagulación, particularmente FX. De este modo, la velocidad de activación de FX a FXa será mayor, simplemente debido a una mayor relación molar de la variante de FVII activada a FX. La velocidad de activación 35 activada de FX entonces da como resultado una mayor cantidad de trombina activa, y de este modo una mayor velocidad de reticulación de fibrina.

De este modo, en relaciones preferidas de la invención el FVII precursor o el Polipéptido de FVlla se ha modificado de manera que la variante polipeptídica activada resultante tiene (comparada con rhFVlla):

i) una biodisponibilidad aumentada (AUCiv) y una afinidad de unión a membrana fosfolipídica aumentada; 40

ii) una biodisponibilidad aumentada (AUCiv) y una capacidad aumentada de activar FX a FXa;

iii) una biodisponibilidad aumentada (AUCiv) y es capaz de generar un coágulo más fuerte (AUCtrom aumentada);

iv) una biodisponibilidad aumentada (AUCiv) y una Tmax reducida;

v) una semivida funcional in vivo aumentada y una afinidad de unión a membrana fosfolipídica aumentada;

vi) una semivida funcional in vivo aumentada y una capacidad de aumentar de activar FX a FXa; 45

vii) una semivida funcional in vivo aumentada y es capaz de generar un coágulo más fuerte (AUCtrom aumentada);

viii) una semivida funcional in vivo aumentada y una Tmax reducida;

ix) una semivida funcional in vivo aumentada y una afinidad de unión a membrana fosfolipídica aumentada;

x) una semivida funcional in vivo aumentada y una capacidad aumentada de activar FX a FXa;

xi) semivida funcional in vivo aumentada y es capaz de generar un coágulo más fuerte (AUCtrom aumentada); y / o 50

xii) una semivida en suero aumentada y una Trnax reducida;

Por consiguiente, el tratamiento medico con una variante polipeptídica de acuerdo con la invención ofrece un número de ventajas sobre el compuesto rhFVlla actualmente disponible (NovoSeven®), tal como administración de dosificación inferior, duración más larga entre inyecciones, resistencia del coágulo aumentada y / o acción más rápida.

De este modo, las variantes de la invención preferidas son variantes tales que, en sus formas activadas y cuando se compara con rhFVlla, genera un Área Bajo la Curva aumentada cuando se administra por vía intravenosa 5 (AUC¡v), en particular cuando se administra por vía intravenosa en ratas. Más particularmente, variantes de la presente invención, que se prefieren son tales variantes donde la relación entre AUCiv de dicha variante, en su forma activada y el AUCiv de rhFVlla es al menos 1,25, tal como al menos 1,.5, por ejemplo, al menos 1,75, más preferiblemente al menos 2, tal como al menos 3, incluso más preferiblemente al menos 4, tal como al menos 5, en particular cuando se administra (por vía intravenosa) en ratas. 10

Este efecto puede a su vez (pero no necesariamente así) corresponder a una semivida funcional in vivo aumentada y / o una semivida en suero aumentada comparada con rhFVlla. De acuerdo con lo anterior, en otra realización preferida de la invención, la relación entre la semivida funcional in vivo o la semivida en suero para la variante, en su forma activada, y la semivida funcional in vivo o la semivida en suero para rhFVlla es al menos 1,25. Más preferiblemente, la relación entre la semivida relevante para la variante, en su forma activada, y la semivida 15 relevante para hFVlla o rhFVlla es al menos 1,5, tal como al menos 1,75, por ejemplo, al menos 2, incluso más preferiblemente al menos 3, tal como al menos 4, por ejemplo, al menos 5.

Como se entenderá, las variantes de la invención también poseen, además de la funcionalidad anteriormente mencionada (es decir, AUCiv aumentado, semivida funcional in vivo aumentada y / o semivida en suero aumentada), una afinidad de unión a membrana fosfolipídica aumentada comparada con rhFVII, una capacidad aumentada de activar 20 FX a Fxa, una capacidad de generar un coágulo más fuerte (AUCtrom aumentada) y / o una Tmax reducida

De este modo, en una realización preferida de la invención, la variante polipeptídica tiene (además de un AUCiv aumentado, semivida funcional in vivo aumentada y / o semivida en suero aumentada) una afinidad de unión a membrana fosfolipídica aumentada con relación a rhFVlla. La afinidad de unión a membrana se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como el ensayo Biacore® descrito en K. Nagata y H. Handa (Ads.), Real-25 Time Análisis en Tierpo Real de Interacciones Biomoleculares, Springer-Verlag, Tokio, 2000, Capítulo 6 titulado "Interacciones Lípido-Proteína". De manera alternativa, la afinidad de unión a membrana se puede medir como se describe en el Ejemplo 1 en el documento WO 99/20767.

En otra realización preferida de la invención, la variante polipeptídica (además de una AUCiv aumentado, semivida funcional in vivo aumentada y / o semivida en suero aumentada), tiene una actividad de activación de FX 30 aumentada comparada con rhFVlla, en particular cuando se ensaya en un ensayo independiente de TF, tal como el "ensayo de Activación del Factor X independiente de TF" descrito en el presente documento. Más particularmente, se prefiere que la relación entre la actividad de activación por FX de la variante polipeptídica, en su forma activada, y la actividad de activación por FX de rhFVlla es al menos 1,25 cuando se ensaya en el "Ensayo de Activación del Factor X independiente de TF" descrito en el presente documento. Más preferiblemente, la relación entre la actividad de 35 activación por FX de la variante, en su forma activada, y la actividad de activación por FX de rhFVlla es al menos 1,5, tal como al menos 1,75, por ejemplo, al menos 2, incluso más preferiblemente al menos 3, tal como al menos 4, por ejemplo, al menos 5, todavía más preferiblemente al menos 6, tal como al menos 7, por ejemplo, al menos 8, lo más preferiblemente al menos 9, tal como al menos 10, cuando se ensaya en el Ensayo de Activación del Factor X independiente de TF" descrito en el presente documento. 40

En todavía otra realización preferida de la invención, la variante polipeptídica es (además de un AUCiv aumentado, semivida funcional in vivo aumentada y / o semivida en suero aumentada), en su forma activada, capaz de generar un coágulo más fuerte comparado con rhFVlla. Este efecto se puede determinar en el "Ensayo de Trombograma" descrito en el presente documento como un incremento en el Área Bajo la Curva (AUCtrom), El AUCtrom también algunas veces significa "trabajo de trombina total" y constituye una medición de la resistencia del coágulo 45 formado. Más particularmente, se prefiere que la relación entre el AUCtrom, generado por la variante en su forma activada, y el AUCtrom generado por rhFVlla es al menos 1,15 cuando se ensaya en el "Ensayo de Trombograma" descrito en el presente documento. Más preferiblemente, la relación es al menos 1,2, tal como al menos 1,25, por ejemplo, al menos 1,3, incluso más preferiblemente al menos 1,4, tal como al menos 1,5, por ejemplo, al menos 1,6, lo más preferiblemente al menos 1,7, tal como al menos 1,8, por ejemplo, al menos 1,9 o al menos 2. 50

En incluso otra realización preferida de la invención la variante polipeptídica tiene (además de un AUCiv aumentado, semivida funcional in vivo y aumentada / o semivida en suero aumentada), en su forma activada, una acción más rápida. Este efecto se puede determinar en el "Ensayo de Trombograma" descrito en el presente documento como una reducción en el tiempo necesario para alcanzar el nivel máximo de trombina (Tmax). De acuerdo con lo anterior, las variantes preferidas son tales variantes donde la relación entre Tmax para la variante, en su forma activada, y 55 Tmax para rhFVlla es como mucho 0,95 cuando se ensaya en el "Ensayo de Trombograma" descrito en el presente documento. Preferiblemente, la relación es como mucho 0,9, tal como mucho 0,8, por ejemplo, como mucho 0,7, más preferiblemente como mucho 0,6, tal como mucho 0,5.

Introducción de sitios de N-glicosilación in vivo localizados fuera del dominio Gla

Un número de modificaciones adecuadas que conduce a un incremento en AUCiv, semivida funcional in vivo y / o semivida en suero se describe en el documento WO 01/58935. Las variantes descritas en el documento WO 01/58935 como resultado de una nueva estrategia en general para el desarrollo de nuevas moléculas de FVII o FVlla, que también se pueden usar para el polipéptido FVII o de FVlla precursor de la presente invención. 5

La posición a modificar preferiblemente está seleccionada entre una parte de la molécula de FVII o de FVlla que se localiza fuera del sitio de unión al factor tisular, y / o fuera de la región de sitio activo, y / o fuera de la cresta de la grieta de unión al sitio activo. Estos sitios / regiones están identificados en el Ejemplo 1 en el presente documento. Sin embargo, se debe enfatizar, que en ciertas situaciones, por ejemplo, en el caso que se desee una variante polipeptídica inactivada, puede ser ventajoso para realizar modificaciones en o cerca de tales regiones. Por ejemplo, se contempla 10 que uno o más sitios de N-glicosilación in vivo se pueden introducir de manera ventajosa en la región de sitio activo o en la cresta de la grieta de unión al sitio activo de una molécula de FVII o de FVlla. La región del sitio activo, el sitio de unión al factor tisular y la cresta de la grieta de unión al sitio activo se definen en el Ejemplo 1 en el presente documento y están constituidos por los siguientes restos:

I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, 15 C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, 1243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y F405 (región del sitio activo); L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, 20 R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 y R379 (sitio de unión al factor tisular); y

N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 y T370 (cresta de la grieta de unión al sitio activo).

El número total de restos de aminoácido a modificar fuera del dominio de Gla en el polipéptido FVII o de FVlla precursor (comparado con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2) típicamente no excederá de 25 10. Preferiblemente, la variante de FVII o FVlla comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 - 10 restos de aminoácido de los restos de aminoácido 46 - 406 mostrados en la SEQ ID NO:2, típicamente en 1 - 8 o en 2 - 8 restos de aminoácido, por ejemplo, en 1 - 5 o en 2 - 5 restos de aminoácido, tal como en 1 - 4 o en 1 - 3 restos de aminoácido, por ejemplo, en 1, 2 ó 3 restos de aminoácido de los restos de aminoácido 46 - 406 mostrados en la SEQ ID NO:2.

De este modo, la variante polipeptídica de la invención puede contener 1 - 10 sitios de N- glicosilación in vivo 30 (adicionales o introducidos), típicamente 1 - 8 ó 2 - 8 sitios de N- glicosilación in vivo (adicionales o introducidos), preferiblemente 1 - 5 ó 2 - 5 sitios de N- glicosilación in vivo (adicionales o introducidos), tal como 1 - 4 ó 1 - 3 sitios de N-glicosilación in vivo (adicionales o introducidos), por ejemplo, 1, 2 ó 3 sitios de N-glicosilación in vivo (adicionales o introducidos). De manera análoga, la variante polipeptídica de la invención puede contener 1 - 10 restos de azúcar (adicionales o introducidos), típicamente 1 - 8 ó 2 - 8 restos de azúcar (adicionales o introducidos), preferiblemente 1 - 5 35 ó 2 - 5 restos de azúcar (adicionales o introducidos), tal como1 - 4 ó 1 - 3 restos de azúcar (adicionales o introducidos), por ejemplo, 1, 2 ó 3 restos de azúcar (adicionales o introducidos). Se entenderá que el resto/restos de azúcar introducido (s) estará (n) unido (s) de manera covalente al sitio (s) de N-glicosilación in vivo introducido (s).

Cuando se usa en el presente contexto, la expresión "sitio de glicosilación de origen natural" cubre los sitios de glicosilación en las posiciones N145, N322, S52 y S60. De una forma similar, la expresión "sitio de O-glicosilación de 40 origen natural in vivo" incluye las posiciones SS2 y S60, mientras que la expresión "sitio de N-glicosilación de origen natural in vivo" incluye las posiciones N145 y N322.

Se entenderá que con el fin de preparar una variante polipeptídica, en la que la variante polipeptídica comprende uno o más restos de azúcar unidos de manera covalente a uno o más sitios de N-glicosilación in vivo, la variante polipeptídica se debe expresar en una célula huésped capaz de unir restos de azúcar (oligosacárido) al (a los) 45 sitio (s) de glicosilación o de manera alternativa someterse a glicosilación in vitro. Los ejemplos de células huésped de glicosilación se proporcionan en la sección adicional más adelante titulada "Acoplamiento a un resto de azúcar".

