KR101234170B1 - 액체 인자 ⅶ 조성물의 바이러스 여과법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 액체 인자 Ⅶ 조성물 특히, 활성 인자 Ⅶ 폴리펩티드(인자 Ⅶa 폴리펩티드)를 포함하는 조성물의 바이러스 안정성을 개선하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
인자 Ⅶ 조성물, 인자 Ⅶ 폴리펩티드, 바이러스, 나노 여과

Description

액체 인자 Ⅶ 조성물의 바이러스 여과법{VIRUS FILTRATION OF LIQUID FACTOR Ⅶ COMPOSITIONS}
본 발명은 액체 인자 Ⅶ 조성물 특히, 활성 인자 Ⅶ 폴리펩티드(인자 Ⅶa 폴리펩티드)를 포함하는 조성물의 바이러스 안정성을 개선하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
인자 Ⅶ(FⅦ), 혈장 당단백질을 포함하는, 다양한 피 응고 과정에 수반된 인자들이 동정되어 왔다. 지혈은 혈관 벽에 상처난 후 순환하는 혈액에 노출되는 조직 인자(TF)와 총 인자 Ⅶ 단백질 양의 약 1%에 상응하는 양으로 순환계에 존재하는 인자 Ⅶa 간의 복합체 형성에 의해서 개시된다. 인자 Ⅶ는 주로 FXa에 의해 그것의 두 사슬, 활성화 형태인 인자 Ⅶa로 분할되는 단일 사슬 효소원으로 혈장에 존재한다. 재조합 활성화 인자 Ⅶa(rFⅦa)는 지혈촉진제로서 개발되어 왔다. rFⅦa의 투약은 항체 형성으로 인하여 다른 응고 인자 산물로는 치료될 수 없는, 출혈하는 혈우병 피험자에게 빠르고 높은 효능이 있는 지혈촉진반응을 보여준다. 또한, 인자 Ⅶ이 결핍된 피험자의 출혈, 또는 정상적인 응고 시스템을 가지고 있지만 과도한 출혈을 경험하는 피험자는 인자 Ⅶa로 성공적으로 치료될 수 있다.
인자 Ⅶ의 정제 및 취급은 분자의 분해 가능성 때문에 조심해야 한다. 큰 분 자(대략, 분자량 50 kD)인 인자 Ⅶ 및 인자 Ⅶa는 정제 및 여과하는 동안 전단력에 의해 기계적으로 분해되기 쉽다. 더욱이, 인자 Ⅶa는 인자 Ⅶa를 포함하는 다른 단백질을 분해하는 활성 단백질가수분해효소이다. 주로 인자 Ⅶa의 분해는 특히 분자 내 아미노산 290번 및 315번에서, 인자 Ⅶa의 무거운 사슬의 분할과 관련된다. 마지막으로, 인자 Ⅶ 및 인자Ⅶa의 메티오닌 잔기는 산화될 수 있다.
본 발명의 목적은 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스의 제거 또는 불활성화를 위한 방법을 제공하는 것인데, 이 방법에 의해서 인자 Ⅶ 성분의 일체가 실질적으로 보존된다.
WO 96/00237호는 거대분자, 예를 들면 혈장 단백질 인자 Ⅸ와 같은 단백질을 함유하는 용액의 바이러스 여과 방법을 개시한다.
WO 98/37086호는 평균 구멍 크기가 15 nm인 멤브레인을 이용한 나노여과법에 의해 혈장유래단백질 용액으로부터 바이러스를 제거하는 것을 개시한다.
Tomokiyo et al.(Vox Sanguinis, 2003, 84, 54-64)은 인간 혈장 유래 활성 인자 Ⅶ 농축물의 대규모 생산을 개시한다. 생산 방법은 불활성 인자 Ⅶ를 포함하는 용액의 바이러스 여과 단계를 수반한다.
발명의 개요
광범위한 양태에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스의 제거 및/또는 불활성화를 위한 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "바이러스"는 살아있는 숙주세포 내에서만 스스로 복제하는 초미세현미경으로만 볼 수 있는 전염성 인자 또는 그것으로부터 유래된 비전염성 미립자를 의미한다. 한 구체예에서, 바이러스는 전염성이 있다. 한 구체예에서, 바이러스는 비전염성 바이러스 미립자이다.
본 발명의 첫번째 양태는 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm의 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 것을 포함한다.
본 발명의 두번째 양태는 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것인데, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 적어도 5%가 활성화 형태이며, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm의 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함한다.
본 발명의 세번째 양태는 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것인데, 상기 조성물은 상기 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 액체 조성물은 실질적으로 무혈청이며, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm의 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것인데, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm의 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함하며, 상기 나노여과기는 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 플루오르화 폴리비닐리덴 (PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF 및 폴리에테르 술폰으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 제조된 막을 가진다.
본 발명의 다른 양태는 액체 인자 Ⅶ 조성물내 바이러스를 비활성화하는 방법에 관한 것인데, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 방법은 상기 조성물을 세정제와 조합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 액체 인자 Ⅶ 조성물내 활성 바이러스의 존재를 고단계 제거하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 (ⅰ) 바이러스 비활성화 단계 및 (ⅱ) 바이러스 제거 단계를 포함한다.
도 1은 본 발명의 방법에 적합한 시스템의 개략도이다. 시스템은 압축 공기가 공급되는 압력 탱크(1), 제거하지 않으면 바이러스 여과기를 막히게 할 미립자를 제거하기 위한 사전 여과기(2), 압력 측정기(P), 바이러스 여과기(3) 및 풀 탱크(4)를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 전형적으로, 활성화되어 단백질가수분해 활성 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 상당한 비율을 포함하는 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 피막없는 바이러스를 포함하여, 바이러스를 제거 또는 비활성화하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 액체 인자 Ⅶ 조성물을 최대 80 nm 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용해 나노여과시키는 단계를 포함한다.
이 방법은 약 50 nm 구멍 크기의 여과기에 의해 제거될 수 있는 쥐 백혈병 바이러스(피막있음) 및 약 20 nm 구멍 크기의 여과기에 의해 제거될 수 있는 돼지 파르보바이러스(피막없음)와 같이, 피막있는 바이러스 뿐만 아니라 피막없는 바이러스의 제거에 특히 유용하다.
