KR20060114034A

KR20060114034A - 섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제 및 이의제조방법

Info

Publication number: KR20060114034A
Application number: KR1020067019636A
Authority: KR
Inventors: 토마스 찰스 분; 호이민 리; 마이클 벤자민 만
Original assignee: 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2006-11-03
Also published as: US20020058322A1; EP1224298B1; AU767827B2; CN101230340A; PL355017A1; IL148787A0; YU22502A; CN100357430C; BR0014414A; EA200200410A1; KR20020047208A; AU7625400A; JP2003511034A; HK1049351B; US7195903B2; EP1605049A3; KR100700753B1; WO2001025445A1; US6261820B1; DE60019147D1

Abstract

본 발명은 생체내에서의 혈병 용해에 유용한 섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제("신규의 대체 혈전용해제" 라고도 함) 및 재조합 발현에 의한 그것의 제조방법과 물질에 관한 것이다.

섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제, 혈전증, NAT, 금속단백질 분해효소

Description

섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제 및 이의 제조방법 {FIBRINOLYTICALLY ACTIVE MODIFIED FIBROLASE AND METHOD FOR ITS MANUFACTURE}

도 1 은 "신호" 펩티드를 포함한 "프리프로" 영역(밑줄친 부분) 및 성숙한 폴리펩티드(밑줄치지 않은 부분)로 구성된, NAT (SEQ ID NO : 3)의 전장의 선형 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

본 발명은 비-자연적으로 발생한 서열로 이루어진 섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제, 그것의 복합적 제조방법 및 생체내에서의 혈전증 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

203 개의 아미노산 잔기로 이루어진 효소적 활성 폴리펩티드 (특히, 금속단백질 분해효소) 인 피브롤라제(Fibrolase) 는, 처음에는 미국 남부지방에 서식하는 살무사의 독액으로부터 정제하여 분리하였다; 1986 년 9 월 9 일에 공고된 (Markland 등의) 미국 특허 번호 제 4,610,879 호 ; 및 Guan 등의 Archives of Biochemistry 및 Biophysics, Volume 289, Number 2, pages 197-207 (1991) 을 참조. 이 효소는 약간의 출혈성 활성을 수반하거나 또는 출혈성 활성을 수반하지 않는 직접적인 섬유소용해 활성을 나타내며 피브리노겐이나 전혈액으로부터 형성된 혈병을 용해시킨다.

피브롤라제의 아미노산 서열은 효모에서의 재조합 생산 및 생체내에서의 혈전색전성 증상 치료의 사용에 관해 기술된 방법으로 측정하였다 ; Randolph 등의 Protein Science, Cambridge University Press(1992), pages 590-600 및 1989 년 7 월 12 일에 공개된 (Valenzuela 등의) 유럽 특허 출원번호 제 0 323 722 호 참조.

본 발명은 SEQ ID NO : 5 의 위치 1-3 에서의 Gln-Gln-Arg 가 Ser 으로 치환된 변이를 갖는 섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제를 제공하며, 본원에서는 "신규의 대체 혈전용해제" (또는 "NAT" ; "novel acting thrombolytic") 로 언급하기도 한다. 본 발명은 또한 NAT 를 코드하는 SEQ ID NO : 2 중 특정한 하나의 핵산 분자 및 이의 변이체를 제공한다.

"성숙한" 이란 용어는 생물학적 활성 폴리펩티드를 언급하도록 그것의 통상적으로 이용가능한 의미에서 사용되며 상기 폴리펩티드는 프리프로(prepro) 영역으로부터 폴리펩티드를 분리하기 위해 숙주 세포의 원위치에서 효소적으로 처리한 것이다.

섬유소용해 활성으로 인해 NAT 는 포유동물(랫, 돼지 및 인체 포함)에서 혈전증을 치료하기 위한 혈병 용해제로서 생체내에서 유용하다.

