CN1665925A - 凝血因子Ⅶ或Ⅶa多肽变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽的新多肽变体，所述变体在第10和第32位包含氨基酸取代，并且所述变体还包含一个糖组分，它与引入到除了Gla结构域之外的位置的体内N－糖基化位点共价连接。所述多肽变体可用于治疗，尤其用于治疗多种与凝血相关的疾病，如创伤。

Description

凝血因子VII或VIIa多肽变体
技术领域
本发明涉及凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽的新多肽变体，所述变体在第10和第32位包含氨基酸取代，并且所述变体还包含一个糖组分，该组分与引入到除了Gla结构域之外的位置的体内N-糖基化位点共价连接。
本发明还涉及所述多肽变体在治疗中的用途，尤其用于治疗多种与凝血相关的疾病。
背景技术
凝血是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块形成的过程。通常，参与被称为“凝血级联反应”的血液组分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，活化剂的作用可使其转变为活性形式。FVII就是这些凝血因子中的一种。
FVII是一种维生素K依赖性血浆蛋白，在肝中合成，并以分子量为53kDa的单链糖蛋白形式分泌到血液中(Broze&Majerus，J.Biol.Chem 1980；255：1242-1247)。FVII酶原在单一位点R152-I153处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为活性形式(FVIIa)。FVIIa与组织因子的复合物(FVIIa复合物)可将凝血因子IX和凝血因子X均转变为其活性形式，接下来的反应导致快速的凝血酶产生以及纤维蛋白形成(Osterud&Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；74：5260-5264)。
FVII经历翻译后修饰，包括依赖维生素K的羧基化，导致在该分子N末端区产生10个γ羧基谷氨酸残基。因此，SEQ ID NO：2中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位残基是Gla结构域中对于FVII活性重要的γ羧基谷氨酸残基。其它翻译后修饰包括在第145和322位的两个天然N-糖基化位点，以及在第52和60位的两个天然O-糖基化位点处分别连接糖组分。
编码人FVII(hFVII)的基因被定位于13号染色体的q34-qter9(deGrouchy等，Hum Genet 1984；66：230-233)。其包含9个外显子，长度为12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；84：5 158-5 162)。FVII的基因组构和蛋白结构与其它维生素K依赖性原凝血蛋白的结构相似，有外显子1a和1b编码信号序列；外显子2编码多肽和Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码表皮生长因子样结构域；以及外显子6到8编码丝氨酸蛋白酶催化结构域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；24：3736-3750)。
已有关于以下分子的实验三维结构的报道：hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；96：8925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)；与可溶性组织因子复合的hFVIIa，其利用了X射线晶体成像方法(Banner等，Nature，1996；380：41和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；285：2089)；以及hFVII的小片段(Muranyi等，Biochemistry，1998；37：10605和Kao等，Biochemistry，1999；38：7097)。
关于FVII的一些蛋白工程化变体已有报道，参见，例如Dickinson&Ruf，J Bio Chem，1997；272：19875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；273：8516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；271：30685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；38：1957-1966；WO 99/20767；WO 00/11416；WO 02/22776；WO 02/38162；WO 01/83725；WO 01/58935；US 5,580,560。
关于FVII在BHK或其它哺乳动物细胞中的表达(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2内切蛋白酶在真核细胞中的共表达(WO00/28065)也已有报道。
人重组FVIIa的商品化制剂以NovoSeven的名称出售。NovoSeven指明用于治疗血友病A或B患者的出血发作。NovoSeven是市售的可治疗出血发作的唯一有效并且可靠的rhFVIIa。
WO91/1154中报道了FVII的一种无活性形式，其中修饰了152位的精氨酸和/或153位的异亮氨酸。这些氨基酸位于活化位点。WO96/12800描述了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂导致的FVIIa的失活；Petersen等说明了FVIIa在I153的α氨基酸基团氨甲酰化导致的失活(Eur J Biochem，1999；261：124-129)。这种失活形式可以与野生型FVII或FVIIa竞争对组织因子的结合以及抑制凝血活性。这提示这种FVIIa的失活形式可用于治疗极易产生凝血的患者，如患脓毒病的患者，其易于发作心肌梗塞或血栓性中风。
在“Summary Basis for Approval for NovoSeven”(FDA参考号96-0597)中报道了rFVIIa的循环半衰期为2.3小时。相对高的剂量和频繁地给药对于达到并维持所需疗效或预防效果是必需的。因此，难以获得足够的剂量调控，而频繁的静脉给药的要求对于患者的生活方式造成了限制。
在涉及治疗失控的出血(bleeding)，例如创伤(trauma)时，据信凝血因子VIIa能使凝血因子X不与组织因子结合就被活化为凝血因子Xa，并且认为这种活化反应主要发生在活化的血小板上(Hedner等Blood Coagulation&Fibrinolysis，2000；11；107-111)。但是，hFVIIa或rhFVIIa在缺乏组织因子时对凝血因子X的活性很低，结果导致治疗失控的出血，例如创伤病人的失控出血时，需要相对较高剂量和相对较多次剂量的hFVIIa或rhFVIIa。因此，为了更有效治疗失控的出血(使失血最少)，需要改进的FVIIa分子，它在缺乏组织因子的情况下对凝血因子X具有较高活性。这类改进的FVIIa分子与rhFVIIa相比，在涉及失控出血的给药中具有较少的凝血时间(或者说更快发挥作用)。
具有更长循环半衰期的分子将降低必需的给药次数。鉴于现有rhFVIIa产品需要经常注射，而且很有可能在获得更好的治疗性FVIIa水平的同时增强疗效，很明显需要改进FVII样或FVIIa样分子。
一种延长蛋白的循环半衰期的方法是确保该蛋白的肾清除率降低。这可以通过将该蛋白与化学组分偶联来实现，该化学组分可赋予该蛋白降低的肾清除率。
此外，使化学组分与该蛋白相连，或对暴露于蛋白裂解作用的氨基酸进行取代，可有效阻断蛋白裂解酶的接触从而避免对该蛋白的降解。聚乙二醇(PEG)就是一种这样的化学组分，它已用于制备治疗性蛋白产品。WO98/32466提示，FVII和其它许多蛋白一样，可以被PEG化，但对此该文献没有提供更进一步的信息。WO 01/58935公开了一种新策略用于开发具有包括增加的半衰期在内的多种活性的FVII或FVIIa分子。
如上所述，目前rhFVIIa治疗的另一个问题是该分子在蛋白酶解方面的相对不稳定。与冻干粉产品相反，蛋白酶解是获得溶液型制剂的一个主要障碍。获得稳定的溶液型制剂的好处在于方便患者操作，并且，在紧急情况下，便于更快地起作用，而这很有可能挽救生命。通过对主要蛋白酶解位点进行定点诱变而防止蛋白酶解的尝试可参见WO88/10295。
本发明的一个目标是提供改进的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa变体)，它具有较长的循环半衰期(从而减少所需的给药次数)，并且能比hFVIIa或rhFVIIa更有效地使凝血因子X(不与组织因子结合)被活化为凝血因子Xa(从而能更有效治疗失控的出血，如创伤)。
本发明的另一个目标是提供改进的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa变体)，它具有增强的生物可利用性(例如，与rhFVIIa相比，在静脉给药时，曲线下面积增加)，并且能比hFVIIa或rhFVIIa更有效地使凝血因子X(不与组织因子结合)被活化为凝血因子Xa(从而能更有效治疗失控的出血，如创伤)。
这些目标可以由本文提供的FVII或FVIIa变体来实现。
发明简述
本发明在其最广泛的方面涉及FVII或FVIIa多肽变体，其具有下述氨基酸序列，该序列相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的hFVII或hFVIIa而言包含3-1 5个氨基酸修饰，其中所述变体的氨基酸序列在第10和第32位包含氨基酸取代，并且有糖组分与引入到Gla结构域以外的位置的体内N-糖基化位点共价连接。
本发明另一方面涉及编码本发明多肽变体的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及包含本发明核苷酸序列的表达载体。
本发明另一方面涉及包含本发明核苷酸序列或本发明表达载体的宿主细胞。
本发明另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的多肽变体以及可药用的载体或赋形剂。
本发明另一方面涉及用作药物的本发明多肽变体或本发明药物组合物。
本发明的其它方面可以参照以下描述以及所附的权利要求来理解。
发明详述
定义
在本申请和本发明的全文中，使用下列定义：
术语“偶联物”(或可互换为“偶联的多肽”)表示由一个或多个多肽与一个或多个非多肽组分(如聚合物分子，亲脂化合物，糖组分及有机衍生剂)共价连接而形成的杂合(复合或嵌合的意思)分子。优选地，偶联物在有关浓度和条件下是可溶的，即在生理液体如血液中可溶。本发明偶联多肽的实施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。
术语“共价连接”表示该多肽变体和非多肽组分彼此直接共价连接，或者通过一个或多个间插组分，如桥，间隔子或连接组分，间接地共价连接。
本文所用术语“非多肽组分”表示能与本发明多肽变体的连接基团偶联的分子，它不同于由氨基酸单体组成并通过肽链连接在一起的肽聚合物。此类分子的优选实例包括聚合物分子，糖组分，亲脂化合物或有机衍生剂。在用于本发明偶联变体的上下文中，应理解为非多肽组分通过多肽连接基团连接到偶联变体的多肽部分。如上说明，非多肽组分可能直接共价地连接到连接基团，或通过一个或多个间插组分，如桥，间隔子或连接组分，间接地共价连接到连接基团。
术语“聚合物分子”是由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中所述单体无一是氨基酸残基，除非聚合物是人白蛋白或另一种丰富血浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换。该术语涵盖经体外糖基化连接的糖分子，所述体外糖基化即体外进行的合成性糖基化，其通常涉及糖分子与所述多肽变体的连接基团共价连接，任选使用交联剂。体外糖基化在下文中详述。
术语“糖组分”是指包含一或多个单糖残基的含糖分子，它能通过体内糖基化与所述多肽变体连接(从而产生糖基化多肽变体形式的多肽变体偶联物)。术语“体内糖基化”是指，通过例如N-连接和O-连接糖基化作用，而在体内出现(即在表达所述多肽变体的糖基化细胞中翻译后加工期间出现)的任何糖组分连接。实际上的寡糖结构很大程度上取决于相关的糖基化生物。
“N-糖基化位点”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸。优选相对于天冬酰胺残基而言第+3位置的氨基酸残基不是脯氨酸。
“O-糖基化位点”是丝氨酸或苏氨酸残基的-OH基。
术语“连接基团”表示多肽变体上能够与非多肽组分如聚合物分子，亲脂化合物，糖组分或有机衍生剂连接的功能基团，特别是其氨基酸残基或糖组分。有用的连接基团及其相配的非多肽组分见下表。
连接基团 氨基酸 非多肽组分实例 偶联方法/活化的PEG 参考
-NH2 N-末端，Lys 聚合物，如PEG，具有酰胺或亚胺基 mPEG-SPATresylated mPEG Shearwater Inc.Delgado等，critical reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems9(3，4)：249-304(1992)
-COOH C-末端，Asp，Glu 聚合物，如PEG，具有酯或酰胺基糖组分 mPEG-Hz体外偶联 Shearwater Inc.
