ES2926359T3

ES2926359T3 - Filtración de virus de composiciones líquidas del Factor VII

Info

Publication number: ES2926359T3
Application number: ES19186952T
Authority: ES
Inventors: Thomas Budde Hansen; Erik Halkjaer; Turid Preuss; Lene Vædele Madsen Tomoda; Nina Johansen; Jesper Christensen
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2003-12-01
Filing date: 2004-12-01
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2024-12-01
Also published as: PT1711513E; EP3594222A1; DK1711513T3; KR20070001887A; US20080274534A1; RU2006118024A; JP2007537994A; WO2005054275A3; JP5666359B2; US20200248150A1; WO2005054275A2; US20070142625A1; RU2472804C2; BRPI0416950B1; US20220064605A1; US20190032026A1; EP1711513A2; KR101234170B1; US20150299685A1; BRPI0416950A

Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo método para mejorar la seguridad viral de las composiciones líquidas de Factor VII, en particular aquellas que comprenden polipéptidos de Factor VII activos (un polipéptido de Factor VIIa). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Filtración de virus de composiciones líquidas del Factor VII

La presente invención se refiere a un método novedoso para mejorar la seguridad viral de las composiciones líquidas del Factor VII que comprenden los polipéptidos del Factor VII activo (un polipéptido del Factor VIIa).

Antecedentes de la invención

Se ha identificado una variedad de Factores involucrados en el proceso de coagulación de la sangre, incluido el Factor VII (FVII), una glicoproteína plasmática. La hemostasia se inicia por la formación de un complejo entre el Factor tisular (TF) que se expone a la sangre circulante después de una lesión a la pared del vaso, y el Factor VIIa que está presente en la circulación en una cantidad correspondiente a aproximadamente el 1 % de la masa proteica total del Factor VII. El Factor VII existe en el plasma principalmente como un zimógeno de cadena única que es escindido por el FXa en su forma activada de dos cadenas, el Factor VIIa. El Factor VIIa activado recombinante (rFVIIa) se ha desarrollado como un agente prohemostático. La administración del rFVIIa ofrece una respuesta prohemostática rápida y altamente efectiva en sujetos hemofílicos con hemorragias, que no pueden tratarse con otros productos del Factor de coagulación debido a la formación de anticuerpos. También se puede tratar con éxito la hemorragia en sujetos con deficiencia del Factor VII o sujetos con un sistema de coagulación normal pero que experimentan una hemorragia excesiva con el Factor VIIa.

La purificación y manipulación del Factor VII debe ser cuidadosa, debido a la posibilidad de degradación de la molécula. El Factor VII y el Factor VIIa, que son moléculas grandes (peso molecular aproximado de 50 kD), son susceptibles a la degradación mecánica por las fuerzas de cizallamiento durante la purificación y la filtración. Además, el Factor VIIa es una enzima proteolítica activa que degrada otras proteínas, incluido el Factor VIIa. La degradación del Factor VIIa implica principalmente la escisión en la cadena pesada del Factor VIIa, particularmente en los aminoácidos núm. 290 y 315 en la molécula. Finalmente, los residuos de metionina en el Factor VII y el Factor VIIa pueden oxidarse.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la eliminación o inactivación de virus de las composiciones líquidas del Factor VII mediante el cual se conserva sustancialmente la integridad de los constituyentes del Factor VII.

El documento WO 96/00237 describe un método de filtración del virus de una solución que contiene un macromolecular, por ejemplo, una proteína tal como la proteína plasmática del Factor IX.

El documento WO 98/37086 describe la eliminación de virus de las soluciones de proteínas derivadas del plasma mediante nanofiltración mediante el uso de una membrana que tiene un tamaño promedio de los poros de 15 nm. Tomokiyo y otros, Vox Sanguinis, 2003, 84, 54-64, describen la producción a gran escala de concentrado del Factor VII activado derivado del plasma humano. El método de producción implica la etapa de filtración del virus de una solución que comprende el Factor VII inactivo.

Burnouf y otros, Haemophilia, vol. 9, núm. 1, 2003, p. 24-37 describe la nanofiltración de los productos biofarmacéuticos derivados del plasma.

Chamouard y otros, Lyon Pharmaceutique, 2000, 51(3), 145-163, describen un proceso para la preparación del Factor VII recombinante activado (Novoseven(R)).

Mollerup y otros, Biotech Bioeng, 1995, volumen. 48, 501-505, por ejemplo, describe un método para la producción del FVII, y se demuestra, por ejemplo, que cada etapa del proceso de fabricación aumenta la cantidad de degradación.

Breve descripción de la invención

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a los métodos para la eliminación de virus de la composición del Factor VII. El término “virus” como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier agente infeccioso ultramicroscópico que se replica solo dentro de células de hospederos vivos, o partículas no infecciosas derivadas de los mismos. En una modalidad, el virus es infeccioso. En una modalidad, el virus es una partícula de virus no infeccioso.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para eliminar los virus de una composición líquida del Factor VII, dicha composición que comprende uno o más polipéptidos del Factor VII, en donde la concentración del(de los) polipéptido(s) del Factor VII en la composición líquida está en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, tal como en el intervalo de 0,05 a 2,0 mg/ml, y la forma activada de los polipéptidos del Factor VII representa el 50-100 %, tal como el 70-100 %, por ejemplo, 80-100 %, de la masa del uno o más polipéptidos del Factor VII en la composición; dicho método comprende someter dicha solución a la nanofiltración mediante el uso de un nanofiltro que tiene un tamaño de los poros de a lo máximo 80 nm.