본 발명의 NAT 폴리펩티드는 치료제(즉, 뱀의 독액에서 발견된 섬유소용해성 폴리펩티드)로서 자연적으로 발생한 피브롤라제 이상의 이점을 제공한다. 천연 피브롤라제는 몇몇의 교대성 N - 말단을 포함하는 것으로 공지되어 있다 : QQRFP, EQRFP 및 ERFP (여기에서, " E " 는 고리형 글루타민 또는 피로글루타민산을 나타낸다). 좀더 명확하게, QQRFP 로 구성된 N - 말단으로 시작하면, 피브롤라제 분자는 분해되어 EQRFP 및 ERFP 각각의 N - 말단의 서열을 갖는 두 가지 이소타입을 나타낸다. 효모에서 생성된 재조합 피브롤라제로 인해 이러한 형태 중 세 가지 모두의 혼합물을 수득하였으므로 균질성을 나타내지 않는다. Loayza 등의 Journal of Chromatography, B 662, pages 227 - 243 (1994) 을 참조하라. 더욱이, 고리형의 글루타민 잔기는 서열결정이 불가능한 "닫혀진" N - 말단을 갖게 된다.

대조적으로, 본 발명의 재조합 NAT 는 단일 종을 제공한다 : 유일한 특정 N - 말단이 전형적으로 생성되었다. 재조합 피브롤라제와 비교한 결과, 최종 산물의 높은 균질성이 나타났으며 최종적으로 의약으로 사용할 경우에 유익하다.

적절한 숙주 세포에서, 누클레오티드 1 - 783 으로부터의 프리프로 영역 및 누클레오티드 784 - 1386 으로부터의 성숙한 폴리펩티드를 포함한, NAT (SEQ ID NO : 3) 의 전체 아미노산 서열을 코드하는 SEQ ID NO : 4 의 핵산 분자의 재조합 발현에 의해 NAT 가 생산될 것이다. 발현시킨 후에, 프리프로 영역을 숙주 세포에서 효소적으로 처리하여 성숙한 활성 폴리펩티드 (SEQ ID NO : 1) 를 수득하였다.

바람직하게, NAT 는 효모에서 재조합적으로 생성된 것이며 이는 하기에 좀더 상세히 설명할 것이다.

따라서 생성된 성숙한 폴리펩티드 (SEQ ID NO : 1) 는 제조된 방법에 따라 아미노 말단으로 메티오닌을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 전형적으로, 폴리펩티드가 숙주로서 비 - 분비 박테리아(예를 들어, E. coil) 균주에서 재조합으로 생성된 경우에, 아미노 말단으로 메티오닌 잔기가 존재할 것이다.

SEQ ID NO : 2 의 핵산 분자 이외에 동일한 폴리펩티드를 코드하는 그것의 퇴화 서열 또한 이용가능하다. 본 발명은 "천연" 프리/프로 영역으로 이루어진 곳(즉, 자연적으로 발생한 피브롤라제에서 발견됨)에서 선택적 프리/프로 영역을 코드하는 서열(즉, 세포막을 통해 폴리펩티드를 분비하는 서열)과 같은 성숙한 폴리펩티드를 코드하는 영역 중 5' 또는 3' 부분의 측면에 위치한 다른 아미노산 잔기를 코드할 수 있는 핵산 분자를 포함할 것이다. 다른 서열은 숙주 세포에 따라 전사 또는 번역의 프로모터와 같은 규칙적인 서열을 포함한, 비코딩 서열일 것이다.

NAT 는 다음과 같은 문헌에 기재된 공지된 재조합 DNA 과학 기술 방법을 이용하여 제조할 수 있다 : Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) 및/또는 Ausubel 등의 editors, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. 및 Wiley 및 Sons, New York (1994). 폴리펩티드 또는 그것의 절두된 형태를 코드하는 DNA 분자는, 예를 들어, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또는 피브롤라제를 코드하는 핵산 분자를 수득하기 위한 PCR 증폭 후에 N - 말단의 아미노산 잔기 QQR 을 코드하는 코돈을 세린 (S) 에 대한 코돈으로 대체함으로써 수득될 것이다. 선택적으로, NAT 를 코드하는 DNA 분자는 문헌 [Engels 등의 in Angew. Chem. Intl. Ed., Volume 28, pages 716 - 734 (1989)] 에 기재된 바와 같이 본 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 이용한 화학적 합성에 의해 제조될 것이다. 전형적으로, DNA 는 길이상 수 백개의 누클레오티드를 가질 것이다. 약 100 개의 누클레오티드보다 큰 핵산은 이러한 동일한 방법을 사용하여 몇몇의 단편으로 합성할 수 있으며, 원하는 길이의 누클레오티드 서열을 형성하기 위해 단편을 함께 연결시킬 수 있다.