액체 인자 Ⅶ 조성물, 예를 들면 활성화된 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 상당한 비율을 포함하는 조성물은 원칙적으로 건조한 인자 Ⅶ 구성성분으로부터 제조될 수 있지만, 더 통상적으로, 대량생산 공정, 예를 들면 재조합 기술과 관련된 공정으로부터 얻어질 수 있다. 이러한 공정에서, 통상적으로 세포 배양 상층액은 수확되고, 이어서, 담체에 고정되지 않은 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과기; 친화 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온 교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 과정(예를 들면, 정제용 등전압집속(IEF), 차동 용해도(예를 들면, 황산암모늄 침전), 또는 추출 등을 비롯한, 소정의 단백질을 얻기 위한 하나 이상의 공정 단계를 거친다. 일반적으로, 문헌(Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; and Protein Purification,J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)를 참조할 수 있다. 또한 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 정제는, 예를 들면 항인자 Ⅶ 항체 칼럼에 대한 친화 크로마토그래피(예를 들면, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; 및 Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988 참조) 및, 인자 ⅩⅡa, 또는 티로신 유사 특이성을 가지는 다른 단백질분해효소, 예를 들면, 인자 Ⅸa, 칼리크레인, 인자 Ⅹa 및 트롬빈을 이용하여, 단백질가수분해적 분할에 의한 활성을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Osterud et al., Biochem. 11:2853, 1972; Thomas, 미국 특허 제 4,456,591호; 및 Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836, 1983)을 참조할 수 있다. 대안적으로, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 그것을 이온 교환 크로마토그래피 칼럼, 예를 들면 모노 Q?(Pharmacia) 등을 통해 통과시킴으로써 활성화될 수 있다.
본 발명의 방법은 특히 대규모 생산 공정에 유용하다. 통상적으로, 용어 "대규모"란 액체 인자 Ⅶ 폴리펩티드 조성물의 부피가 적어도 100 L, 예를 들면 500 L, 예를 들면 적어도 1000 L, 또는 적어도 5000 L인 방법을 의미한다. 이는 임의의 방법으로 제한하는 것은 아니고, 또한 본 발명은 100 L 보다 적은 액체 인자 Ⅶ 폴리펩티드 조성물에 잘 맞을 것이다.
나노 여과는 인자 Ⅶ 폴리펩티드 대용량이 부분적으로 또는 완전히 활성화된 후에 조차도 사용될 수 있다는 것이 최근에 파악되었다.
따라서, 본 발명의 방법은 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 위한 전반적인 정제 공정의 단계 중 하나로서, 통상적으로 정제 공정의 최종 단계의 하나로서 적용가능하다.
더 구체적으로 설명하자면, 발효 액체 배지로부터(또는 인간(또는 포유류) 혈장으로부터) 수확된 물질로부터 시작하는 통상적인 정제 공정은 하기와 같이 개설할 수 있다:
Figure 112006038502716-pct00001
통상적으로, 활성화 형태인 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 함량은 처음에(즉, 수확 단계로부터) 약 2%인데, 폴리펩티드가 약물로 얻어지기 전에 정제 공정의 과정에서 90%까지 증가한다.
나노여과되는 액체 인자 Ⅶ 조성물은 적합한 용매에 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 용매는 물 또는 수성 혼합물/용액, 예를 들면 정수, 수성 완충제, 물/에탄올 혼합물, 물/DMSO 혼합물, 또는 수성 염용액, 예를 들면 염수, 요소 용액 또는 구아니딘 용액이다. 또한 적합한 수성 액체는 세정제(계면활성제)를 포함할 수 있다.
흥미로운 구체예에서, 액체 인자 Ⅶ 조성물은 세포 배양 상층액, 예를 들면 WO 02/29084호에서 개시된 바와 같이 얻어진 세포 배양 상층액으로부터 얻어지거나 또는 유래한다. 구체예에서, 액체 인자 Ⅶ 조성물은 무혈청, 예를 들면 동물 유래 성분이 제거되어 있다. 따라서, 세포 배양은 동물 유래 성분이 결핍된 배지에서 배 양될 수 있다.
매력적인 변형은 인자 Ⅶ 폴리펩티드(들)가 CHO 세포, 예를 들면 동물 기원의 임의의 성분이 제거된 배지 또는 동물 유래 성분이 결핍되고 단백질이 결핍("무단백질")된 배지에 있는 CHO 세포에서 세포 배양에 의해 생산되는 것이다.
CHO 세포를 위한 배지는 동물 유래 성분이 결핍된 임의의 상업적으로 구입가능한 무단백질 CHO 배지 또는 CHO 세포를 위해 내부에서 생산된 배지가 될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명을 실시하는데 사용되는 세포는 동물 유래 성분이 결핍된 배지, 예를 들면 혈청이 결핍된 배지에서 현탁액 성장에 적합하다. 이러한 적합화 공정은 예를 들면 문헌(Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 2lst Century, E. C. Beuvery et al.(Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623,1995 (BHK and CHO cells); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (insect cells); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (myeloma cells); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993(human kidney 293 cells))에 설명되어 있다. 특정한 구체예에서, 숙주 세포는 인간 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 발현하도록 조작되고, 혈청 또는 동물 유래 성분의 부재 상태에서 성장하도록 적합화된 BHK 21 또는 CHO 세포이다.
대안적인 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드(들)는 소 또는 태아 송아지 혈청의 존재하에 세포 배양에 의해 생산된다.
발명의 한 양태에 따르면, 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 상당한 비율 즉, 적어도 5%, 예를 들면 적어도 7%, 예를 들면 적어도 10%가 활성화 형태인 것을 특징으로 한다(즉, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 생활성, 분열된 형태(즉, 인자 Ⅶa 폴리펩티드)). 다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 양의 5-70%, 예를 들면 7-40%, 예를 들면 10-30%를 나타낸다. 다른 구체예에서, 인자 Ⅶa 폴리펩티드는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 양의 50-100%, 예를 들면 70-100%, 예를 들면 80-100%를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 양의 20-80%, 예를 들면 30-70%, 예를 들면 30-60%를 나타낸다.
최상의 구체예에서, 용액은 비활성 형태인 인자 Ⅶ 폴리펩티드 뿐만 아니라생활성 인자 Ⅶa 폴리펩티드도 포함하는데, 즉, 인자 Ⅶa 폴리펩티드는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 양의 100% 미만을 나타낸다. 가장 통상적인 구체예에서, 조성물은 (비활성) 인자 Ⅶ 폴리펩티드에 상응하는 (활성화) 인자 Ⅶa 폴리펩티드를 포함하는데, 즉, 인자 Ⅶa 폴리펩티드는 활성화 형태인 인자 Ⅶ 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 인자 Ⅶa 폴리펩티드는 비활성화 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성화 형태와는 다소 다르다. 물론 특정한 구체예에서 조성물이 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 및 하나 이상의 인자 Ⅶa 폴리펩티드를 포함할 수 있다는 것은 이해되어야 한다.