La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde dicho nanofiltro tiene una membrana fabricada a partir de uno o más materiales seleccionados de celulosa regenerada con cupramonio, fluoruro de polivinilideno hidrófilo (PVDF), PVDF compuesto, PVDF de superficie modificada y sulfona de poliéter.

La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, en donde dicha composición líquida está sustancialmente libre de suero.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una ilustración esquemática de un sistema adecuado para los métodos de la invención. El sistema incluye un tanque de presión (1) con un suministro de aire comprimido, un prefiltro (2) para eliminar las partículas que de cualquier otra manera obstruirían el filtro de virus, un indicador de presión (P), un filtro de virus (3) y un tanque de charco (4).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona los métodos para eliminar los virus, incluidos los virus no envueltos, a partir de una composición líquida del Factor VII que típicamente comprende una relación significativa de polipéptidos activados y, por lo tanto, del Factor VII proteolíticamente activo, dicha composición que comprende uno o más polipéptidos del Factor VII, en donde la concentración del(de los) polipéptido(s) del Factor VII en la composición líquida está en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, tal como en el intervalo de 0,05 a 2,0 mg/ml y la forma activada de los polipéptidos del Factor VII representa el 50-100 %, tal como el 70-100 %, por ejemplo, 80-100 %, de la masa del uno o más polipéptidos del Factor VII en la composición. El método incluye la etapa de someter la composición líquida del Factor VII a nanofiltración mediante el uso de un nanofiltro que tiene un tamaño de los poros de a lo máximo 80 nm.

El método es particularmente útil para la eliminación de los virus envueltos así como también los virus no envueltos tales como el virus de la leucemia murina (envuelto) que puede eliminarse mediante filtros con un tamaño de los poros de alrededor de 50 nm, y el parvovirus porcino (no envuelto) que puede eliminarse mediante filtros con un tamaño de los poros de alrededor de 20 nm.

Las composiciones líquidas del Factor VII, por ejemplo las que comprenden una proporción significativa de los polipéptidos del Factor VII activado, pueden prepararse en principio a partir de los constituyentes secos del Factor VII, pero se obtienen más típicamente a partir de procesos de producción a gran escala, por ejemplo, procesos que implican técnicas recombinantes. En tales procesos, un sobrenadante de cultivo celular se cosecha típicamente y se somete subsecuentemente a una o más etapas de procesamiento para obtener la proteína deseada, que incluye, sin limitación, centrifugación o filtración para eliminar las células que no se inmovilizaron en los portadores; cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión por tamaño; procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo (IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), o extracción y similares. Ver, generalmente, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York, 1982; y Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989. La purificación de los polipéptidos del Factor VII también puede implicar, por ejemplo, cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos anti-Factor VII. (Ver, por ejemplo, Wakabayashi y otros, J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim y otros, Biochem. 27:7785, 1988) y la activación por escisión proteolítica, mediante el uso del Factor XIIa u otras proteasas que tienen una especificidad similar a la de la tripsina, tal como, por ejemplo, el Factor IXa, la calicreína, el Factor Xa y la trombina. Ver, por ejemplo, Osterud y otros, Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, patente de Estados Unidos núm. 4, 456,591; y Hedner y otros, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Alternativamente, un polipéptido del Factor VII puede activarse al pasarlo a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia) o similar.

Los métodos de la presente invención son particularmente útiles para los procesos de producción a gran escala. Por el término “gran escala” se entiende típicamente métodos en donde el volumen de las composiciones líquidas de los polipéptidos del Factor VII son de al menos 100 l, tal como al menos 500 l, por ejemplo, al menos 1000 l, o al menos 5000 l. Esto no debe limitarse de ninguna manera, ya que la presente invención también funcionará para las composiciones líquidas de los polipéptidos del Factor VII de menos de 100 l.

Ahora se ha dado cuenta de que la nanofiltración puede aplicarse incluso después de que el volumen de polipéptido del Factor VII se ha activado parcial o completamente.

Por lo tanto, los métodos de la invención son aplicables como una de las etapas del proceso de purificación general para el polipéptido del Factor VII, típicamente una de las etapas finales del proceso de purificación.

Más específicamente, un proceso de purificación típico que comienza a partir del material cosechado a partir de un caldo de fermentación (o del plasma humano (o de mamíferos)) puede describirse de la siguiente manera: Etapa de purificación PosiDles etapas

para la filtración de virus

Cosecha

♦ ¹

Captura

♦ ²

Purificación intermedia

♦ ³

Pulida

i *

Sustancia farmacológica

El contenido del polipéptido del Factor VII en la forma activada es inicialmente (es decir, de la etapa de cosecha) típicamente alrededor del 2 %, y aumenta en el curso del proceso de purificación a 90 % o más antes de que el polipéptido se obtenga como una sustancia farmacológica.

La composición líquida del Factor VII sujeta a nanofiltración comprende uno o más polipéptidos del Factor VII en un solvente adecuado. El solvente es típicamente agua o una mezcla/solución acuosa, tal como agua pura, un tampón acuoso, una mezcla de agua/etanol, una mezcla de agua/DMSO, o una solución de sal acuosa, por ejemplo, solución salina, una solución de urea o solución de guanidina. Un líquido acuoso adecuado también puede comprender un detergente (surfactante).