DNA 분자를 적절한 숙주 세포에서 발현하기에 적합한 적절한 발현 벡터내로 삽입시켰다. 그 벡터는 사용된 특정 숙주 세포에서 기능하도록 선택한 것이다(즉, DNA 가 발현할 수 있도록 벡터는 숙주 세포 기관과 양립할 수 있다). 하기에 좀 더 상세히 설명한 대로 효모가 바람직하지만, 폴리펩티드는 원핵 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충(바쿨로바이러스계) 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포에서 발현될 것이다.

NAT 를 발현하기 위해 모든 숙주 세포에 사용된 벡터는 다음을 포함할 것이다. : 5' 측면 서열("프로모터"라고도 함) 및 발현되도록 DNA 에 작동적으로 결합된 그 밖의 다른 발현 조절 요소, 인핸서, 복제 기점 요소, 전사 종결 요소, 공여체 및 수용체 접합 부위를 함유한 전체의 인트론 서열, 신호 펩티드 서열, 리보솜 결합 부위 요소, 폴리아데닐화 서열, NAT 를 코드하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역 및 선택가능한 마커 요소. 이러한 요소 각각은 하기에 기재되어 있다.

선택적으로, 벡터는 "표식" 서열, 즉, 폴리 His (헥사 His 와 같음) 또는 다른 소형의 면역원성 서열[c-myc 또는 적혈구응집소 에피토프와 같음, 이들의 항체(모노클로날 항체 포함)는 상업적으로 이용가능하다]을 코드하는 폴리펩티드 - 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치한 올리고누클레오티드 서열을 포함할 것이다. 이러한 표식은 NAT 와 함께 발현될 것이며 숙주 세포로부터 이러한 폴리펩티드를 정제하기 위해 친화성 표식으로 사용할 수 있다. 선택적으로, 다양한 방법, 예를 들어, 선택적 펩티다제 사용에 의해 정제된 폴리펩티드로부터 표식을 제거할 수 있다.

5' 측면 서열은 천연 5' 측면 서열이거나 숙주 세포와 같은 종 및/또는 균주의 서열과 상동적이고, 숙주 세포와 같은 종 또는 균주 이외의 종의 서열과 이형적이며, 다양한 원으로부터의 5' 측면 서열을 조합한 바와 같이 혼성적이거나 또는 합성적일 것이다. 5' 측면 서열이 기능적이고 숙주 세포기관에 의해 활성화될 수 있다면, 5' 측면 서열의 원은 모든 단세포의 원핵 생물 또는 진핵 생물 유기체, 모든 척추동물 또는 무척추 동물 유기체 또는 모든 식물일 것이다.

복제 기점 요소는 통상적으로 입수한 원핵 생물의 발현 벡터의 전형적 부분이며 숙주 세포에서 벡터를 증폭시키는데 도움이 된다. 몇몇 경우에서, 벡터를 특정한 복제수까지 증폭시키는 것은 NAT 의 최상 발현에 중요할 수 있다. 만일 선택한 벡터가 복제 기점 부위를 함유하고 있지 않다면, 공지된 서열을 기초로 화학적으로 합성한 다음, 벡터내로 삽입시킨다.

전사 종결 요소는 일반적으로 폴리펩티드 코딩 서열의 3' 말단에 위치하며 mRNA 의 전사를 종결시키는데 적합하다. 일반적으로, 원핵 세포에서의 전사 종결 요소는 폴리 T 서열 다음에 G - C 가 풍부한 단편이다. 이 요소는 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되거나 벡터의 일부로서 통상적으로 입수할 수 있지만, 핵산 합성을 위해 공지된 방법을 이용하여 용이하게 합성할 수 있다.