용어 "하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 야생형 인자 Ⅶ(즉, 미국 특허 제4,784,950호에 개시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드) 뿐만 아니라 야생형 인자 Ⅶ에 대하여 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 보이는 인자 Ⅶ의 변형체를 포함한다. 용어 " 인자 Ⅶ"는 분열되지 않은(효소원) 형태인 인자 Ⅶ 폴리펩티드 뿐만 아니라 인자 Ⅶa라고 지명될 수 있는 그들 각각의 생활성 형태를 생산하도록 단백질가수분해 공정을 거친 것들을 포함하도록 의도된다. 통상적으로, 인자 Ⅶ는 인자 Ⅶa를 생산하기 위해서 잔기 152 및 153 사이에서 분열된다. 구체적으로 용어 "인자 Ⅶa"는 활성화(즉, 생활성, 분열된) 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, "인자 Ⅶa"는 "인자 Ⅶ"에 대하여 하위그룹이다. 구체적으로, 용어 "비활성 인자 Ⅶ"는 인자 Ⅶa가 아닌 인자 Ⅶ를 의미한다.
또한 용어 "인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 변형체를 포함한, 폴리펩티드를 포함하는데, 이것의 인자 Ⅶa 생물학적 활성은 인자 Ⅶ 유도체 및 인자 Ⅶ 접합체 뿐만 아니라, 야생형 인자 Ⅶa의 활성에 비해서 실질적으로 변형되었거나 다소 감소되었다. 이 폴리펩티드로는 한정하는 것은 아니지만, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa를 포함하는데, 이 안으로 특정 아미노산 서열 변경이 도입되어 폴리펩티드의 생활성을 변형시키거나 붕괴시킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인자 Ⅶ 유도체"는 야생형 인자 Ⅶ, 야생형 인자 Ⅶ에 비해 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 보이는 인자 Ⅶ의 변형체 및 인자 Ⅶ 연관 폴리펩티드를 지정하는 것으로 의도되는데, 여기서 모체 펩티드의 하나 이상의 아미노산은 예를 들면, 알킬화, 당화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 및/또는 효소학적으로 변성되었다. 이는, 한정하는 것은 아니지만, PEG화된 인간 인자 Ⅶa, 시스테인-PEG화된 인간 인자 Ⅶa 및 그것의 변형체를 포함한다. 인자 Ⅶ 유도체의 비한정적인 예는 WO 03/31464호 및 미국 특허 출원 제20040043446호, 제20040063911 호, 제20040142856호, 제20040137557호 및 제20040132640호(Neose Technologies, Inc.)에 개시된 바와 같은, 당PEG화된 FⅦ 유도체; WO 01/04287호, 미국 특허 출원 제20030165996호, WO 01/58935호, WO 03/93465호(Maxygen ApS) 및 WO 02/02764호, 미국 특허 출원 제20030211094호(University of Minnesota)에 개시된 바와 같은, FⅦ 접합체를 포함한다.
용어 "PEG화된 인간 인자 Ⅶa"는 인간 인자 Ⅶa 폴리펩티드에 접합된 PEG 분자를 가지는 인간 인자 Ⅶa를 의미한다. PEG 분자는 인자 Ⅶa 폴리펩티드의 임의의 아미노산 잔기 또는 탄수화물 부분을 포함하는 인자 Ⅶa 폴리펩티드의 임의의 부분에 부착될 수 있다고 이해된다. 용어 "시스테인-PEG화된 인간 인자 Ⅶa"는 인간 인자 Ⅶa에 도입된 시스테인의 황화수소기에 접합된 PEG 분자를 가지는 인자 Ⅶa를 의미한다.
혈액 응고에서 인자 Ⅶa의 생물학적 활성은 (ⅰ) 조직 인자(TF)에 결합하고, (ⅱ) 활성화 인자 Ⅸ 또는 인자 Ⅹ(각각, 인자 Ⅸa 또는 Ⅹa)를 생산하기 위해 인자 Ⅸ또는 인자 Ⅹ의 단백질가수분해 분할을 촉매작용하는 능력으로부터 유래한다.
본 발명의 목적을 위해서, 예를 들면, 미국 특허 제5,997,864호 또는 WO 92/15686호에 기재된 바와 같이, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 생물학적 활성("인자 Ⅶ 생물학적 활성")은 인자 Ⅶ가 결핍된 혈장 및 트롬보플라스틴을 이용하여 혈액 응고를 촉진하는 준비 능력을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이 분석에서, 생물학적 활성은 대조 표본에 비해서 응고 시간의 감소로 표현되고, 1 단위체/mL 인자 Ⅶ 활성을 포함하는 합일 인간 혈청 표준과 비교하여 "인자 Ⅶ 단위체"로 변환된다. 대 안적으로, 인자 Ⅶa 생물학적 활성은 (ⅰ) 지질막 및 인자Ⅹ에 매립되어 있는 TF를 포함하는 시스템에서 활성화 인자 Ⅹ(인자 Ⅹa)를 생산하는 인자 Ⅶa(또는 인자 Ⅶ 폴리펩티드)의 능력의 측정(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ⅱ) 수성 시스템에서의 인자 Ⅹ 가수분해의 측정("시험관내 단백질가수분해 측정", 하기 참조); (ⅲ) 표면 플라스몬 공명에 기반된 기구를 이용하여 인자 Ⅶa(또는 인자 Ⅶ 폴리펩티드)과 TF의 물리적 결합의 측정(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (ⅳ) 인자 Ⅶa(또는 인자 Ⅶ 폴리펩티드)에 의한 합성 기질의 가수분해의 측정("시험관내 가수분해 측정", 아래 참조); 또는 (ⅴ) 시험관내 시스템에서 TF 비의존성 트롬빈의 생성의 측정에 의해서 정량화될 수 있다.