Los ejemplos de posiciones, en los que los sitios de N-glicosilación in vivo se pueden introducir incluyen, pero no se limitan a, posiciones que comprenden un resto de aminoácido que tiene un resto de aminoácido que tiene al menos 25% de esta cadena lateral expuesta a la superficie (como se ha definido en el Ejemplo 1 en el presente 50 documento), tal como una posición que comprende un resto de aminoácido que tiene al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se ha definido en el Ejemplo 1 en el presente documento). En general, se prefiere que el sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por sustitución, aunque también se contempla la inserción. La posición preferiblemente se selecciona entre una parte de la molécula que se localiza fuera del sitio de unión al factor tisular y / o la región del sitio activo y / o fuera de la cresta de la grieta del sitio activo. Estos sitios/regiones se identifican en el 55 Ejemplo 1 en el presente documento. Se debe entender que cuando la expresión "al menos 25% (o al menos 50%) de su cadena lateral expuesta a la superficie" se usa junto con la introducción de un sitio de N-glicosilación in vivo este término se refiere a la accesibilidad de superficie de la cadena lateral de aminoácidos en la posición donde el resto de

azúcar está unido realmente. En muchos casos sera necesario introducir un resto de serina o de treonina en la posición +2 con relación al resto de asparagina al que el resto de azúcar está realmente unido (salvo, de hecho, esta posición ya ocupada por un resto de serina o de treonina) y estas posiciones, donde los restos de serina o de treonina se introducen, se permite que estén enterrados, es decir, que tenga menos de 25% de sus cadenas laterales expuestas a la superficie. La variante polipeptídica de la invención comprende al menos una sustitución que crea un sitio de N-5 glicosilación in vivo, en el que dicha sustitución se selecciona entre el grupo constituido por A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N y sus combinaciones. Más preferiblemente, el sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por una sustitución seleccionada entre el grupo constituido por A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, 10 S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N, D334N y sus combinaciones. Incluso más preferiblemente, el sitio de N- glicosilación in vivo se introduce por una sustitución seleccionada entre el grupo constituido por T106N, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T y sus combinaciones, en particular I205T.

En una realización, solamente un sitio de N-glicosilación in vivo se ha introducido por sustitución. En otra realización, dos o más (tal como dos) sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustitución. Ejemplos de 15 sustituciones preferidas que crean dos sitios de N- glicosilación in vivo incluyen sustituciones seleccionadas entre el grupo constituido por A51N+G58N, A51N+T106N, A51N+K109N, A51N+G124N, A51N+K143N+N145T, A51N+A175T, A51N+I205T, A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+T106N, G58N+K109N, G58N+G124N, G58N+K143N+N145T, G58N+A175T, G58N+I205T, G58N+V253N, G58N+T267N+S269T, G58N+S314N+K316T, 20 G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N145T, T106N+A 175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+ G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, 25 G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, K143N+N145T+I205T, K143N+N145T+V253N, K143N+N145T+T267N+S269T, K143N+N145T+S314N+K316T, K143N+N145T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, 30 A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N, V253N+D334N, T267N+ S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, 35 R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N y G318N+D334N. Más preferiblemente, las sustituciones se seleccionan entre el grupo constituido por T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T y V253N+T267N+S269T, incluso más preferiblemente entre el grupo constituido por T106N+I205T, T106N+V253N y I205T+T267N+S269T. 40

En incluso una realización adicional, tres o más (tal como tres) sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustitución. Los ejemplos de sustituciones preferidas que crean tres sitios de N-glicosilación in vivo incluyen sustituciones seleccionadas entre el grupo constituido por l205T+ V253N+T267N+S269T y T106N+I205T+V253N.

Como se ha descrito anteriormente, se prefiere que el sitio de N-glicosilación in vivo se introduzca en una 45 posición que ni forma parte del sitio de unión al factor tisular ni forma parte de la región del sitio activo y la cresta de la grieta de unión al sitio activo como se define en el presente documento. Se contempla que tales variantes de glicosilación principalmente pertenecerán a la clase de variantes polipeptídicas activas como se define en el presente documento antes.

Se entenderá que como una alternativa a la introducción sitios de N-glicosilación in vivo en las posiciones 50 descritas anteriormente se puede introducir (o bien por sustitución o mediante inserción) de restos de cisteína en las mismas posiciones, donde el resto de cisteína introducido se une de manera covalente posteriormente a un resto no polipeptídico, tal como PEG, en particular mPEG. De este modo, los ejemplos de posiciones, en las que un resto de cisteína se puede introducir incluyen, pero no se limitan a, posiciones que comprenden un resto de aminoácido que tiene un resto de aminoácido que tiene al menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se ha definido en el 55 Ejemplo 1 en el presente documento), tal como en una posición que comprende un resto de aminoácido que tiene al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se ha definido en el Ejemplo 1 en el presente documento). La posición preferiblemente se selecciona entre una parte de la molécula que se localiza fuera del sitio de unión al factor tisular y / o la región del sitio activo y / o fuera de la cresta de la grieta del sitio activo. Estos sitios / regiones se identifican en el Ejemplo 1 en el presente documento. De este modo, la introducción referente a la 60

descripción anterior de sitios de N-glicosilación in vivo se aplica mutatis mutandis a la introducción de restos de cisteína.

Se entenderá que las modificaciones en las posiciones localizadas fuera del dominio Gla descritas en la sección anterior se deben combinar con sustituciones en las posiciones 10 y 32 en el dominio Gla (véase la sección titulada "Modificaciones en el dominio Gla " más adelante), de acuerdo con la reivindicación 1. 5

Modificaciones en el dominio Gla

Como se entenderá las variantes de la presente invención comprenden, además de al menos un sitio de N-glicosilación introducido in vivo localizado fuera del dominio Gla (véase antes), al menos dos sustituciones en el dominio Gla, a saber una sustitución en la posición 10 y posición 32.

Un número de modificaciones adecuadas que conducen afinidad de unión a membrana fosfolipídica 10 aumentada se describe en el documento WO 99/20767 y documento WO 00/66753.

En una realización preferida de la invención la sustitución en la posición 10 es P10Q. En otra realización preferida de la invención la sustitución en la posición 32 es K32E. En otra realización particularmente preferida de la invención la variante comprende las siguientes sustituciones P10Q+K32E.

En una realización interesante de la invención la variante comprende, además de las sustituciones en la 15 posición 10 y 32, tal como además de las sustituciones P10Q+K32E, al menos una modificación adicional en el dominio Gla.

En una realización preferida de la invención la modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución de aminoácido en la posición 33. Preferiblemente, un resto de aminoácido hidrófobo se introduce por sustitución en la posición 33, tal como D331, D33L, D33M, D33V, D33F, D33Y o D33W, en particular D33F. De acuerdo 20 con lo anterior, en una realización de la invención muy interesante, la variante comprende las siguientes sustituciones P10Q+K32+D33F.

En otra realización preferida de la invención la modificación adicional en el dominio Gla comprende una inserción de al menos un (tal como un) resto de aminoácido entre la posición 3 y 4. Se prefiere que el resto de aminoácido insertado sea un resto de aminoácido hidrófobo. Lo más preferiblemente la inserción es A3AY. De acuerdo 25 con lo anterior, en otra realización de la invención muy interesante, la variante comprende las siguientes modificaciones A3AY+P10Q+K32E o A3AY+P10Q+K32E+D33F.

En todavía otra realización preferida de la invención la modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución en la posición 34. Se prefiere que un resto de aminoácido cargado negativamente se introduzca por sustitución en la posición 34. Lo más preferiblemente la sustitución es A34E. De acuerdo con lo anterior, en todavía 30 realización de la invención muy interesante, la variante comprende las siguientes modificaciones P10Q+K32E+A34E, P10Q+K32E+D33F+A34E, A3AY+P10Q+K32E+A34E o A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E.

El dominio Gla también puede contener modificaciones en otras posiciones, en particular en las posiciones 8, 11 y 28, tal como R28F o R28E. Por otra parte se debe entender que el dominio Gla no se debe modificar hasta tal grado que las propiedades de unión a membrana se alteren. De acuerdo con lo anterior, se prefiere que no se realicen 35 modificaciones en los restos que llegan a estar γ-carboxilados, es decir, se prefiere que no se realicen modificaciones en los restos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35. De una manera similar, en general no se prefiere que los restos no polipeptídicos, tales como restos de azúcar y / o grupos PEG, se introduzcan en el dominio Gla. Por consiguiente, se prefiere que no se realicen modificaciones en el dominio Gla que cree un sitio de N-glicosilación in vivo.

Finalmente, se entenderá que las modificaciones en el dominio Gla descritas en esta sección se deben 40 combinar con una o más de las modificaciones descritas en la sección titulada "Introducción de sitios de N-glicosilación in vivo localizados en el dominio Gla" anteriormente.

Los ejemplos específicos de tales variantes "combinadas" se proporcionan más adelante.

En una realización de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T106N. 45

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A175T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 50 modificaciones: P10Q+K32E+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+T106N+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 5 modificaciones: P10Q+K32E+I205T+T267N+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T106N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A175T. 10

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+V253N.

En una realización adicional preferida de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 15 modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+T106N+V253N. 20

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+I205T+T267N+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T106N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 25 modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A175T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+V253N. 30

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 35 modificaciones: P10Q+K32E+D33F+T106N+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: 45 A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N. 40

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A175T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 45 modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N+I205T. 50

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 5 modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T106N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+A175T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+I205T. 10

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 15 modificaciones: P10Q+K32E+A34E+T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: 15 P10Q+K32E+A34E+T106N+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+A34E+I205T+T267N+S269T. 20

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E+T106N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E+ A175T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 25 modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E +I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: 25 P10Q+K32E+D33F+A34E +V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E T267+S269T. 30

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 35 modificaciones: P10Q+K32E+D33F+A34EI205T+T267N+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: 35 A3AY+P10Q+K32E+A34E+T106N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E A175T. 40

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 45 modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: 45 A3AY+P10Q+K32E+A34E T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E T106N+V253N. 50

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+A34E I205T+T267N+ S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E+T106N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 5 modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E A175T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: 55 A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E V253N. 10

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E T267+S269T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+I205T.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes 15 modificaciones: 5 A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E T106N+V253N.

En una realización adicional de la invención dicha variante de FVII o FVlla comprende las siguientes modificaciones: A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E I205T+T267N+ S269T.

Otras modificaciones fuera del dominio Gla

En una realización adicional de la presente invención, la variante de FVII o FVlla puede, además de las 20 modificaciones descritas en las secciones anteriores, también contienen mutaciones, que ya se conoce que incrementan la actividad intrínseca del polipéptido, por ejemplo, tales como las descritas en el documento WO 02/22776

Ejemplos of sustituciones preferidas incluyen sustituciones seleccionadas entre el grupo constituido por V158D, E296D, M298Q, L305V and K337A. Más preferiblemente, said sustituciones are selected entre el grupo constituido por V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A, V158D+E296D+M298Q+K337A, V158D+E296D+M298Q+ 25 L305V, V158D+E296D+M298Q, M298Q, L305V+K337A, L305V y K337A.

En una realización adicional de la presente invención, la variante de FVII o FVlla puede, además de las modificaciones descritas en las secciones anteriores, también contienen mutaciones, que ya se conoce que provocan una inhibición disminuida por TFPI. Un ejemplo incluye la sustitución K341Q descrita por Neuenschwander et al, Biochemistry, 1995; 34: 8701 - 8707. 30

Además, la variante puede contener modificaciones que se cree que incrementan la afinidad de unión de TF. Ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones seleccionadas entre el grupo constituido por L39E, L39Q, L39H, 142K, 142R, S43H, S43Q, K62E, K62R, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, E82Q, E82N, E82K y F275H

Como ya se ha indicado anteriormente, la variante también puede contener sustituciones de aminoácido conservadoras. 35

El resto no polipeptídico

Basándose en la presente descripción los expertos en la técnica son conscientes de que los restos de aminoácido que comprenden otros grupos de unión se pueden introducir por sustitución en el polipéptido precursor, usando el mismo planteamiento que el ilustrado anteriormente con sitios de N-glicosilación in vivo. Por ejemplo, uno o más restos de aminoácido que comprenden un grupo ácido (ácido glutámico o ácido aspártico), tirosina o Lisina se 40 puede introducir en las posiciones descritas anteriormente. En particular, uno o más restos de cisteína se pueden introducir en las posiciones descritas anteriormente.

Como se ha indicado antes anteriormente el resto no polipeptídico de la variante conjugada preferiblemente se selecciona entre el grupo constituido por una molécula de polímero, un compuesto lipófilo, un resto de azúcar (por medio de una glicosilación in vivo) y un agente de derivación orgánico. Todos estos agentes pueden conferir propiedades 45 deseables al polipéptido variante, en particular AUCiv aumentado, semivida funcional aumentada in vivo y / o semivida en plasma aumentada. El polipéptido variante está normalmente está conjugado solamente a un tipo de resto no polipeptídico, pero también puede estar conjugado a dos o más tipos diferentes de restos no polipeptídicos, por ejemplo, a una molécula de polímero y un resto de azúcar, a un grupo lipófilo y un resto de azúcar, a un agente de derivación orgánico y un resto de azúcar, a un grupo lipófilo y una molécula de polímero, etc. La conjugación a dos o más restos no 50 polipeptídicos se puede hacer de manera simultánea o secuencial.

Procedimientos de preparación de una variante conjugada de la invención

En las siguientes secciones "Conjugación a un compuesto lipófilo", "Conjugación a una molécula de polímero", "Conjugación a un resto de azúcar" y "Conjugación a un agente de derivación orgánico" se describe la conjugación a tipos específicos de restos no polipeptídicos. En general, una variante conjugada de acuerdo con la invención se puede producir mediante cultivo de una célula huésped apropiada en condiciones que conducen a la expresión del polipéptido 5 variante, y recuperación del polipéptido variante, en la que a) el polipéptido variante comprende al menos un sitio de N- u O-glicosilación y la célula huésped es una célula huésped eucariótica capaz de glicosilación in vivo, y / o b) el polipéptido variante se somete a conjugación a un resto no polipeptídico in vitro.