선택가능한 표지 유전자 요소는 선택 배양 배지에서 성장한 숙주 세포의 생존 및 성장에 필수적인 단백질을 코드한다. 전형적인 선택 표지 유전자는 다음의 기능을 갖는 단백질을 코드한다 : (a) 항생물질 또는 그밖의 다른 독소(예를 들어, 원핵 숙주 세포의 경우 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신, 효모 숙주 세포의 경우 제오신 및 포유동물 숙주 세포의 경우 네오마이신)에 대한 내성 형성 ; (b) 세포의 영양 요구성 결핍증 보충 ; 또는 (c) 복합 배지에서 유효하지 않은 부족한 영양성분 공급. 원핵성 발현에 사용하기 위한 바람직한 선택가능한 표지는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다.

일반적으로 샤인-달가노 서열(원핵 생물의 경우) 또는 코작 서열(진핵 생물의 경우)이라 칭하는 리보솜 결합 요소는 초기의 mRNA 번역에 필수적이다. 이 요소는 일반적으로 프로모터의 3' 및 합성하려는 폴리펩티드의 코딩 서열 5' 에 위치한다. 샤인 - 달가노 서열은 다양하지만 일반적으로 A - G 함유량이 많은 폴리퓨린이다. 많은 샤인 - 달가노 서열이 확인되었으며 이들 각각은 상기에 설명한 방법을 사용하여 쉽게 합성할 수 있으며 원핵 생물의 벡터에 사용될 수 있다. 코작 서열은 일반적으로 개시 코돈 바로 전 후의 서열을 포함한다. 바람직한 코작 서열은 AVG 개시 코돈에서 번역 개시의 높은 효율과 관련되어 있다.

숙주 세포로부터 분비되는 NAT 폴리펩티드가 바람직한 경우에 있어, 신호 서열은, NAT 폴리펩티드가 합성되는 숙주 세포 안의 폴리펩티드를 조절하는데 사용될 것이다. 전형적으로, 신호 서열은 핵산 서열의 코딩 영역에 위치하거나 코딩 영역의 5' 말단에 바로 위치한다. 많은 신호 서열이 확인되었으며 선택한 숙주 세포에서 기능을 하는 그들 모두를 본원에서 사용할 것이다. 따라서, 신호 서열은 폴리펩티드와 상동적이거나 이종적일 것이다. 부가적으로, 상기에서 언급한 방법을 사용하여 신호 서열을 화학적으로 합성할 것이다.

벡터를 조작하고 핵산을 벡터의 적당한 위치에 삽입시킨 후에, 증폭 및/또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 완성된 벡터를 적절한 숙주 세포에 삽입할 것이다.

언급한 바와 같이, 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들어, E. coli) 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포 또는 척추동물 세포)일 것이다. 숙주 세포가 효모이거나 몇몇의 다른 숙주 세포이든 간에, 적당한 조건하에서 배양할 경우에 숙주 세포는 NAT 를 합성할 수 있으며, 결과적으로 이 NAT 는 배지로부터 수확할 수 있으며(숙주 세포가 NAT 를 배지로 분비한 경우) 또는 NAT 를 생산하는 숙주 세포로부터 직접 수확할 수 있다(NAT 가 배지에 분비되지 않은 경우). 수확한 후에, 분자체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 방법을 사용하여 NAT 폴리펩티드를 정제하였다.

세포에 의해 생물학적 활성 물질을 제조할 수 있도록 숙주 세포에서 NAT 를 NAT 의 천연 2 차 구조 및 3 차 구조(예를 들어, 이황화결합의 적절한 방향)로 "접힐 수 있는" 방법에 따라 숙주 세포를 선별할 것이다. 숙주 세포가 생물학적 활성 물질을 합성하지 않을 경우라도, 본 분야의 숙련자에게 공지된 것과 같은 적절한 화학 조건을 사용하면 합성 후에 "접힐 것이다". 둘 중 어느 한 경우에 있어서, 생물학적 활성 물질을 수득했다는 사실로부터 접힘이 적절하다는 것을 추론할 수 있다.