-SH Cys 聚合物，如PEG，具有二硫键，马来酰亚胺或乙烯砜基糖组分 PEG-乙烯砜PEG-马来酰亚胺体外偶联 Shearwater Inc.Delgado等，critical reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems9(3，4)：249-304(1992)
-OH Ser，Thr，Lys，OH- 糖组分具有酯，醚，氨基甲酸酯，碳酸酯基团的PEG 体内O-连接的糖基化
-CONH2 Asn作为N-糖基化位点的一部分 糖组分聚合物，如PEG 体内N-糖基化
芳香族残基 Phe，Tyr，Trp 糖组分 体外偶联
-CONH2 Gln 糖组分 体外偶联 Yan & Wold，Biochemistry，1984，Jul 31：23(16)：3759-65
醛酮 氧化的寡糖 聚合物，如PEG，PEG-酰肼 PEG化 Andresz等，1978，Makromol.Chem.179：301，WO92/16555，WO00/23114
胍 Arg 糖组分 体外偶联 Lundblad & Noyes，ChemicalReagents for ProteinModification，CRC Press Inc.，Florida USA
咪唑环 His 糖组分 体外偶联 同胍
对于体内N-糖基化来说，术语“连接基团”以非常规方式用于表示构成N-糖基化位点的氨基酸残基(具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是在糖基化期间与糖组分连接的残基，但这种连接不能完成，除非该N-糖基化位点存在其它氨基酸残基。
因此，当非多肽组分是糖组分，并且偶联是通过体内N-糖基化实现时，与所述多肽氨基酸序列的改变联用的术语“含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基”应理解为，构成体内N-糖基化位点的一个或多个氨基酸残基被改变，且改变方式使功能性体内N-糖基化位点被引入该氨基酸序列。
在本申请中，氨基酸命名和原子命名(如，CA，CB，CD，CG，SG，NZ，N，O，C等)按Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)所定义的来使用，此定义基于IUPAC命名法(IUPAC Nomenclature and Symbolism for AminoAcids and Peptides(residue names，atom names，etc.)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘误Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。
术语“氨基酸残基”表示包含在下组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，组氨酸(His或H)，异亮氨酸(Ile或I)，赖氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，甲硫氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，丝氨酸(Ser或S)，苏氨酸(Thr或T)，缬氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
用于鉴定氨基酸位置的术语举例说明如下：I205表示SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第205位被异亮氨酸残基占据，I205T表示第205位异亮氨酸残基被苏氨酸残基取代。备选取代可以用“/”表示，如I205S/T表示所得氨基酸序列第205位的异亮氨酸被丝氨酸或苏氨酸取代。多重取代用“+”表示，如K143N+N145T表示第143位赖氨酸残基被天冬酰胺残基取代，并且第145位的天冬酰胺残基被苏氨酸残基取代。插入另一氨基酸残基如下表示：在A3之后(即第4位)插入一个酪氨酸残基，表示为A3AY(导致在第4位插入一个酪氨酸残基)。氨基酸残基的缺失以星号表示。例如，第172位缬氨酸残基的缺失表示为V172*。既有插入又有取代用如下方式表示：将第175位的丙氨酸残基用苏氨酸残基取代，随后在第175位之后插入一个亮氨酸残基，这可以表示为A175TL。
除非另有说明，本文中氨基酸残基的序号对应于hFVII/hFVIIa多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
术语“不同于”涉及具体突变时，是指除特定的氨基酸差异外，允许存在另外的差异。例如，除了引入体内N-糖基化位点(位于Gla结构域之外)，所述多肽还可包含与引入这些氨基酸残基无关的其它修饰。类似地，除了在Gla结构域中进行修饰以便增加磷脂膜结合亲和力以外，所述多肽可包含并非该效应所必须的其它修饰。
因此，除了本文公开的氨基酸修饰，应理解本发明多肽变体的氨基酸序列可以根据需要而包含其它改变，即其它的取代，插入或缺失。例如，这些改变可包括在N-和/或C-末端截短一个或多个氨基酸残基(例如1-10个氨基酸残基)，或在N-和/或C-末端添加一个或多个额外的氨基酸残基，如在N末端加入一个甲硫氨酸残基或在C-末端或其附近引入一个半胱氨酸残基，以及“保守氨基酸取代”，即，在具有类似特性的一组氨基酸中进行的取代，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，极性氨基酸，碱性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸之间进行取代。
这类保守取代的实例见下表。
    1 丙氨酸(A)    甘氨酸(G)  丝氨酸(S)  苏氨酸(T)
    2 天冬氨酸(D)  谷氨酸(E)
    3 天冬酰胺(N)  谷氨酰胺(Q)
    4 精氨酸(R)    组氨酸(H)  赖氨酸(K)
    5 异亮氨酸(I)  亮氨酸(L)  甲硫氨酸(M)  颉氨酸(V)
    6 苯丙氨酸(F)  酪氨酸(Y)  色氨酸(W)
其它修饰的实例可参见下文题为“Gla结构域之外的其它修饰”的章节。
术语“核苷酸序列”表示两个或多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成或合成来源或其任意组合。
术语“聚合酶链反应”或“PCR”通常指一种体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如，按美国专利4683195描述的方法。一般来说，PCR方法涉及使用能够与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物来使引物延伸合成反应反复循环。
术语“载体”是指质粒或其它核苷酸序列，它们能在宿主细胞内复制或者能整合到宿主细胞基因组中，因此可用于实现与兼容宿主细胞相关联的不同功能(载体-宿主系统)：促进核苷酸序列的克隆化，即产生可用量的序列，指导该序列编码的基因产物的表达，以及将该核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中。载体根据其所要实现的功能而包含不同组分。
“细胞”，“宿主细胞”，“细胞系”和“细胞培养”在本文中可互换使用并且这些术语都应当理解为包括细胞生长或培养所产生的后代。
“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA引入细胞的过程。
“可操作连接的”指两个或多个核苷酸序列通过酶促连接等方式共价连接在彼此相关的构象中，使序列行使正常功能。例如，编码前序列或分泌前导序列的核苷酸序列当要表达为参与多肽分泌的前蛋白时，与该多肽的核苷酸序列可操作连接；启动子或增强子当要影响编码序列的转录时，与该序列可操作连接；核糖体结合位点当需要处在促进翻译的位置时，与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接的”意指被连接的核苷酸序列是邻接的，并且在分泌前导区的情况下，是邻接的而且在阅读状态下。连接在方便的限制性位点来完成。如果不存在此类位点，那么使用合成的寡核苷酸衔接子或接头和标准的重组DNA方法。
在本发明上下文中，术语“修饰”或“氨基酸修饰”包括氨基酸侧链的替换，氨基酸残基的取代，氨基酸残基的缺失和/或氨基酸残基的插入。
术语“突变”和“取代”在本文中可互换使用。
术语“引入”是指，通过取代现存氨基酸残基，或者通过插入另外的氨基酸残基，来引入氨基酸残基。
术语“去除”是通过将需要去除的氨基酸残基用另外的氨基酸残基取代，或者使需要去除的氨基酸残基缺失(不经取代)，而去除氨基酸残基。
术语“FVII”或“FVII多肽”指单链形式的FVII分子。FVII多肽的一个实例是SEQ ID NO：2所示的野生型人FVII(hFVII)。但应理解，术语“FVII多肽”还表示hFVII-样分子，如SEQ ID NO：2的片段或变体，尤其具有相对于SEQ ID NO：2而言包含至少一个，诸如1-5个，例如1-10个氨基酸修饰的序列的变体
术语“FVIIa”或“FVIIa多肽”指活化的双链形式的FVIIa分子。当用氨基酸序列SEQ ID NO：2描述FVIIa的氨基酸序列时，应理解单链形式中R152和I153之间的肽键已被剪切，并且其中一条链包含氨基酸残基1-152，另一条链包含氨基酸残基153-406。
术语“rFVII”和“rFVIIa”指重组技术产生的FVII和FVIIa分子。
术语“hFVII”和“hFVIIa”分别指人野生型FVII和FVIIa，它们具有氨基酸序列SEQ ID NO：2。
术语“rhFVII”和“rhFVIIa”是指通过重组方式产生的，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的人野生型FVII和FVIIa。rhFVIIa的一个实例是NovoSeven。
本文中术语“Gla结构域”是指SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-45。
相应地，术语“Gla结构域之外”是指SEQ ID NO：2的氨基酸残基46-406。
术语“TF”和“TFPI”分别指组织因子和组织因子途径抑制物。
术语“蛋白酶结构域”是指从N-末端开始计数的约第153-406位残基。
术语“催化位点”用于指由所述多肽变体的S344，D242和H193组成的催化三联体。
术语“亲本”是指将要根据本发明进行修饰/改进的分子。通过本发明进行修饰的亲本多肽可以是任何FVII或FVIIa多肽，并因此可以源自任何来源，例如非人哺乳动物来源，但优选亲本多肽是hFVII或hFVIIa。
“变体”是一种多肽，它有一个或多个氨基酸残基区别于亲本多肽，通常有3-15个氨基酸残基不同，如有3-10个氨基酸残基不同，例如，有3-8个或3-5个氨基酸残基(例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸)不同。换而言之，“变体”相对于亲本多肽通常有3-15个氨基酸修饰(例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸修饰)，如有3-10个氨基酸修饰，例如有3-8个或3-5个氨基酸修饰。在本发明上下文中，术语“修饰”包括插入，缺失，取代及其组合。应理解，本发明的多肽变体在至少3个位置被修饰，即至少在第10位和第32位(位于Gla结构域内)以及在Gla结构域以外的至少一个位置，其中所述至少一个修饰产生体内N-糖基化位点。
术语“凝血活性(clotting activeity)”用于指在本文所述“凝血试验”中测定的活性。为了表现“凝血活性”，本发明变体的活化形式当在本文所述“凝血试验”中测定时，应具有rhFVIIa凝血活性的至少10％。在本发明一个优选实施方案中，所述变体的活化形式当在本文所述“凝血试验”中测定时，应具有rhFVIIa凝血活性的至少20％，如至少30％，例如至少40％，更优选至少50％，如至少60％，例如至少70％，还更优选至少80％，如至少90％。在一个感兴趣的实施方案中，所述变体的活化形式应具有与rhFVIIa基本相同的凝血活性，例如应具有rhFVIIa凝血活性的至少75-125％。
术语“酰胺分解活性”用于指在本文所述“酰胺分解试验”中测定的活性。为了表现“酰胺分解活性”，本发明变体的活化形式当在本文所述“酰胺分解试验”中测定时，应具有rhFVIIa酰胺分解活性的至少10％。在本发明一个优选实施方案中，所述变体的活化形式当在本文所述“酰胺分解试验”中测定时，应具有rhFVIIa酰胺分解活性的至少20％，如至少30％，例如至少40％，更优选至少50％，如至少60％，例如至少70％，还更优选至少80％，如至少90％。在一个感兴趣的实施方案中，所述变体的活化形式应具有与rhFVIIa基本相同的酰胺分解活性，例如应具有rhFVIIa酰胺分解活性的至少75-125％。
在本发明上下文中，术语“活性”也与所述变体将FX活化为FXa的能力连用。该活性也称为“FX活化活性”或“FXa生成活性”。
术语“增加的FX活化活性”或“增加的FXa生成活性”用于指本发明变体的活化形式与rhFVIIa相比，将FX活化为FXa的能力具有统计学显著意义的增加。本发明变体(活化形式)的FX活化活性增加到何种程度，可以通过本文所述“TF-依赖性凝血因子X活化试验”测定。
术语“更强凝血”或“凝血强度增加”用于指所述多肽变体产生的凝血强度与rhFVIIa在同等条件(compareable condition)下测定的凝血强度相比，具有统计学显著意义的增加。该效应可以通过用本文所述“凝血图试验(Thrombogram Assay)”测定本发明变体的活化形式产生的曲线下面积(AUCthrom)来确定。类似地，术语“增加的AUCthrom”用于指，经过本文所述“凝血图试验”的测定，所述变体(活化形式)产生的曲线下面积与rhFVIIa在同等条件下测定的曲线下面积相比，具有统计学显著意义的增加。
术语“Tmax”是指在“凝血图试验”中获得最大凝血酶活性水平所花费的时间。
术语“免疫原性”与给定的物质联用时，旨在表示该物质诱导免疫系统反应的能力。免疫反应可以是细胞或抗体介导的反应(对免疫原性更进一步的定义参见，如，Roitt：Essential Immunnology(8th Edition，Blackwell))。一般来说，抗体反应性下降提示免疫原性下降。降低的免疫原性可通过本领域任何已知的方法来测定，如体内方法或体外方法。
术语“功能性体内半衰期”使用其通常的含义，即所述多肽在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者所述多肽的活性为最初活性的50％的时间。
测定功能性体内半衰期的另一种方法可以是测定“血清半衰期”，即，50％多肽在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半衰期的测定常常比测定功能性体内半衰期简单，并且血清半衰期的大小通常可以很好地说明功能性体内半衰期大小。血清半衰期的其它可替换术语包括“血浆半衰期”，“循环半衰期”，“血清清除率”，“血浆清除率”和“清除半衰期”。所述多肽通过网状内皮系统(RES)，肾，脾或肝中一个或多个的作用，通过组织因子，SEC受体或其它受体介导的清除作用，或通过特异或非特异的蛋白水解作用而清除。通常，清除取决于大小(相对于肾小球过滤的截留值而言)，电荷，连接的糖链，以及是否存在该蛋白的细胞受体。将被保留的功能通常选自前凝血活性，蛋白酶解活性或受体结合活性。功能性体内半衰期和血清半衰期可通过本领域中已知的任何合适的方法来测定。
术语“增加”涉及功能性体内半衰期或血清半衰期时，表示所述多肽变体的相应半衰期与rFVIIa在同等条件下测定(通常在试实验动物，如大鼠，兔，猪或猴中测定)的相应半衰期相比，具有统计学显著意义的增加。
术语“AUCiv”或“静脉给药时的曲线下面积”使用其通常的含义，即当所述多肽变体被静脉给药，尤其是当在大鼠体内静脉给药时，在血清-时间曲线中所述活性以下的面积。通常，所测定的活性是前文所述的“凝血活性”。一旦测定了实验性活性-时间点，可以通过计算机程序，如GraphPadPrism 3.01来方便地计算AUCiv。
应理解，为了直接比较不同分子之间(例如，本发明变体与参照分子如rhFVIIa之间)的AUCiv值，应给与相同量的活性。结果是，AUCiv-值通常被标准化(即校正了注射剂量中的差异)，并被表示为AUCiv/所给剂量。
术语“对蛋白酶解降低的敏感性”主要指，所述多肽变体与在同等条件下检测的hFVIIa或rhFVIIa相比，对蛋白酶解的敏感性降低。优选，蛋白酶解降低了至少10％(例如降低了10-25％或10-50％)，如至少25％(例如降低了25-50％，25-75％或25-100％)，更优选降低了至少35％，如至少降低了50％(例如降低了50-75％或50-100％)，还更优选降低了60％，如至少降低了75％(例如降低了75-100％)，或甚至降低了至少90％。最优选，蛋白酶解降低了至少100％。
术语“肾清除”使用其通常的含义，即发生在肾的清除，例如，通过肾小球过滤，肾小管排泄或在肾小管细胞中的降解来完成。肾清除取决于所述多肽的物理特性，包括大小(直径)，流体体积(hydrodynamic volume)，对称性，形状/刚性，以及电荷。通常来说，大约为67kDa的分子量被认为是肾清除的截留值。肾清除可通过任何合适的试验来确定，如已建立的体内试验。通常，肾清除通过将标记的(如，放射标记的或荧光标记的)多肽给予患者并测定收集的患者尿液中的标记物活性来确定。肾清除的下降通过在同等条件下与相应参照多肽，如rhFVIIa，进行比较而确定。优选，所述多肽变体的肾清除率比rhFVIIa降低至少50％，优选降低至少75％，最优选降低至少90％。
术语“其侧链的至少25％暴露于该分子表面”和“其侧链的至少50％暴露于该分子表面”都是根据实施例1来限定的，在实施例1中详细描述了计算方法等内容。
应理解，当术语“其侧链的至少25％暴露于该分子表面”和“其侧链的至少50％暴露于该分子表面”与体内N-糖基化位点的引入联合使用时，这些术语是指氨基酸侧链中与糖组分实际连接的位置的表面可接近性。在大多数情况下，必需在相对于与糖组分实际连接的天冬酰胺残基而言的+2位置引入丝氨酸残基或苏氨酸残基(当然，除非该位置已经被丝氨酸或苏氨酸残基占据)，而且这些位置在引入丝氨酸或苏氨酸残基后，允许被掩盖，即它们的侧链只有不到25％或50％暴露在该分子表面。
术语“组织因子结合位点”，“活性位点区”以及“活性位点结合槽(cleft)的脊(ridge)”都根据实施例1来限定，在实施例1中指明了上述位点/区。
术语“疏水氨基酸残基”包括：异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
术语“负电荷氨基酸残基”包括：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
术语“正电荷氨基酸残基”包括：赖氨酸(K)，精氨酸(R)和组氨酸(H)。
本发明的变体
本发明在其最广泛方面涉及具有下述氨基酸序列的FVII或FVIIa多肽变体，所述氨基酸序列相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的hFVII或hFVIIa有3-15个氨基酸修饰，其中所述变体的氨基酸序列在第10和32位包含氨基酸取代，并且糖组分共价连接在引入到Gla结构域以外的位置的体内N-糖基化位点上。
在亲本FVII多肽的上述两个区域中进行的修饰具有以下目的：
在Gla结构域以外的位置进行的修饰(引入体内N-糖基化位点)优选具有下述特点：使所得变体与rhFVIIa相比，AUCiv，功能性体内半衰期和/或血清半衰期增加。
在亲本多肽的Gla结构域中进行的修饰优选具有下述特点：使所得分子的磷脂膜结合亲和力增加，和/或将FX活化为FXa的能力增加，和/或形成更强的凝血(stronger clot)。
在不限于任何具体理论的前提下，目前相信，膜亲和力增强将导致在其它凝血因子，尤其FX的邻近区域中，活化的多肽变体的局部浓度更高。故而将FX活化为FXa的活化率更高，而这仅仅归因于活化的FVII变体相对于FX的较高摩尔比。对FX的活化率增加使有活性的凝血酶的量增加，从而纤维蛋白的交联率较高。