Se entenderá que la conjugación se debe diseñar de manera que produzca la molécula optima con respecto al número de restos no polipeptídicos unidos, el tamaño y forma de tales moléculas (por ejemplo, si son lineales o 10 ramificados), y el (los9 sitio (s) de unión en el polipéptido. El peso molecular del resto no polipeptídico a usar se puede, por ejemplo, elegir en base al efecto deseado a lograr. Por ejemplo, si el propósito primario de la conjugación es lograr una variante conjugada que tiene un alto peso molecular (por ejemplo, para reducir la eliminación renal) usualmente es deseable conjugar tan pocos restos no polipeptídicos de alto peso molecular como sea posible para obtener el molecular deseado. Cuando es deseable un alto grado de protección esto se puede obtener mediante el uso de un número 15 suficientemente alto restos no polipeptídicos de bajo peso molecular (por ejemplo, con un peso molecular de entre aproximadamente 300 Da y aproximadamente 5 kDa, tal como un peso molecular de entre 300 Da y 2 kDa).

Conjugación a una molécula de polímero

La molécula de polímero a acoplar al polipéptido variante puede ser cualquier molécula de polímero adecuada, tal como un homo-polímero o hetero-polímero natural o sintético, típicamente con un peso molecular en el intervalo de 20 aproximadamente 300-100,000 Da, such as aproximadamente 500-20,000 Da, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 500 - 15,000 Da, incluso más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2 - 12 kDa, tal como en el intervalo de aproximadamente 3 – 10 kDa. Cuando la expresión "aproximadamente" se usa en el presente documento junto con un cierto peso molecular, la palabra "aproximadamente" indica un peso molecular medio aproximado y refleja el hecho que existirá normalmente una distribución de peso molecular en una preparación de 25 polímero dada.

Los ejemplos de homo-polímeros incluyen un poliol (es decir poli-OH), una poliamina (es decir, poli-NH2) y un ácido policarboxílico (es decir, poli-COOH). Un hetero-polímero es un polímero que comprende grupos de acoplamiento diferentes, tal como un grupo hidroxilo y un grupo amina.

Los ejemplos de moléculas de polímero adecuadas incluyen moléculas de polímero seleccionadas entre el 30 grupo constituido por óxido de polialquileno (PAO), incluyendo polialquilen glicol (PAG), tales como polietilen glicol (PEG) y polipropilen glicol (PPG), PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), poli-carboxilato, poli-(vinilpirolidona), anhídrido de ácido polietilen-co- maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico, dextrano, incluyendo carboximetil-dextrano, o cualquier otro biopolímero adecuado para reducir la inmunogenicidad y / o incrementar la semivida funcional in vivo y / o semivida en suero. Otro ejemplo de una molécula de polímero es albúmina humana u otra proteína de 35 plasma abundante. En general, polímeros derivados de polialquilen biocompatible, no tóxicos, no antigénicos, no inmunogénicos, tienen diversas propiedades de solubilidad en agua, y se excretan fácilmente de los organismos vivos.

PEG es la molécula de polímero preferida, ya que hay solamente pocos grupos reactivos capaces de reticularse comparados con, por ejemplo, polisacáridos tales como dextrano. En particular, PEG monofuncional, por ejemplo, metoxipolietilen glicol (mPEG), es de interés ya que su química de acoplamiento es relativamente simple 40 (solamente un grupo reactivo está disponible para conjugación con grupos de unión en el polipéptido). Por consiguiente, ya que se elimina el riesgo de reticulación las variantes conjugadas resultantes son más homogéneas y la reacción de las moléculas de polímero con el polipéptido variante es fácil de controlar.

Para efectuar la unión covalente de la (s) molécula (s) de polímero (s) al polipéptido variante, los grupos terminales hidroxilo de la molécula de polímero se debe proporcionar en forma activada, es decir, con grupos 45 funcionales reactivos (ejemplos de los cuales incluyen grupos amino primarios, hidrazida (HZ), tiol, succionato (SUC), succionato de succinimidilo (SS), succinimidil succinamida (SSA), propionato de succinimidilo (SPA), butirato de succinimidilo (SBA), carboximetilato de succinimidilo (SCM), carbonato de benzotriazol (BTC), N-hidroxisuccinimida (NHS), aldehído, nitrofenilcarbonato (NPC), y tresilato (TRES)). Las moléculas de polímero activadas adecuadas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos, o de PolyMASC 50 Pharmaceuticals plc, Reino Unido.

De manera alternativa, las moléculas de polímero se pueden activar mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO 90/13540. Los ejemplos específicos de moléculas de polímero lineales o ramificadas activadas para uso en la presente invención se describen en Shearwater Polymers, Inc. Catálogos 1997 y 2000 (Polímeros Biocompatibles Funcionalizados para Investigación y compuestos 55 farmacéuticos, Polietilen Glicol y Derivados, incorporados en el presente documento por referencia).

Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales: NHS-PEG (por ejemplo, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC- PEG, SG-PEG, y SCM-PEG), y NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI- PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, y MAL-PEG, y PEG ramificados tal como PEG2-NHS y los descritos en los documentos US 5.932.462 y US 5.643.575, los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Además, las siguientes publicaciones describen moléculas de 5 polímero útiles y / o químicas de PEGilación: documentos US 5.824.778, US 5.476.653, WO 97/32607, EP 229.108, EP 402.378, US 4.902.502, US 5.281.698, US 5.122.614, US 5.219.564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5.736.625, WO 98/05363, EP 809 10 996, US 5.629.384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5.473.034, US 5.516.673, EP 605 963, US 5.382.657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183503 y EP154316.

Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados particularmente preferidos para acoplamiento a restos de cisteína, incluyen los siguientes PEG lineal: vinilsulfona-PEG (VS-PEG), preferiblemente vinilsulfona-mPEG (VS-mPEG); maleimida-PEG (MAL-PEG), preferiblemente maleimida-mPEG (MAL-mPEG) y ortopiridil-disulfuro-PEG 15 (OPSS-PEG), preferiblemente ortopiridil-disulfuro-mPEG (OPSS-mPEG). Típicamente, tales polímeros de PEG o mPEG tendrán un tamaño de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kD, aproximadamente 12 kDa o aproximadamente 20 kDa.

La conjugación de la variante polipeptídica y las moléculas de polímero activadas se lleva a cabo mediante el uso de cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, como se describe en las siguientes referencias (que también 20 describen procedimientos adecuados para la activación de moléculas de polímero): Harris y Zalipsky, eds., Poly(etilene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). 25

Los expertos en la técnica serán conscientes de que el procedimiento de activación y / o química de conjugación a usar depende del (de los) grupo (s) de unión del polipéptido variante (ejemplos de los cuales se han proporcionado anteriormente), así como los grupos funcionales del polímero (siendo por ejemplo, amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La PEGilación se puede dirigir hacia la conjugación a todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido variante (es decir, tales grupos de unión que 30 se exponen a la superficie del polipéptido) o se pueden dirigir hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal como se describe en el documento US 5.985.265 o a restos de cisteína. Además, la conjugación se puede lograr en una etapa o de una manera por etapas (por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/55377).

Para PEGilación a restos de cisteína (véase anteriormente) la variante de FVII o FVlla se trata usualmente con 35 un agente reductor, tal como ditiotreitol (DDT) antes de la PEGilación. El agente reductor se elimina posteriormente mediante cualquier procedimiento convencional, tal como mediante desalación. Conjugación de PEG a un resto de cisteína típicamente tiene lugar en un tampón adecuado en pH 6 - 9 a temperaturas que varían entre 4°C y 25°C durante períodos de hasta 16 horas.

Se entenderá que la PEGilación se diseña de manera que produzca la molécula optima con respecto al 40 número de moléculas de PEG unidas, el tamaño y forma de tales moléculas (por ejemplo, si son lineales o ramificadas), y el (los) sitio (s) de unión en el polipéptido variante. El peso molecular del polímero a usar se puede por ejemplo, elegir en base al efecto a lograr.

Junto con la conjugación a solamente un único grupo de unión en la proteína (por ejemplo, el grupo amino N-terminal), puede ser ventajoso que la molécula de polímero, que puede ser lineal o ramificada, tiene un alto peso 45 molecular, preferiblemente aproximadamente 10 - 25 kDa, tal como aproximadamente 15 - 25 kDa, por ejemplo, aproximadamente 20 kDa.

Normalmente, la conjugación polimérica se lleva a cabo bajo condiciones dirigidas a reaccionar como muchos de los grupos de unión con moléculas poliméricas disponibles. Esto se logra por medio de un exceso molar adecuado del polímero con relación al polipéptido. Típicamente, las relaciones molares de moléculas de polímero activadas al 50 polipéptido son hasta aproximadamente 1000 - 1, tal como hasta aproximadamente 200 - 1, o hasta aproximadamente 100 - 1. En algunos casos la relación puede ser algo menor, sin embargo, tal como hasta aproximadamente 50 - 1, 10 - 1, 5 - 1, 2 - 1 ó 1 - 1 con el fin de obtener la reacción óptima.

También se contempla de acuerdo con la invención acoplar las moléculas de polímero al polipéptido mediante un engarce. Los engarces adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo preferido es cloruro 55 cianúrico (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578 - 3581; documento US 4.179.337; Shafer et al., (1986), J. Polim. ScL Polim. Chem. Ed., 24, 375 - 378).

Después de la conjugación, las moléculas de polímero activadas residuales se bloquean de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por adición de amina primaria a la mezcla de reacción, y las moléculas de polímero inactivadas resultantes se eliminan mediante un procedimiento adecuado.

Se entenderá que dependiendo de las circunstancias, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, la naturaleza del compuesto de PEG activado que se usa y las condiciones específicas de 5 PEGilación, incluyendo la relación molar de PEG a polipéptido, se pueden obtener grados variables de PEGilación, con un grado mayor de PEGilación obteniéndose en general con una relación mayor de PEG a polipéptido variante. Los polipéptidos variantes PEGilados que se producen por cualquier procedimiento de PEGilación dado, sin embargo, normalmente comprenderán una distribución estocástica de variantes conjugadas polipeptídicas que tienen grados ligeramente diferentes de PEGilación. 10

Acoplamiento a un resto de azúcar

Con el fin de lograr la glicosilación in vivo de una molécula de FVII que comprende uno o más sitios de glicosilación la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido variante se debe insertar en un huésped de glicosilación, de expresión eucariótico. La célula huésped de expresión se puede seleccionar entre hongos (hongos filamentosos o levaduras, células de insecto o de animal o de células de plantas transgénicas. En una realización la 15 célula huésped es una célula de mamífero, tal como una célula de CHO, BHK o HEK, por ejemplo, célula HEK 293, o una célula de insecto, tal como una célula SF9, o una célula de levadura, por ejemplo, S. cerevisiae o Pichia pastoris, o cualquiera de las células huésped mencionadas en el presente documento después.

El acoplamiento covalente in vitro de restos de azúcar (tal como dextrano) a restos de aminoácido del polipéptido variante también se puede usar, por ejemplo, como se describe, por ejemplo en el documento WO 87/05330 20 y en Aplin etl al., CRC Crit Rev. Biochem, p. 259 - 306, 1981. El acoplamiento in vitro de restos de azúcar o PEG a restos Gln unidos por proteína- y péptido se puede llevar a cabo mediante transglutaminasas (TGasas). Las transglutaminasas catalizan la transferencia de grupos amina donantes a restos Gln unidos por proteína- y péptido en una llamada reacción de reticulación. Los grupos amina donantes pueden estar unidos por proteína- o péptido, tal como el grupo ε-amlno en restos Lys o puede ser parte de una molécula orgánica grande o pequeña. Un ejemplo de una 25 molécula orgánica pequeña que funciona como donante amino en la reticulación catalizada por TGasa es putrescina (1,4-diaminobutano). Un ejemplo de una molécula orgánica mayor que funciona como donante de amino en la reticulación catalizada por TGasa es un PEG que contiene amina (Sato et al., 1996, Biochemistry 35, 13072 - 13080).

Las TGasas, en general, son enzimas altamente específicas, y no todo resto de Gln expuesto sobre la superficie de una proteína es accesible a la reticulación catalizada por TGasa a sustancias que contienen amino. Por el 30 contrario, solamente unos pocos restos de Gln funcionan de manera natural como sustratos de TGasa pero los parámetros exactos que gobiernan dichos restos de Gln son buenos sustratos de TGasa que permanecen desconocidos. De este modo, con el fin de hacer una proteína susceptible a reacciones de reticulación catalizada por TGasa a menudo es un requisito previo en las posiciones convenientes añadir tramos de secuencia de aminoácidos conocidos que funcionan muy bien como o sustratos de TGasa. Se conoce que varias secuencias de aminoácidos son o 35 contienen sustratos de TGasa naturales excelentes por ejemplo, sustancia P, elafina, fibrinógeno, fibronectina, inhibidor de α2-plasmina, α -caseína, y β- caseína.