적절한 숙주 세포 또는 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 3T3 세포와 같은 포유동물 세포일 것이다. 형질전환시키기 위한 방법 및 적절한 포유동물 숙주 세포의 선별, 배양, 증폭, 스크리닝 및 산물 생산과 정제는 본 분야에 공지되어 있다. 다른 적절한 세포주로는 원숭이 COS - 1 과 COS - 7 세포주 및 CV - 1 세포주가 있다. 또다른 전형적인 포유동물 숙주 세포는 형질전환시킨 세포주를 포함한 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 1 차 외식편 뿐만 아니라 정상적인 2 배체 세포, 1 차 조직의 시험관내 배양물로부터 유도된 세포균주 또한 적당하다. 후보 세포는 선택 유전자에서 유전자형이 결실된 것이거나 주요하게 작용하는 선택 유전자를 포함할 것이다. 또다른 적절한 포유동물 세포주는 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다 : HeLa 세포, 마우스 L-929 세포, 스위스로부터 유래한 3T3 세포주, Balb-c 이거나 NIH 마우스 세포주, BHK 이거나 HaK 햄스터 세포주.

숙주 세포로서 또한 박테리아 세포가 유용하다. 예를 들어, 다양한 E. coli 균주(예를 들어, HB101, DH5a, DH10 및 MC1061)는 생명공학 분야에서 숙주 세포로 공지되어 있다. 고초균, 슈도모나스 spp., 다른 바실루스 spp., 스트렙토마이세스 spp. 등의 다양한 균주 또한 사용할 것이다. 부가적으로, 본 분야의 숙련자에게 공지된 효모 세포의 많은 균주는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 숙주 세포로서 또한 유용하다. 바람직한 경우에, 숙주 세포로서 곤충 세포를 사용할 수도 있다. 예를 들어, Miller 등의 Genetic Engineering, Volume 8, pages 277 - 298 (1986) 을 참조하라.

선택한 숙주 세포로의 벡터 삽입("형질전환" 또는 "트랜스펙션" 이라고도 함)은 인산 칼슘법, 전기천공법, 미량 주입법, 리포펙션 또는 DEAE - 덱스트란법을 사용하여 시행될 것이다. 선택한 방법은 사용하려는 대부분의 숙주 세포 유형에 작용할 것이다. 이러한 방법 및 그밖의 다른 적절한 방법은 본 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며 예를 들어, 상기 Sambrook 등의 문헌에 설명되어 있다.

벡터를 함유한 숙주 세포를 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 표준배지를 사용하여 배양하였다. 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 있어서 필요한 모든 영양분을 함유한다. E. coli 세포를 배양하기에 적당한 배지는, 예를 들어, 루이아 육즙(LB) 및/또는 테리픽 육즙(TB) 이다. 진핵 세포를 배양하기에 적당한 배지는 개개의 세포주를 배양하기 위해 요구되는 혈청 및/또는 성장인자를 보충해준, RPMI 1640, MEM, DMEM 이다. 곤충 세포 배양에 적당한 배지는 필수적으로, 이스톨레이트, 락트알부민 가수분해물 및/또는 우태아 혈청이 보충된 그레이스 배지이다.

대체로, 형질전환된 세포의 선택적인 성장에 유용한 항생물질 및 다른 화합물만을 배지에 보충물로서 첨가하였다. 이 화합물은 형질전환된 숙주 세포의 플라스미드에 존재하는 선택가능한 표지 성분에 의해 규정될 것이다. 예를 들어, 선택할 수 있는 마커 성분이 카나마이신 내성이면, 배지에 첨가되는 화합물은 카나마이신이 될 것이다.

숙주 세포에서 생산된 NAT 의 양을 본 분야에 널리 공지된 표준 방법을 사용하여 측정하였다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯(western blot) 분석, SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비 - 변성 겔 전기영동, HPLC 분리, 면역침강 및/또는 DNA 결합 겔 변이 검정과 같은 활성 검정 을 포함하나 이것으로 한정되지는 않는다.