En modalidades interesantes, la composición líquida del Factor VII se obtiene, o se origina, a partir de un sobrenadante de cultivo celular, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo celular obtenido como se describe en el documento WO 02/29084. En una modalidad, la composición líquida del Factor VII está libre de suero, es decir, libre de componentes derivados de animales. Por lo tanto, los cultivos celulares pueden cultivarse en un medio que carece de componentes derivados de animales.

Una variante atractiva de la presente es en la que se produce el(los) polipéptido(s) de Factor VII por cultivo celular en células CHO, por ejemplo en células CHO en un medio libre de cualquier componente de origen animal, o un medio que carece de componentes derivados de animales y carece de proteínas (“libre de proteínas”).

El medio para las células CHO puede ser cualquier medio CHO sin proteína disponible comercialmente que carece de componentes derivados de animales o un medio producido internamente para las células CHO.

En algunas modalidades, las células usadas en la práctica de la presente invención se adaptan al crecimiento en suspensión en medio que carece de componentes derivados de animales, tales como, por ejemplo, medio que carece de suero. Dichos procedimientos de adaptación se describen, por ejemplo, en Scharfenberg, y otros, Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E. C. Beuvery y otros. (Ed.), Kluwer Academic Publishers, pp.

619-623, 1995 (células BHK y CHO); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (células de insectos); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (células de mieloma); Berg y otros, Biotechniques 14:972-978, 1993 (células 293 de riñón humano). En una modalidad particular, las células huésped son células BHK 21 o CHO que se han modificado genéticamente para expresar el Factor VII humano o un polipéptido del Factor VII y que se han adaptado para crecer en ausencia de los componentes derivados de suero o animales.

En una modalidad alternativa, el(los) polipéptido(s) del Factor VII se produce(n) por cultivo celular en presencia de suero bovino o fetal de ternera.

El polipéptido del Factor VIIa representa el 50-100 %, tal como el 70-100 %, por ejemplo, el 80-100 %, de la masa del uno o más polipéptidos del Factor VII. En la mayoría de las modalidades, la solución comprende un polipéptido del Factor VII en forma inactivada así como también un polipéptido del Factor VIIa bioactivo, es decir, el polipéptido del Factor VIIa representa menos del 100 % de la masa del uno o más polipéptidos del Factor VII. En la modalidad más típica, la composición comprende un(os) polipéptido(s) del Factor VIIa (activado) que corresponde a un polipéptido del Factor VII (inactivo), es decir, el polipéptido del Factor VIIa es el polipéptido del Factor VII en la forma activada. En otra modalidad, el polipéptido del Factor VIIa es algo diferente de la forma activada del polipéptido del Factor VII inactivado. Debe entenderse, por supuesto, que la composición en modalidades particulares puede comprender más de un polipéptido del Factor VII y más de un polipéptido del Factor VIIa.

El término “uno o más polipéptidos del Factor VII” engloba el Factor VII de tipo silvestre (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la patente de Estados Unidos núm. 4, 784,950), así como también las variantes del Factor VII que muestran sustancialmente la misma actividad biológica o mejorada en relación con el Factor VII de tipo silvestre. El término “Factor VII” pretende englobar los polipéptidos del Factor VII en su forma no seccionada (zimógeno), así como también los que se han procesado proteolíticamente para producir sus respectivas formas bioactivas, que pueden designarse como Factor VIIa. Típicamente, el Factor VII se escinde entre los residuos 152 y 153 para producir el Factor VIIa. El término “Factor VIIa” significa específicamente un polipéptido del Factor VII activado (es decir, bioactivo, escindido). Por lo tanto, el “Factor VlIa” es un subgrupo con relación al “Factor VII”. El término “Factor VII inactivo” significa específicamente que el Factor VII no es el Factor VIIa.

El término “polipéptido del Factor VII” engloba además los polipéptidos, que incluyen variantes, en las que la actividad biológica del Factor VIIa se ha modificado sustancialmente o se ha reducido de alguna manera en relación con la actividad del Factor VIIa de tipo silvestre, así como también los derivados del Factor VII y los conjugados del Factor VII. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el Factor VII o el Factor VIIa en los que se han introducido alteraciones específicas de la secuencia de aminoácidos que modifican o interrumpen la bioactividad del polipéptido. El término “derivado del Factor VII”, como se usa en la presente descripción, pretende designar el Factor VII de tipo silvestre, las variantes del Factor VII que exhiben sustancialmente la misma actividad biológica o una mejorada con relación al Factor VII de tipo silvestre y los polipéptidos relacionados con el Factor VII, en los que uno o más de los aminoácidos del péptido original se han modificado química y/o enzimáticamente, por ejemplo, por alquilación, glicosilación, PEGilación, acilación, formación de éster o formación de amida o similares. Esto incluye pero no se limita al Factor VIIa humano PEGilado, Factor VIIa humano PEGilado con cisteína y las variantes de los mismos. Los ejemplos no limitantes de derivados del Factor VII incluyen derivados de FVII glicopegilados como se describe en el documento WO 03/31464 y solicitudes de patentes de Estados Unidos US20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557 y US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); conjugados del FVII como se describe en el documento WO 01/04287, solicitud de patente de Estados Unidos 20030165996, documento WO 01/58935, documento WO 03/93465 (Maxygen ApS) y documento WO 02/02764, solicitud de patente de Estados Unidos 20030211094 (Universidad de Minnesota).