Conjugación a un agente de derivación orgánico

La modificación covalente del polipéptido variante se puede realizar haciendo reaccionar uno o más grupos de unión del polipéptido variante con un agente de derivación orgánico. Los agentes de derivación y procedimientos 40 adecuados se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, restos de cisteinilo lo más comúnmente se hacen reaccionar con α-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para proporcionar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos de cisteinilo también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(4-imidozoil)propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p- cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-45 oxa-1 ,3-diazol. Los restos de histidilo se derivatizan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5 – 7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil bromuro de para-bromofenacilo. La reacción se realiza preferiblemente en 0.1 M de cacodilato de sodio a pH 6,0. Los restos de lisinilo y amino terminal se hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otro carboxílico. La derivatización con estos agentes tienen el efecto de inverter la carga de los restos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos 50 que contienen α-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, cloroborohidruro de piridoxal, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanediona y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Los restos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanediona, 1,2-ciclohexanediona, y ninhidrina. La derivatización de restos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanidina. 55

Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de Lisina así como con el grupo arginina guanidino. Los grupos secundarios de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican de manera selectiva por reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), donde R y R' son diferentes grupos alquilo, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)

carbodiimida o 1-etil-3-(4- azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, restos de aspartilo y glutamilo se convierten en restos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Conjugación a un compuesto lipófilo

El polipéptido variante y el compuesto lipófilo pueden estar conjugados entre sí, o bien directamente o mediante el uso de un engarce. El compuesto lipófilo puede ser un compuesto natural tal como un ácido graso saturado 5 o insaturado, una dicetona de ácido graso, un terpeno, una prostaglandina, una vitamina, un carotenoide o esteroide, o un compuesto sintético tal como un ácido de carbono, un alcohol, una amina y ácido sulfónico con uno o más alquil-, aril-, alquenil- u otros compuestos no saturados. La conjugación entre el polipéptido variante y el compuesto lipófilo, opcionalmente a través de un engarce se puede realizar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Bodanszky en Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 y en el documento WO 10 96/12505.

Procedimientos de preparación de una variante polipeptídica de la invención

La variante polipeptídica de la presente invención se puede producir mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Tales procedimientos incluyen la construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica la variante polipeptídica y que expresa la secuencia en un huésped transfectado o transfectado adecuado. 15 Preferiblemente, la célula huésped es una célula huésped gamma carboxilante tal como una célula de mamífero. Sin embargo, se pueden producer variantes polipeptídicas de la invención, aunque menos eficaz, mediante síntesis química de una combinación de síntesis química o combinación se síntesis química y tecnología de ADN recombinante.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una polipéptido de la invención se puede construir mediante aislamiento o síntesis de una secuencia de nucleótidos que codifican el FVII precursor, tal como hFVl1 con la secuencia 20 de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 y después cambiando la secuencia de nucleótidos de manera que efectúe la introducción (es decir, inserción o sustitución) o eliminación (es decir supresión o sustitución) del (de los) resto (s) de aminoácido relevante (s).

La secuencia de nucleótidos se modifica de manera conveniente mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con procedimientos convencionales. De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos se prepara mediante 25 síntesis química, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos, en el que los oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y preferiblemente seleccionando los codones que están favorecidos en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican partes del polipéptido deseado se pueden sintetizar y ensamblar mediante PCR, ligación o reacción en cadena de ligación (LCR) (Barany, PNAS 88: 189 - 193, 1991). Los 30 oligonucleótidos individuales típicamente contienen 5' o 3' salientes para ensamblaje complementario.

Los procedimientos de modificación de secuencia de nucleótidos alternativos están disponibles para producir variantes polipeptídicas para rastreo de alto rendimiento, por ejemplo procedimientos que implican cruzamiento homólogo tal como se describe en el documento US 5.093.257, y procedimientos que implican mezcla de genes, es decir, recombinación entre dos o más secuencias de nucleótidos homólogas que dan como resultado nuevas secuencias 35 de nucleótidos que tienen un número de alteraciones de nucleótidos cuando se compara con las secuencias de nucleótidos de partida. La recomposición de genes (también conocida como recomposición de ADN) implica uno o más ciclos de fragmentación al azar y reensamblaje de las secuencias de nucleótidos, seguido de rastreo para seleccionar secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con propiedades deseadas. Con el fin de que tenga lugar la recomposición de ácido nucleico basada en homología, las partes relevantes de la secuencias de nucleótidos son 40 preferiblemente al menos 50% idénticas, tal como al menos 60% idénticas, más preferiblemente al menos 70% idénticas, tal como al menos 80% idénticas. La recombinación se puede realizar in vitro o in vivo.

Los ejemplos de procedimientos de recomposición de genes in vitro adecuados están descritos por Stemmer et al. (1994), Proc. Natl. Acad. ScL USA; vol. 91, p. 10747 - 10751; Stemmer (1994), Nature, vol. 370, p. 389 - 391; Smith (1994), Nature vol. 370, p. 324 - 325; Zhao et al., Nat. Biotechnol. 1998, Mar; 16 (3): 258 - 61; Zhao H. y Arnold, 45 FB, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25. No. 6 p. 1307 - 1308; Shao et al., Nucleic Acids Research 15 de enero de 1998; 26(2): p. 681 - 83; y documento WO 95/17413.

Un ejemplo de procedimiento de recomposición in vivo adecuado se describe en el documento WO 97/07205. Otras técnicas para mutagénesis de secuencias de ácido nucleico por recombinación in vitro o in vivo se describen por ejemplo, en el documento WO 97/20078 y documento US 5.837.458. Los ejemplos de técnicas de recomposición 50 específicas incluyen "recomposición de familia", "recomposición sintética" y " recomposición in silico".

La recomposición de familia implica someter una familia de genes homólogos de especies diferentes a uno o más ciclos de recomposición y posterior rastreo y selección. Las técnicas de recomposición de familia se describen por ejemplo, por Crameri et al. (1998), Nature, vol. 391, p. 288-291; Christians et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, p. 259 - 264; Chang et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, p. 793 - 797; y Ness et al. (1999), Nature Biotechnology, 55 vol. 17, 893 - 896.

La recomposición sintética implica proporcionar genotecas de oligonucleótidos sintéticos de superposición basada por ejemplo, en una alineación de secuencia de genes homólogos de interés. Los oligonucleótidos generados de manera sintética se recombinan, y las secuencias de ácido nucleico recombinantes resultantes se rastrean y si se desea se usan para ciclos de recomposición adicionales. Las técnicas de recomposición sintéticas se describen en el documento WO 00/42561. 5

La recomposición in silico se refiere a un procedimiento de recomposición de ADN, que se realiza o se modela usando un sistema de ordenador, evitando por lo tanto parcialmente o enteramente la necesidad de manipular físicamente ácidos nucleicos. Las técnicas para recomposición in silico se describen en el documento WO 00/42560.

Una vez ensamblada (por síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro procedimiento), la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector recombinante y unido de manera operativa a secuencias 10 de control necesarias para la expresión del FVII en la célula huésped transformada deseada.

De hecho se debe entender que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionan igualmente bien para expresar la secuencia de nucleótidos que codifican las variantes polipeptídicas como se describe en el presente documento. Ninguno de todos los huéspedes funcionará igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden hacer selección entre estos vectores, secuencias de control 15 de expresión y huéspedes sin experimentación excesiva. Por ejemplo, cuando se selecciona un vector, el huésped se debe considerar ya que el vector puede replicarse en él o ser capaz de integrarse en el cromosoma. El número de copias del vector, la capacidad de controlar el número de copias, y la expresión de cualesquiera otras proteínas codificadas por el vector, tales como marcadores de antibióticos, también se debe considerar. Cuando se selecciona la secuencia de control de expresión, también se debe considerar una diversidad de factores. Éstos incluyen, por ejemplo, 20 la resistencia relativa de la secuencia, su capacidad de control, y su compatibilidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, particularmente en lo que respecta a las estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes se deben seleccionar mediante consideración de su compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad del producto codificado por la secuencia de nucleótidos, sus características de secreción, su capacidad para plegar la variante polipeptídica correctamente, sus requerimientos de fermentación o cultivo, y la facilidad de purificación de los productos 25 codificados por las secuencia de nucleótidos.

El vector recombinante puede ser un vector de replicación de manera autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. De manera alternativa, el vector es uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica asociado a el (los) cromosoma (s) en el que se ha integrado. 30

El vector es preferiblemente un vector de expresión, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la variante polipeptídica de la invención está unida de manera operativa a segmentos adicionales requeridos para la transcripción de la secuencia de nucleótidos. El vector se deriva típicamente de ADN de plásmido o viral. Un número de vectores de expresión adecuados para la expresión en las células huésped mencionadas en el presente documento están comercialmente disponibles o descritos en la bibliografía. Los vectores de expresión útiles para huéspedes 35 eucarióticos, incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden las secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores específicos son, por ejemplo, pCDNA3.1 (+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y pCI-neo (Stratagene, La Jola, CA, Estados Unidos). Los vectores de expresión útiles para células de levadura incluyen el plásmido 2 μ y sus derivados, el vector POT1 (documento US 4.931.373), y el vector pJS037 descrito en Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202 - 207,1996, y pPICZ A, B o C 40 (Invitrogen). Los vectores útiles para las células de insecto incluyen pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Sustance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, p. 685 - 98 (1986), pBluebac 4.5 y pMelbac (ambos disponibles de Invitrogen). Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, incluyendo pBR322, pET3a y pET12a (ambos de Novagen Inc., WI, Estados Unidos), plásmidos intervalo de huésped más amplio, tales 45 como RP4, ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados de fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN, tal como M13 y fagos de ADN de una sola cadena filamentosos.

Otros vectores para uso en esta invención incluyen los que permiten que la secuencia de nucleótidos que codifican la variante polipeptídica se amplifique en número de copias. Tales vectores amplificables son bien conocidos en la técnica. Incluyen, por ejemplo, vectores capaces de ser amplificados mediante amplificación por DHFR (véase, 50 por ejemplo, Kaufman, Patente de Estados Unidos Nº 4.470.461, Kaufman y Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, p. 1304 - 19 (1982)) y amplificación por glutamina sintetasa ("GS") (véase, por ejemplo, los documentos US 5.122.464 y EP 338.841).

El vector recombinante puede además comprender una secuencia de ADN que permite que el vector se 55 replique en la célula huésped en cuestión. Un ejemplo de tal secuencia (cuando la célula huésped es una célula de mamífero) es el origen SV40 de replicación. Cuando la célula huésped es una célula de levadura, las secuencias adecuadas que permiten que el vector a replicar sean los genes de replicación REP 1-3 del plásmido de levadura 2μ y origen de replicación.

El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como el gen que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen de Schizosaccharomyces pombe TPI (descrito por P.R. Russell, Gene 40, 1985, p. 125 - 130), o uno que confiere resistencia a un fármaco, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloramfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato. Para Saccharomyces cerevisiae, los marcadores seleccionables incluyen ura3 y leu2. Para hongos 5 filamentosos, los marcadores seleccionables incluyen amdS, pirG, arcB, niaD y sC.

La expresión "secuencias de control" se define en el presente documento para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de la variante polipeptídica de la invención. Cada secuencia de control puede ser secuencia de ácido nucleico nativa o extraña que codifica la variante polipeptídica. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia guía, secuencia de poliadenilación, secuencia propeptídica, 10 promotora, potenciadora o secuencia de activación cadena arriba, secuencia peptídico de señal, y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor.

Una amplia diversidad de secuencias de control de expresión se pueden emplear en la presente invención. Tales secuencias de control de expresión incluyen las secuencias de control de expresión asociadas a genes estructurales de los vectores de expresión anteriores así como cualquier secuencia conocida para controlar la expresión 15 de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y sus diversas combinaciones.

Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en células de mamífero incluyen los promotores tempranos y tardíos de SV40 y adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus 2, el promotor de MT-1 (gen de metalotioneina), el promotor génico temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor del factor 1α de elongación (EF-1α) humano, el promotor 70 de la proteína de choque térmico mínimo de 20 Drosophila, el promotor de Virus del Sarcoma de Rous (RSV), el promotor de ubiquitina C (UbC) humano, el terminador de la hormona de crecimiento humana, SV40 o señales de poliadenilación de la región Elb de adenovirus y la secuencia de consenso Kozak (Kozak, M. J Mol Biol 20 de agosto de 1987; 196 (4): 947 - 50).

Con el fin de mejorar la expresión en células de mamífero se puede insertar un intrón sintético en la región no traducida de 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un ejemplo de un intrón sintético es el intrón 25 sintético del plásmido pCI-Neo (disponible de Promega Corporation, WI, Estados Unidos).

Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para la dirección de transcripción en células de insecto incluyen el promotor de polihedrina, el promotor P10, el promotor de la proteína básica de virus de polihedrosis de Autographa californica, el promotor del gen 1 temprano inmediato de baculovirus y el promotor del gen temprano retrasado de 39K de baculovirus, y la secuencia de poliadenilación de SV40. Los ejemplos de secuencias de control 30 adecuadas para uso en células huésped de levadura incluyen los promotores del sistema de α-emparejamineto de levadura, el promotor de triosa fosfato isomerasa (TPI) de levadura, promotores de los genes glicolíticos de levadura o genes de alcohol deshidrogenasa, el promotor de de ADH2-4c, y el promotor de GAL inducible GAL. Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para uso en células huésped de hongos filamentosos incluyen el promotor y terminador de ADH3, un promotor derivado de los genes que codifican TAKA amilasa, triosa fosfato isomerasa o 35 proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, una α-amilasa de A. niger, glucoamilasa de A. niger o A. nidulans, acetamidasa de A. nidulans, aspártico proteinasa o lipasa de Rhizomucor miehel, el terminador TPI1 y el terminador ADH3. Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para uso para uso en células huésped bacterianas incluyen promotores del sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o el sistema TRC, y las regiones promotoras principales del fago lambda. 40

La presencia o ausencia de un péptido señal dependerán, por ejemplo, de la célula huésped de expresión usada para la producción de la variante polipeptídica a expresar (tanto si es un polipéptido intracelular o extracelular) y si es deseable obtener secreción. Para uso en hongos filamentosos, el péptido de señal se puede derivar de manera conveniente de un gen que codifica una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen que codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido de señal preferiblemente se deriva de 45 un gen que codifica una TAKA amilasa de A. oryzae, α-amilasa neutra de A. niger, amilasa estable a ácido de A. niger, o glucoamilasa de A. niger. Para uso en células de insecto, el péptido de señal se puede derivar de manera conveniente de un gen de insecto (véase, el documento WO 90/05783), tal como el precursor de hormona adipocinética de Lepidopteran manduca sexta, (véase, el documento US 5.023.328), la melitina de abeja de miel (Invitrogen), ecdiesteroide UDPglucosiltransferasa (egt) (Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349 - 357 (1993) o 50 lipasa pancreática humana (hpl) (Methods in Enzymology 284, p. 262 - 272, 1997). Un péptido de señal preferido para uso en células de mamífero es el de hFVl1 o el péptido de señal de cadena ligera kappa de Ig murino (Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152: 89 - 104). Para uso en células de levadura se han encontrado péptidos de señal adecuados que son el péptido de señal del factor α de S. cereviciae (véase, el documento US 4.870.008), un péptido de señal de carboxipeptidasa modificado (véase, L. A. Valis et al., Cell 48, 1987, p. 887 - 897), el péptido de señal 55 BAR1 de levadura (véase, el documento WO 87/02670), el péptido de señal de aspártico proteasa 3 de levadura (YAP3) (véase, M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, p. 127 - 137), y la secuencia guía sintética TA57 (documento W098/32867). Para uso en células de E. coli se ha encontrado un péptido de señal adecuado que es el péptido de señal ompA (documento EP581821).

La secuencia de nucleótidos de la invención que codifica una variante polipeptídica, tanto si prepara mediante mutagénesis dirigida al sitio, síntesis, PCR u otros procedimientos, pueden opcionalmente incluir una secuencia de nucleótidos que codifican un péptido de señal. El péptido de señal está presente cuando la variante polipeptídica se va a secretar desde las células en las que se expresa. Tal péptido de señal, si está presente, debe ser uno reconocido por la célula elegida para la expresión de la variante polipeptídica. El péptido de señal puede, por ejemplo, que esté 5 normalmente asociado a hFVII) o, de manera alternativa, el péptido de señal puede ser de otra fuente diferente de hFVII, tales como cualesquiera de los asociados normalmente a otros polipéptidos dependientes de vitamina K de tipo salvaje humano. Además, el péptido de señal puede ser un péptido de señal normalmente expresado de la célula huésped o uno que normalmente no se expresa normalmente a partir de la célula huésped. De acuerdo con lo anterior, el péptido de señal puede ser procariótico, por ejemplo, derivado de una bacteria tal como E. coli, o eucariótico, por 10 ejemplo, derivado de una célula de mamífero, o de insecto o de levadura.

Se puede usar cualquier huésped adecuado para producir la variante polipeptídica, incluyendo bacterias (aunque no se prefiere particularmente), hongos (incluyendo levaduras), células de planta, insecto, mamífero, u otras de animal apropiadas o líneas celulares, así como animales o plantas transgénicos. Los ejemplos de células huésped bacterianas incluyen bacterias gram positivas tales como cepas de Bacillus, por ejemplo, B. brevis o B. subtilis, 15 Pseudomonas o Streptomyces, o bacterias gram negativas, tales como cepas de E. coli. La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana se puede, por ejemplo, efectuar mediante transformación de protoplasto (véase, por ejemplo,, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111 - 115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823 - 829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209 - 221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 20 742 - 751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 - 5278). Los ejemplos de células huésped de hongos filamentosos incluyen cepas de Aspergillus, por ejemplo, A. oryzae, A. niger, o A. nidulans, Fusarium o Trichoderma. Las células de hongos se pueden transformar mediante un procedimiento que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para transformación de células huésped de Aspergillus se describen 25 en el documento EP 238023 y documento US 5.679.543. Los procedimientos adecuados para transformar esepcies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 - 156 y documento WO 96/00787. Los ejemplos de suitable yeast células huésped de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, por ejemplo, S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, tales como P. pastoris o P. methanolica, Hansenula, tales como H. Polimorpha o Yarrowia. La levadura se puede transformar usado los procedimientos descritos por Becker y Guarente, 30 en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, p 182 - 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920: y como se describe por Clontech laboratories, Inc, Palo Alto, CA, Estados Unidos (en el protocolo de producto para el YeastrnakerTM Kit de Sistema de Transformación de Levadura). Los ejemplos de células huésped de insecto adecuadas incluyen una línea celular de 35 Lepidoptora, tales como células de Spodoptera frugiperda (Sf9 o Sf21) o Trichoplusioa ni (Cinco alto) (documento US 5.077.214). La transformación de células de insecto y producción de polipéptidos heterólogos en ellas se puede realizar como se describe por Invitrogen. Los ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares de ovario de Hámster Chino (CHO), (por ejemplo, CHO-K1; ATCC CCl-61), líneas celulares de mono verde (COS) (por ejemplo, COS 1 (ATCC CRl-1650), COS 7 (ATCC CRl-1651 )); células de ratón (por ejemplo, NS/O), líneas celulares de 40 Riñón de Hámster Infantil (BHK) (por ejemplo, ATCC CRl-1632 o ATCC CCl-1 O), y células humanas (por ejemplo, HEK 293 (ATCC CRl-1573)), así como células de plantas en cultivo de tejidos. Las líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en la técnica y estás disponibles a partir de depositarios públicos tal como La Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland. También, la célula de mamífero, tal como una célula de CHO, se puede modificar para expresar la sialil transferasa, por ejemplo, 1,6- sialil transferasa, por ejemplo, como se describe en el documento US 45 5.047.335, con el fin de proporcionar glicosilación mejorada de la variante polipeptídica.

Con el fin de incrementar la secreción puede ser de particular interés producir la variante polipeptídica de la invención asociado a una endoproteasa, en particular una PACE (enzima convertidota de aminoácido básico apareado) (por ejemplo, como se describe en el documento US 5.986.079), tal como una Kex2 endoproteasa (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/28065). 50

Procedimientos para introducir ADN exógeno en células huésped de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada por DEAE- dextrano, transfección mediada por liposoma, vectores virales y el procedimiento de transfección descrito por Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido usando Lipofectamina 2000. Estos procedimientos se conocen bien en la técnica y por ejemplo, descritos por Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, Estados Unidos. El cultivo de las 55 células de mamífero se realiza de acuerdo con procedimientos establecidos, por ejemplo, como se describe en (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, Estados Unidos and Harrison MA y Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).

En los procedimientos de producción descritos en el presente documento, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción de la variante polipeptídica de la invención usando procedimientos conocidos en 60

la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraces de agitación, fermentación a pequeña escala o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, alimentada por lotes, o de estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permiten que el polipéptido se exprese y / o aísle. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están 5 disponibles a partir de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Si la variante polipeptídica se secreta en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si la variante polipeptídica no se secreta, se puede recuperar de lisados de célula.

La variante polipeptídica resultante se puede recuperar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por 10 ejemplo, la variante polipeptídica se puede recuperar del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluye, pero no se limita a, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

Los polipéptidos se pueden purificar mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, enfoque cromático, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad 15 diferencial (por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio), HPLC, o extracción (véase, por ejemplo, Purificación por Proteína, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Las variantes polipeptídicas de una sola cadena de la invención se pueden purificar y activar a variantes polipeptídicas de dos cadenas mediante un número de procedimientos como se describe en la bibliografía (Broze y Majerus, 1980, J. Biol. Chem. 255: 1242 - 47 y Hedner y Kisiel, 1983, J. Clin. lnvest. 71: 1836 - 41). Otro procedimiento 20 por el que una variante polipeptídica de una sola cadena se puede purificar es por la incorporación de iones de Zn durante la purificación como se describe en el documento US 5.700.914. En una realización preferida la variante polipeptídica se purifica como una variante polipeptídica de una sola cadena. La variante polipeptídica de una sola cadena se active mediante o bien el uso de una enzima inmovilizada (por ejemplo, factores Ila, IXa, Xa y Xlla) o mediante autoactivación usando una matriz de intercambio iónico cargada positivamente o similares. 25

Es ventajoso primero purificar la variante polipeptídica en su forma de una sola cadena, después PEGilar (si se desea) y por último activar por uno de los procedimientos descritos anteriormente o por autoactivación como se describe por Pedersen et al, 1989, Biochemistry 28: 9331 - 36. La ventaja de llevar a cabo la PEGilación antes de la activación es que la PEGilación del nuevo amino terminal formado por escisión de R152 - I153 se evita. PEGilación de este nuevo amino terminal hará la molécula inactiva ya que la formación de un enlace hidrógeno entre D242 y el amino terminal de 30 I153 es necesario para actividad.

Composición farmacéutica de la invención y su uso

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición, en particular a una composición farmacéutica, que comprende una variante polipeptídica de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 35

La variante polipeptídica o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede usar como un medicamento.

Debido a las propiedades mejoradas mencionadas en el presente documento anteriormente, las variantes polipeptídicas de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, son en particular útiles para el tratamiento de episodios de hemorragia no controlables en pacientes con trauma, pacientes trombocitopénicos, pacientes en 40 tratamiento anticoagulante, y pacientes de cirrosis con hemorragias varicosas, u otras hemorragias gastrointestinales de la parte superior, y en pacientes sometidos a transplante de hígado ortotópico, o resección de hígado (que permite la cirugía sin transfusión).

Trauma se define como una lesión al tejido vivo provocada por un agente extrínseco. Es la causa que provoca la muerte en los Estados Unidos y tiene una gran carga financiera en la economía. 45

Trauma se clasifica o bien no penetrante o penetrante. El trauma no penetrante se produce como una compresión interna, daño de órgano y hemorragia interna mientras que el trauma penetrante (como consecuencia de un agente que penetra el cuerpo y que destruye tejido, vasos y órganos) da como resultado hemorragia externa.

La hemorragia, como resultado de trauma, puede desencadenar una cascada de problemas. Por ejemplo mecanismos de compensación fisiológica se inician con vasoconstricción periférica y mesentérica inicial para derivar la 50 sangre a la circulación central. Si la circulación no se reestablece, se producirá choque hipervolémico (fallo multiorgánico debido a una perfusión inadecuada). En el momento que los tejidos de todo el cuerpo se llegan a privar de oxígeno, el metabolismo anaerobio comienza. Sin embargo, el ácido láctico concomitante conduce a que el pH de la sangre se reduzca y se desarrolle acidosis metabólica. Si la acidosis es grave y no se corrige, el paciente puede desarrollar fallo multisistémico y la muerte. 55

Aunque la mayoría de los pacientes con trauma tienen hipotermia al llegar a las salas de emergencias debido a las condiciones ambientales en la escena, la protección inadecuada, administración de fluido intravenoso y pérdida de

sangre progresiva empeora el estado hipodérmico. Las deficiencias en los factores de coagulación se pueden producir por pérdida de sangre o transfusiones. Mientras tanto, la acidosis e hipotermia interfieren con los mecanismos de coagulación de sangre. De este modo se desarrolla la coagulopatía, que a su vez, puede enmascararlos sitios de hemorragia quirúrgicos e impedir el control de la hemorragia mecánica. Hipotermia, coagulopatía y acidosis se caracterizan a menudo como la "triada de trauma de la muerte" 5

Trauma se puede provocar mediante varios episodios. Por ejemplo, los accidentes de tráfico de carretera que dan como resultado muchos tipos diferentes de trauma. Mientras que algunos accidentes de tráfico de carretera probablemente dan como resultado trauma penetrante, muchos accidentes de tráfico de carretera es probable que causen trauma no penetrante a tanto la cabeza como el cuerpo. Sin embargo, estos diversos tipos de trauma pueden dar como resultado coagulopatía en el paciente. Los accidentes de tráfico de carretera son la causa principal de muerte 10 accidental en los Estados Unidos. Existen por encima de 42.000 muertes por ellos en los Estados Unidos cada año. Muchos pacientes de trauma mueren en el lugar del accidente o bien mientras se están tratando por los paramédicos, antes de que llegue el FR o en tránsito.

Otro ejemplo incluye heridas por disparo de arma. Las heridas por disparo de arma son traumas que dan como resultado hemorragia masiva. Son penetrantes y destruyen tejidos ya que la bala pasa a través del cuerpo, tanto si es en 15 el torso como en un miembro. En los Estados Unidos aproximadamente 40.000 personas al año mueren de heridas por disparo de arma.