NAT 가 그람 - 음성 박테리아 이외의 숙주 세포에서 분비된다면, 대부분 세포 배지에서 발견될 것이다. NAT 가 그람 - 음성 박테리아에서 분비된다면, 그것은 주변세포질에서 같은 정도로 발견될 것이다. NAT 가 분비되지 않는다면, 그것은 세포질에 존재할 것이다.

세포내의 NAT 에서, 숙주 세포는 대체로 우선 기계적으로 분쇄된다. NAT 를 함유하는 주변세포질 위치에서, 기계적 분쇄 또는 삼투압 처리중 어느 하나를 사용함으로써 완충 용액 내로 주변세포질 함량을 방출시킬 수 있다. 그 후에, NAT 폴리펩티드를 완충용액에서 분리시켰다. 그 다음, 다양한 기술을 사용하여 용액으로부터 정제시켰다. 카르복실 또는 아미노 말단에서의 헥사히스티딘 또는 다른 작은 펩티드 같은 표식을 포함하는 NAT 가 합성되었다면, 이것을 표식 또는 폴리펩티드(예를 들어, 모노클로날 항체)에 직접적인 높은 친화력을 갖는 컬럼 기질을 포함하는 친화성 컬럼을 통해 용액을 흘려보냄으로써 단단계(one-step)법으로 정제시켰다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈에 높은 친화력과 특이성을 가지고 결합하므로 정제시에 니켈의 친화컬럼(예를 들어, 퀴아젠 니켈 컬럼)을 사용할 수 있다(예를 들어, 상기 Ausubel 등의 editor, Current Protocols in Molecular Biology 을 참조하라).

다른 한편으로, 표식 및 항체를 포함하지 않는 폴리펩티드도 이용할 수 있는데, 잘 알려진 다른 정제 과정을 사용할 수 있다. 이러한 과정은 이온 교환 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, 겔 용리에 결합되는 천연 겔 전기영동 및 조제용 등전집중("아이소프라임" 장치/기술, 호에퍼 사이언티픽)을 포함하나 이것으로 한정되지는 않는다. 일부 경우에 있어서는, 상기 기술 중 둘 또는 그 이상의 기술을 겸할 것이다.

NAT 의 생산에는 특히 효모 세포가 바람직하며, 예를 들어, 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)같은, 피히아(Pichia)로 공지된 효모 속이 가장 바람직한데 그 이유는 예를 들어, E. coli 와 같은 박테리아 세포보다 재접힘 효율이 더 우세하기 때문이다. 상기 효모 균주에서의 발현의 적당한 재조합 방법은 미국 특허 제 4,855,231 호(Stroman 등의), 제 4,812,405 호(Lair 등의), 제 4,818,700 호(Cregg 등의), 제 4,885,242 호(Cregg 등의) 및 제 4,837,148 호(Cregg 등의)에 기술되어 있으며, 그 내용을 본원에서 참고문헌으로 인용하고 있다.

특히, 피히아 세포는 금속단백질 분해효소를 코드하는 DNA 분자와 비슷한 능력을 갖는 피브롤라제의 발현에 이용될 수 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 부가적인 양상이다. 피브롤라제는 과학 문헌 및 특 허 문헌에 기술된 금속단백질 분해효소이다(Randolph 등의 상기 문헌 및 유럽 특허 출원 제 0 323 722 호 참조). 일반적으로, 발현시키고자 하는 피브롤라제는 SEQ ID NO : 6 의 cDNA 분자(또는 동일한 아미노산 서열을 코드하는 이의 변이체)에 의해 코드되며, SEQ ID NO : 5 에 존재할 것이다. 이러한 시스템에서의 피브롤라제의 발현은 일반적으로 SEQ ID NO : 7 의 DNA 분자를 수반하며, "성숙한" 폴리펩티드(누클레오티드 784 - 1392) 이외에 "프리프로" 서열(누클레오티드 1 - 783)을 코드한다.