因此，本发明优选实施方案中，亲本FVII或FVIIa多肽经过修饰使得最终的经活化的多肽变体(与rhFVIIa相比)具有以下特征：
i)   生物可利用性(AUCiv)增加，且磷脂膜结合亲和力增加；
ii)  生物可利用性(AUCiv)增加，且将FX活化为FXa的能力增加；
iii) 生物可利用性(AUCiv)增加，且能产生更强的凝血(AUCthrom增加)；
iv)  生物可利用性(AUCiv)增加，以及Tmax减小；
v)   功能性体内半衰期增加，且磷脂膜结合亲和力增加；
vi)  功能性体内半衰期增加，且将FX活化为FXa的能力增加；
vii) 功能性体内半衰期增加，且能产生更强的凝血(AUCthrom增加)；
viii)功能性体内半衰期增加，且Tmax减小；
ix)  血清半衰期增加，且磷脂膜结合亲和力增加；
x)   血清半衰期增加，且将FX活化为FXa的能力增加；
xi)  血清半衰期增加，且能产生更强的凝血(AUCthrom增加)；和/或
xii) 血清半衰期增加，且Tmax减小。
结果，本发明多肽变体的医疗处理可提供多种优于现有rhFVIIa化合物(NovoSeven)的优点，如给药剂量较低，两次注射之间的间隔期较长，凝血强度增加和/或作用发挥得更快。
因此，本发明优选的变体是那些在活化状态时与rhFVIIa相比，静脉给药，尤其当在大鼠中静脉给药时，可以产生更大的曲线下面积(AUCiv)的变体。更具体地，本发明优选的变体是那些，在所述变体的活化状态时的AUCiv相对于rhFVIIa的AUCiv之比至少为1.25，如至少1.5，例如至少1.75，更优选至少2，如至少3，还更优选至少4，如至少5，尤其当在大鼠中(静脉)给药时。
该效应可以(但并非必需)对应于比rhFVIIa更强的功能性体内半衰期和/或更强的血清半衰期。相应地，在本发明另一优选实施方案中，活化形式的所述变体的功能性体内半衰期或血清半衰期与rhFVIIa的功能性体内半衰期或血清半衰期之比为至少1.25。更优选，所述变体的活化形式的相关半衰期与hFVIIa或rhFVIIa的相关半衰期之比为至少1.5，如至少1.75，例如至少2，更优选至少3，如至少4，例如至少5。
应理解，本发明的变体除了具有上述功能(即，增加的AUCiv，增加的功能性体内半衰期和/或增加的血清半衰期)，还具有比rhFVII更强的磷脂膜结合亲和力，更强的将FX活化为Fxa的能力，产生更强凝血的能力(增加的AUCthrom)和/或降低的Tmax。
因此，本发明一个优选实施方案中，所述多肽变体与rhFVIIa相比，(除了增加的AUCiv，增加的功能性体内半衰期和/或增加的血清半衰期以外)，还具有增加的磷脂膜结合亲和力。膜结合亲和力可以用本领域已知的方法测量，如Biacore试验，它记录在K.Nagata and H.Handa(Ads.)，Real-TimeAnalysis of Biomolecular Interactions，Springer-Verlag，Tokyo，2000，Chapter 6entitled“Lipid-Protein Interactions”。或者，膜结合亲和力也可以按照WO99/20767的实施例1所述进行测量。
本发明另一优选实施方案中，所述多肽变体与rhFVIIa相比，(除了增加的AUCiv，增加的功能性体内半衰期和/或增加的血清半衰期以外)，还具有增加的FX活化活性，尤其当在TF-非依赖性试验，例如本文所述“TF非依赖性凝血因子X活化试验”中测量时。更具体地，当在本文所述“TF非依赖性凝血因子X活化试验”中测量时，优选所述多肽变体的活化形式的FX活化活性与rhFVIIa的FX活化活性之比为至少1.25。更优选地，当在本文所述“TF非依赖性凝血因子X活化试验”中测量时，所述多肽变体的活化形式的FX活化活性与rhFVIIa的FX活化活性之比为至少1.5，如至少1.75，例如至少2，甚至更优选至少3，如至少4，例如至少5，还更优选至少6，如至少7，例如至少8，最优选至少9，如至少10。
本发明另一优选实施方案中，所述多肽变体与rhFVIIa相比，(除了增加的AUCiv，增加的功能性体内半衰期和/或增加的血清半衰期以外)，能产生更强的凝血。该效应可以在本文所述“凝血图试验”中以增加的曲线下面积(AUCthrom)的形式来确定。AUCthrom有时也称“总凝血酶效应(totalthrombin work)”，它可以作为所形成的凝血的强度的衡量尺度。更具体地，当在本文所述“凝血图试验”中测量时，优选所述变体的活化形式所产生的AUCthrom与rhFVIIa所产生的AUCthrom之比为至少1.15。更优选，该比例为至少1.2，如至少1.25，例如至少1.3，还更优选至少1.4，如至少1.5，例如至少1.6，最优选至少1.7，如至少1.8，例如至少1.9或至少2。
本发明另一优选实施方案中，所述多肽变体与rhFVIIa相比，(除了增加的AUCiv，增加的功能性体内半衰期和/或增加的血清半衰期以外)，还可以更快地发挥作用。该效应可以在本文所述“凝血图试验”中以达到最大凝血酶水平所需时间(Tmax)的减少量的形式来确定。相应地，优选的变体是那些在本文所述“凝血图试验”中测量时，所述变体的活化形式的AUCthrom与rhFVIIa的AUCthrom之比为最多0.95。优选，该比例为最多0.9，如最多0.8，例如最多0.7，更优选最多0.6，如最多0.5。
在Gla结构域以外的位置引入体内N-糖基化位点
多种使AUCiv，功能性体内半衰期和/或血清半衰期增加的适当修饰公开在WO 01/58935中。WO 01/58935公开的变体是开发改良的FVII或FVIIa分子的总体新策略的结果，该策略也可用于本发明的亲本FVII或FVIIa多肽。
被修饰的位置优选选自FVII或FVIIa多肽分子中位于组织因子结合位点以外的位置，和/或活性位点区以外的位置，和/或活性位点结合槽的脊以外的位置。这些位点/区已经在本文实施例1中指明。但应强调，在某些情况中，例如需要失活的多肽变体的情况中，在这些区之中或附近进行修饰可能有利。例如，有人认为，将一或多个体内N-糖基化位点引入FVII或FVIIa分子的活性位点区或活性位点结合槽的脊是有利的。所述活性位点区，组织因子结合位点和活性位点结合槽的脊都在本文实施例1中指明，并且它们由以下残基组成：
I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，1361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405(活性位点区)；
L13，K18，F31，E35，R36，L39，F40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F71，C72，L73，P74，F76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R271，A274，F275，V276，R277，F278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q3 12，Q3 13，E325和R379(组织因子结合位点)；和
N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370(活性位点结合槽的脊)。
在亲本FVII或FVIIa多肽的Gla结构域以外将要被修饰的氨基酸残基的总数(相对于氨基酸序列SEQ ID NO：2)通常不超过10。优选，FVII或FVIIa变体包含与SEQ ID NO：2的氨基酸残基46-406有1-10个氨基酸残基差异的氨基酸序列，通常与SEQ ID NO：2的氨基酸残基46-406有1-8或2-8个氨基酸残基，例如1-5或2-5个氨基酸残基，如1-4或1-3个氨基酸残基，例如1，2或3个氨基酸残基不同。
因此，本发明的多肽变体可以包含1-10个(额外的或引入的)体内N-糖基化位点，通常1-8或2-8个(额外的或引入的)体内N-糖基化位点，优选1-5或2-5个(额外的或引入的)体内N-糖基化位点，如1-4或1-3个(额外的或引入的)体内N-糖基化位点，例如1，2或3个(额外的或引入的)体内N-糖基化位点。类似地，本发明的多肽变体可以包含1-10个(额外的或引入的)糖组分，通常1-8或2-8个(额外的或引入的)糖组分，优选1-5或2-5(额外的或引入的)糖组分，如1-4或1-3(额外的或引入的)糖组分，例如1，2或3(额外的或引入的)糖组分。应理解，所述引入的一或多个糖组分可以与引入的一或多个体内N-糖基化位点共价连接。
本发明上下文中，术语“天然糖基化位点”包括N145，N322，S52和S60位置的糖基化位点。类似地，术语“天然体内O-糖基化位点”包括位置S52和S60，而术语“天然体内N-糖基化位点”包括位置N145和N322。
应理解，为了制备包含与一或多个体内N-糖基化位点共价连接的一或多个糖组分的多肽变体，所述多肽变体必须在能将糖(寡糖)组分连接至糖基化位点的宿主细胞中表达，或者必须进行体内糖基化。糖基化宿主细胞的实例参见下文中的“与糖组分偶联”一节。
可以引入体内N-糖基化位点的那些位置的实例，包括但不限于，包含下述氨基酸残基的位置，所述残基的至少25％侧链暴露在表面(按照本文实施例1所限定)，如包含下述氨基酸残基的位置，所述残基的至少50％侧链暴露在表面(按照本文实施例1所限定)。一般优选通过取代来引入体内N-糖基化位点，但也可以考虑插入。所述位置优选选自该分子上位于组织因子结合位点和/或活性位点区以外的位置和/或位于活性位点槽的脊以外的位置。这些位点/区在本文实施例1中限定。应理解，当术语“至少25％(或至少50％)的侧链暴露在表面”与引入体内N-糖基化位点联合使用时，该术语表示氨基酸侧链在糖组分真实连接的位置的表面可接近性(surfaceaccessibility)。在很多情况下，必须在相对于真实连接糖组分的天冬酰胺残基而言的+2位置引入丝氨酸或苏氨酸残基(当然，除非该位置已经被丝氨酸或苏氨酸残基占据)，并且这些位置在引入丝氨酸或苏氨酸残基后，允许被掩盖，例如其侧链有不到25％暴露在表面。
这类产生体内N-糖基化位点的取代的具体优选例包括选自下组的取代：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205S，I205T，V253N，T267N，T267N+S269T，S314N+K316S，S314N+K316T，R315N+V317S，R315N+V317T，K316N+G318S，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。更优选，所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T，S314N+K316T，R315N+V317T，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。还更优选，所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：T106N，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T及其组合，尤其I205T。
在一个实施方案中，通过取代仅引入一个体内N-糖基化位点。在另一实施方案中，通过取代引入了两个或更多个(如两个)体内N-糖基化位点。产生两个体内N-糖基化位点的优选取代例包括选自下组的取代：A51N+G58N，A51N+T106N，A51N+K109N，A51N+G124N，A51N+K143N+N145T，A51N+A175T，A51N+I205T，A51N+V253N，A51N+T267N+S269T，A51N+S314N+K316T，A51N+R315N+V317T，A51N+K316N+G318T，A51N+G318N，A51N+D334N，G58N+T106N，G58N+K109N，G58N+G124N，G58N+K143N+N145T，G58N+A175T，G58N+I205T，G58N+V253N，G58N+T267N+S269T，G58N+S314N+K316T，G58N+R315N+V317T，G58N+K316N+G318T，G58N+G318N，G58N+D334N，T106N+K109N，T106N+G124N，T106N+K143N+N145T，T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，T106N+S314N+K316T，T106N+R315N+V317T，T106N+K316N+G318T，T106N+G318N，T106N+D334N，K109N+G124N，K109N+K143N+N145T，K109N+A175T，K109N+I205T，K109N+V253N，K109N+T267N+S269T，K109N+S314N+K316T，K109N+R315N+V317T，K109N+K316N+G318T，K109N+G318N，K109N+D334N，G124N+K143N+N145T，G124N+A175T，G124N+I205T，G124N+V253N，G124N+T267N+S269T，G124N+S314N+K316T，G124N+R315N+V317T，G124N+K316N+G318T，G124N+G318N，G124N+D334N，K143N+N145T+A175T，K143N+N145T+I205T，K143N+N145T+V253N，K143N+N145T+T267N+S269T，K143N+N145T+S314N+K316T，K143N+N145T+R315N+V317T，K143N+N145T+K316N+G318T，K143N+N145T+G318N，K143N+N145T+D334N，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，A175T+S314N+K316T，A175T+R315N+V317T，A175T+K316N+G318T，A175T+G318N，A175T+D334N，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T，I205T+S314N+K316T，I205T+R315N+V317T，I205T+K316N+G318T，I205T+G318N，I205T+D334N，V253N+T267N+S269T，V253N+S314N+K316T，V253N+R315N+V317T，V253N+K316N+G318T，V253N+G318N，V253N+D334N，T267N+S269T+S314N+K316T，T267N+S269T+R315N+V317T，T267N+S269T+K316N+G318T，T267N+S269T+G318N，T267N+S269T+D334N，S314N+K316T+R315N+V317T，S314N+K316T+G318N，S314N+K316T+D334N，R315N+V317T+K316N+G318T，R315N+V317T+G318N，R315N+V317T+D334N和G318N+D334N。更优选，所述取代选自T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T和V253N+T267N+S269T，还更优选选自T106N+I205T，T106N+V253N和I205T+T267N+S269T。
在另一实施方案中，通过取代引入三个或更多个(如三个)体内N-糖基化位点。产生三个体内N-糖基化位点的优选取代例包括选自下组的取代：I205T+V253N+T267N+S269T和T106N+I205T+V253N。
如上所述，优选将体内N-糖基化位点引入下述位置，该位置即不是本文所述组织因子结合位点的一部分，也不是本文所述活性位点区的一部分，或者本文所述活性位点结合槽的脊。应明白，这类糖基化变体主要属于本文前面所述的活性多肽变体一类。
应理解，除了将体内N-糖基化位点引入上述位置以外，还可以在相同位置引入(通过取代或通过插入)半胱氨酸残基，使所引入的半胱氨酸残基随后与非多肽组分(如PEG，尤其mPEG)共价连接。因此，能够引入半胱氨酸残基的位置实例包括但不限于：包含那些其至少25％的侧链暴露在表面的氨基酸残基(参看本文实施例1的限定)的位置，如包含那些其至少50％的侧链暴露在表面的氨基酸残基(参看本文实施例1的限定)的位置。所述位置优选选自该分子上位于组织因子结合位点以外的位置和/或活性位点区和/或活性位点槽脊以外的位置。这些位点/区在本文实施例1中限定。因此上述涉及体内N-糖基化位点的引入的内容可以在经过必要修正后用于引入半胱氨酸残基。
应理解，在上述章节中讨论的G1a结构域以外的位置进行的修饰应该与在Gla结构域中进行的一或多个修饰(参见下文题为“在Gla结构域中的修饰”一节)组合。
在Gla结构域中的修饰
可以理解，本发明的变体除了在Gla结构域以外的位置包含至少一个引入的体内N-糖基化位点(参见上文)以外，还包括至少两个在Gla结构域中的取代，即在位置10和位置32的取代。
导致磷脂膜结合亲和力增加的多种合适取代公开在WO 99/20767和WO 00/66753中。
在本发明一个优选实施方案中，位置10的取代是P10Q。在本发明另一实施方案中，位置32的取代是K32E。在本发明一个具体实施方案中，所述变体包含P10Q+K32E取代。
在本发明一个感兴趣的实施方案中，所述变体除了在位置10和32包含取代(例如，P10Q+K32E取代)以外，至少还包含另一个在Gla结构域中的修饰。
在本发明一个优选实施方案中，所述另一个在Gla结构域中的修饰包含位置33的氨基酸取代。优选地，通过位置33的取代引入疏水氨基酸残基，如D33I，D33L，D33M，D33V，D33F，D33Y或D33W，尤其D33F。相应地，在本发明一个非常感兴趣的实施方案中，所述变体包含以下取代：P10Q+K32+D33F。
在本发明另一优选实施方案中，所述另一个在Gla结构域中的修饰包括在位置3和4之间插入至少一个(如一个)氨基酸残基。优选所插入的氨基酸残基是疏水氨基酸残基。最优选所述插入是A3AY。相应地，在本发明另一感兴趣的实施方案中，所述变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E或A3AY+P10Q+K32E+D33F。
在本发明另一优选实施方案中，所述另一个在Gla结构域中的修饰包括在位置34的取代。优选通过位置34的取代引入负电荷氨基酸残基。最优选所述取代是A34E。相应地，在本发明另一个非常感兴趣的实施方案中，所述变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E，P10Q+K32E+D33F+A34E，A3AY+P10Q+K32E+A34E或A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E。
Gla结构域还可以在其它位置(尤其位置8，11和28)包含修饰，如R28F或R28E。另一方面，应理解，对Gla结构域的修饰不应损害膜结合特性。相应地，优选不在发生γ-羧基化的残基中进行修饰，即优选不在位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35进行修饰。类似地，通常不优选将非多肽组分，如糖组分和/或PEG基团，引入Gla结构域。因此，优选不在Gla结构域中进行能产生体内N-糖基化位点的修饰。
最后，应理解本章节所述在Gla结构域中的修饰必须与上文中题为“在Gla结构域以外的位置引入体力N-糖基化位点”的章节中所公开的一或多个修饰组合。
这类“组合”变体的具体实例如下。
在本发明一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+T267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+T106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+T106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+I205T+T267N+S269 T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+V253N.