Un ejemplo adicional incluye caídas. Las caías dan como resultado un perfil similar de tipo de trauma a los accidentes de tráfico de carretera. Mediante la caída sobre un objeto sólido o el suelo desde una altura puede provocar tanto trauma penetrante como no penetrante desacelerante. En los Estados Unidos, las caídas son una causa común de 20 muerte accidental, en número de aproximadamente 13,000.

Todavía un ejemplo adicional incluye accidentes de maquinaria. Un número más pequeño de personas mueren en los Estados Unidos por accidente de maquinaria relacionados con muerte, tanto por golpes, o atrapados por maquinaria. Los números son pequeños pero significativos alrededor de 2.000.

Todavía un ejemplo adicional incluye heridas por puñalada. Las heridas por puñalada son lesiones penetrantes 25 que pueden también provocar hemorragia masiva. Los órganos más probable que estén dañados por una herida de puñalada son el hígado, intestino delgado y el colon.

Cirrosis del hígado es la secuela terminal de lesión repetida prolongada al parénquima hepático. El resultado final es la formación de amplias bandas de tejido fibroso que separa los nódulos regenerativos que no mantienen la organización normal de los lóbulos hepáticos y de este modo provocan la función hepática deteriorada. Los pacientes 30 tienen tiempos de protrombina prolongados como resultado de la supresión de los factores de coagulación dependiente de la vitamina K. Patogenéticamente, la cirrosis hepática se debe relacionar con la ruta final común de lesión hepática crónica, que se puede producir a partir de cualquier forma de lesión de células hepáticas prolongada repetida intensa. La cirrosis hepática puede estar provocada por lesión hepática directa, incluyendo alcoholismo crónico, hepatitis viral crónica (tipos B, C, y D), y hepatitis auto inmune así como mediante lesión indirecta por medio de daño del conducto 35 biliar, incluyendo cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y atresia biliar. Las causas menos comunes de cirrosis incluyen lesión hepática directa de enfermedad heredada tal como fibrosis quística, deficiencia de alfa-1-antitripsina, hemocromatosis, enfermedad de Wilson, galactosemia, y enfermedad de almacenamiento de glicógeno.

Transplante principalmente se reserva para pacientes cirróticos en fase tardía, donde es clave la intervención para tratar la enfermedad. Para se elegible para transplante, un paciente se debe clasificar como B o C de niños, así 40 como reunir criterios adicionales para selección. El año último, en los Estados Unidos solo, se realizaron 4.954 transplantes.

Se ha estimado que existen 6.000 casos de hemorragias asociados a pacientes sometidos a resección cada año. Esto se correlaciona con la posición reservada de este procedimiento aunque parece ligeramente alto en comparición con el número de transplantes. 45

Los datos exactos de la incidencia de hemorragia varicosa es difícil de obtener. Los hechos clave conocidos son en el momento de la diagnosis, varices están presentes en aproximadamente el 60% de pacientes descompensados y 30% de compensados y que aproximadamente 30% de estos pacientes con varices experimentarán una hemorragia y cada episodio de hemorragia varicosa está asociada al 30% de riesgo de mortalidad.

De este modo, en un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una variante polipeptídica de la 50 invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastorno en el que es deseable la formación de coágulo. Todavía un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno en el que es deseable la formación de coágulo, que comprende la administración a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la variante polipeptídica o la composición farmacéutica de la invención. 55

Trombocitopenia está provocada por uno de los tres mecanismos que disminuyen la producción de médula ósea, secuestro esplénico aumentado, o destrucción acelerada de plaquetas. Trombocitopenia es un factor de riesgo

para hemorragia, y la transfusión de plaquetas reduce la incidencia de hemorragia. El umbral para la transfusión de plaquetas profiláctica es 10.000 / μl. En los pacientes sin fiebre ni infecciones, un umbral de 5000/ μl puede ser suficiente para prevenir hemorragia espontánea. Para los procedimientos invasivos, 50.000/ μl de plaquetas es el nivel diana usual. En los pacientes que desarrollan anticuerpos para las plaquetas después de transfusiones repetidas, la hemorragia puede ser extremadamente difícil de controlar. 5

Los ejemplos de enfermedades/trastornos en los que se desea la formación aumentada de coágulo incluyen, pero no se limitan a, hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, como un paciente con hemorragias no controladas graves, tal como trauma. Los ejemplos adicionales incluyen pacientes sometidos a transplante en vivo, pacientes sometidos a resección y pacientes con hemorragias varicosas.

Las variantes polipeptídicas de la invención se administran a pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz, 10 normalmente una aproximadamente paralelamente en paralelo con la empleada en la terapia con rFVl1 tal como NovoSeven®, o a una dosificación menor. Por “dosis terapéuticamente eficaz" en el presente documento significa una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados en relación con la condición para la que se administra. La dosis exacta dependerá de las circunstancias, y serán determinados por los expertos en la técnica usando técnicas conocidas. Normalmente, la dosis debe ser capaz de evitar o reducir la gravedad o dispersión de la afección o síntoma 15 que se está tratando. Será evidente para los expertos en la técnica que una cantidad eficaz de una variante polipeptídica o composición de la invención depende, inter alia, de la enfermedad, la dosis, el programa de administración, tanto la variante polipeptídica como la composición se administra sola o junto con otros agentes terapéuticos, la semivida en plasma de las composiciones, y la salud general del paciente. Preferiblemente, la variante polipeptídica o composición de la invención se administra en una dosis eficaz, en particular una dosis que es suficiente para normalizar el trastorno 20 de coagulación.

La variante polipeptídica de la invención preferiblemente se administra en una composición que incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo o excipiente que no provoca ningún efecto adverso en los pacientes a los que se administra. Tales vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical 25 Sciences, 18ª edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).

La variante polipeptídica de la invención se puede formular en composiciones farmacéuticas mediante procedimientos bien conocidos. Las formulaciones adecuadas se describen por Remington's Pharmaceutical Sciences 30 por E.W. Martin (Mark Publ, Co., 16ª Ed., 1980).

La variante polipeptídica de la invención se puede usar "como es" y / o en su forma de sal. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tal como sodio, potasio, calcio y magnesio, así como por ejemplo, sales de zinc. Estas sales o complejos pueden estar presentes en forma de una estructura cristalina y / o amorfa. 35

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o juntos con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la misma composición farmacéutica o se puede administrar de manera separada a partir de la variante polipeptídica de la invención, o bien simultáneamente o de acuerdo con otro programa de tratamiento. Además, la variante polipeptídica o composición farmacéutica de la invención se puede usar como un adyuvante a otras terapias. 40

Un "paciente" para los propósitos de la presente invención incluye tantos seres humanos como otros mamíferos. De este modo, los procedimientos son aplicables para tanto terapia humana como aplicaciones de veterinaria. La composición farmacéutica que comprende la variante polipeptídica de la invención se puede formular en una diversidad de formas, por ejemplo, en forma de un líquido, gel, liofilizado, o en forma de un sólido comprimido. La forma preferida dependerá del síntoma particular que se está tratando y será evidente para los expertos en la técnica. 45

En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante polipeptídica de la invención se puede formular en una forma soluble liofilizada o estable. La variante polipeptídica se puede liofilizar mediante una diveridad de procedimientos conocidos en la técnica. La variante polipeptídica puede estar en una forma soluble estable mediante la eliminación o protección de sitios de degradación proteolítica como se describe en el presente documento. La ventajan de obtener una preparación soluble estable supone la manipulación más fácil para el paciente y, en el caso de 50 emergencias, acción más rápida, que potencialmente puede llegar a salvar vidas. La forma preferida dependerá del síntoma particular que se está tratando y será evidente para los expertos en la técnica.

La administración de las formulaciones de la presente invención se pueden realizar de una diversidad de formas, que incluyen, pero no se limitan a, por vía oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular, o de cualquier otra manera 55 aceptable. Las formulaciones se pueden administrar de manera continua mediante infusión, aunque es aceptable inyección de bolo, usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como bombas o implante. En algunos casos las formulaciones se pueden aplicar directamente como una solución o pulverización.

Parentales

Un ejemplo preferido de una composición farmacéutica es una solución diseñada para administración parenteral. Aunque en muchos casos las formulaciones de solución farmacéutica se proporcionan en forma líquida, apropiada para uso inmediato, tales formulaciones parenterales también se pueden proporcionar en forma congelada o liofilizada. En el caso anterior, la composición se debe descongelar antes de uso. La última forma a menudo se usa para 5 potenciar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición bajo una diversidad más amplia de condiciones de almacenamiento, como se reconoce por los expertos en la técnica las preparaciones liofilizadas son en general más estables que sus parejas líquidas. Tales preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de usar por la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina estéril fisiológica. 10

En el caso de parenterales, se preparan para almacenamiento en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante mezcla, según sea apropiado, la variante polipeptídica que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables típicamente empleados en la técnica (todos los cuales se denominan "excipientes"), por ejemplo agentes de tamponación, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, tensioactivos o detergentes no no iónicos, antioxidantes y / u otros aditivos misceláneos. 15

Los agentes de tamponación ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a condiciones fisiológicas. Típicamente están presentes a una concentración que varía entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 50 mM. Los agentes de tamponación adecuados para uso en la presente invención incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sus sales tales como tampones citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico - citrato monosódico, etc.), tampones 20 succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico - succinato monosódico, mezcla de ácido succínico - hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico - succinato disódico etc.), tampones tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico - tartrato disódico, mezcla de ácido tartárico - tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico - hidróxido sódico, etc.), tapones fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico - fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico - fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico - fumarato disódico, etc.), tampones gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido 25 glucónico - gliconato sódico, mezcla de ácido glucónico – hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico - gliconato potásico, etc.), tampón oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico - oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico - hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico - oxalato potásico, etc.), tampones lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico - lactato sódico, mezcla de ácido láctico - hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico - lactato potásico, etc.) y tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético - acetato de sodio, mezcla de ácido acético - hidróxido sódico, 30 etc.). Las posibilidades adicionales son tampones fosfato, tampones histidina y sales de trimetilamina tal como Tris.

Estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes, que pueden variar en función de un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihidroxílicos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-Ieucina, 2-35 fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tal como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tal como inositol; polietilen glicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, α-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 restos); proteínas tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina o inmunoglobulinas; 40 polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; monosacáridos tales como xilosa, manosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tal como rafinosa, y polisacáridos tal como dextrano. Los estabilizantes están típicamente presentes en el intervalo de entre 0,1 y 10.000 partes en peso basándose en el peso de proteína.

Los conservantes de añaden para retrasar el crecimiento microbiano, y típicamente se añaden en cantidades 45 de aproximadamente 0,2% - 1% (p/v). Los conservantes adecuados con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio), cloruro de hexametonio, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Los isotonificadores se añaden para asegurar isotonicidad de composiciones líquidas e incluyen alcoholes de 50 azúcar polihidroxílicos, preferiblemente alcoholes de azúcar trihidroxílicos o alcoholes de azúcar superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihidroxílicos pueden estar presentes en una cantidad entre 0,1% y 25% en peso, típicamente 1% a 5%, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes.

Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como “agentes humectante”) pueden estar presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como para proteger el polipéptido terapéutico contra a 55 agregación inducida por agitación que también permite que la formulación se exponga a tensión superficial de cizalla sin provocar desnaturalización del polipéptido. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188 etc.), polioles Pluronic®, monoéteres de polioxietilen sorbitán (Tween®-20, Tween®-80, etc.).

Los excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes de carga o cargas (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y codisolventes.

El ingrediente activo también puede estar atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcellulosa, gelatina o poli-(metilmetacilato), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, 5 microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones parenteral a usar para administración in vivo debe ser estéril. Esto se lleva a cabo fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

Preparaciones de liberación sostenida 10

Los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la variante polipeptídica, las matrices que tienen una forma adecuada tal como una película o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-methacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como la tecnología de 15 ProLease® o Lupron Depot® (microesperas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-( -)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante largos períodos tal como hasta por encima de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos de tiempo. Cuando los polipéptidos encapsulados permaneces en el cuerpo durante un largo período de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como 20 resultado de exposición a humedad a 37°C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Se pueden proyectar estrategias racionales para estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlace intermolecular S-S a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr mediante modificación de restos sulfidrilo, liofilización de soluciones ácidas, control del contenido de huemdad, usando aditivos apropiadas, y desarrollo de 25 composiciones de matriz polímeros específicos.

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Área Superficial Accesible (ASA)

El programa de ordenador Access (B. Lee y F.M.Richards, J. Mol.Biol. 55: 379 - 400 (1971)) versión 2 (© 1983 30 Universidad de Yale) se usa para calcular el área superficial accesible (ASA) de los átomos individuales en la estructura. Este procedimiento típicamente usa un tamaño de sonda de 1,4Å y define el Área Superficial Accesible (ASA) como el área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno se deben eliminar del conjunto de coordenadas, así como se deben eliminar otros átomos no relacionados directamente con la proteína. 35

ASA fraccionaria de cadena lateral

El ASA fraccionaria de los átomos de la cadena lateral se calcula mediante división de la suma del ASA de los átomos de la cadena lateral con un valor que representa el ASA de los átomos de cadena lateral de ese tipo de resto en un tripéptido Ala-x-Ala extendido (Véase Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J.MoI.BioI.220, 507 - 530). Para este ejemplo el átomo de CA se considera como una parte de la cadena lateral de restos de pero no para los restos 40 remanentes. La siguiente tabla se usa como un 100% de ASA para la cadena lateral:

Ala

69,23 Å2 Leu 140,76 Å2

Arg

200,35 Å2 Lys 162,50 Å2

Asn

106,25 Å2 Met 156,08 Å2

Asp

102,06 Å2 Phe 163,90 Å2

Cys

96,69 Å2 Pro 119,65 Å2

Gln

140,58 Å2 Ser 78,16 Å2

Glu

134,61 Å2 Thr 101,67 Å2

Gly

32,28 Å2 Trp 210,89 Å2

His

147,00 Å2 Tyr 176,61 Å2

lIe

137,91 Å2 Val 114,14 Å2

Los restos no detectados en la estructura se definen por tener 100% de exposición ya que se cree que residen en regiones flexibles. Los ácidos gamma-carboxi glutámicos en las posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 se definen todos por estar 100% expuestos.