특성을 변형하기 위해서, 폴리펩티드를 중합체 또는 다른 분자에 결합시켜 유도체를 형성하는데 있어서의 NAT 의 화학적 변형 버전 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 인체 치료효과에 있어서 특히, 폴리펩티드 부분으로 하나 또는 그 이상의 다른 화학적 부분의 부착에 의한 이러한 방법으로 NAT 를 유도체화 하는 것이 유리할 것이다. 이러한 화학적 부분을 다양한 수용성 중합체 중에서 선택할 것이다. 중합체는 NAT 폴리펩티드가 부착되기 위해 수용성이어야 하며 생리적 환경과 같은 수성환경에 혼합될 수 있다. 수용성 중합체는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레익 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 임의 또는 비임의 공중합체 중 어느 하나, 융합 분자에 관하여 하기를 참조하라) 및 덱스트란 또는 폴리(n - 비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리스티렌말레이트 및 폴리비닐 알콜 중에서 선택할 것이다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정하기 때문에 제조에 유리할 것이다.

중합체는 모든 분자량을 가질 수 있으며, 가지난 것이거나 그렇지 않을 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에서, 취급 및 제조를 용이하게 하기 위한 바람직한 분자량은 약 2 킬로달톤(kDa) 및 약 100 kDa 사이이다(폴리에틸렌 글리콜의 제조시의 "약" 이란 용어는, 특정한 분자가 규정된 분자량보다 무게가 더 나가거나 조금 덜 나감을 나타낸다). 다른 크기도 사용되는데, 요구되는 치료학적 프로필에 의존한다(예를 들어, 요구되는 서방성의 지속기간, 생물학적 활성이 있을 때의 영향, 취급의 용이함, 항원성의 결여 또는 정도 및 치료학적 단백질의 폴리에틸렌 글리콜의 알려진 다른 효과).

이와 같이 부착하는 중합체 분자의 수는 변할 수 있으며, 본 분야의 숙련자에 의해 기능의 효과를 확인할 수 있을 것이다. 이는 모노유도체화 되거나, 디-, 트리-, 테트라- 또는 동일하거나 상이한 화학적 부분(예를 들어, 상이한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체)을 갖는 유도체화의 특정 결합이 제공될 것이다. 반응 혼합물의 농도에 따라 NAT 폴리펩티드 분자와 중합체 분자의 비율이 변할 것이다. 일반적으로, 최적의 비율(비반응 폴리펩티드 또는 중합체의 초과됨 없는 반응의 효율에 의한)은 바람직한 유도체화의 정도(예를 들어, 모노-, 디-, 트리- 등), 선택된 중합체의 분자량(중합체는 가지난 것 또는 아닌 것) 및 반응 상태 같은 인자에 의해 결정된다.

화학적 부분은 폴리펩티드의 기능적 또는 항원적 도메인에서의 영향을 고려하여 NAT 에 부착해야 한다. 본 분야의 숙련자들에 의해서 다수의 부착 방법이 가능하다. 예를 들어, 제 EP 0 401 384 호(G-CSF 에 대한 PEG 의 결합) 및 Malik 등의 Experimental Hematology, Volume 20, pages 1028 - 1035(1992) (염화트레실을 사용한 GM-CSF 의 폴리에틸렌글리콜화의 보고)를 참조하라. 실례로서, 폴리에틸렌 글리콜은 유리 아미노기 또는 카르복실기 같은 반응기를 통하여 아미노산 잔기에 공유 결합할 수 있다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학적 부분)에 결합할 수 있다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기는 리신 잔기 및 N - 말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 유리 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 설프히드릴기 또한 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학적 부분)의 부착에 있어서 반응기 로 사용할 수 있다. 바람직한 제조 효과는 N - 말단 또는 리신기 같은 아미노기에 부착시키는 것이다. 만약 수용체 결합이 요구된다면, 수용체 결합에서 중요한 잔기로의 부착은 피해야 한다.