在本发明另一个优选实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+T267+S269 T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+T106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+T106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+I205T+T267N+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+T267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+T106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+T106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+T267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+T106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+I205T+T267N+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+A175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+V25 3N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+T267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+T106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+T106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+A34E+I205T+T267N+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34E+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34EA175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34EI205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34EV253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34ET267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34ET106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34ET106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：P10Q+K32E+D33F+A34EI205T+T267N+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34E+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34EA175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34EI205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34EV253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34ET267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34ET106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34ET106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+A34EI205T+T267N+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E+T106N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34EA175T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34EI205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34EV253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34ET267+S269T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34ET106N+I205T.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34ET106N+V253N.
在本发明另一个实施方案中，所述FVII或FVIIa多肽变体包含以下修饰：A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34EI205T+T267N+S269T。
在Gla结构域以外的其它修饰
在本发明另一个优选实施方案中，所述FVII或FVIIa变体除了包含以上章节所述的修饰以外，还包含已知能增加所述多肽的固有活性的突变，例如在WO 02/22776中公开的那些突变。
优选取代的实例包括选自下组的取代：V158D，E296D，M298Q，L305V和K337A。更优选所述取代选自V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A，V158D+E296D+M298Q+K337A，V158D+E296D+M298Q+L305V，V158D+E296D+M298Q，M298Q，L305V+K337A，L305V和K337A。
在本发明另一个优选实施方案中，所述FVII或FVIIa变体除了包含以上章节所述的修饰以外，还包含已知能使TFPI的抑制作用减弱的突变。一个实例包括Neuenschwander等，Biochemistry，1995；34：8701-8707中公开的K341Q取代。
此外，所述变体可以包含被认为能增加TF结合亲和力的修饰。这类修饰的实例包括选自下组的取代：L39E，L39Q，L39H，I42K，I42R，S43H，S43Q，K62E，K62R，L65Q，L65S，F71D，F71Y，F71E，F71Q，F71N，E82Q，E82N，E82K和F275H。
如上所述，这类变体还可以包含保守氨基酸取代。
非多肽组分
根据本文的描述，本领域技术人员知道，可以利用上文中针对体内N-糖基化位点所描述的方法，通过取代将包含其它连接基团的氨基酸残基引入亲本多肽。例如，可以将一或多个包含酸性基团(谷氨酸或天冬氨酸)，酪氨酸或赖氨酸的氨基酸残基引入上述位置。尤其可以将一或多个半胱氨酸残基引入上述位置。
如上所述，偶联变体的非多肽组分优选选自聚合物分子，亲脂化合物，糖组分(通过体内糖基化的方式)和有机衍生剂。所有这些物质都可为变体多肽提供所需性质，特别是增加AUCiv，增加功能性体内半衰期和/或增加血浆半衰期。变体多肽通常可以仅与一种类型的非多肽组分偶联，但也可以与两种或多种不同类型的非多肽组分偶联，例如，与聚合物分子和糖组分偶联，与亲脂基团和糖组分偶联，与有机衍生剂和糖组分偶联，与亲脂基团和聚合物分子偶联等。与两种或多种不同类型的非多肽组分偶联可同时或按顺序进行。
制备本发明偶联变体的方法
在下文题为“与亲脂化合物偶联”，“与聚合物分子偶联”，“与糖组分偶联”和“与有机衍生剂偶联”的章节中，描述了与非多肽组分的具体类型进行的偶联。总体而言，本发明的偶联变体如下制备：在有利于所述变体多肽表达的条件下培养合适的宿主细胞，并获取所述变体多肽，其中a)所述变体多肽包含至少一个N-或O-糖基化位点，所述宿主细胞是可进行体内糖基化的真核细胞，和/或b)所述变体多肽可体外偶联非多肽组分。
应理解，对偶联的设计应使所得分子在所连接的非多肽组分的数量，这类分子的大小和形式(如线性或分支)，以及在所述多肽上的连接位点各方面最佳。所用非多肽组分的分子量可基于，例如希望达到的效果进行选择。例如，当偶联的主要目的是获得具有高分子量(以便，例如降低肾清除率)的偶联变体，通常要偶联尽量少的高分子量非多肽组分，以获得期望的分子量。当希望获得高度的掩盖，可使用足量的低分子量非多肽组分(如分子量从约300Da到约5kDa，如分子量从300Da到2kDa)。
与聚合物分子偶联
与变体多肽偶联的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或杂聚物，通常所述分子的分子量范围约为300-100,000Da，如约500-20,000Da，更优选约为500-15,000Da，甚至更优选约为2-12kDa，如约为3-10kDa。当本文所用术语“约”涉及某一分子量时，“约”就表示大约的平均分子量，且反映这样一个事实，即在给定的聚合物制品中通常有一确定的分子量分布。
均聚物的实例包括聚醇(即聚-OH)，聚胺(即聚-NH2)和聚羧酸(即聚-COOH)。杂聚物是包含不同的偶联基团，如羟基基团和氨基基团的聚合物。
合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖或任何其它适于减小免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期的生物聚合物。聚合物分子的另一实例是人白蛋白或另一丰富血浆蛋白。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的，无毒的，无抗原性的，无免疫原性的，具有各种水溶性特性并易于从活的生物中分泌。
PEG是优选的聚合物分子，因为其与，例如多糖如葡聚糖相比仅仅具有极少量的能够交联的反应基团。特别感兴趣的是单功能PEG，如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因为其偶联化学相对简单(仅仅一个反应基团可用于与多肽上的连接基团偶联)。因此，交联的危险被消除，所得偶联变体更均一并且聚合物分子与变体多肽的反应更易于控制。
为了使聚合物分子与变体多肽共价结合，聚合物分子的羟基末端基团必须为活化形式，即具有反应性功能基团(其实例包括伯胺基团，酰肼(HZ)，巯基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)，琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，醛，硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子有商品例如可得自Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
或者，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法，例如，如WO 90/13540中所述FF活化。本发明所用的线性或分支的活化型聚合物分子的具体实例参见Shearwater Polymers，Inc.1997和2000目录(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycoland Derivatives，引入本文供参考)。
活化型PEG聚合物的具体实例包括下列线性PEG：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，和支链PEG如PEG2-NHS以及US 5,932,462和US 5,643,575中所公开的那些，将这两专利引入本文供参考。此外，引入本文供参考的下列出版物中公开了有用的聚合物分子和/或PEG化化学过程：US 5,824,778，US 5,476,653，WO97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO95/13090，WO95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO95/06058，EP 439 508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO96/07670，US 5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。
那些尤其优选与半胱氨酸残基偶联的活化型PEG聚合物的具体实例包括以下线性PEG：乙烯砜(vinylsulfone)-PEG(VS-PEG)，优选乙烯砜-mPEG(VS-mPEG)；马来酰亚胺-PEG(MAL-PEG)，优选马来酰亚胺-mPEG(MAL-mPEG)和正吡啶基-二硫化物(orthopyridyl-disulfide)-PEG(OPSS-PEG)，优选正吡啶基-二硫化物-mPEG(OPSS-mPEG)。这类PEG或mPEG聚合物的大小通常为约5kDa，约10kD，约12kDa或约20kDa。
多肽变体和活化型聚合物分子的偶联可通过使用任何常规方法，例如，按下列参考文献所述(这些参考文献中也描述了活化聚合物分子的适宜方法)进行：Harris and Zalipsky，eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications，AZC，Washington；R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson et al.，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y.)。
技术人员会知道，所用的活化方法和/或偶联化学取决于所述变体多肽的连接基团(以上已给出实例)，以及聚合物的功能基(例如，是氨基，羟基，羧基，醛，sulfydryl，琥珀酰亚氨基，马来酰亚胺，乙烯砜或卤代乙酸)。PEG化可以与变体多肽上的所有可利用的连接基团(即，暴露于该多肽表面的连接基团)直接进行偶联，或者可以与一个或多个特定的连接基团(如US5,985,265所述的N-末端氨基)直接偶联，或与半胱氨酸残基偶联。而且，偶联可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)来完成。
在对半胱氨酸残基进行PEG化(参见上文)时，FVII或FVIIa变体通常在用还原剂如二硫苏糖醇(DDT)处理后再进行PEG化。该还原剂随后通过任何常规方法如脱盐法除去。PEG与半胱氨酸残基的偶联通常是在合适的缓冲液中，在pH 6-9，4℃-25℃，持续最多16小时。
应理解，需通过设计PEG化作用，使所得分子在连接的PEG分子的数目，这些分子的大小和形式(如，线性或分支)，以及变体多肽中的连接位置各方面最佳。例如，可以根据需要达到的效果来选择所使用的聚合物的分子量。
仅与蛋白上单个连接基团(如N-末端氨基基团)偶联时，聚合物分子(线性或分支)具有高分子量是有利的，优选约10-25kDa，如约15-25kDa，例如约20kDa。
一般来说，聚合物偶联是在使尽可能多的可利用的聚合物连接基团与聚合物分子反应的条件下进行。这可以通过使所述聚合物相对于所述多肽适当摩尔过量来实现。通常，活化型聚合物分子与多肽的摩尔比最高达到约1000-1，如最高约200-1，或最高约100-1。有些情况下，所述比例也可略低，如最高约50-1，10-1，5-1，2-1或1-1，以便获得最佳反应。
本发明还涉及利用接头将聚合物分子与多肽偶联。合适的接头是技术人员公知的。一个优选的实例是氰尿酰氯(cyanuric chloride)(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶联后，残留的活化型聚合物分子用本领域已知的方法(如将伯胺加入反应混合物中)来封闭，所得失活型聚合物分子通过合适的方法除去。
应理解，根据各种情况(如所述变体多肽的氨基酸序列，所用活化型PEG化合物的性质以及具体的PEG化条件，包括PEG与多肽的摩尔比)，有可能获得不同程度的PEG化，较高程度的PEG化通常来自PEG与变体多肽的较高摩尔比。然而，来源于任何给定PEG化过程的PEG化变体多肽通常包含PEG化程度略有不同的偶联多肽变体的随机分布。
与糖组分偶联
为了实现FVII分子(包含一个或多个糖基化位点)的体内糖基化，编码所述变体多肽的核苷酸序列必须被插入到糖基化真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)，昆虫，或动物细胞，或选自转基因植物细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞，BHK细胞或HEK细胞，如HEK293细胞，或昆虫细胞，如SF9细胞，或者酵母细胞如酿酒酵母(S.Cerevisiae)或毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或任何下文描述的宿主细胞。
糖组分(如葡聚糖)与变体多肽的氨基酸残基在体外的共价偶联也可使用，例如WO87/05330和Aplin等人，CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中描述的方法。糖组分或PEG与蛋白结合型和肽结合型Gln-残基的体外偶联也可以通过谷氨酰胺转移酶(TGases)来进行。谷氨酰胺转移酶在所谓的交联反应中催化供体氨基基团转移到蛋白-和肽-结合型Gln残基上。供体氨基基团可以是蛋白-结合型或肽-结合型，如赖氨酸残基中的ε氨基基团，或者也可以是有机小分子或有机大分子的一部分。在TGase催化的交联反应中作为氨基供体的有机小分子的一例如腐胺(putrescine)(1，4二氨基丁烷)。在TGase催化的交联反应中作为氨基供体的有机大分子的一例如含有氨基的PEG(Sato等，1996，Biochemistry 35，13072-13080)。
TGase通常是高度特异的酶，并非所有暴露于蛋白表面的Gln残基都可用于TGase催化的与含氨基物质的交联。相反，只有少数Gln残基是TGase的天然底物，但对于控制Gln残基作为良好的TGase底物的确切参数仍不可知。因此，为了使蛋白对TGase催化的交联反应敏感，经常的前提是，在方便的位置添加已知非常适合用做TGase底物的氨基酸序列。已知多种氨基酸序列本身是或者包含极佳的TGase天然底物，如P物质，elafin，纤维蛋白原，纤连蛋白，α2-纤溶酶抑制剂，α-酪蛋白，和β-酪蛋白。
与有机衍生剂的偶联
变体多肽的共价修饰可通过使该变体多肽的一个或多个连接基团与有机衍生剂反应来进行。合适的衍生剂和方法在本领域中是公知的。例如，半胱氨酰基残基常常与α-卤代乙酸(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应，产生羧甲基衍生物或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可与以下物质反应来衍生：溴三氟丙酮，α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸，氯乙酰基磷酸酯，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，对氯汞基苯甲酸酯，2-氯汞-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。组氨酰基残基通过与二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0反应来衍生，因为该试剂较特异于组氨酰基侧链。对-溴苯甲酰甲基溴化物也可用于衍生。该反应优选在0.1M卡可酸钠中于pH6.0进行反应。赖氨酰基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生具有使赖氨酰基残基的电荷逆转的作用。其它合适对含α-氨基的残基进行衍生的试剂包括，亚氨基酯如甲基吡啶酰亚胺甲酯(methyl picolinimidate)，磷酸吡多醛，吡多醛，氯代氢硼化物，三硝基苯磺酸，邻甲基异脲，2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。精氨酰基残基通过与一种或多种常规试剂的反应来修饰，所述试剂包括苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生要求反应在碱性条件中进行，因为胍功能基具有较高的pKa。
此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸胍基反应。羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应来进行选择性地修饰，其中R和R’是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰基和谷氨酰基通过与铵离子反应转化为天冬酰酰胺基和谷氨酰酰胺基。
与亲脂化合物偶联
变体多肽和亲脂化合物可以直接偶联或利用接头来偶联。亲脂化合物可以是天然化合物，如饱和或不饱和脂肪酸，脂肪酸二酮，萜烯，前列腺素，维生素，类胡萝卜素或胆固醇，或者合成的化合物如碳酸，醇，胺和具有一个或多个烷基-，芳基-，链烯基-的磺酸或其它多元不饱和化合物。变体多肽和亲脂化合物之间的偶联(任选地通过接头进行的连接)，可按本领域已知的方法，如Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505所述方法来进行。
制备本发明多肽变体的方法
本发明的多肽变体可通过本领域已知的任何合适方法来制备。所述方法包括，构建编码该多肽变体的核苷酸序列，并在合适的被转化或转染的宿主中表达该序列。优选宿主细胞是γ-羧基化宿主细胞，如哺乳动物细胞。也可通过化学合成方法或化学合成方法的组合或者化学合成方法和重组DNA技术的组合来产生本发明的多肽变体，但效率很低。
编码本发明多肽的核苷酸序列可以如下来构建：分离或合成编码亲本FVII，如具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的hFVII的核苷酸序列，然后改变所述核苷酸序列以引入(即插入或取代)或去除(即缺失或取代)相关氨基酸残基。
核苷酸序列可通过公知方法经定点诱变方便地进行修饰。或者，核苷酸序列可通过化学合成来制备，例如通过使用寡核苷酸合成仪，其中基于所需多肽的氨基酸序列来设计寡核苷酸，并且优选选择有利于在产生重组多肽的宿主细胞中表达的那些密码子。例如，可以合成多个编码所需多肽各部分的小分子寡核苷酸，然后通过PCR，连接反应或连接链反应(LCR)(Barany，PNAS 88：189-193，1991)将所述寡核苷酸装配起来。各个寡核苷酸通常含有5′或3′突出端用于互补装配。