Determinación de las distancias entre átomos

La distancia entre átomos es muy fácil de determinar usando software de gráficos moleculares por ejemplo, 5 Insightll® v. 98.0, MSI INC.

Región del sitio activo

La región del sitio activo se define como cualesquiera restos que tienen al menos un átomo dentro de 10 Å de cualquier átomo en la triada catalítica (restos H193, D242, S344).

Determinación del Sitio de Unión del Factor 10

El sitio de unión de TF se define por comprender todos los restos que tiene su área superficial accesible cambiada sobre la unión de TF. Esto se determina por al menos dos cálculos de ASA; uno sobre el (los9 ligando (s) aislado (s) en el complejo ligando (s)/receptor (es) y uno en el complejo ligando (s)/receptor (es).

Medición de sensibilidad reducida a Degradación Proteolítica

La degradación proteolítica se puede medir usando el ensayo descrito en el documento US 5.580.560, Ejemplo 15 5, donde la proteolisis es autoproteolisis.

Además, la proteolisis reducida se puede ensayar en un modelo in vivo que usa muestras radiomarcadas y comparando la proteolisis de rhFVlla y la variante polipeptídica de la invención mediante retirada de muestras de sangre y someter éstas a SDS-PAGE y autorradiografía.

Independientemente del ensayo usado para determinar la degradación proteolítica, " degradación proteolítica 20 reducida" pretende significar una reducción que se puede medir en la escisión comparada con la obtenida por rhFVlla como se mide por barrido en gel de geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie, HPLC o como se mide por actividad catalítica conservada en comparación con el tipo salvaje usando el ensayo de actividad independiente del factor tisular descrito más adelante.

Determinación del Peso molecular de Variantes polipeptídicas 25

El peso molecular de las variantes polipeptídicas se determina o bien mediante SDS- PAGE, filtración en gel, Transferencia de Western, espectrometría de masas de desorción por láser de matriz asistida o centrifugación de equilibrio, por ejemplo, SDS-PAGE de acuerdo con Laemmli, Reino Unido, Nature Vol 227 (1970), p. 680 - 85.

Ensayo de activación del Factor X independiente de TF

30

Este ensayo se ha descrito en detalle en la página 39826 en Nelsestuen et al., J Biol Chem, 2001; 276: 39825 - 39831 .

En resumen, la molécula a ensayar (o bien hFVlla, rhFVlla o la variante polipeptídica de la invención en su forma activada) se mezcla con una fuente de fosfolípido (fosfatidilcolina y fosfatidilserina en una relación de 8:2 o fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanol en una relación de 4:2:4) y Factor X en BSA que contiene tampón Tris. 35 Después de un tiempo de incubación específico la reacción se para mediante la adición de un exceso de EDTA. La concentración del factor Xa después se mide a partir del cambio de absorbancia a 405 nm después de la adición de un sustrato cromogénico (S-2222, Chromogenix). Después de la corrección del fondo de la actividad independiente del factor tisular de rhFVlla (awt) se determina como el cambio de absorbancia después de 10 minutos y la actividad independiente del factor tisular de la variante polipeptídica de la invención (avariante) también se determina como el 40 cambio de absorbancia después de 10 minutos. La relación entre la actividad de la variante polipeptídica, en su forma activada, y la actividad rhFVlla se define como avariante/awt.

Ensayo de coagulación

Actividad de coagulación se mide en esayos de una etapa y tiempos de coagulación se registran en un coagulómetro Trombotrack IV (MEDINOR). Plasma humano agotado de FVII (American Diagnostica) se reconstituye y 45 se equilibra a temperatura ambiente durante 15 - 20 minutos. 50 μl de plasma se transfiere después a las copas de coagulómetro.

hFVlla, rhFVlla o variantes se diluyen en Tampón Glioxalina (5,7 mM de barbiturato, 4,3 mM de citrato de sodio, 117 mM de NaCI, 1 mg/ml de BSA, pH 7,35). Las muestras se añaden a la copa en 50 μl y se incubaron a 37°C durante 2 minutos. 50

Tromboplastina (MEDINOR) se reconstituye con agua y se añade CaCI2. La reacción se inicia mediante la adición de 0,1 ml de tromboplastina que contienen 4,5 mM de CaCI2.

Los datos se analizan usando el software PRISM.

Ensayo de coagulación independiente de TF

Este ensayo se realiza como se ha descrito anteriormente anteriormente "Ensayo de coagulación" pero sin adición de tromboplastina.

Ensayo amidolítico 5

La capacidad de las variantes de escindir sustratos de péptidos pequeños se puede medir usando el sustrato cromogénico S-2288 (D-lIe-Pro-Arg-p-nitroanilida). La actividad amidolítica se puede medir tanto en la presencia y ausencia de antitrombina III (ATIII).

HFVlla, rhFVlla o variante se diluye hasta 90 nM en tampón de ensayo (50 mM de Na- Hepes pH 7,5, 150 mM de NaCI, 5 mM de CaCI2, 0,1% de BSA, 1U/ml de Heparina). Además, TF soluble (TFs) se diluye hasta 450 nM en 10 tampón de ensayo. ATIII se diluye hasta 900 nM en tampón de ensayo. 120 μl de tampón de ensayo se mezcla con 20 μl de la muestra FVlla, 20 μl de sTF y 20 μl de ATIII o tampón de ensayo. Las concentraciones finales de FVlla, sTF y ATIII con 10, 50 y 100 nM, respectivamente. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente con agitación suave, seguido de10 min min de incubación a 37ºC, la reacción comienza mediante la adición del sustrato S-2288 a1 mM y se determina la absorción a 405 nm en varios momentos. 15

Ensayo de Trombograma

El efecto de hFVlla, rhFVlla or variante sobre la regeneración de trombina en plasma humano se ensaya una versión modificada del ensayo descrito en la página 589 en Hemker et al. en Tromb Haemost 2000; 83: 589 - 91. En resumen, la molécula a ensayar (o bien hFVlla, rhFVlla o variante) se mezcla con plasma rico en plaquetas (PRP) normal, plasma pobre en plaquetas (PPP) normal o PPP agotado en FVII con o sin la adición de factor tisular 20 recombinante (rTF) humano, rTF relipidado u otra fuente de TF (tal como tromboplastina). Se puede añadir una fuente de fosfolípido (fosfatidilcolina y fosfatidilserina en una relación de 8:2 o fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanol en una relación de 4:2:4).

La reacción comienza mediante la adición de un sustrato de trombina fluorogénico y cloruro de calcio. La fluorescencia se mide continuamente y se calcula la actividad amidolítica de trombina se calcula calculando la 25 pendiente de la curva de fluorescencia (el incremento en fluorescencia con el tiempo). De esta forma el tiempo hasta que se obtiene la máxima actividad amidolítica de trombina (Tmax) y trabajo total de trombina (Área Bajo la Curva (AUC)) se puede calcular.

Se usa el siguiente procedimiento: PRP se obtiene centrifugando sangre extraída reciente a 250 g, 15°C durante 10 min. La coagulación de sangre se inhibe o bien mediante el uso de citrato (13 mM de citrato de sodio), 30 inhibidor de tripsina de maíz (50 - 100 μg/ml de sangre) o una combinación de citrato e inhibidor de tripsina de maíz. El recuento de plaquetas se ajusta hasta 3 x 108/ml usando tampón o plasma pobre en plasma (PPP) autólogo. PPP se obtiene mediante doble centrifugación de PRP a 1000 g, 15°C durante 10 min. El agotamiento de FVII se realiza incubando PPP con un anticuerpo monoclonal específico de FVII acoplado a una fase sólida.

Por pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos se añaden 80 μl de PRP y 20 μl de tampón que 35 contenía rhFV11 o variante a ensayar en concentraciones finales entre 0,1 y 100 nM. Se añade rTF en 5 μl de tampón de ensayo hasta una concentración final de 1 pM. El tampón de ensayo consta de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCI y 60 mglml de BSA en agua destilada. La reacción comienza mediante la adición de 20 μl de la solución de sustrato que contiene 0,1 M de cloruro de calcio. La placa de ensayo y reactivos se calientan previamente a 37°C y la reacción tiene lugar a esta temperatura. El fluorómetro usado es el fluorómetro BMG con un filtro de excitación a 390 nm y un filtro de 40 emisión a 460 nm. La fluorescencia se mide en cada pocillo de las placas de fondo transparente de 96 pocillos a intervalos de 20 - 40 segundos durante 30 - 180 minutos. Los datos se analizan usando el Software PRISM.

Ensayo ELlSA

Se determinan las concentraciones de FVII/FVlla (o variante) mediante ELlSA. Los pocillos de una placa de microvaloración se recubren con un anticuerpo dirigido contra el dominio de proteasa usando una solución de 2 μg/ml en 45 PBS (100 μl por pocillo). Después de 2 horas de revestimiento a T. A, los pocillos se lavan 4 veces con tampón THT (100 mM de NaCI, 50 mM de Tris-HCI pH 7,2 0,05% de Tween-20). Posteriormente, se añaden 200 μl de 1% de Caseína (diluida de reserva al 2.5% usando 100 mM de NaCI, 50 mM de Tris-HCI pH 7,2) por pocillo para bloquear. Después de 1 hr de incubación a T. A., los pocillos se vacían, y se añaden 100 μl de muestra (opcionalmente diluida en tampón de dilución (THT + 0,1 % de Caseína)). Después de otra incubación de 1 hr a temperatura ambiente, los pocillos 50 se lavan 4 times con tampón THT, y se añaden 100 μl de un anticuerpo marcado con biotina dirigido contra el dominio de tipo EGF (1 μg/ml). Después de otra 1 hr de incubación a T. A., seguido de 4 lavados más con tampón THT, se añaden 100 μl de estreptavidina - peroxidasa de rábano picante (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, diluida 1/10000). Después de otra 1 hr de incubación a T. A., seguido de 4 lavados más con tampón THT, se añaden 100 μl de TMB (3,3', 5,5' - tetrametilbencidina, Kem-en-Tech A/S, Dinamarca). Después de 30 min de incubación a T. A., en la oscuridad, se 55 añaden 100 μl de 1 M H2SO4 y se determina la DO450nm. Se prepara una curva estándar usando rhFVlla (NovoSeven®).

De manera alternativa, FVII/FVlla o variantes se pueden cuantificar mediante el dominio Gla mejor que mediante el dominio de proteasa. En esta puesta en marcha de ELlSA, los pocillos se recubren durante toda una noche con un anticuerpo dirigido contra el dominio de tipo EGF y para detección, se usa un anticuerpo del dominio monoclonal anti-Gla marcado con biotina dependiente de calcio (2 μg/ml, 100 μl por pocillo). En la puesta en marcha, 5 mM de CaCI2 se añade al THT y tampones de dilución. 5

Ensayo de sangre entera

El ensayo de coagulación de sangre entera se realiza como se describe por Elg et al. Trombosis Res. 2001, 101(3):159-170.

Ensayo de Coagulación reconstituido

El ensayo de coagulación reconstituido se realiza como se describe por Van't Veer et al. Blood 2000, 95(4), 10 1330 - 1335.

EJEMPLOS

Ejemplo1

La estructura de rayos X de hFVlla en complejo con el factor tisular soluble por Banner et.al., J Mol Biol, 1996; 285: 2089 se usa para este ejemplo. Se observa que la numeración de los restos en la referencia no sigue la secuencia. 15 En este documento los inventores usaron la numeración secuencial de acuerdo con la SEQ ID NO:2. Los ácidos gamma-carboxi glutámicos en las posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 se denominan en este documento GLU (abreviatura de tres letras) o E (abreviatura de una letra). Restos 143 - 152 no están presentes en la estructura.

Exposición superficial

La realización de los cálculos de ASA fraccionaria en los fragmentos FVII solos combinados con la definición 20 de accesibilidades de restos convencionales y / o desaparecidos descritos en los procedimientos dio como resultado los siguientes restos que tiene más de un 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1, N2, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35, R36, K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, 25 H105, T106, G107, T108, K109, S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131, E132, I140, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158, P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, I186, H193, K197, K199, N200, R202, N203, I205, S214, E215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251, V253, T255, D256, E265, R266, T267, E270, R271, F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, 30 R290, G291, A292, T293, L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321, N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353, G354, Q366, G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404 Y P406 (A1-S45 se localizan en el dominio Gla, las posiciones restantes se localizan fuera del dominio Gla).