El término "Factor VIIa humano PEGilado" significa Factor VIIa humano, que tiene una molécula de PEG conjugada a un polipéptido del Factor VIIa humano. Debe entenderse que la molécula de PEG se puede unir a cualquier parte del polipéptido del Factor VIIa, incluido cualquier residuo de aminoácido o resto de carbohidrato del polipéptido del Factor VIIa. El término "Factor VIIa humano PEGilado con cisteína” significa el Factor VIIa que tiene una molécula de PEG conjugada a un grupo sulfhidrilo de una cisteína introducida en el Factor VIIa humano.

La actividad biológica del Factor VIIa en la coagulación sanguínea deriva de su capacidad para (i) unirse al Factor tisular (TF) y (ii) catalizar la escisión proteolítica del Factor IX o Factor X para producir Factor IX o X activado (Factor IXa o Xa, respectivamente).

Para los propósitos de la invención, la actividad biológica de los polipéptidos del Factor VII (“actividad biológica del Factor VII”) puede cuantificarse al medir la capacidad de una preparación para promover la coagulación sanguínea mediante el uso de plasma deficiente en el Factor VII y tromboplastina, como se describió, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5, 997,864 o el documento W o 92/15686. En este ensayo, la actividad biológica se expresa como la reducción del tiempo de coagulación con relación a una muestra control y se convierte en “unidades del Factor VII” en comparación con un patrón de suero humano combinado que contiene 1 unidad/ml de actividad del Factor VII. Alternativamente, la actividad biológica del Factor VIIa puede cuantificarse mediante (i) la medición de la capacidad del Factor VIIa (o el polipéptido del Factor VII) para producir el Factor X activado (Factor Xa) en un sistema que comprende el TF incorporado en una membrana lipídica y el Factor X. (Persson y otros, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) la medición de la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso (“ensayo de proteólisis in vitro”, ver más abajo); (iii) la medición de la unión física del Factor VIIa (o el polipéptido del Factor VII) al TF mediante el uso de un instrumento en base a la resonancia de plasmón superficial (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (iv) la medición de la hidrólisis de un sustrato sintético mediante el Factor VIIa (o un polipéptido del Factor VII) (“ensayo de hidrólisis in vitro”, ver más abajo); o (v) la medición de la generación de trombina en un sistema in vitro independiente del TF.

Las variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biológica o mejorada con relación al Factor VIIa de tipo silvestre engloban aquellas que exhiben al menos aproximadamente 25 %, tal como al menos aproximadamente 50 %, tal como al menos aproximadamente 75 %, tal como al menos aproximadamente 90 % de la actividad específica del Factor VIIa que se ha producido en el mismo tipo de célula, cuando se prueban en uno o más de un ensayo de coagulación, un ensayo de proteólisis, o una unión a TF como se describió anteriormente. En una modalidad, la actividad biológica es más del 80 % de la actividad biológica del Factor VIIa humano recombinante de tipo silvestre. En otra modalidad, la actividad biológica es más del 90 % de la actividad biológica del Factor VIIa humano recombinante de tipo silvestre. En una modalidad adicional, la actividad biológica es más del 100 % de la actividad biológica del Factor VIIa humano recombinante de tipo silvestre. En una modalidad adicional, la actividad biológica es más del 120 % de la actividad biológica del Factor VIIa humano recombinante de tipo silvestre. En una modalidad adicional, la actividad biológica es más del 200 % de la actividad biológica del Factor VIIa humano recombinante de tipo silvestre. En una modalidad adicional, la actividad biológica es más del 400 % de la actividad biológica del Factor VIIa humano recombinante de tipo silvestre.

Las variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente reducida con relación al Factor VIIa de tipo silvestre son aquellas que exhiben menos de aproximadamente 25 %, tal como menos de aproximadamente 10 %, tal como menos de aproximadamente 5 %, tal como menos de aproximadamente 1 % de la actividad específica del Factor VIIa de tipo silvestre que se ha producido en el mismo tipo de célula cuando se ha probado en uno o más de un ensayo de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de unión de TF como se describió anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente modificada con relación al Factor VII de tipo silvestre incluyen, sin limitación, variantes del Factor VII que exhiben actividad proteolítica del Factor X independiente de TF y aquellas que se unen a TF pero no se escinden del Factor X.

Las variantes del Factor VII, ya sea que muestren sustancialmente la misma o mejor bioactividad que el Factor VII de tipo silvestre, o, alternativamente, que muestren sustancialmente bioactividad modificada o reducida con relación al Factor VII de tipo silvestre, incluyen, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del Factor VII de tipo silvestre por inserción, deleción, o sustitución de uno o más aminoácidos.

Los ejemplos no limitantes de variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el Factor VII de tipo silvestre incluye S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino y otros, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes del Factor VIIa que muestran un aumento de la estabilidad proteolítica como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,580,560; Factor VIIa que se ha escindido proteolíticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup y otros, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); formas oxidadas del Factor VIIa (Kornfelt y otros, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); variantes del Factor VII como se describe en el documento PCT/DK02/00189 (WO 02/077218); y variantes del Factor VII que muestran un aumento de la estabilidad proteolítica como se describe en el documento W ^o02/38162 (Scripps Research Institute); variantes del Factor VII que tienen un dominio Gla modificado y exhiben una unión a membrana mejorada como se describe en el documento WO 99/20767, patentes de Estados Unidos US 6017882 y US 6747003, solicitud de patente de Estados Unidos 20030100506 (Universidad de Minnesota) y el documento WO 00/66753, solicitudes de patentes de Estados Unidos US 20010018414, US 2004220106 y US 200131005, patentes de Estados Unidos US 6762286 y US 6693075 (Universidad de Minnesota); y variantes del Factor VII como se describe en el documento WO 01/58935, la patente de Estados Unidos US 6806063, solicitud de patente de Estados Unidos 20030096338 (Maxygen ApS), documento WO 03/93465 (Maxygen ApS) y documento ^wO 04/029091 (Maxygen ApS).