야생형 인자 Ⅶa에 비해서 실질적으로 동일한 또는 개선된 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶa 변형체는, 전술한 바와 같은 하나 이상의 응고 측정, 단백질가수분해 측정, 또는 TF 결합 측정으로 시험되었을 때, 동일한 세포형에서 생산되는 인자 Ⅶa의 특정 활성의 적어도 약 25%, 예를 들면 적어도 약 50%, 예를 들면 적어도 약 75%, 예를 들면 약 90%를 나태내는 것을 포함한다. 구체예에서, 생물학적 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa의 생물학적 활성의 80% 이상이다. 다른 구체예에서, 생물학적 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa의 생물학적 활성의 90% 이상이다. 다른 구체예에서, 생물학적 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa의 생물학적 활성의 100% 이상이다. 다른 구체예에서, 생물학적 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa의 생물학적 활성의 120% 이상이다. 다른 구체예에서, 생물학적 활성은 재조합 야생형 인간 인자 Ⅶa의 생물학적 활성의 200% 이상이다. 생물학적 활성은 재조 합 야생형 인간 인자 Ⅶa의 생물학적 활성의 400% 이상이다.
야생형 인자 Ⅶa에 비해서 실질적으로 감소된 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶ 변형체는, 전술한 바와 같은, 하나 이상의 응고 측정, 단백질가수분해 측정, 또는 TF 결합 측정으로 시험되었을 때, 동일한 세포형에서 생산되는 야생형 인자 Ⅶa의 특정 활성의 약 25% 미만, 예를 들면 약 10% 미만, 예를 들면 약 5% 미만, 예를 들면 약 1% 미만을 나타내는 것이다. 야생형 인자 Ⅶ에 비해서 실질적으로 변형된 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶ 변형체로는, 한정하는 것은 아니지만, TF 비의존성 인자 Ⅹ 가수분해 활성을 나타내는 인자 Ⅶa 변형체 및 TF에 결합하지만 인자 Ⅹ를 개열하지 않는 것이 있다.
야생형 인자 Ⅶa와 실질적으로 동일하거나 또는 더 나은 생활성을 나타내거나, 또는 대안적으로, 야생형 인자 Ⅶ에 비해서 실질적으로 변형되거나 또는 감소된 생활성을 나타내는 인자 Ⅶ의 변형체로는, 한정하는 것은 아니지만, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해서 야생형 인자 Ⅶ의 서열과는 다른 아마노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
야생형 인자 Ⅶ와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶ 변형체의 비한정적인 예는 S52A-FⅦa, S60A-FⅦa(Lino etal., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); 미국 특허 제5,580,560호에 개시된 바와 같은 증가된 단백질가수분해 안정성을 나타내는 인자 Ⅶa 변형체; 잔기 290 및 291 또는 잔기 315 및 316 사이에서 단백질가수분해에 의해서 개열되는 인자 Ⅶa(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); 인자 Ⅶa의 산화된 형태(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189호에 개시된 바와 같은 인자 Ⅶa 변형체; WO 02/38162호에 개시된 바와 같은 증가된 단백질가수분해 안정성을 나타내는 인자 Ⅶ 변형체(Scripps Research Institute); WO 99/20767호, 미국 특허제6017882호 및 제6747003호, 미국 특허 출원 제20030100506호(University of Minnesota) 및 WO 00/66753호, 미국 특허 출원 제20010018414호, 제2004220106호 및 제200131005호, 미국 특허 제6762286호 및 제6693075호(University of Minnesota)에 개시된 바와 같은 변형된 Gla 도메인을 가지고 증가된 막 결합을 나타내는 인자 Ⅶ 변형체; 및 WO 01/58935호, 미국 특허 제6806063호, 미국 특허 출원 제20030096338호(Maxygen ApS), WO 03/93465호(Maxygen ApS) 및 WO 04/029091호(Maxygen ApS)에 개시된 바와 같은 인자 Ⅶ 변형체를 포함한다.
야생형 인자 Ⅶa와 비교해서 증가된 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶ 변형체의 비한정적인 예는 WO 01/83725호, WO 02/22776호, WO 02/077218호, WO 03/27147호, WO 03/37932호; WO 02/38162호(Scripps Research Institute); 및 JP 2001061479호(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)에 개시된 바와 같이, 증가된 활성을 가지는 인자 Ⅶa 변형체를 포함한다.
야생형 인자 Ⅶ와 비교해서 실질적으로 감소되거나 또는 변형된 생물학적 활성을 가지는 인자 Ⅶ 변형체의 비한정적인 예는 R152E-FⅦa(Wildgoose et al., Biochem 29: 3413-3420, 1990), S344A-FⅦa(Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FⅦa(Holst et al, Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) 및 Gla 도메인이 결핍된 인자 Ⅶa(Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993)을 포함한다.
인자 Ⅶ 폴리펩티드의 명백한 예는, 한정하는 것은 아니지만, 야생형 인자 Ⅶ, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII 및 S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII,L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-인자 VII, S60A-인자 VII; R152E-인자 VII, S344A-인자 VII, Gla 도메인이 결핍된 인자 VIIa; 및 P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 및 233번 트레오닌부터 240번 아스파라긴까지 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실이 있는 인자 VII, 304 아르기닌부터 329번 시스테인까지 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실이 있는 인자 VII를 포함한다.
일부 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa(hFⅦa), 예를 들면 재조합으로 만들어진 인간 인자 Ⅶa(rhFⅦa)이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 서열 변형체를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 야생형 인자 Ⅶ와는 다른 당화를 가진다.
나노여과
액체 인자 Ⅶa 조성물은 최대 80 nm의 구멍을 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과된다. 더 바람직하게는, 나노여과기의 구멍 크기는 최대 50 nm, 예를 들면, 10-30 nm 범위와 같이, 최대 30 nm 이다.
통상적으로, 용어 "구멍 크기"는 여과기에 의해서 보류된 가장 작은 바이러스의 크기를 의미한다.
적합한 시중 구입가능한 나노여과기의 예는 Asahi Planove 15 N, Asahi Planove 20 N, Asahi Planova 35 N 및 Asahi Planova 75 N(모두 일본 도쿄 Asahi Chemical 제품); 밀리포어 NFR, 밀리포어 NFP, 밀리포어 Viresolve 70 및 밀리포어 180(모두 밀리포어 제품); 및 Pall DV20, Pall DV 50, Pall Omega VR 100 K; 및 Bemberg 미소공성 막-15 nm(BMM-15)이다.
나노여과기 막은 예를 들면, 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 폴리비닐니덴 플루오르화물(PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF, 폴리에테르 술폰 및 유사물로부터 선택된 하나 이상의 물질에서 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 물질은 폴리비닐니덴 풀루오르화물계 물질 및 폴리에테르 술폰계 물질로부터 선택된다.