另有核苷酸序列修饰方法可用于产生多肽变体以便进行高通量筛选，例如US 5,093,257中公开的有关同源交换的方法，以及有关基因改组的方法，即两个或多个同源核苷酸序列之间重组，导致产生与起始核苷酸序列相比有多个核苷酸改变的新的核苷酸序列。基因改组(也称DNA改组)涉及一次或多次核苷酸序列的随机片段化和重新装配的循环，随之通过筛选来选出编码具有所需特性的多肽的核苷酸序列。为了使基于同源性的核酸改组能够发生，所述核苷酸序列的相关部分优选至少有50％相同，如至少60％相同，更优选至少70％相同，如至少80％相同。重组可在体外或体内进行。
适当的体外基因改组方法的实例参见Stemmer等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，Naturem vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature vol.370，pp.324-325；Zhao等，Nat.Biotechnol.1998.Mar；16(3)：258-61；Zhao H.和Arnold，FB，Nucleic Acids Research，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research 1998，Jan 15；26(2)：pp.681-83；以及WO95/17413。
WO97/07205中公开了一种合适的体内改组方法。其它通过体外或体内重组进行核酸序列诱变的技术参见，例如WO97/20078和US5837458。具体的改组技术包括“家族改组(Family shuffling)”，“合成改组”“计算机化(insilico)改组”。
家族改组是使来自不同物种的一族同源基因进行一次或多次的改组和后续筛选或选择的循环。家族改组技术可参见，例如：Crameri等，(1998)，Nature，vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.259-264；Chang等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.793-797；以及Ness等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，893-896。
合成改组涉及提供重叠的合成寡核苷酸的文库，该文库基于，例如目的同源基因的序列比对。对这种合成的寡核苷酸进行重组，对所得重组核酸序列进行筛选，如有需要可进行进一步的改组循环。合成改组技术公开在WO00/42561中。
计算机化改组指一种DNA改组过程，由计算机系统实施或建立模型，从而部分或完全避免了对核酸的物理操作。计算机化改组公开在WO00/42560中。
一旦装配(通过合成，定点诱变或另一方法)后，将编码多肽的核苷酸序列插入重组载体中，并与FVII在目标转化宿主细胞中表达所必需的调控序列可操作相连。
当然，应理解不是所有载体和表达调控序列都能同样良好地表达本文所述多肽变体的核苷酸序列。不是所有宿主都能使相同的表达系统发挥同样优良的功能。然而，本领域技术人员不用进行大量实验就可以对这些载体，表达调控序列和宿主作出选择。例如，在选择载体时必须考虑宿主，因为载体必须在其中复制或能够整合到染色体中。还应考虑载体拷贝数，控制拷贝数的能力以及载体编码的任何其它蛋白如抗生素标记的表达。在选择表达调控序列时，也应考虑各种因素。这些因素包括，例如，序列的相对长度，其可控制性以及与编码多肽的核苷酸序列的相容性，特别要考虑潜在的二级结构。选择宿主时应考虑其与所选载体的相容性，核苷酸序列编码的产物的毒性，宿主的分泌特性，宿主正确折叠多肽变体的能力，宿主的发酵和培养要求，以及核苷酸序列编码产物纯化的难易。
重组载体可以是自主复制的载体，即载体作为染色体外实体存在，其复制独立于染色体复制，例如质粒。另外，引入宿主细胞时，载体可整合到宿主细胞基因组中并且与其整合的染色体一起复制。
载体优选是表达载体，其中编码本发明多肽变体的核苷酸序列与该核苷酸序列转录所需的另外的片段可操作相连。载体通常由质粒或病毒DNA衍生。用于在本文所述宿主细胞中表达的多种合适的表达载体是可商购的或有文献描述的。可用于真核宿主的表达载体包括，例如，含有来自SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。具体的载体如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jola，CA，USA)。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物，POT1载体(US 4,931,373)，pJSO37载体(描述于Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用于昆虫细胞的表达载体包括pVL941，pBG311(Cate等，“Isolation of Bovine and HumanGenes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene InAnimal Cells”，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都来自Invitrogen)。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(都来自Novagen Inc.，WI，USA)，宽宿主范围质粒，如RP4，噬菌体DNA，例如λ噬菌体的各种衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
本发明中使用的其它载体包括允许编码多肽变体的核苷酸序列扩增多个拷贝的那些载体。这种可扩增的载体是本领域公知的。例如，它们包括能够通过DHFR扩增的载体(例如参见Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufman and Sharp，″Construction Of A Modular Dihydrofolate ReductasecDNA Gene：Analys为Of Signals Utilized For Efficient Expression″，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和可通过谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增的载体(例如参见US 5,122,464和EP338,841)。
重组载体可进一步包含能够使所述载体在目标宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的一个例子(宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40复制起点。当宿主细胞是酵母细胞时，能够使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP 1-3和复制起点。
载体也可含有选择标记，如基因，其产物补充宿主细胞的缺陷，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell，Gene 40，1985，pp.125-130)，或者赋予对药物如氨苄青霉素，卡那霉素，四环素，氯霉素，新霉素，潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。对于酿酒酵母来说，选择标记包括ura3和Leu2。对于丝状真菌来说，选择标记包括amdS，pyrG，arcB，niaD和sC。
术语“调控序列”在本文中包括对本发明多肽变体的表达所必需的或有利的所有成分。每种调控序列对编码多肽变体的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这类调控序列包括但不限于前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，增强子或上游活化序列，信号肽序列和转录终止子。调控序列至少包括启动子。
本发明可以使用各种各样的表达调控序列。这类可使用的表达调控序列包括与前述表达载体的结构基因相连的表达调控序列，以及已知调控原核或真核细胞或其病毒的基因表达的任何序列及其各种组合。
哺乳动物细胞中指导转录的合适调控序列的实例包括SV40和腺病毒的早期或晚期启动子，如腺病毒2的主要晚期启动子，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子，人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)，人延伸因子1α(EF-1α)启动子，果蝇最小热休克蛋白70启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，人遍在蛋白C(UbC)启动子，人生长激素终止子，SV40或腺病毒Elb区聚腺苷酸化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)：947-50)。
为了改进在哺乳动物细胞中的表达，可以将合成的内含子插入编码所述多肽的核苷酸序列的5’非翻译区。合成内含子的实例是来自质粒pCI-Neo的合成内含子(购自Promega Corporation，WI，USA)。
昆虫细胞中指导转录的合适调控序列的实例包括多角体蛋白启动子，P10启动子，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动子，杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟早期基因启动子，以及SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括酵母α交配系统的启动子，酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子，来自酵母糖酵解基因或醇脱氢酶基因的启动子，ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。在丝状真菌宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括ADH3启动子和终止子，由编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶，黑曲霉(A.niger)α淀粉酶，黑曲霉或构巢曲霉(A.nidulans)葡萄糖淀粉酶，构巢曲霉乙酰胺酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的启动子，TPI1终止子和ADH3终止子。在细菌宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括lac系统，trp系统，TAC或TRC系统的启动子和λ噬菌体的主要启动子区域。
信号肽的存在或不存在将取决于，例如，需要表达的多肽变体(胞内多肽或胞外多肽)的表达宿主细胞和是不是需要分泌。为了在丝状真菌中使用，信号肽可以由编码曲霉属菌株的淀粉酶或葡萄糖淀粉酶的基因，编码米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便地衍生。信号肽优选由编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定淀粉酶或黑曲霉葡萄糖淀粉酶的基因衍生。为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以由昆虫基因方便地衍生(参见WO90/05783)，如鳞翅目Manducasexta脂动激素前体(US5023328)，蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)，蜕皮甾类UDP葡糖基转移酶(glucosyltransferase)(egt)(Murphy等，Protein Expression andPurification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods in Enzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳动物细胞中使用的优选信号肽是hFVII信号肽或鼠Igκ轻链信号肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 152：89-104)。适于在酵母细胞中使用的信号肽是酿酒酵母α-因子信号肽(参见US4870008)，修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)，酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)，酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)以及合成的前导序列TA57(WO98/32867)。大肠杆菌的合适信号肽是信号肽ompA(EP581821)。
本发明编码多肽变体的核苷酸序列，无论通过定点诱变，合成，PCR或其它何种方法制备，可以任选包括编码信号肽的核苷酸序列。当多肽变体需要从表达的细胞中分泌时，有信号肽存在。这种信号肽，如果存在，应该是能被表达所述多肽变体的细胞识别的。信号肽可以是，例如，与hFVII相关的信号肽，或者，该信号肽可以来自不同于hFVII的另一来源，如任一种通常与其它的人野生型维生素K-依赖性多肽相关者。而且，信号肽可以是该宿主细胞通常表达的信号肽或者是该宿主细胞并不通常表达的信号肽。相应的，信号肽可以是原核的，如来源于细菌如大肠杆菌，或者是真核的，如来源于哺乳动物或昆虫或酵母细胞。
可以使用任何合适的宿主来产生多肽变体，所述宿主包括细菌(尽管并非特别优选)，真菌(包括酵母)，植物，昆虫，哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌，假单胞菌属或链霉菌属，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌菌株。载体引入细菌宿主细胞可以通过涉及以下的方式进行：例如，原生质体转化(参见如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见如Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau andDavidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)，或偶联(参见如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)。合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌株，如米曲霉，黑曲霉或构巢曲霉，镰刀菌属(Fusarium)或木霉菌(Trichoderma)属。真菌细胞可以通过涉及以下的方式转化：原生质体形成，原生质体转化和细胞壁通过本身已知的方式再生。转化曲霉属宿主细胞的合适方法见EP238023和US5679543。转化镰刀菌属的合适方法见Malardier等人1989，Gene 78：147-156和WO96/00787。合适的酵母宿主细胞的实例包括以下的菌株：糖酵母属如酿酒酵母，裂殖酵母属，克鲁维酵母属，毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica，汉逊酵母属如多形汉逊酵母，或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，InAbelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，NewYork；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920；以及由Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母转化系统试剂盒的产品手册)中所述的方法来转化。合适昆虫宿主细胞的实例包括鳞翅目(Lepidoptora)细胞系，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾(Trichoplusioa ni)细胞(High Five)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法转化昆虫细胞并在其中产生异源多肽。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如，CHO-K1；ATCCCCL-61)，绿猴细胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)，COS7(ATCCCRL-1651))；小鼠细胞(如，NS/O)，仓鼠幼鼠肾脏(BHK)细胞系(如，ATCCCRL-1632或ATCC CCL-10)和人细胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及组织培养中的植物细胞。其它合适的细胞系在本领域中是已知的并可得自公共保藏中心如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳动物细胞(如CHO细胞)可按US5047335所述方法进行修饰来表达唾液酸转移酶，如，1，6-唾液酸转移酶，以便改进所述多肽变体的糖基化。
为了增加分泌，特别希望使本发明多肽变体与内切蛋白酶，尤其是PACE(配对的碱性氨基酸转化酶)(US5986079)，如Kex2内切蛋白酶(WO00/28065)一起产生。
将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括，磷酸钙介导的转染，电穿孔，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染，病毒载体和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000进行的转染方法。这些方法在本领域中是已知的，例如参见Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，USA。哺乳动物细胞的培养按成熟方法进行，例如参见Animal Cell Biotechnology，Methodsand Protocols，Nigel Jenkins编，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USA以及Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997。
在本发明的产生方法中，用本领域已知的方法在适于产生所述多肽变体的营养培养基中培养细胞。例如，细胞可以在实验室中通过摇瓶培养，小规模或大规模发酵(包括连续，分批，补料分批或固态发酵)来培养，或在合适的培养基中并在允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行工业发酵。所述培养在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法来进行。合适的培养基可商购或可以按公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽变体分泌在营养培养基中，该多肽可从培养基中直接回收。如果多肽变体不被分泌，可从细胞裂解物中回收。
所得多肽变体可通过本领域已知的方法来回收。例如，多肽变体可通过常规方法从营养培养基中回收，所述方法包括但不限于，离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发或沉淀。
多肽可通过本领域已知的各种方法来纯化，所述方法包括但不限于，层析(如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦和大小排阻)，电泳方法(如，制备性等电聚焦)，溶解度差异(如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE或提取(参见，如Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
本发明的单链多肽变体可以用文献中公开的多种方法纯化并被活化为双链多肽变体(Broze和Majerus，1980，J.Biol.Chem.255：1242-47，Hedner和Kisiel，1983，J.Clin.Invest.71：1836-41)。另一种可纯化单链多肽变体的方法是US 5,700,914所述的在纯化过程中引入Zn离子。一个优选实施方案中，所述多肽变体被纯化为单链多肽变体。所述单链多肽变体通过使用固定化酶(如凝血因子IIa，IXa，Xa和XIIa)来活化，或通过使用正电荷离子交换基质等自我活化。
有利的是，首先纯化单链形式的多肽变体，然后进行PEG化(如果需要)，最后通过上述方法之一或如Pedersen等，1989，Biochemistry 28：9331-36所述的自我活化进行活化。在活化前进行PEG化的优点在于，避免对R152-I153剪切所形成的新的氨基末端进行PEG化。该新的氨基末端的PEG化可使所述分子失活，因为D242和氨基末端I153之间形成的氢键是活性所必需的。
本发明的药物组合物及其用途
另一个方面，本发明涉及组合物，尤其药物组合物，其包含本发明的多肽变体和可药用载体或赋形剂。
本发明的多肽变体或药物组合物可用做药物。
由于前文所述的改进特性，本发明的多肽变体或本发明的药物组合物尤其可用于治疗创伤患者，血小板减少症患者(thrombocytopenic patient)，抗凝治疗中的患者，有静脉曲张(variceal)出血或其它上胃肠道出血的硬化患者，和接受正位(orthotopic)肝移植或肝切除(允许无输血(transfuseion)的外科手术)的患者中的失控出血事件。
创伤被定义为由外在因素(extrinsic agent)引起的活组织损伤。这是美国第4大致死因素，在经济上带来了巨大的财政负担。
创伤分为钝伤或穿透伤。钝伤导致内部压力(compression)，器官损伤和内部出血，而穿透伤作为一种穿刺机体和损伤组织，血管和器官的因素的结果，导致外部出血。
出血作为创伤的一种结果，可以引起一系列的问题。例如，生理代偿机制都始于最初的外周和肠系膜(mesenteric)血管收缩，以便使血流分流(shunt)到中心循环(central circulation)。如果循环未恢复，必然发生低血容量休克(hypovolemia shock)(因灌血(perfusion)不足引起的多器官衰竭)。由于整个机体的组织缺乏氧气，开始了厌氧代谢。然而，伴随而来的乳酸引起血液pH降低和发生代谢性酸中毒。如果酸中毒很严重且未矫正，该患者将发生多系统衰竭和死亡。