Los ejemplos no limitantes de variantes del Factor VII que tienen una mayor actividad biológica en comparación con el Factor VIIa de tipo silvestre incluyen variantes del Factor VII como se describe en los documentos WO 01/83725,

WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); y variantes del Factor VIIa con actividad mejorada como se describe en el documento JP 2001061479 (Cémigorot-S).

Los ejemplos no limitantes de variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente reducida o modificada con relación al Factor VII de tipo silvestre incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose y otros, Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama y otros, J. Biol. Quím. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst y otros, Eur. J. Vasc.

Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y Factor VIIa sin el dominio Gla, (Nicolaisen y otros, FE^bS Letts. 317:245-249, 1993).

Los ejemplos explícitos de polipéptidos del Factor VII incluyen, sin limitación, Factor VII de tipo silvestre, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor VIIa que carece del dominio Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; y el Factor VII que tiene sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, Factor VII que tiene sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys.

En algunas modalidades, el polipéptido del Factor VIIa es el Factor VIIa humano (hFVIIa), tal como el Factor VIIa humano fabricado recombinantemente (rhFVIIa). En otras modalidades, el uno o más polipéptidos del Factor VII comprenden una variante de secuencia del Factor VII. En algunas modalidades, el uno o más polipéptidos del Factor VII tienen una glicosilación diferente del Factor VII de tipo silvestre.

Nanofiltración

La composición líquida del Factor VII se somete a nanofiltración mediante el uso de un nanofiltro que tiene un tamaño de los poros de a lo máximo 80 nm. El tamaño de los poros del nanofiltro es más particularmente a lo máximo 50 nm, por ejemplo, a lo máximo 30 nm, tal como en el intervalo de 10-30 nm.

El término “tamaño de los poros” típicamente significa el tamaño de los virus más pequeños que se retienen por el filtro.

Ejemplos de nanofiltros disponibles comercialmente adecuados son Asahi Planove 15 N, Asahi Planove 20 N, Asahi Planova 35 N y Asahi Planova 75 N, todos de Asahi Chemical, Tokio, Japón; Millipore NFR, Millipore NFP, Millipore Viresolve 70 y Millipore Viresolve 180, todos de Millipore; y Pall DV20, Pall DV 50, Pall Omega VR 100 K; y Bemberg Microporous Membrane-15 nm (BMM-15).

La membrana del nanofiltro puede, por ejemplo, fabricarse a partir de uno o más materiales seleccionados de celulosa regenerada con cupramonio, fluoruro de polivinilideno hidrófilo (PVDF), PVDF compuesto, PVDF de superficie modificada, sulfona de poliéter y materiales similares. En una modalidad, el material se selecciona de los materiales a base de fluoruro de polivinilideno y materiales a base de sulfona de poliéter.

La nanofiltración puede llevarse a cabo en el modo de filtración tangencial o en el modo de filtración sin salida como lo entenderá el experto. En una modalidad, la nanofiltración se lleva a cabo en el modo de filtración sin salida.

El valor de pH de la composición líquida del Factor VII tras la nanofiltración no se considera particularmente crítico. Por lo tanto, el valor de pH se da normalmente por en vista de las condiciones aplicadas en las etapas del proceso que preceden inmediatamente a la etapa de nanofiltración. En algunas modalidades, el valor de pH se ajusta de manera que la composición líquida tiene un pH de en el intervalo de 5,5-10, tal como en el intervalo de 7,0-9,5, por ejemplo en el intervalo de 7,6-9,4, tal como en el intervalo de 7,7-9,3, por ejemplo en el intervalo de 8,0-9,0 o en el intervalo de 8,3-8,7. En una modalidad, el pH está en el intervalo de 5-7. En una modalidad, el pH es mayor que 9,5, tal como en el intervalo de 9,5-10.

Además, la concentración del polipéptido del Factor VII en la composición líquida se da típicamente además por las etapas del proceso anteriores, pero normalmente se encuentra en el intervalo de 0,01-5 mg/ml, tal como en el intervalo de 0,05-2,0 mg/ml.

El proceso de nanofiltración puede llevarse a cabo mediante el uso de un sistema de filtración como se ilustra en la figura 1.

El proceso puede llevarse a cabo como en el siguiente ejemplo ilustrativo: El tanque de presión (1) es rellenado con agua para inyección (WFI), y la presión en el tanque se eleva a 3,5 bar antes del filtro de virus (3), y el filtro se lava durante 10 minutos. La presión se reduce a 2 bar y el filtro de virus (3) se lava durante otros 10 minutos. El tanque de presión (1) se vacía de WFI y el proceso se repite opcionalmente con un almacenamiento temporal antes de que la composición líquida del Factor VII se llene en el tanque de presión (1). La presión se eleva a 2 bar y se mantiene sustancialmente constante durante la filtración. El filtro de virus (3) puede probarse posteriormente para determinar la integridad mediante procedimientos estándar.

El filtrado se recoge en un tanque de mezcla y puede procesarse además para obtener una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del Factor VIIa como una sustancia farmacológica.