나노여과는 접선 여과 방식 또는 전량 여과 방식에 의해서 수행될 수 있는데 이는 당업자에게 이해될 것이다. 구체예에서, 나노 여과는 극한 여과 방식으로 수행된다.
나노여과에 대한 액체 인자 Ⅶ 조성물의 pH값은 특별히 중요한 것으로 간주되지는 않는다. 따라서, 보통 pH값은 나노여과 단계를 직전의 공정 단계에 적용되는 상태의 관점에 의해서 주어진다. 몇몇 구체예에서, pH값은 액체 조성물이 5.5-10 범위의 pH, 예를 들면 7.0-9.5 범위, 예를 들면 7.6-9.4 범위, 예를 들면 7.7-9.3 범위, 예를 들면 8.0-9.0 범위 또는 8.3-8.7 범위를 갖도록 pH값이 조절된다. 구체예에서, pH는 5-7 범위이다. 구체예에서, pH는 9.5 이상, 예를 들면 9.5-10 범위이다.
더욱이, 통상적으로 또한, 액체 조성물내 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 선행하는 공정단계에 의해서 주어지지만, 보통 0.01-5 mg/mL 범위, 예를 들면 0.05-2.0 mg/mL 범위이다.
나노여과는 도 1에서 설명하는 바와 같은 여과 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.
공정은 하기 설명예와 같이 수행될 수 있다: 압력 탱크(1)를 주입용수(WFI)로 충전하고, 탱크내 압력은 바이러스 여과기 전(3)에 3.5 바까지 올리며, 여과기는 10분동안 플러싱한다. 압력을 2 바로 감소시키고, 바이러스 여과기(3)를 10분 더 플러싱한다. 압력 탱크(1)에서 WFI를 비우고, 공정은 액체 인자 Ⅶ 조성물이 압력 탱크(1)에 채워지기 전에 완충제로 선택적으로 반복한다. 압력을 2 바로 올리고, 여과하는 동안에 실질적으로 일정하게 유지시킨다. 그 후에 바이러스 여과기(3)는 표준 과정에 의해서 무결성을 위해 시험될 수 있다.
여과액을 풀 탱크에 수집하고, 약물로서 인자 Ⅶa 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 얻기 위해서 더 진행할 수 있다.
통상적으로 보다 큰 미립자, 응집체 등을 제거하기 위해서 나노여과 단계 전에 사전 여과 단계를 거치는 것이 유리하다고 하는데, 그렇지 않으면 나노필터가 막히게 될 것이다. 통상적으로, 이 사전 여과기는 0.05-0.5 μm 범위의 구멍 크기를 가진다. 구체예에서, 사전 여과기는 밀리포어 NFR 여과기이다.
공기 압력를 이용하는 것의 대안으로, 압력 탱크 뒤에 위치한 액체 펌프는 여과에 필요한 압력을 제공할 수 있다.
나노여과된 액체 인자 Ⅶ 조성물이 비활성 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하면, 예를 들면, 문헌(Bjorn. S. & Thim, L. Res. Disclosures (1986) 269,564-565, Pedersen, A. H. & al., Biochemistry (1989), 28,9331-9336, 및 Tomokiyo, K. & al., Vox Sang. 84,54-64 (2003))에 개시된 바와 같이, 그 후 조성물은 활성화 단 계를 거칠 수 있다.
약학 산물로서 조성물 및 최종 제제의 다음 공정은 문헌(B. & al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27,4, 373-383 (2001))에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.
무혈청 액체 인자 Ⅶ 폴리펩티드 조성물의 나노여과
본 발명의 분리된 양태는, 상기 특징의 일부 또는 모두를 포함할 수 있는데, 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것이며, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 액체 조성물은 실질적으로 무혈청이며, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm 구멍 크기를 가진 나노여과기를 이용하는 나노여과에 사용하는 것을 포함한다.
이것의 매력적인 변형체는 인자 Ⅶ 폴리펩티드(들)가 CHO 세포, 예를 들면 동물 기원의 임의의 구성성분이 제거된 배지에 있는 CHO 세포에서 세포배양에 의해서 생산되는 것이다.
본 발명의 이 양태는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 특정 비율이 활성화 형태인 액체 인자 Ⅶ 조성물에 특히 한정되어 있지 않다. 그러나, 본 발명의 첫번째 양태에 대하여 상기에서 언급된 조건은 이러한, 필요한 변경을 가한 본 발명의 두번째 양태에 또한 적용한다.
특정한 여과기를 통한 액체 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 나노여과
본 발명의 다른 분리된 양태는, 상기 특징의 일부 또는 모두를 포함할 수 있는데, 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법에 관한 것으로서, 상 기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm 구멍 크기를 가진 나노여과기를 이용한 나노여과에 사용하는 것을 포함하며, 상기 나노여과기는 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 플루오르화 폴리비닐리덴(PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF 및 폴리에테르 술폰으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 제조된 막을 가진다.
구체예에서, 물질은 플루오르화 폴리비닐리덴계 물질 및 폴리에테르 술폰계 물질로부터 선택된다.
본 발명의 이 양태는 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 특정 부분이 활성화 형태인 액체 인자 Ⅶ 조성물에 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 본 발명의 첫번째 양태에 대하여 상기에서 언급된 조건은 이, 필요한 변경을 가한 본 발명의 세번째 양태에 또한 적용한다.
세정제 첨가에 의한 바이러스 비활성화
다른 양태에서, 본 발명은 또한 액체 인자 Ⅶ 조성물내 바이러스를 비활성화하는 방법에 관한 것인데, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 그 방법은 상기 조성물을 세정제와 조합하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 세정제는 비이온 세정제, 예를 들면 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올, 폴리소르베이트, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리에틸렌/폴리프로필렌 블록 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌 스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 피마자유로부터 선택된다. 비이온 세정제의 설명예는 Triton X- 100, Tween?, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, Brij-35(폴리옥시에틸렌 도데실 에테르), 폴록사머 188, 폴록사머 407, PEG8000, Pluronic? 폴리올, 폴리옥시-23-로릴 에테르, Myrj 49 및 크레모포 A로부터 선택된다.
특히 유용한 세정제는 n이 5-15 범위, 특히 n이 9-10 범위인 화학식 p-((CH3)CH2C(CH2)2)-C6H4-O-(CH2CH2O)n-H의 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올, 예를 들면 세정제 Triton X-100이다.