绝大多数创伤患者在到达急诊室时因事发地点(at the scene)的环境条件而导致低体温(hypothermia)，但保护不足，静脉内输液和持续失血可以使这种低体温状态恶化。凝血因子的缺陷可以是由失血或输血引起的。同时，酸中毒和低体温干扰凝血机制。因此发生凝血病(coagulopathy)，它可以掩盖外科手术出血点并妨碍对机械性出血的控制。低体温，凝血病和酸中毒常常被认定为“死亡的创伤三联症(trauma triad of death)”。
创伤可以由多种事件引起。例如，道路交通事故导致多种不同类型的创伤。虽然一些道路交通事故很可能导致穿透伤，但很多道路交通事故却很可能造成头部和机体的双重钝伤。而这些不同类型的创伤都可以导致患者的凝血病。道路交通事故在美国是意外死亡的主要原因。美国每年有超过42,000例死亡是由于道路交通事故所致。很多创伤病人在他们到达或被转移到急救中心(ER)之前在事故地点接受医务人员处理时死亡。
另一个例子包括枪伤。枪伤是可以引起大量出血的创伤。它们是穿透性的并在子弹穿过机体(躯干或一肢)时破坏组织。美国一年有大约40,000人死于枪伤。
另一个例子包括跌伤。跌伤导致与道路交通事故类似的情形(profile)。从高处跌落到硬物(solid object)或地上既可以导致穿透伤也可以导致减速性(decelerative)钝伤。在美国，跌伤是意外死亡的常见原因，有大约13,000例。
再一个例子包括机械事故。在美国，死于与机械意外(机械撞击或缠在机械中)有关的死亡的人略少一点。数量虽少但很明显-约2,000。
还有一个例子包括刺伤。刺伤也是可以引起大量出血的穿透伤。最容易在穿透伤中受损的器官有肝脏，小肠和结肠。
肝硬化是对肝实质长期反复损伤的最终结果。这种最终结果是形成宽的纤维组织带(band)分隔再生结节，它们不能维持肝小叶的正常组成，并因此引起肝功能恶化。由于维生素K依赖性凝血因子的消耗，病人的凝血酶原时间延长(prolonged prothrombin time)。从病因的角度说，肝硬化应被看成是慢性肝损伤的最终共同途径，它可以由任何形式的反复长期肝细胞强损伤造成。肝硬化可以因直接肝损伤以及通过胆管损伤造成的间接损伤引起，所述直接肝损伤包括慢性酒精中毒，慢性病毒性肝炎(乙型，丙型和丁型)，和自身免疫性肝炎，所述间接损伤包括原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎和胆道闭锁。引起硬化的较不常见原因包括遗传病引起的直接肝损伤，所述遗传病例如囊性纤维化，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，血色素沉着，Wilson病，半乳糖血症，和糖原贮积病(glycogen storage disease)。
移植主要用于晚期肝硬化病人，它是治疗该病的关键介入疗法。为了适合于接受移植，病人的分类必需为Child B级或C级，并符合其它选择标准。去年，仅在美国，就进行了4,954例移植。
据估计，每年有6,000例出血事件与病人接受切除术有关。这与该手术的保守性地位有关，但比移植例数略高。
静脉曲张出血的准确数据很难获得。已知的关键因素是，诊断当时静脉曲张出现在约60％的失代偿病人和约30％的代偿病人中，且这些伴有静脉曲张的病人有大约30％将发生出血，且每一次静脉曲张出血事件都伴有30％死亡危险。
因此，本发明另一方面涉及本发明多肽变体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗需要形成凝血块的疾病。本发明还有一方面涉及治疗哺乳动物疾病的方法，所述疾病是需要形成凝血块的疾病，所述方法包括给有此需要的哺乳动物给药有效量的本发明多肽变体或药物组合物。
血小板减少由三种机制之一引起：骨髓生成减少，脾脏潴留(sequestration)增加，或血小板的破坏加速。血小板减少是出血(hemorrhage)的危险因子，而血小板输液可以减少出血的发生率。预防性血小板输注的阈值是10,000/μl。在没有发烧或感染的病人中，阈值5000/μl可能足以阻止自发性出血。在侵入性操作中，50,000/μl血小板是通常的目标水平。在那些于反复输血后产生了血小板抗体的病人中，出血极难控制。
需要增加凝血块形成的疾病的例子包括，但不限于，出血(hemorrhages)，包括脑出血，以及患严重失控的出血如创伤的病人。其它例子包括接受活体移植的病人，接受切除术的病人和患静脉曲张出血的病人。
本发明的多肽变体以治疗有效剂量给予病人，所述剂量通常大约与用rFVII如NovoSeven治疗所采用的剂量相同或更低。本文中“治疗有效剂量”是指对所治疾病状态足以产生预期效果的剂量。给药的准确剂量取决于具体情况，可通过本领域技术人员公知方法利用已知技术加以确定。一般来说，所述剂量应当能够防止或减小被治疗疾病或症状的严重程度或扩散。本领域技术人员很容易认识到，本发明多肽变体或组合物的有效量取决于，例如，疾病，剂量，给药方案，多肽变体或组合物是单独给药还是与其它治疗剂联合给药，组合物的血浆半衰期，以及患者的总体健康状况等。优选，本发明的多肽变体或组合物以有效剂量给予，尤其以足以使凝血疾病正常化的剂量给予。
本发明的多肽变体优选以组合物形式给药，其中包括可药用载体或赋形剂。“可药用”意指在给药的患者中不引起任何不利作用的载体或赋形剂。这类可药用载体和赋形剂在本领域中是公知的(参见，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer and L.Hovgaard，Eds.，Taylor&Francis[2000]；andHandbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press[2000])。
本发明的多肽变体可通过公知方法配制成药物组合物。合适的配制剂在E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mark Publ公司，第16版，1980)中描述。
本发明的多肽变体可以以其原形和/或以其盐的形式使用。合适的盐包括但不限于，与碱金属或碱土金属如钠，钾，钙和镁形成的盐，以及例如锌盐。这些盐或复合物可作为晶体和/或无定形结构存在。
本发明的药物组合物可单独给予也可以与其它治疗制剂联合给予。这些制剂可以作为相同药物组合物的一个部分而掺入，或者与本发明多肽变体分别给予，这时可以是同时给予或依照另一治疗时间表给予。此外，本发明的多肽变体或药物组合物可用做其它治疗的辅助剂。
本发明中“患者”包括人和其它哺乳动物。因此，所述方法可以应用于人的治疗和兽医学应用。包含本发明多肽变体的药物组合物可以配制成多种形式，如液体，凝胶，冻干形式，或压制的固体形式。优选的形式取决于所治疗的具体症状，这对于本领域技术人员是显而易见的。
具体地，包含本发明多肽变体的药物组合物可以配制成冻干形式或稳定溶液形式。所述多肽变体可通过多种本领域公知方法冻干。多肽变体可通过按照本文所述去除或掩盖蛋白酶解位点而制备成稳定溶液形式。获得稳定溶液制剂的优点在于更便于患者使用，而且在紧急情况时，作用更快，这可能可以救生。优选的形式取决于所治疗的具体症状，这对于本领域技术人员是明显的。
本发明的配制剂可以通过多种途径给药，包括但不限于，口服，皮下，静脉内，脑内，鼻内，经皮，腹腔，肌肉内，肺内，经阴道，经直肠，眼内，或以任何其它可接受的方式。配制剂可利用本领域公知技术(如泵或植入)连续灌注给予，但大药丸注射(bolus injection)也是可接受的。一些情况下所述配制剂可以以溶液或喷雾剂形式直接给予。
非胃肠道给药剂(Parentals)
药物组合物的优选实例是设计成非胃肠道给药的溶液。尽管在很多情况下，药物溶液配制剂可以以适用于立即使用的液体形式提供，但非胃肠道配制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性化合物在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如无菌注射用水或无菌生理盐水溶液来重建。
在非胃肠道给药剂的情况下，所述给药剂可以制备成冻干配制剂或水溶液以便贮存，制备方法例如是，在需要时将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体，赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合，所述赋形剂如缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子表面活性剂或去污剂，抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡糖酸盐(gluconate)缓冲剂(如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物，葡糖酸-氢氧化钠混合物，葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂，组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，omithine，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露糖醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽，硫辛酸，硫代乙酸钠，硫代甘油，α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖和葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。稳定剂通常的存在范围为0.1-10,000重量份，基于活性蛋白重量计。
可以加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚，苯甲醇，间甲酚，羟苯甲酸(paraben)甲酯，羟苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苯甲基氯化铵，苯扎卤铵(benzalkonium halide)(如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)，苯扎溴铵或苯扎碘铵)，氯化己烷双胺(hexamethonium chloride)，羟苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油，赤藓醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以其它组分的相对量计算。
可以包括非离子表面活性剂或去污剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽以避免搅拌诱导的聚集，其也允许该配制剂暴露于剪切表面压力而不导致该多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括polysorbate(20，80等)，polyoxamer(184，188等)，Pluronic多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(polyoxyethylene sorbitan monoether)(吐温20，吐温80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)，螯合剂(如EDTA)，抗氧化剂(如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和共溶剂。
活性组分也可以包裹在例如通过coascervation技术或通过界面聚合所制备的微囊(例如羟甲基纤维素，明胶或聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中，包裹在胶体状药物运送系统(例如脂质体，白蛋白微球，微乳，纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包裹在大乳剂中。这些技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences(同上)中。
体内给药所使用的非胃肠道配制剂必须是灭菌的。该过程容易完成，例如，通过除菌滤膜来过滤。
持续释放制剂
持续释放制剂的例子包括含有多肽变体的固体疏水聚合物的半渗透材料(matrice)，该材料具有合适的形式如膜或微囊。持续释放材料的例子包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技术或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如最长达或超过100天，一些水凝胶释放蛋白的时间短。当包囊中的多肽长时间保留在体内时，它们因在37℃潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致生物活性丧失并且可能改变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基，冻干酸性溶液，控制湿度，使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物材料组合物来达到稳定。
本发明进一步在下列非限制性实施例中描述。
材料和方法
可接近的表面区域(ASA)
使用计算机程序组(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(1983 Yale University)计算结构中各个原子的可接近的表面区域(Accessible Surface Area，ASA)。该方法通常使用1.4的探针大小并将可接近的表面区域(ASA)定义为探针中心形成的面积。于该计算前，从坐标中去除所有水分子和所有氢原子，以及其它不与该蛋白直接相连的原子。
侧链的分级(fractional)ASA
侧链原子的分级ASA通过将侧链中原子的ASA总和除以延长的ALA-x-ALA三肽中该残基类型的侧链原子的ASA代表值来计算(参见Hubbard，Campbell&Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530)。在本例中，CA原子被看作甘氨酸残基侧链的一部分但不被看作其它残基的一部分。下表表示侧链的100％ASA标准：
 Ala  69.232  Leu  140.762
 Arg  200.352  Lys  162.502
 Asn  106.252  Met  156.082
 Asp  102.062  Phe  163.902
 Cys  96.692  Pro  119.652
 Gln  140.582  Ser  78.162
 Glu  134.612  Thr  101.672
 Gly  32.282  Trp  210.892
 His  147.002  Tyr  176.612
 Ile  137.912  Val  114.142
将该结构中未检测到的残基被定义为具有100％的暴露，因其被认为位于弹性区域(flexible region)中。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35处的γ-羧基谷氨酸都被定义为100％暴露。
确定原子之间的距离
利用分子绘图软件，如Insight IIv.98.0，MSI INC.，可方便地确定原子之间的距离。
活性位点区
活性位点区定义为任何这样的残基，所述残基具有至少一个原子在催化三联体(残基H193，D242，S344)内任何原子的10距离内。
确定组织因子结合位点
TF结合位点被定义为包含所有这类残基，所述残基在TF结合时，其可接近的表面区域发生改变。这通过至少两个ASA计算来确定；一个基于配体/受体复合物中分离的配体，另一个基于完整的配体/受体复合物。
检测降低的对蛋白酶解的敏感性
蛋白酶解可通过US 5,580,560的实施例5所述试验检测，其中的蛋白酶解是自我蛋白酶解。
此外，降低的蛋白酶解可利用放射性标记的样品在体内模型中进行检测，其包括取血样并对这些血样进行SDS-PAGE和放射自显影来对比rhFVIIa和本发明多肽变体的蛋白酶解作用。
无论使用何种试验确定蛋白酶解，“降低的蛋白酶解”是指，通过对考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶进行凝胶扫描，HPLC，或者利用下述组织因子非依赖性活性试验测定相对于野生型所保留的(conserved)催化活性，发现裂解程度比rhFVIIa明显降低。
测定多肽变体的分子量
多肽变体的分子量通过以下方法确定：SDS-PAGE，凝胶过滤，Western印迹，基质辅助的激光解吸(matrix assisted laser deserption)，质谱分析或平衡离心(equilibrium centrifugation)，如根据Laemmli，UK(Nature Vol 227(1970)，pp.680-85)所述的SDS-PAGE。
TF-非依赖性凝血因子X活化试验
该试验详见Nelsestuen等，J Biol Chem，2001；276：39825-39831的39826页。
简言之，将待测分子(hFVIIa，rhFVIIa或活化的本发明多肽变体)与磷脂源(磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸8∶2，或磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇4∶2∶4)和凝血因子X在含BSA的Tris缓冲液中混合。经过指定的温育时间后，加入过量EDTA终止反应。然后加入显色底物(S-2222，Chromogenix)，测定405nm处的吸光度改变，从而测量凝血因子Xa的浓度。根据本底进行校正后，将rhFVIIa的组织因子非依赖性活性(awt)确定为10分钟之后的吸光度改变，将本发明多肽变体的组织因子非依赖性活性(avariant)也确定为10分钟之后的吸光度改变。将活化的多肽变体的活性和rhFVIIa的活性的比定义为avariant/awt。
凝血试验
在一步试验(one-stage assay)中测定凝血活性，并将凝血时间记录在Thrombotrack IV血凝度仪(MEDINOR)上。耗尽了FVII的人血浆(AmericanDiagnostica)在室温重建并平衡15-20分钟。然后将50μl血浆转移到血凝度仪的杯中。
将hFVIIa，rhFVIIa或变体用Glyoxaline缓冲液(5.7mM巴比土酸盐(barbiturate)，4.3mM柠檬酸钠，117mM NaCl，1mg/mL BSA，pH7.35)稀释。将50μl样品添加到所述杯中，37℃保温2分钟。
织促凝血酶原激酶(Thromboplastin)(MEDINOR)用水重建，添加CaCl2。加入0.1ml含4.5mM CaCl2的织促凝血酶原激酶以便使反应起始。
数据用PRISM软件进行分析。
TF-非依赖性凝血试验
该试验按照上述“凝血试验”进行，但不加织促凝血酶原激酶。
酰胺分解试验
所述变体分解小肽底物的能力可以用显色底物S-2288(D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺(p-nitroanilide))来测量。酰胺分解活性可以在有和无抗凝血酶III(ATIII)的情况下都进行测量。
将HFVIIa，rhFVIIa或变体用试验缓冲液(50mM Na-Hepes pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％BSA，1U/ml肝素)稀释为90nM。另将可溶性TF(sTF)用试验缓冲液稀释为450nM。将ATIII用试验缓冲液稀释为900nM。将120μl试验缓冲液与20μl FVIIa样品，20μl sTF和20μl ATIII或试验缓冲液混合。FVIIa，sTF和ATIII的终浓度分别为10，50和100nM。室温保温5分钟并轻轻摇动，之后在37℃保温10分钟，通过添加S-2288底物至1mM使反应起始，在数个时间点测定405nm处的吸光度。
凝血图试验(Thrombogram Assay)
hFVIIa，rhFVIIa或变体对人血浆中凝血酶生成的影响在改良版的Hemker等Thromb Haemost 2000；83：589-91第589页所述试验中检测。简言之，将待测分子(hFVIIa，rhFVIIa或变体)与正常的血小板丰富的血浆(PRP)，正常的血小板贫乏的血浆(PPP)或耗尽了FVII的PPP混合，加或不加重组人组织因子(rTF)，重新脂化的(relipidated)rTF或另一种TF源(如织促凝血酶原激酶)。可以加入磷脂源(磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸8∶2，或磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇4∶2∶4)。
加入荧光性凝血酶底物和氯化钙使反应起始。连续测量荧光，通过计算荧光曲线的斜率(荧光随时间的增强)来计算凝血酶的酰胺分解活性。通过这种方式可以计算直至获得最大凝血酶酰胺分解活性的时间(Tmax)和总凝血酶效力(work)(曲线下面积(AUC))。
用到了以下方法：将新鲜采集的血在250g，15℃离心10min，获得PRP。用柠檬酸盐(13mM柠檬酸三钠)，玉米胰蛋白酶抑制剂(50-100μg/ml血)或柠檬酸盐与玉米胰蛋白酶抑制剂的混合物抑制血液凝固。将血小板计数用缓冲液或自体血小板贫乏的血浆(PPP)调整到3×108/mL。将PRP两次在1000g，15℃离心10min，获得PPP。将PPP与偶联至固相的FVII特异性单克隆抗体一起保温，使FVII耗尽。
在96-孔微滴板的每一孔中加入80μl PRP和20μL缓冲液，所述缓冲液中包含终浓度为0.1-100nM的rhFVII或待测变体。将rTF添加到5μL试验缓冲液中，使其终浓度为1pM。试验缓冲液组成如下：20mM Hepes，150mM NaCl和60mg/ml BSA，蒸馏水。加入20μL含0.1M氯化钙的底物溶液来开始反应。试验板和试剂在37℃预温，反应也在该温度进行。所用的荧光计是一种BMG荧光计(Fluormeter)，配备有390nm的激发滤片和460nm的发射滤片。在30-180分钟内，以20-40秒的间隔，测量96孔透底平板(clear bottom plate)上每一孔的荧光。数据用PRISM软件进行分析。
ELISA试验
FVII/FVIIa(或变体)的浓度用ELISA测定。将微滴板的孔用抗蛋白酶结构域的抗体在PBS中的2μg/ml溶液包被(100μl/孔)。室温包被2小时后，将这些孔用THT缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.2 0.05％Tween-20)洗4次。此后，每孔添加200μl 1％酪蛋白(用100mM NaCl，50mM Tris-HClpH 7.2从2.5％原液稀释)进行封闭。室温保温1hr后，将孔清空，加入100μl样品(任选用稀释缓冲液(THT+0.1％酪蛋白)进行稀释)。再次于室温保温1hr后，孔用THT缓冲液洗4次，加入100μl经生物素-标记的抗EGF-样结构域抗体(1μg/ml)。室温保温1hr，然后再用THT缓冲液洗4次，加入100μl链亲和素-辣根过氧化物酶(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，稀释到1/10000)。室温保温1hr，然后再用THT缓冲液洗4次，加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，Kem-en-Tech A/S，Denmark)。室温避光保温30min，加入100μl1M H2SO4，测定OD450nm。用rhFVIIa(NovoSeven)制备标准曲线。