Dicho esto, es típicamente ventajoso aplicar una etapa de prefiltración antes de la etapa de nanofiltración con el fin de eliminar partículas más grandes, agregados, etc., que de cualquier otra manera harían que el nanofiltro se obstruya. Tal prefiltro típicamente tiene un tamaño de los poros de en el intervalo de 0,05-0,5 pm. En una modalidad, el prefiltro es el filtro NFR de Millipore.

Alternativamente al uso de presión de aire, una bomba de líquido colocada después del tanque de presión puede proporcionar la presión necesaria para la filtración.

Si la composición del Factor VII líquido nanofiltrado comprende polipéptidos del Factor VII inactivos, la composición puede someterse posteriormente a una etapa de activación, por ejemplo, como se describe en Bj⁰rn. S. y Thim, L. Res. Disclosures (1986) 269, 564-565, Pedersen, A.H. y al., Biochemistry (1989), 28, 9331-9336, y Tomokiyo, K. y al., Vox Sang. 84, 54-64 (2003).

El procesamiento adicional de la composición y la formulación final como un producto farmacéutico puede llevarse a cabo como se describe en Jurlander, B. y al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4, 373-383 (2001).

Nanofiltración de composiciones líquidas libres de suero de los polipéptidos del Factor VII

En una modalidad de la invención, la composición líquida indicada puede estar sustancialmente libre de suero.

Una variante atractiva de la presente es en la que el(los) polipéptido(s) del Factor VII se produce(n) por cultivo celular en células CHO, por ejemplo, en células CHO en un medio libre de cualquier componente de origen animal.

Nanofiltración de las composiciones líquidas de los polipéptidos del Factor VII mediante filtros particulares

En una modalidad de la invención, el nanofiltro puede tener una membrana fabricada a partir de uno o más materiales seleccionados de celulosa regenerada con cupramonio, fluoruro de polivinilideno hidrófilo (PVDF), PVDF compuesto, PVDF de superficie modificada y sulfona de poliéter.

El material puede seleccionarse de materiales basados en fluoruro de polivinilideno y materiales basados en sulfona de poliéter.

Inactivación del virus mediante la adición de un detergente

También describimos un método para inactivar virus en una composición líquida del Factor VII, dicha composición comprende uno o más polipéptidos del Factor VII, el método comprende la etapa de combinar dicha composición con un detergente.

En algunas descripciones, el detergente se selecciona a partir de detergentes no iónicos tales como los seleccionados a partir de octilfeniloxipolietanol, polisorbatos, poloxámeros, éteres de alquilo de polioxietileno, copolímeros de bloque de polietileno/polipropileno, polietilenglicol (PEG), estearatos de polioxietileno y aceites de rilato de polioxietileno. Los ejemplos ilustrativos de los mismos son detergentes no iónicos Triton X-100, Tween®, polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, Brij-35 (éter dodecílico de polioxietileno), poloxámero 188, poloxámero 407, PEG8000, polioles Pluronic®, polioxi-23-lauril éter, Myrj 49 y Cremofor A.

Un detergente particularmente útil es un octilfenoxipolietoxietanol de la fórmula p-((CH³)³CH²C(CH²)²)-C⁶H⁴-O-(CH²CH²O)n-H en donde n está en el intervalo de 5-15, en particular uno donde n es 9-10, tal como el detergente Triton X-100.

En una descripción, el detergente se combina con la composición líquida del Factor VII para obtener una concentración del detergente en la composición de en el intervalo de 0,01-0,5 % en peso, tal como en el intervalo de 0,05-0,4 % en peso, tal como en el intervalo de 0,05-0,3 % en peso, tal como en el intervalo de 0,05-0,2 % en peso, tal como en el intervalo de 0,05-0,1 % en peso.

En una descripción adicional, el detergente se combina con la composición a una temperatura de en el intervalo de 2 12 °C, tal como en el intervalo de 2-9 °C.

Para la mayoría de los propósitos, se encuentra que no se desea incluir un detergente de trialquilfosfato, por lo tanto, el detergente puede estar sustancialmente libre de solventes de trialquilfosfato tales como tri(n-butil) fosfato.

En una descripción particular, el método comprende las etapas de combinar la composición de polipéptidos del Factor VII con Triton X-100 a una concentración de 0,05-0,2 % en peso a una temperatura en el intervalo de 2-9 °C, con la condición de que el detergente está sustancialmente libre de disolventes de trialquilfosfato tales como tri(n-butil)fosfato.

Este aspecto de la descripción no se limita particularmente a las composiciones líquidas del Factor VII en las que una determinada proporción del (de los) polipéptido(s) del Factor VII está(n) en la forma activada. Sin embargo, las condiciones mencionadas anteriormente para el primer aspecto de la invención también se aplican a esto, el cuarto aspecto de la invención, mutatis mutandis.

Combinación de las etapas de inactivación de virus

También describimos un método para la eliminación de alto nivel de la presencia de virus activos en una composición líquida del Factor VII, el método que comprende las etapas de (i) inactivar virus mediante el método definido bajo “ inactivación del virus mediante la adición de un detergente”, y (ii) eliminar virus mediante cualquiera de los métodos definidos en la presente descripción bajo “nanofiltración”, en cualquier orden.

En una descripción, la etapa de inactivar virus precede a la etapa de eliminar virus.