한 구체예에서, 세정제는 0.01-0.5 중량% 범위, 예를 들면 0.05-0.4 중량% 범위, 예를 들면 0.05-0.3 중량% 범위, 예를 들면 0.05-0.2 중량% 범위, 예를 들면 0.05-0.1 중량% 범위의 조성물 내 세정제 농도를 얻기 위해서 액체 인자 Ⅶ 조성물과 조합된다.
다른 구체예에서, 세정제는 2-12℃ 범위, 예를 들면 2-9℃ 범위의 온도에서 조성물과 조합된다.
최선의 목적을 위해서, 트리알킬포스페이트 세정제를 포함하는 것이 바람직하지 않다고 발견되어, 실질적으로 세정제는 트리(n-부틸)포스페이트와 같은 트리알킬포스페이트를 함유하지 않을 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 방법은 인자 Ⅶ 폴리펩티드 조성물을, 2-9℃ 범위의 온도에서 0.05-0.2 중량%의 농도로 Triton X-100과 조합하는 단계를 포함하며, 단, 세정제는 트리(n-부틸)포스페이트와 같은 트리알킬포스페이트 용매를 실질적으로 함유하지 않는다.
본 발명의 이 양태는 인자 Ⅶ 폴리펩티드(들)의 특정 부분이 활성화 형태인 액체 인자 Ⅶ 조성물에 특별히 한정되는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 첫번째 양태에 대하여 상기에서 언급된 조건은 이, 필요한 변경을 가한 본 발명의 네번째 양태에 또한 적용한다.
바이러스 비활성화 단계의 조합
다른 양태에서, 본 발명은 액체 인자 Ⅶ 조성물 내 활성 바이러스 존재의 고단계 제거 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (ⅰ) "세정제 첨가에 의한 바이러스 비활성화"에서 정의된 방법에 의한 바이러스의 비활성화 및 (ⅱ) "나노여과"에서 정의된 임의의 방법에 의한 바이러스의 제거 단계를 임의의 순서로 포함한다.
구체예에서, 바이러스를 비활성화하는 단계는 바이러스를 제거하는 단계를 선행한다.
각각의 단계가 활성 바이러스의 존재를 제거하는 목적에 충분하다고 믿어지더라도, 특정 바이러스는 어느 한 방법에 의해서 제거하기 더 어려울 수 있는 반면에, 동일한 특정 바이러스는 다른 방법에 의해서 더 쉽게 제거될 수 있으며, 그 반대일 수 있다는 의미에서, 두가지 방법이 최소한 부분적으로 "직교"하는 것으로 생각될 수 있다. 따라서, 두가지 방법의 조합은 인자 Ⅶ 폴리펩티드가 의도된 환자를 위해서와, 인자 Ⅶ 폴리펩티드 약을 처방하는 적잖은 의사를 위해서, 그리고 약을 승인하는 규제 당국을 위해서 더 높은 수준의 안전을 제공할 것이다. 따라서, 두가지 방법의 조합은 높은 상업적 가치를 가질 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 바이러스 미립자의 제거 또는 비활성화에 관한 것이다. 특정 공정 단계에서의 바이러스 미립자 양의 감소는 대개 로그 단위(log 10 로그, 또는 log10)로 기술되는데, 이때 감소 인자는 공정 단계 전의 바이러스 미립자의 양에 대해 그 단계 후의 바이러스 미립자의 양으로서 계산될 수 있다.
예를 들면, 106 바이러스 미립자가 단계 전에 발견되고 102 단계 후에 발견된다면, 감소는 104 또는 4 log10이다.
완전한 공정으로부터 바이러스 다립자의 총 감소는 동일한 방식으로 기술되고, 그 공정의 각 단계로부터 바이러스 클리어런스를 첨가함으로써 계산될 수 있으며, "클리어런스"라는 말은 바이러스의 제거 및 바이러스의 비활성화 모두를 의미한다.
특정 바이러스 제거 단계가 효과적이도록 하기 위해서, 적어도 4 log10의 바이러스 감소가 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 여과 단계는 바이러스의 미립자의 양을 적어도 약 4 log10로 감소시킨다. 본 발명의 구체예에서, 여과 단계는 바이러스 미립자의 양을 적어도 약 5 log10으로 감소시킨다.
본 발명의 구체예에서, 상기 FⅦ 조성물을 세정제와 조합하는 단계는 적어도 약 4 log10의 바이러스를 비활성화한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 FⅦ 조성물을 세정제와 조합하는 단계는 적어도 약 5 log10의 바이러스를 비활성화한다.