Los siguientes restos tenían más de 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie: 35

A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107, T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131, E132, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249, 40 Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, N301, M306, 0308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341, G354, G367, V371, E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 y P406 (A1-843 se localizan en el dominio Gla, las posiciones restantes se localizan fuera del dominio Gla) ..

Sitio de unión al Factor tisular 45

La realización de los cálculos de ASA los siguientes restos en el cambio de FVII su ASA en el complejo. Estos restos se definieron como constituyentes del sitio de unión al receptor: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 y R379.

Región del sitio activo 50

La región del sitio activo se define como cualquier resto que tiene al menos un átomo con una distancia de 10 Å de cualquier átomo en la triada catalítica (restos H193, D242, S344): I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339,C340, K341, G342, D343, 55

S344,G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, 0382, Y383, W386, L387, L400 y F405.

La cresta de la grieta de unión al sitio activo

La región de la cresta de la grieta de unión al sitio se definió por inspección visual de la estructura de FVlla 1FAK.pdb como: N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 y T370. 5

Ejemplo 2

Diseñó de un módulo de expresión en la expresión de rhFVII en las células de mamífero

La secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 1, que abarca la forma corta del ADNc de longitud completa que codifica hFVl1 con su péptido de señal corto nativo (Hagen et al., 1986. PNAS 83: 2412), se sintetizó con el fin de facilitar alta expresión en células de mamífero. Primero el contexto de codón de inicio ATG se modificó de acuerdo con 10 la secuencia de consenso de Kozak (Kozak, M. J Mol Biol 20 de agosto de 1987;196 (4): 947 - 50), de manera que existe una coincidencia perfecta con la secuencia de consenso cadena arriba del codón de inicio ATG. En Segundo lugar el marco abierto de lectura del ADNc nativo se preparó haciendo una desviación en el uso de codón hacia los codones usados frecuentemente en genes usados altamente expresados. Además, dos codones de parada de traducción se insertaron en el extreme del marco abierto de lectura con el fin de facilitar la parada de traducción eficaz. 15 El gen de hFVl1 completamente sintético y de expresión optimizada se ensambló de oligonucleótidos de ADN de 70 meros y finalmente se amplificó finalmente usando cebadores en el extremo insertando los sitios BamHI y Hindlll en los extremos 5' y 3' respectivamente técnicas de PCR convencionales, que dio como resultado la siguiente secuencia:

Un vector para la clonación del producto de PCR generado que abarca el módulo de expresión para hFVl1 se 20 preparó mediante clonación del intrón de pCINeo (Promega). El intrón sintético de pCI-Neo se amplificó usando condiciones de PCR convencionales y los cebadores:

CBProFpr174: 5'- AGCTGGCTAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCA -3' y

CBProFpr175: 5'- TGGCGGGATCCTIAAGAGCTGTAATIGAACT -3'

que da como resultado un fragmento de PCR de 332 pares de bases. El fragmento se cortó con Nhel y BamHI antes de 25 clonar en pCDNA3.1/HygR (obtenido de Invitrogen) que da como resultado PF nº 34.

El modulo de expresión para hFVl1 se clonó entre los sitios BamHI y Hindlll de PF nº 34, dando como resultado el plásmido PF nº 226.

Ejemplo 3

Expresión de variantes polipeptídicas en células CHO K1 30

La línea celular CHO K1 (ATCC nº CCl-61) se siembra a 50% de confluencia en matraces T-25 usando MEMa, 10% de FCS (Gibco/BRl nº de catálogo 10091), PIS y 5 μg/ml de filoquinona y se dejó crecer hasta confluencia. La capa monocelular confluente se transfecta con 5 μg del plásmido relevante descrito anteriormente que usa el agente de transfección de Lipofectamine 2000 (Life technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección se sacó una muestra y se cuantificó usando por ejemplo, un ELlSA que reconoce el 35 dominio EGF1 de hFVl1. En este momento la selección relevante (por ejemplo, Higromicina B) se puede aplicar a las células con el propósito de generar una combinación de transfectantes estables. Cuando se usan células CHO K1 y el gen de resistancia a Higromicina B como un marcador seleccionable en el plásmido, esto se logra usualmente en una semana.

Ejemplo 4

Generación de células CHO K1 que expresan establemente las variantes polipeptídicas.

Un vial de combinación de transfectante CHO-K1 se descongela y las células se siembran en un matraz de de tejido de 175 cm2 que contiene 25 ml de MEMα, 10% de FCS, filoquinona (5 μg/ml), 100 U/I penicilina, 100 μg/l de estreptomicina y se desarrolla durante 24 horas. Las células se recogen, se diluyen y se siembran en placas de 5 microvaloración de 96 pocillos a una densidad de células de ½ - 1 célula/pocillo. Después de una semana de crecimiento, colonias de 20 -100 células están presentes en los pocillos y los pocillos que contienen solamente una colonia se marcaron. Después de dos semanas adicionales, el medio en todos los pocillos que contienen solamente una colonia se sustituye con 200 μl de medio reciente. Después de 24 horas, se retira una muestra de medio y se analiza mediante por ejemplo, ELlSA. Los clones de alta producción se seleccionan y se usan para producir FVII o variante a 10 gran escala.

Ejemplo 5

Purificación de variantes polipeptídicas y posterior activación

Las variantes de FVII y FVII se purifican como sigue: el procedimiento se realiza a 4°C. El medio de cultivo recogido de la producción a gran escala se ultrafiltró usando un sistema Millipore TFF con membranas Pellicon de 15 corte de 30 KDa. Después de la concentración del medio, se añade citrato a 5 mM y el pH se ajusta hasta 8,6. Si es necesario, la conductividad se reduce lasta debajo de 10 mS/cm. Posteriormente, la muestra se aplica a una columna FF de Q- sefarosa, equilibrado con 50 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8,6. Después de lavar la columna con 100 mM NaCI, 10 mM Tris pH 8.6, seguido de 150 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8,6, FVII se eluye usando 10 mM de Tris, 25 mM de NaCI, 35 mM de CaCI2, pH 8,6. 20

Para la segunda etapa cromatográfica, se prepara una columna de afinidad se prepara mediante acoplamiento de un anticuerpo de dominio de antigua dependiente de Ca monoclonal a Sefarosa FF activada por CNBr. Aproximadamente 5,5 mg de de anticuerpo se acopla por ml de resina. La columna se equilibra con 10 mM de Tris, 100 mM de NaCI, 35 mM de CaCI2, pH 7,5. Se añade NaCI a la muestra a una concentración de 100 mM de NaCI y el pH se ajusta hasta 7,4 - 7,6. Después de la aplicación de O/N de la muestra, la columna se lava con 100 mM de NaCI, 35 25 mM de CaCI2, 10 mM de Tris pH 7,5, y la proteína de FVII se eluye con 100 mM de NaCI, 50 mM de citrato, 75 mM de Tris pH 7,5.

Para la tercera etapa cromatográfica, la conductividad de la muestra se reduce hasta por debajo de 10 mS/cm, si es necesario, y el pH se ajusta hasta 8,6. La muestra se aplica después a una columna de Q-sefarosa (equilibrada con 50 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8,6) a una densidad alrededor de 3 - 5 mg de proteína por ml de gel para 30 obtener la actividad eficaz. Después de la aplicación, la columna se lava con 50 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8,6 durante aproximadamente 4 horas con un flujo de 3 - 4 volúmenes de columna (cv) por hora. La proteína de FVII se eluye usando un gradiente de 0 - 100% de 500 mM de NaCI, 10 mM de Tris pH 8,6 sobre 40 cv. Las fracciones que contienen FVII se combinan.

Para la etapa final cromatográfica, la conductividad se reduce hasta por debajo de 10 mS/cm. Posteriormente, 35 la muestra se aplica a una columna de Q-sefarosa (se equilibra con 140 mM de NaCI, 10 mM de glicilglicina pH 8,6) a una concentración de 3 - 5 mg de proteína por ml de gel. Después la columna se lava con 140 mM de NaCI, 10 mM de glicilglicina pH 8,6 y FVII se eluye con 140 mM de NaCI, 15 mM de CaCI2, 10 mM de glicilglicina pH 8,6. El eluato se diluye hasta 10 mM de CaCI2 y el pH se ajusta 6,8 – 7,2. Finalmente, se añade Tween-80 a 0,01 % y el pH se ajusta hasta 5,5 para almacenamiento a -80°C. 40

LISTADO DE SECUENCIAS

45 <110> Maxygen ApS; Maxygen Holdings

<120> Variantes polipeptídicas de Factor VII o VlIa

<130> 0259w02100 45

<140>

<141>

<160> 4

50

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220> 5

<221> CDS

<222> (115)..(1335)

<400> 1

<210> 2

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial Secuencia 5

<220>

5 <223> Descripción de la secuencia artificial: Primer CBProFpr174

<400> 3

agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a 31

10

<210> 4

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial Secuencia

15 <220> 15

<223> Descripción de la secuencia artificial: Primer CBProFpr175

<400> 4

tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t 31

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una variante polipeptídica del Factor VlI (FVII) o Factor Vlla (FVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3 - 15 modificaciones de aminoácidos con relación al Factor VII humano (hFVII) o Factor Vlla humano (hFVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, en la que la secuencia de aminoácidos de la variante comprende sustituciones de aminoácido en las posiciones 10 y 32 en la SEQ ID NO:2 y en la que un resto 5 de azúcar está unido de manera covalente a al menos un sitio introducido de N-glicosilación in vivo localizado en el dominio Gla, en el que al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por a sustitución en la SEQ ID NO:2 seleccionada entre el grupo que consiste en A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315A+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N y D334N. 10
2. 2. La variante de la reivindicación 1, en la que la sustitución en la posición 10 es P10Q.
3. 3. La variante de la reivindicación 1 ó 2, en la que la sustitución en la posición 32 es K32E.
4. 4. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos una modificación de aminoácido adicional en el dominio Gla.
5. 5. La variante de la reivindicación 4, en la que la modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución de 15 aminoácido en la posición 33.
6. 6. La variante de la reivindicación 4 ó 5, en la que la modificación adicional en el dominio Gla comprende la inserción de un resto de aminoácido hidrófobo entre la posición 3 y 4.
7. 7. La variante de la reivindicación 6, en la que la inserción es A3AY.
8. 8. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 4 - 7, en la que la modificación adicional en el dominio Gla 20 comprende una sustitución de aminoácido en la posición 34.
9. 9. La variante de la reivindicación 8, en la que un resto de aminoácido cargado negativamente se introduce por sustitución en la posición 34.
10. 10. La variante de la reivindicación 9, en la que la sustitución es A34E.
11. 11. La variante de la reivindicación 10, que comprende las sustituciones P100+K23E+A34E. 25
12. 12. La variante de la reivindicación 10, que comprende las modificaciones A3AY+P100+K32E+A34E.
13. 13. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por una sustitución seleccionada entre el grupo consiste en A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N y D334N
14. 14. La variante de la reivindicación 13, en la que el al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por a 30 sustitución seleccionada entre el grupo consiste en T106N, A175T, I205T, V253N and T267N+S269T.
15. 15. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dos o más sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustitución.
16. 16. La variante de la reivindicación 15, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustituciones seleccionadas entre el grupo consiste en A51N+G58N, A51N+T106N, A51N+K109N, A51N+G124N, 35 A51N+K143N+N145T, A51N+A175T, A51N+I205T,A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+T106N, G58N+K109N, G58N+G124N, G58N+K143N+N 145T, G58N+A175T, G58N+I205T, G58N+V253N, G58N+T267N+S269T, G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N-G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N 145T, T106N+A175T, T106N-I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, 40 T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N-I205T, K109N+V235N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, G124N+A175T, G124+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, 45 K143N+N145T+I205T, K143N+N145T+V253N, K143N+N145T+T267N+S269T, K143N+N145T+S314N+K316T, K143N+NI45T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, A175+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, 50 V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N y G318N+D334N.
17. 17. La variante de la reivindicación 16, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustituciones seleccionadas entre el grupo consiste en T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T y V253N+T267N+S269T.
18. 18. La variante de la reivindicación 17, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustituciones seleccionadas entre el grupo constituido por T106N+I205T, T106N+V253N y I205T+T267N+S269T. 5
19. 19. La variante de la reivindicación 18, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por las sustituciones T106N+V235N.
20. 20. La variante de la reivindicación 15, en la que tres sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustitución.
21. 21. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la variante está en su forma activada.
22. 22. Una secuencia de nucleótidos que codifica una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 10 - 21.
23. 23. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos como se ha definido en reivindicación 22.
24. 24. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos como se ha definido en reivindicación 22 o un vector de expresión como se ha definido en la reivindicación 23, en la que la célula huésped es una célula gamma-carboxilante capaz de glicosilación in vivo. 15
25. 25. Una composición farmacéutica que comprende una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
26. 26. Una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 para uso como un medicamento.
27. 27. Uso de una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento hemorragia no controlada. 20
28. 28. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona entre el grupo consiste en hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, hemorragias no controladas graves, tal como trauma, hemorragias en pacientes que se someten a transplantes en vivo, hemorragias en pacientes que experimentan hemorragias varicosas.
29. 29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la enfermedad o trastorno es trauma. 25
30. 30. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la enfermedad o trastorno es hemorragia cerebral.