Aunque se cree que las etapas individuales son suficientes para el propósito de eliminar la presencia de virus activos, los dos métodos pueden considerarse como al menos parcialmente “ortogonales” en el sentido de que determinados virus pueden ser más difíciles de eliminar por uno de los métodos, mientras que lo mismo de los ciertos virus puede eliminarse más fácilmente por el otro método, y viceversa. Por lo tanto, la combinación de los dos métodos proporcionará un nivel de seguridad aún mayor para el paciente para el que se pretende el polipéptido del Factor VII, y no menos importante para el médico que receta el medicamento del polipéptido del Factor VII, y para las autoridades reguladoras que aprueban el medicamento. Por lo tanto, la combinación de los dos métodos puede tener un alto valor comercial.

Como se describió anteriormente, la presente invención se refiere a la eliminación o inactivación de partículas de virus. La reducción de la cantidad de partículas de virus en una etapa de proceso particular se describe generalmente en unidades log (logaritmo de log 10 o log-¹⁰), en donde el Factor de reducción se calcula como la cantidad de partículas de virus después de la etapa con relación a la cantidad de partículas de virus antes de la etapa de proceso.

Por ejemplo, si se encuentran 106 partículas de virus antes de una etapa y se encuentran 102 después de la etapa, la reducción es 104, o 4 log-iQ.

La reducción total de las partículas de virus del proceso completo se describe de la misma manera y puede calcularse mediante la adición del aclaramiento del virus de cada etapa del proceso, la palabra “aclaramiento” significa tanto eliminación del virus como inactivación del virus

Para que una etapa de aclaramiento de virus específico sea efectiva, se prefiere tener una reducción de virus de al menos 4 log-¹⁰.

En una modalidad de la presente invención, una etapa de filtración reduce la cantidad de partículas de virus con al menos aproximadamente 4 log¹⁰. En una modalidad de la presente invención, una etapa de filtración reduce la cantidad de partículas de virus con al menos aproximadamente 5 logm

En una modalidad de la presente invención, una etapa de combinar dicha composición del FVII con un detergente inactiva al menos aproximadamente 4 log¹⁰del virus. En una modalidad de la presente invención, una etapa de combinar dicha composición del FVII con un detergente inactiva al menos aproximadamente 5 log¹⁰del virus.

La determinación de la cantidad de partículas de virus es conocida por el experto en la técnica y puede medirse en ensayos de TCID⁵⁰estándar (dosis infecciosa de cultivo de tejidos del 50 % final por ml), ensayos de placa o ensayos de PCR. Los ensayos de placa y TCID⁵⁰pueden usarse para medir la concentración de partículas infecciosas, mientras que los ensayos de PCR pueden usarse para medir partículas de virus inactivadas tanto infecciosas como no infecciosas

Ejemplos

Ejemplo 1: Producción libre de suero del Factor VII

El siguiente experimento se realizó para producir el Factor VII en un cultivo piloto a gran escala.

Una línea celular CHO K1 transformada con un plásmido codificante del Factor VII se adaptó al crecimiento en cultivo en suspensión en un medio libre de componentes derivados de animales. Se congeló un banco de las células adaptadas. Las células del banco se propagaron en frascos giratorios en cultivo en suspensión en medio libre de componentes derivados de animales. A medida que el número de células aumentaba, el volumen aumentaba gradualmente mediante la adición de un nuevo medio. Cuando el volumen había alcanzado los 4 l y el número de células había alcanzado 0,«8 * 106/ml, el contenido de los frascos giratorios se transfirió a un reactor de tanque agitado de 50 l (reactor de siembra). A medida que el número de células aumentaba en el reactor de 50 l, el volumen aumentaba gradualmente mediante la adición de un nuevo medio. Cuando el volumen de células alcanzó los 50 l y el número de c alcanzó «1 x 106/ml, el contenido del reactor de 50 l se transfirió a un reactor de tanque agitado de 500 l (reactor de producción). El reactor de 500 l contenía los portadores macroporosos de Cytopore 1 (Amersham Biosciences) dentro de los cuales las células se inmovilizaron en las 24 horas siguientes a la inoculación. El volumen en el reactor de 500 l se aumentó gradualmente mediante la adición de un nuevo medio a medida que aumentaba el número de células. Cuando el volumen alcanzó los 450 l y el número de células alcanzó «2 x 106/ml, se inició la fase de producción y se realizó un cambio de medio cada 24 horas: La agitación se detuvo para permitir la sedimentación de los portadores que contenían células, y el 80 % del sobrenadante de cultivo se cosechó y reemplazó con un nuevo medio. El sobrenadante de cultivo cosechado se filtró para eliminar las células no atrapadas y los restos celulares y luego se transfirió para su procesamiento posterior. Tanto el biorreactor de 50 l así como también el de 500 l se instrumentaron para el control de la temperatura, el oxígeno disuelto (aspersión de oxígeno a través del microaspersor), la velocidad de agitación, la velocidad de aireación del espacio de cabeza y el pH (control descendente mediante la adición de gas de CO²al espacio de cabeza). Además, el biorreactor de 500 l se instrumentó para el control del CO²disuelto. La medición de CO²en línea se realizó por medio de in instrumento YSI 8500 CO². El nivel de CO²se controló mediante la aspersión de aire atmosférico en el líquido a través de un tubo de acuerdo con la señal de CO². La velocidad de aspersión se estableció en 0 l/min por l de líquido de cultivo cuando la concentración de CO²estaba en o por debajo del punto de ajuste, y en 0,01-0,05 l/min por l de líquido de cultivo cuando la concentración de CO²estaba por encima del punto de ajuste. El punto de ajuste para el CO²disuelto fue de 160 mmHg. Como se mencionó, no se adicionó ninguna base al biorreactor para controlar el pH hacia arriba. Durante la fase de producción, la densidad celular alcanzó 1-2 x 107 células/ml, y la concentración del Factor VII en la cosecha diaria 10-20 mg/l. El pCO²se mantuvo dentro del intervalo de 150-170 mmHg. El pH se mantuvo por encima de 6,70, aunque no se adicionó ninguna base.