바이러스 미립자의 양을 결정하는 것은 당업자에게 알려져 있고, 표준 TCID50 분석(ml 당 조직 배양 감염양 50% 종점), 플라크 분석 또는 PCR 분석으로 측정될 수 있다. TCID50 및 플라크 분석은 감염 미립자의 농도 측정에 사용될 수 있고, 반면에 PCR 분석은 감염 및 비감염 비활성화된 바이러스 미립자 측정에 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예:
1. 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법으로서, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 적어도 5%는 활성화 형태이며, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm의 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 구체예 1에 있어서, 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 적어도 7%, 예를 들면 적어도 10%는 활성화 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 구체예 1에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성화 형태는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 질량의 5-70%, 예를 들면 7-40%, 예를 들면 10-30%를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 구체예 1에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성화 형태는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 질량의 50-100%, 예를 들면 70-100%, 예를 들면 80-100%를 나타 내는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 구체예 1에 방법에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성화 형태는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 질량의 20-80%, 예를 들면 30-70%, 예를 들면 30-60%를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물은 pH 7.0-9.5 범위, 예를 들면 7.6-9.4 범위, 예를 들면 7.7-9.3 범위, 예를 들면 8.0-9.0 범위 또는 8.3-8.7 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물 내 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 0.01-5 mg/mL 범위, 예를 들면 0.05-2.0 mg/mL 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 나노여과기의 구멍 크기는 최대 50 nm, 예를 들면 최대 30 nm, 예를 들면 10-30 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 나노여과기의 막은 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 플루오르화 폴리비닐리덴(PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF 및 폴리에테르 술폰으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
10. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 액체 인자 Ⅶ 조성물은 세포 배양 상층액으로부터 얻어지거나 또는 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
11. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물은 실질적으로 무 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 소 또는 태아 송아지 혈청의 존재 하에 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 선행하는 구체예 중 어느 하나에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 CHO 세포에서 세포배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 구체예 13에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 동물 유래의 임의의 성분이 제거된 배지에 있는 CHO 세포에서 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법으로서, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 조성물은 실질적으로 무혈청이며, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm의 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 구체예 15에 있어서, 액체 인자 Ⅶ 조성물은 세포 배양 상층액으로부터 얻어지거나 또는 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 구체예 15 또는 16에 있어서,인자 Ⅶ 폴리펩티드는 CHO 세포에서 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 구체예 17에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 동물 기원의 임의의 성분이 제거된 배지에 있는 CHO 세포에서 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 구체예 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 적어도 5%는 활성화 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 구체예 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물은 pH 7.0-9.5 범위, 예를 들면 7.6-9.4 범위, 예를 들면 7.7-9.3 범위, 예를 들면 8.0-9.0 범위 또는 8.3-8.7 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 구체예 15 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 0.01-5 mg/mL 범위, 예를 들면 0.05-2.0 mg/mL 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 구체예 15 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 나노여과기의 구멍 크기는 최대 50 nm, 예를 들면 30 nm, 예를 들면 10-30 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 구체예 15 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 나노여과기의 막은 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 플루오르화 폴리비닐리덴(PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF 및 폴리에테르 술폰으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
24. 액체 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법으로서, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm 구멍 크기를 가지는 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함하며, 상기 나노여과기는 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 플루오르화 폴리비닐리덴(PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF 및 폴리에테르 술폰으로부터 선택된 하나 이 상의 물질로부터 제조된 막을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 구체예 24에 있어서, 상기 물질은 플루오르화 폴리비닐리덴계 물질 및 폴리에틸렌 술폰계 물질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 구체예 24 또는 25에 있어서, 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 적어도 5%는 활성화 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 구체예 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물은 pH 7.0-9.5 범위, 예를 들면 7.6-9.4 범위, 예를 들면 7.7-9.3 범위, 예를 들면 8.0-9.0 범위 또는 8.3-8.7 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 방법..
28. 구체예 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 0.01-5 mg/mL 범위, 예를 들면 0.05-2.0 mg/mL 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 구체예 24 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 나노여과기의 구멍 크기는 최대 50 nm, 예를 들면 30 nm, 예를 들면 10-30 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 구체예 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 액체 인자 Ⅶ 조성물은 세포 배양 상층액으로부터 얻어지거나 또는 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 구체예 24 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 액체 조성물은 실질적으로 무혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 구체예 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 소 또는 태아 송아지 혈청의 존재 하에 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하 는 방법.
33. 구체예 24 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 CHO 세포에서 세포배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 구체예 33에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 동물 기원의 임의의 성분이 제거된 배지에 있는 CHO 세포에서 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 액체 인자 Ⅶ 조성물 내의 바이러스를 비활성화하는 방법으로서, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 방법은 상기 조성물을 세정제와 조합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 구체예 35에 있어서, 세정제는 화학식 p-((CH3)3CH2C(CH2)2)-C6H4-O-(CH2CH2O)n-H의 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올이고, 식중 n은 5-15 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 구체예 36에 있어서, 세정제는 n이 9-10인 것, 예를 들면 Triton X-100인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 구체예 35에 있어서, 세정제는 Tween?, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
39. 구체예 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 세정제는 0.01-0.3 중량% 범위, 예를 들면 0.05-0.2 중량% 범위의 조성물 내 세정제의 농도를 얻기 위해서 액체 인자 Ⅶ 조성물과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 구체예 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 세정제는 2-12℃ 범위, 예를 들면 2-9℃ 범위의 온도에서 조성물과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 구체예 35 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 실질적으로 세정제는 트리알킬포스페이트 용매, 예를 들면 트리(n-부틸)포스페이트가 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
42. 액체 인자 Ⅶ 조성물 내 활성 바이러스 존재의 고 레벨 제거 방법으로서, (ⅰ) 구체예 35 내지 41 중 어느 하나로 정의된 방법에 의해서 바이러스를 비활성화하는 단계 및 (ⅱ) 구체예 1 내지 35 중 어느 하나로 정의된 방법 중 어느 하나에 의해서 바이러스를 제거하는 단계를 임의의 순서로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 구체예 42에 있어서, 바이러스를 비활성화하는 단계는 바이러스를 제거하는 단계에 선행하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 1: 인자 Ⅶ의 무혈청 생산
하기 실험은 인자 Ⅶ를 대규모 예비 스케일 배양으로 생산하기 위해서 수행되었다.
인자 Ⅶ 도입 플라즈미드로 형질전환된 CHO K1 세포주는 동물 유래 성분이 제거된 배지에 현탁액에서 성장하기에 적합하였다. 적합한 세포 은행은 냉동되었다. 은행으로부터 나온 세포는 동물 유래 성분이 제거된 배지에서 현탁액 배양으로 회전용기에서 증식시켰다. 세포수가 증가됨에 따라, 부피는 새로운 배지의 첨가에 의해 점차 증가되었다. 부피가 4 L에 도달하고, 세포수가 약 0.8 *106/ml에 도달했을 때, 회전용기의 내용물을 50 L 교반된 탱크 반응기(시드 반응기)로 옮겼다. 세포수가 50 L 반응기에서 증가됨에 따라, 부피는 새로운 배지의 첨가에 의해서 점차 증가되었다. 부피가 50 L 에 도달하고, 세포수가 약 1×106/ml에 도달했을 때, 50 L 반응기의 내용물은 500 L 교반된 탱크 반응기(생산 반응기)에 옮겼다. 500 L 반응기는 접종 후 24시간 내에 세포가 부동화된 거대다공성 사이토포어 1 담체(American Bioscience)를 함유하였다. 500 L 반응기의 부피는 세포수가 증가함에 따라서, 새로운 배지의 첨가에 의해 점차 증가되었다. 부피가 450 L에 도달하고, 세포수가 약 2×106/ml에 도달했을 때, 생산 단계를 개시하였고, 배지 교환을 매 24시간마다 수행하였다: 교반을 중지시켜 세포 함유 담체를 침강시킨 다음, 배양 상층액의 80%를 수확하였고, 새로운 배지로 대체하였다. 수확된 배양 상층액을 여과하여 포착되지 않은 세포 및 세포 조직파편을 제거한 다음, 더 이상의 공정을 위해 옮겼다. 500 L 뿐만 아니라 50 L 생반응기는 온도, 용존 산소(마이크로스파저를 통해 산소를 살포함), 교반 속도, 헤드공간 통기 속도 및 pH(헤드공간에 CO2 기체를 첨가함으로써 하향 조절)의 조절을 위해 설치하였다. 또한, 500 L 생반응기는 용존 CO2의 조절을 위해서 설치되었다. 온라인 CO2의 측정은 YSI 8500 CO2 기구에 의해서 수행되었다. CO2 수준은 CO2 신호에 따라서, 대기중 공기를 액체 내로 튜브를 통해 살포함으로써 조절하였다. 살포 비율은 CO2 농도가 세트 포인트 이하였을 때, 배양 액체의 L 당 0 L/분, CO2 농도가 세트 포인트를 초과했을 때, 배양 액체의 L 당 0.01-0.05 L/분으로 맞춰졌다. 용존 CO2의 세트 포인트는 160 mmHg이었다. 언급한 바와 같이, 염기는 pH를 상향조절하기 위해서 생반응기에 첨가하지 않았다. 생산 단계 동안, 세포 밀도는 1-2×107 세포/ml에 도달하였고, 하루 수확한 인자 Ⅶ 농도는 10-20 mg/L에 도달하였다. pCO2 는 150-170 mmHg 범위 내에 유지되었다. pH는 염기가 첨가되지 않았더라도, 6.70을 초과하여 유지되었다.