或者，FVII/FVIIa或变体可以通过Gla结构域而非蛋白酶结构域来定量。在该ELISA设置中，孔用抗EGF-结构域的抗体包被过夜，用钙-依赖性生物素-标记的单克隆抗-Gla结构域抗体(2μg/ml，100μl/孔)进行检测。在该设置中，将5mM CaCl2添加到THT和稀释缓冲液中。
全血试验
全血凝血试验按照Elg等Thrombosis Res.2001，101(3)：159-170所述进行。
重建的凝固试验
重建的凝固试验(reconstituted coagulation assay)按照Van‘t Veer等Blood2000，95(4)，1330-1335所述进行。
实施例
实施例1
本实施例使用Banner等(J Mol Biol，1996；285：2089)确定的hFVIIa与可溶性组织因子形成的复合物的X射线结构。注意，该参考文献中的残基序号并不与该序列一致。本文所用序号依据SEQ ID NO：2。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35处的γ-羧基谷氨酸在此都命名为GLU(三字母简写)或E(单字母简写)。所述结构中不存在第143-152位的残基。
表面暴露
单独计算FVII片段的分级ASA，结合上述方法中对非标准残基和/或丢失残基的可接近性的定义，确定以下残基有超过25％的侧链暴露于其表面：A1，N2，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，S12，L13，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，F24，E25，E26，R28，E29，F31，K32，D33，A34，E35，R36，K38，L39，W41，I42，S43，S45，G47，D48，Q49，A5 1，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，D63，Q64，L65，Q66，S67，I69，F7 1，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，T83，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，E99，S103，D104，H105，T106，G107，T108，K109，S111，R113，E116，G117，S119，L120，L121，A122，D123，G124，V125，S126，T128，P129，T130，V131，E132，I140，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，V158，P160，K161，E163，L171，N173，G174，A175，N184，T185，I186，H193，K197，K199，N200，R202，N203，I205，S214，E215，H216，D217，G218，D219，S222，R224，S232，T233，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H249，Q250，P251，V253，T255，D256，E265，R266，T267，E270，R271，F275，V276，R277，F278，L280，L287，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，E296，N301，M306，T307，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，V317，G318，D319，S320，P321，N322，T324，E325，Y326，Y332，S333，D334，S336，K337，K341，G342，H351，R353，G354，Q366，G367，T370，V371，G372，R379，E385，Q388，K389，R392，S393，E394，P395，R396，P397，G398，V399，L400，L401，R402，P404和P406(A1-S45位于Gla结构域中，其它位置位于G1a结构域以外)。
以下的残基有超过50％的侧链暴露于表面：A1，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，E25，E26，E29，K32，A34，E35，R36，K38，L39，I42，S43，G47，D48，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，T106，G107，T108，K109，S111，E116，S119，L121，A122，D123，G124，V131，E132，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，P160，N173，G174，A175，K197，K199，N200，R202，S214，E215，H216，G218，R224，V235，P236，G237，T238，H249，Q250，V253，D256，T267，F275，R277，F278，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，N301，M306，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，G318，D319，N322，E325，D334，K341，G354，G367，V371，E385，K389，R392，E394，R396，P397，G398，R402，P404和P406(A1-S43位于Gla结构域中，其它位置位于Gla结构域以外)。
组织因子结合位点
经过ASA计算，人FVII中的以下残基在复合物中改变了它们的ASA。这些残基被定义为组成受体结合位点的残基：L13，K18，F31，E35，R36，L39，F40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F71，C72，L73，P74，F76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R27 1，A274，F275，V276，R277，F278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q312，Q313，E325和R379。
活性位点区
活性位点区被定义为下述任何残基：其具有至少一个与催化三联体(残基H193，D242，S344)中任何原子间距在10以内的原子：I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405。
活性位点结合槽(cleft)的脊(ridge)
活性位点结合槽区域的脊通过目测FVIIa结构1FAK.pdb而定义为：N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370。
实施例2
用于在哺乳动物细胞中表达rhFVII的表达盒的设计
SEQ ID NO：1所示DNA序列包含编码hFVII及其天然短信号肽的全长cDNA的短形式(Hagen等，1986.PNAS 83：2412)，合成该DNA序列以便有利于其在哺乳动物细胞中的高表达。首先根据Kozak共有序列(Kozak，M.JMol Biol 1987 Aug 20；196(4)：947-50)修饰ATG起始密码子的周围序列(context)，以使ATG起始密码子上游共有序列完全匹配。其次，通过将密码子使用习惯调整为偏好高表达的人基因中常用的密码子，来修饰天然cDNA的开放读框。此外，在开放读框末端插入两个翻译终止密码子，以便有利于有效终止翻译。用70-mer DNA寡核苷酸装配出完全合成且优化表达的hFVII基因，最后用分别插入5’和3’末端的BamHI和HindIII位点的末端引物经标准PCR技术扩增，得到以下序列：
ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgcagggctgcctggctgc
cgtcttcgtcacccaggaggaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctggaagagct
ccgccctggctccctggaacgcgaatgcaaagaggaacagtgcagctttgaggaagcccgggagattttcaaag
acgctgagcggaccaaactgttttggattagctatagcgatggcgatcagtgcgcctccagcccttgccagaacgg
gggctcctgcaaagaccagctgcagagctatatctgcttctgcctgcctgcctttgaggggcgcaattgcgaaacc
cataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacgggggctgcgagcagtactgcagcgatcacacgggcac
gaagcggagctgccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtcctgcacgcccacggtggaat
acccttgcgggaagattcccattctagaaaagcggaacgctagcaaaccccagggccggatcgtcggcgggaag
gtctgccctaagggggagtgcccctggcaggtcctgctcctggtcaacggggcccagctgtgcggcgggaccct
catcaataccatttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcgataagattaagaattggcggaacctcatcgctgtgctc
ggcgaacacgatctgtccgagcatgacggggacgaacagtcccgccgggtggctcaggtcatcattccctccacc
tatgtgcctggcacgaccaatcacgatatcgctctgctccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccgatcacgtcgt
gcctctgtgcctgcctgagcggacctttagcgaacgcacgctggctttcgtccgctttagcctcgtgtccggctggg
gccagctgctcgaccggggcgctaccgctctcgagctgatggtgctcaacgtcccccggctgatgacccaggact
gcctgcagcagtcccgcaaagtgggggactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgctggctatagcgatgg
ctccaaggatagctgcaagggggactccggcgggccccatgccacgcactatcgcgggacctggtacctcaccg
ggatcgtcagctggggccagggctgcgccacggtggggcactttggcgtctacacgcgcgtcagccagtacatt
gagtggctgcagaagctcatgcggagcgaaccccggcccggggtgctcctgcgggcccctttcccttgataaaa
gctt
所得PCR产物包含hFVII表达盒，用于克隆该产物的载体通过从pCINeo(Promega)克隆内含子来制备。pCI-Neo的合成内含子用标准PCR条件扩增，引物如下：
CBProFpr174：5’-AGCTGGCTAGCCACTGGGCAGGTAAGTATCA-3’和
CBProFpr175：5’-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT-3’
得到322 bp的PCR片段。该片段用NheI和BamHI剪切，之后克隆到pCDNA3.1/HygR(Invitrogen)，得到PF#34。
将hFVII的表达盒克隆到PF#34的BamHI和HindIII位点之间，得到质粒PF#226。
实施例3
在CHOK1细胞中表达多肽变体
将细胞系CHOK1(ATCC#CRL-61)以50％汇合水平接种在T-25培养瓶中，用MEMα，10％FCS(Gibco/BRL Cat#10091)，P/S和5μg/ml植醌使细胞生长直到汇合。汇合的单层细胞用5μg上述相关质粒以Lipofectamine 2000为转染试剂(Life technologies)按照产生商的方法进行转染。转染后24小时，取样，采用例如识别hFVII的EGF1结构域的ELISA进行定量。在该时间点，可以对细胞进行相关筛选(如潮霉素B筛选)，以便得到一群稳定转染体。当使用CHOK1细胞，并以质粒上的潮霉素B抗性基因作为选择标记时，这通常在一周内完成。
实施例4
制备稳定表达多肽变体的CHOK1细胞
将一小瓶CHOK1转染子解冻，并将细胞接种于含15ml MEMα，10％FCS，植醌(5μg/ml)，100U/l青霉素，100μg/l链霉素的175cm2组织培养瓶中，生长24小时。收集细胞，将其稀释并以1/2-1细胞/孔的密度铺96孔微滴板。生长一周后，孔中出现20-100个细胞的集落，将仅包含一个集落的那些孔进行标记。再生长2周后，将所有仅包含一个集落的孔中的培养基更换为200μl新鲜培养基。24小时后，对培养基取样，采用例如ELISA进行分析。选出高产生力克隆，将其用于大规模产生FVII或变体。
实施例5
多肽变体的纯化和随后的活化
FVII和FVII变体如下纯化：在4℃进行纯化。从大规模产生中收获培养基，用配备有30KDa截留值的Pellicon膜的Millipore TFF系统进行超滤。在将培养基浓缩后，加入柠檬酸至5mM，将pH调整为8.6。必要时，将导电性降到10mS/cm以下。随后，将样品加载到已经用50mM NaCl，10mMTris pH 8.6平衡过的Q-sepharose FF层析柱中。用100mM NaCl，10mM TrisDH 8.6洗柱，然后用150mM NaCl，10mM Tris pH 8.6洗柱，FVII用10mMTris，25mM NaCl，35mM CaCl2，pH 8.6洗脱。
在第二轮层析步骤中，将单克隆钙-依赖性抗Gla-结构域抗体与经过CNBr-活化的Sepharose FF偶联，制备亲和层析柱。每ml树脂偶联约5.5mg抗体。该柱用10mM Tris，100mM NaCl，35mM CaCl2，pH 7.5平衡。向样品中加入NaCl，使达到100mM NaCl，将pH调整为7.4-7.6。样品过夜(O/N)加载后，用100mM NaCl，35mM CaCl2，10mM Tris pH 7.5洗柱，FVII蛋白用100mM NaCl，50mM柠檬酸盐，75mM Tris pH 7.5洗脱。
在第三轮层析中，将样品的导电性降到10mS/cm以下(必要时)，并将pH调整到8.6。然后将样品加载到Q-sepharose层析柱(已用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6平衡)中，加载密度为大约3-5mg蛋白/ml凝胶以便进行有效活化。之后，用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6以3-4个柱体积(cv)/hr的流速洗柱约4小时。FVII蛋白用40cv内0-100％梯度的500mM NaCl，10mMTris pH 8.6洗脱。集中含有FVII的级分。
在最后一轮层析中，将样品的导电性降到10mS/cm以下。随后，将样品以3-5mg蛋白/ml凝胶的浓度加载到Q-sepharose层析柱(已用140mMNaCl，10mM甘氨酰甘氨酸pH 8.6平衡)中。然后用140mM NaCl，10mM甘氨酰甘氨酸pH 8.6洗柱，FVII用140mM NaCl，15mM CaCl2，10mM甘氨酰甘氨酸pH 8.6洗脱。洗脱物用10mM CaCl2稀释，并将pH调整为6.8-7.2。最后，加入Tween-80直至0.01％，将pH调整到5.5以便在-80℃贮存。
                           序列表
<110>马克西根公司(Maxygen ApS)；马克西根控股公司(Maxygen Holdings)
<120>凝血因子VII或VIIa多肽变体
<130>0259wo210
<140>
<141>
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1338
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(115)..(1335)
<400>1
atggtcagcc aggccctccg cctcctgtgc ctgctcctgg ggctgcaggg ctgcctggct 60
gccgtcttcg tcacccagga ggaagcccat ggcgtcctgc atcgccggcg ccgg gcc  117
                                                            Ala
                                                              1
aat gcc ttt ctg gaa gag ctc cgc cct ggc tcc ctg gaa cgc gaa tgc  165
Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys
              5                  10                  15
aaa gag gaa cag tgc agc ttt gag gaa gcc cgg gag att ttc aaa gac  213
Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp
         20                  25                  30
gct gag cgg acc aaa ctg ttt tgg att agc tat agc gat ggc gat cag  261
Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln
     35                  40                  45
tgc gcc tcc agc cct tgc cag aac ggg ggc tcc tgc aaa gac cag ctg  309
Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu
 50                  55                  60                  65
cag agc tat atc tgc ttc tgc ctg cct gcc ttt gag ggg cgc aat tgc  357
Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys
                 70                  75                  80
gaa acc cat aag gat gac cag ctg att tgc gtc aac gaa aac ggg ggc  405
Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly
             85                  90                  95
tgc gag cag tac tgc agc gat cac acg ggc acg aag cgg agc tgc cgc  453
Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg
        100                 105                 110
tgc cac gaa ggc tat agc ctc ctg gct gac ggg gtg tcc tgc acg ccc    501
Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro
    115                 120                 125
acg gtg gaa tac cct tgc ggg aag att ccc att cta gaa aag cgg aac    549
Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn
130                 135                 140                 145
gct agc aaa ccc cag ggc cgg atc gtc ggc ggg aag gtc tgc cct aag    597
Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys
                150                 155                 160
ggg gag tgc ccc tgg cag gtc ctg ctc ctg gtc aac ggg gcc cag ctg    645
Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu
            165                 170                 175
tgc ggc ggg acc ctc atc aat acc att tgg gtc gtg tcc gcc gct cac    693
Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His
        180                 185                 190
tgc ttc gat aag att aag aat tgg cgg aac ctc atc gct gtg ctc ggc    741
Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly
    195                 200                 205
gaa cac gat ctg tcc gag cat gac ggg gac gaa cag tcc cgc cgg gtg    789
Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val
210                 215                 220                 225