Ejemplo 2: Filtración de eluato de la etapa de captura.

Solución de proteína a filtrar: 25 l de la solución del FVII de la etapa de captura, con las siguientes características Concentración del FVII/FVIIa: 630 mg/l

1,7 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa):

degradación no analizada: <2,2 %

La filtración se realizó esencialmente como se describió en la presente descripción con referencia a la figura 1: Filtro: Millipore NFR, 0,08 m2

Presión: 2 bar

Propiedades del filtrado:

Concentración del FVII / FVIIa: 610 mg/l, es decir: rendimiento del FVII: 96,8 %

1,5 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa): no analizado.

Degradación: < 2,2 %

Ejemplo 3: Filtración de eluato de la etapa de captura.

Solución de proteína a filtrar: 185 ml de la solución del FVII a partir de la etapa de captura, con las siguientes características

Concentración del FVII/FVIIa: 82 mg/l

3,4 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa): 19 %.

Degradación: < 3 %

La filtración se realizó esencialmente como se describió en la presente descripción con referencia a la figura 1: Filtro: Pall DV50, 0,0017 m2

Presión: 2 bar

Propiedades del filtrado:

Concentración del FVII / FVIIa: 77,1 mg/l, es decir: rendimiento del FVII: 94 %

4.1 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa): 20 %.

Degradación: < 3 %

Ejemplo 4: Filtración de eluato de la etapa de captura.

Solución de proteína a filtrar: eluato la etapa 1 de 108 ml con las siguientes características:

Concentración del FVII/FVIIa: 320 mg/l

3.7 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa) 3,3 %

Degradación: <0,5 %

La filtración se realizó esencialmente como se describió en la presente descripción con referencia a la figura 1: Filtro: Asahi Planova 20 N, 0,001 m2

Presión: 0,8 bar

Propiedades del filtrado:

Concentración del FVII/FVIIa: 310 mg/l, es decir: rendimiento del FVII: 100 %

3.7 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa): no analizado,

Degradación: < 0,5 %

Ejemplo 5: Filtración de la sustancia farmacológica en masa del FVII.

Solución de proteína a filtrar: 98 ml de la sustancia del FVIIa en masa, con las siguientes características Concentración del FVII / FVIIa: 1460 mg/l

2.1 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa): >90 %.

Degradación: 11,9 %

La filtración se realizó esencialmente como se describió en la presente descripción con referencia a la figura 1: Filtro: Millipore NFP, 0,0017 m2

Presión: 2 bar

Propiedades del filtrado:

Concentración del FVII / FVIIa: 1320 mg/L, es decir: rendimiento de FVII: 90,4 %

2,3 % de las formas oxidadas del FVII

Grado de activación (es decir, porcentaje del FVIIa): no analizado, ya que el grado de activación en la solución a filtrar es 98 %

Degradación: 12,3 %

Ejemplo 6: Eliminación de virus

50 ml de una solución del polipéptido del Factor VII (ver el ejemplo 1) de la etapa de captura que comprende un título YY de unidades formadoras de placa (pfu) para el virus de la leucemia murina.

La filtración se realiza esencialmente como se describió en la presente descripción con referencia a la figura 1: Filtro: Millipore NFR, yy cm2

Presión: YY bar

Título del virus en el filtrado: xx pfu

Factor de aclaramiento calculado: xx.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para eliminar virus de una composición líquida del FactorVII, dicha composición comprende uno o más polipéptidos del Factor VII, en donde la concentración del(de los) polipéptido(s) del Factor VII en la composición líquida está en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, tal como en el intervalo de 0,05-2,0 mg/ml, y la forma activada de los polipéptidos del Factor VII representa del 50-100 %, tal como 70-100 %, por ejemplo 80-100 %, de la masa del uno o más polipéptidos del Factor VII en la composición;

dicho método comprende someter dicha solución a la nanofiltración mediante el uso de un nanofiltro que tiene un tamaño de los poros de a lo máximo 80 nm.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición líquida tiene un pH en el intervalo de 7,0 9,5, tal como en el intervalo de 7,6-9,4, en el intervalo de 7,7-9,3, en el intervalo de 8,0-9,0, o en el intervalo de 8,3-8,7.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tamaño de los poros del nanofiltro es a lo máximo 50 nm.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tamaño de los poros del nanofiltro es a lo máximo 30 nm, tal como en el intervalo de 10-30 nm.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la membrana del nanofiltro se fabrica a partir de uno o más materiales seleccionados de celulosa regenerada con cupramonio, fluoruro de polivinilideno hidrófilo (PVDF), PVDF compuesto, PVDF de superficie modificada y sulfona de poliéter.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición líquida del Factor VII se obtiene de un sobrenadante de cultivo celular.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición líquida está sustancialmente libre de suero.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el(los) polipéptido(s) del Factor VII se produce(n) por cultivo celular en presencia de suero de ternero bovino o fetal.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el(los) polipéptido(s) del Factor VII se produce(n) por cultivo celular en células CHO.