실시예 2: 포획단계로부터 용출물의 여과
여과하고자 하는 단백질 용액: 하기 특징을 가진 포획 단계로부터 FⅦ 용액 25 L
FⅦ / FⅦa의 농도: 630 mg/L
FⅦ의 산화된 형태의 1.7%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 분석 안됨
분해: < 2.2%
본질적으로 여과는 도 1을 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수행하였다:
여과기: 밀리포어 NFR, 0.08 m2
압력: 2 바
여과물의 성질:
FⅦ / FⅦa의 농도 : 610 mg/L, 즉: FⅦ의 생산량: 96.8%
FⅦ의 산화된 형태의 1.5%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 분석 안됨.
분해: < 2.2%
실시예 3: 포획단계로부터 용출물의 여과
여과하고자 하는 단백질 용액: 하기 특징을 가진 포획 단계로부터 FⅦ 용액 185 mL
FⅦ / FⅦa의 농도 : 82 mg/L
FⅦ의 산화된 형태의 3.4%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 19%
분해: < 3%
본질적으로 여과는 도 1을 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수행하였다:
여과기: 폴 DV50, 0.0017 m2
압력: 2 바
여과물의 성질:
FⅦ / FⅦa의 농도 : 77.1 mg/L, 즉: FⅦ의 수율: 94%
FⅦ의 산화된 형태의 4.1%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 20%
분해: < 3%
실시예 4: 포획단계로부터 용출물의 여과
여과되는 단백질 용액: 하기 특징을 가진 1 단계 용출물 108 mL
FⅦ / FⅦa의 농도 : 320 mg/L
FⅦ의 산화된 형태의 3.7%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 3.3%
분해: < 0.5%
본질적으로 여과는 도 1을 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수행하였다:
여과기: 아사히 플라노바 20 N, 0.001 m2
압력: 0.8 바
여과물의 성질:
FⅦ / FⅦa의 농도 : 310 mg/L, 즉: FⅦ의 수율: 100%
FⅦ의 산화된 형태의 3.7%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 분석안됨.
분해: < 0.5%
실시예 5: FⅦ 대량 약물의 여과
여과되는 단백질 용액: 하기 특징을 가진 FⅦ 대량 물질 98 mL
FⅦ / FⅦa의 농도 : 1460 mg/L
FⅦ의 산화된 형태의 2.1%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): > 90%
분해: 11.9%
본질적으로 여과는 도 1을 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수행하였다:
여과기: 밀리포어 NFR, 0.0017 m2
압력: 2 바
여과물의 성질:
FⅦ / FⅦa의 농도 : 1320 mg/L, 즉: FⅦ의 생산량: 90.4%
FⅦ의 산화된 형태의 2.3%
활성화 정도(즉, FⅦa의 백분율): 여과되는 용액에서 활성화 정도가 98%이기 때문에 분석안됨.
분해: 12.3%
실시예 6: 바이러스 제거
생쥐 백혈병 바이러스, 적정량 YY 플라크 형성 단위체(pfu)를 포함하는 포획단계로부터 인자 Ⅶ 폴리펩티드 용액 50 mL(실시예 1 참조).
본질적으로 여과는 도 1을 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 수행하였다:
여과기: 밀리포어 NFR, yy cm2
압력: YY 바
여과물 내 바이러스 적정량: xx pfu
계산된 클리어런스 인자: xx.

Claims (43)

  1. 액체 재조합 인자 Ⅶ 조성물로부터 바이러스를 제거하는 방법으로서, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 0.01-5 mg/mL 범위이고, 상기 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 50% 내지 100%는 활성화 형태이며, 상기 방법은 상기 용액을 최대 80 nm 구멍 크기를 가진 나노여과기를 이용하여 나노여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성화 형태는 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드 질량의 70-100%를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 액체 조성물의 pH는 5.5-10의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 액체 조성물 내 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 0.05-2.0 mg/mL 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 나노여과기의 구멍 크기는 최대 50 nm인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 나노여과기의 막은 구리암모늄 재생된 셀룰로스, 친수성 플루오르화 폴리비닐리덴(PVDF), 복합 PVDF, 표면 개질 PVDF 및 폴리에테르 술폰으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 인자 Ⅶ 조성물은 세포 배양 상층액으로부터 얻어지거나 또는 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물은 무혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 소 또는 태아 송아지 혈청의 존재 하에 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 CHO 세포에서 세포 배양에 의해서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 액체 재조합 인자 Ⅶ 조성물로부터 활성 바이러스를 제거하는 방법으로서, 상기 조성물은 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함하고, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 농도는 0.01-5 mg/mL 범위이고, 상기 하나 이상의 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 50% 내지 100%는 활성화 형태이며,
    상기 방법은 (i) 상기 조성물을 세정제와 조합함으로써 바이러스를 비활성화하는 단계 및 (ii) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해서 바이러스를 제거하는 단계를 임의의 순서로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 바이러스를 비활성화하는 단계는 바이러스를 제거하는 단계에 선행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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