gct cag gtc atc att ccc tcc acc tat gtg cct ggc acg acc aat cac    837
Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His
                230                 235                 240
gat atc gct ctg ctc cgc ctc cac cag ccc gtc gtg ctc acc gat cac    885
Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His
            245                 250                 255
gtc gtg cct ctg tgc ctg cct gag cgg acc ttt agc gaa cgc acg ctg    933
Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu
        260                 265                 270
gct ttc gtc cgc ttt agc ctc gtg tcc ggc tgg ggc cag ctg ctc gac    981
Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp
    275                 280                 285
cgg ggc gct acc gct ctc gag ctg atg gtg ctc aac gtc ccc cgg ctg    1029
Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu
290                 295                 300                 305
atg acc cag gac tgc ctg cag cag tcc cgc aaa gtg ggg gac tcc ccc    1077
Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro
                310                 315                 320
aat atc acg gag tat atg ttt tgc gct ggc tat agc gat ggc tcc aag    1125
Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys
            325                 330                 335
gat agc tgc aag ggg gac tcc ggc ggg ccc cat gcc acg cac tat cgc    1173
Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg
        340                 345                 350
ggg acc tgg tac ctc acc ggg atc gtc agc tgg ggc cag ggc tgc gcc    1221
Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala
    355                 360                 365
acg gtg ggg cac ttt ggc gtc tac acg cgc gtc agc cag tac att gag    1269
Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu
370                 375                 380                 385
tgg ctg cag aag ctc atg cgg agc gaa ccc cgg ccc ggg gtg ctc ctg    1317
Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu
                390                 395                 400
cgg gcc cct ttc cct tga taa                                        1338
Arg Ala Pro Phe Pro
            405
<210>2
<211>406
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu
  1               5                  10                  15
Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys
             20                  25                  30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp
         35                  40                  45
Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln
     50                  55                  60
Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn
 65                  70                  75                  80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly
                 85                  90                  95
Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys
            100                 105                 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr
        115                 120                 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg
    130                 135                 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln
                165                 170                 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala
            180                 185                 190
His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu
        195                 200                 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg
    210                 215                 220
Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tvr Val Pro Gly Thr Thr Asn
225                 230                 235                 240
His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp
                245                 250                 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr
            260                 265                 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu
        275                 280                 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg
    290                 295                 300
Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser
305                 310                 315                 320
Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser
                325                 330                 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr
            340                 345                 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys
        355                 360                 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile
    370                 375                 380
Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu
385                 390                 395                 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro
                405
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CBProFprl74引物
<400>3
agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a                                     31
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CBProFprl75引物
<400>4
tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t                                     31

Claims (59)

1.凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽的变体，其具有下述氨基酸序列，该序列相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的人凝血因子VII(hFVII)或人凝血因子VIIa(hFVIIa)而言包含3-15个氨基酸修饰，其中所述变体的氨基酸序列在第10和第32位包含氨基酸取代，并且有糖组分与引入到Gla结构域以外的位置的体内N-糖基化位点共价连接。
2.权利要求1的变体，其中所述在第10位的取代为P10Q。
3.权利要求1或2的变体，其中所述在第32位的取代为K32E。
4.在先任一权利要求的变体，其中所述在第10位的取代为P10Q并且所述在第32位的取代为K32E。
5.在先任一权利要求的变体，其中所述变体在Gla结构域中包含至少一个另外的氨基酸修饰。
6.权利要求5的变体，其中所述在Gla结构域中的另外的修饰包含在第33位的氨基酸取代。
7.权利要求6的变体，其中通过在第33位的取代引入疏水氨基酸残基。
8.权利要求7的变体，其中所述取代是D33F。
9.权利要求8的变体，其中所述变体包含取代P10Q+K32E+D33F。
10.权利要求5-9之一的变体，其中所述在Gla结构域中的另外的修饰包括在第3和第4位之间插入至少一个氨基酸残基。
11.权利要求10的变体，其中所述在Gla结构域中的另外的修饰包括在第3和第4位之间插入一个氨基酸残基。
12.权利要求10或11的变体，其中将疏水氨基酸残基插入第3和第4位之间。
13.权利要求12的变体，其中所述插入是A3AY。
14.权利要求13的变体，其中所述变体包含修饰A3AY+P10Q+K32E。
15.权利要求13的变体，其中所述变体包含修饰A3AY+P10Q+K32E+D33F。
16.权利要求5-15之一的变体，其中所述在Gla结构域中的另外的修饰包括在第34位的氨基酸取代。
17.权利要求16的变体，其中通过第34位的取代引入带负电荷的氨基酸残基。
18.权利要求17的变体，其中所述取代为A34E。
19.权利要求18的变体，其中所述变体包含取代P10Q+K32E+A34E。
20.权利要求18的变体，其中所述变体包含取代P10Q+K32E+D33F+A34E。
21.权利要求18的变体，其中所述变体包含修饰A3AY+P10Q+K32E+A34E。
22.权利要求18的变体，其中所述变体包含修饰A3AY+P10Q+K32E+D33F+A34E。
23.权利要求5-22之一的变体，其中所述在Gla结构域中的另外的修饰包括在选自第8，11和28位的位置的取代。
24.权利要求23的变体，其中所述在第28位的取代为R28F或R28E。
25.在先任一权利要求的变体，其中对残基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35无修饰。
26.在先任一权利要求的变体，其中所述体内N-糖基化位点是通过取代而引入的。
27.权利要求26的变体，其中所述体内N-糖基化位点被引入到包含下述氨基酸残基的位置，所述氨基酸残基有至少25％的侧链暴露在表面(按照本文实施例1的限定)。
28.权利要求27的变体，其中所述体内N-糖基化位点被引入到包含下述氨基酸残基的位置，所述氨基酸残基有至少50％的侧链暴露在表面(按照本文实施例1的限定)。
29.权利要求26-28之一的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205S，I205T，V253N，T267N，T267N+S269T，S314N+K316S，S314N+K316T，R315N+V317S，R315N+V317T，K316N+G318S，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。
30.权利要求29的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T，S314N+K316T，R315N+V317T，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。
31.权利要求30的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：T106N，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T及其组合。
32.权利要求16-31之一的变体，其中已经通过取代而引入了一个体内N-糖基化位点。
33.权利要求16-31之一的变体，其中已经通过取代而引入了两个或更多个体内N-糖基化位点。
34.权利要求33的变体，其中已经通过取代而引入了两个体内N-糖基化位点。
35.权利要求33或34的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：A51N+G58N，A51N+T106N，A51N+K109N，A51N+G124N，A51N+K143N+N145T，A51N+A175T，A51N+I205T，A51N+V253N，A51N+T267N+S269T，A51N+S314N+K316T，A51N+R315N+V317T，A51N+K316N+G318T，A51N+G318N，A51N+D334N，G58N+T106N，G58N+K109N，G58N+G124N，G58N+K143N+N145T，G58N+A175T，G58N+I205T，G58N+V253N，G58N+T267N+S269T，G58N+S314N+K316T，G58N+R315N+V317T，G58N+K316N+G318T，G58N+G318N，G58N+D334N，T106N+K109N，T106N+G124N，T106N+K143N+N145T，T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，T106N+S314N+K316T，T106N+R315N+V317T，T106N+K316N+G318T，T106N+G318N，T106N+D334N，K109N+G124N，K109N+K143N+N145T，K109N+A175T，K109N+I205T，K109N+V253N，K109N+T267N+S269T，K109N+S314N+K316T，K109N+R315N+V317T，K109N+K316N+G318T，K109N+G318N，K109N+D334N，G124N+K143N+N145T，G124N+A175T，G124N+I205T，G124N+V253N，G124N+T267N+S269T，G124N+S314N+K316T，G124N+R315N+V317T，G124N+K316N+G318T，G124N+G318N，G124N+D334N，K143N+N145T+A175T，K143N+N145T+I205T，K143N+N145T+V253N，K143N+N145T+T267N+S269T，K143N+N145T+S314N+K316T，K143N+N145T+R315N+V317T，K143N+N145T+K316N+G318T，K143N+N145T+G318N，K143N+N145T+D334N，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，A175T+S314N+K316T，A175T+R315N+V317T，A175T+K316N+G318T，A175T+G318N，A175T+D334N，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T，I205T+S314N+K316T，I205T+R315N+V317T，I205T+K316N+G318T，I205T+G318N，I205T+D334N，
V253N+T267N+S269T，V253N+S314N+K316T，V253N+R315N+V317T，V253N+K316N+G318T，V253N+G318N，V253N+D334N，T267N+S269T+S314N+K316T，T267N+S269T+R315N+V317T，T267N+S269T+K316N+G318T，T267N+S269T+G318N，T267N+S269T+D334N，S314N+K316T+R315N+V317T，S314N+K316T+G318N，S314N+K316T+D334N，R315N+V317T+K316N+G318T，R315N+V317T+G318N，R315N+V317T+D334N和G318N+D334N。
36.权利要求35的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T和V253N+T267N+S269T。
37.权利要求36的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：T106N+I205T，T106N+V253N和I205T+T267N+S269T。
38.权利要求26-37之一的变体，其中已经通过取代而引入了三个或更多个体内N-糖基化位点。
39.权利要求38的变体，其中已经通过取代而引入了三个体内N-糖基化位点。
40.权利要求38或39的变体，其中所述体内N-糖基化位点通过选自下组的取代来引入：I205T+V253N+T267N+S269T和T106N+I205T+V253N。
41.在先任一权利要求的变体，其中所述变体为其活化形式。
42.在先任一权利要求的变体，其中所述变体的活化形式经本文所述“酰胺分解试验”分析具有rhFVIIa的酰胺分解活性的至少10％。
43.在先任一权利要求的变体，其中所述变体的活化形式经本文所述“凝血试验”分析具有rhFVIIa的凝血活性的至少10％。
44.一种核苷酸序列，其编码权利要求1-43之一的变体。
45.一种表达载体，其包含权利要求44所述的核苷酸序列。
46.一种宿主细胞，其包含权利要求44的核苷酸序列或权利要求45的表达载体。
47.权利要求46的宿主细胞，其中所述宿主细胞是能进行体内糖基化的γ羧基化细胞。
48.一种药物组合物，其包含权利要求1-43之一的变体以及可药用的载体或赋形剂。
49.权利要求1-43之一的变体，或权利要求48的药物组合物，用作药物。
50.权利要求1-43之一的变体在制备药物中的用途，所述药物在需要形成凝血块的疾病治疗中有用。
51.权利要求50的用途，其中所述疾病选自出血，包括脑出血，严重失控的出血，如创伤，进行活体移植的病人的出血，接受切除术的病人的出血，以及静脉曲张出血。
52.权利要求51的用途，其中所述疾病为创伤。
53.权利要求52的用途，其中所述疾病为钝伤。
54.权利要求52的用途，其中所述疾病为穿透伤。
55.治疗哺乳动物疾病的方法，所述疾病需要形成凝血块，所述方法包括对有此需要的病人给药有效量的权利要求1-43之一所述变体或权利要求48所述药物组合物。
56.权利要求55的方法，其中所述疾病选自出血，包括脑出血，严重失控的出血，如创伤，进行活体移植的病人的出血，接受切除术的病人的出血，以及静脉曲张出血。
57.权利要求56的方法，其中所述疾病为创伤。
58.权利要求57的方法，其中所述疾病为钝伤。
59.权利要求57的方法，其中所述疾病为穿透伤。
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