N-말단이 화학적으로 변이된 유도체가 특히 바람직할 것이다. 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하며, 이는 폴리에틸렌 글리콜 분자의 종류(분자량, 가지난 것 등에 의함), 반응 혼합물에서 폴리펩티드 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 실행되기 위한 폴리에틸렌글리콜화 반응 형태 및 선택된 N-말단의 폴리에틸렌글리콜화된 NAT 를 수득하기 위한 방법 중에서 선택될 것이다. N-말단의 폴리에틸렌글리콜화된 제제의 수득방법(즉, 가능하다면 다른 모노폴리에틸렌글리콜화된 부분으로부터 이 부분을 분리시킴)은 폴리에틸렌글리콜화된 NAT 분자 집단에서 N-말단의 폴리에틸렌글리콜화된 물질의 정제에 의해 이루어질 것이다. 선택적인 N-말단의 화학적 변이는 유도체화에 이용할 수 있는 주요한 아미노기의 상이한 형태(리신 대 N-말단)의 상이한 반응성을 이용하는 환원 알킬화에 의해 이루어질 것이다. 1996 년 4 월 25 일자로 공개된 PCT 출원 제 WO 96/11953 호를 참조하라. 적당한 반응 조건하에서, 대체로 카르보닐기를 함유하는 중합체를 갖는 N-말단의 선택적인 NAT 유도체화가 이루어진다. 예를 들어, 리신 잔기의 ε - 아미노기 및 폴리펩 티드의 N-말단 잔기에서의 α - 아미노기 간의 pK_a 차이를 이용할 수 있는 pH 에서 반응시킴으로써 선택적으로 N-말단에 NAT 를 폴리에틸렌글리콜화시킬 것이다. 이러한 선택적인 유도체화로, 폴리펩티드에 대한 중합체의 부착을 조절하였다 : 중합체와의 접합은 폴리펩티드의 N-말단에서 우세하게 일어나며, 리신 측쇄 아미노기 같은 다른 반응기에서는 현저한 변이가 일어나지는 않는다. 환원 알킬화를 이용하여, 중합체는 상기에 기술된 형태이며, 폴리펩티드로의 결합에서 단일 반응성인 알데히드를 가질 것이다. 단일 반응성인 알데히드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 사용되었다.

본 발명에 따른 NAT 또는 화학적으로 변이된 유도체를 생체내 투여하기 위해 제형화시켰으며, 혈전내를 통한 투여가 가장 바람직하다(즉, 도뇨관에 의한 것과 같이 혈관 내 응괴 위치로의 직접적인 국부 수송을 통함). 전신성 수송은, 피브린 또는 피브리노겐을 수반하는 상호작용을 막기 위해 일반 혈행내의 선천적인 α2 고분자글로불린이 NAT 에 결합할 수 있는 가능성 때문에 보통은 바람직하지 않으므로, 응괴 용해를 약화시킨다. 그러나, NAT 를 α2 고분자글로불린의 혈중 농도 이상의 양으로 사용함에 따라 전신성 투여 및 수송을 가능하게 하는 실례가 있을 수 있다. 일반적으로, 약학적으로 용인가능한 희석제, 보존 제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 NAT 유효량을 함유하는 약학적 조성물도 본 발명의 범주에 포함된다. "유효량" 은 알맞은 생물학적 효과를 나타내기에 충분한 양을 뜻한다(즉, 혈병 또는 응괴의 용해에 영향을 미치는 혈전용해적 유효량).

일반적으로, NAT 는 고도로 정제된 형태일 것이며, 수송 부형제로서 이용되는 어떤 약학적 조성물은 살균한 여과막을 통한 여과와 같이, 보통은 사용하기 전에 멸균될 것이다.

본 분야의 숙련자들은 투여 및 바람직한 치료학적 효과를 관찰함으로써 유효 투여량을 확정할 수 있을 것이다. 본 범주내의 특정한 유효 투여량은 수용자의 나이 및 일반적 건강상태는 물론, 특정한 증상 또는 상태에 따라서 처리될 것이고, 표준 임상 절차에 의해 결정될 수 있다. 가능하다면, 인간에게 시험하기 전에 생물검정 시스템에 따라 먼저 생체외에서 시험한 다음 생체내의 유용한 동물 모델 시스템에서 시험하여 약학적 조성물에 대한 투여반응 곡선을 결정하는 것이 바람직할 것이다. 처리하의 증상의 형태 및 적용할 수 있는 다른 인자 같은 치료학적 환경을 숙고하여, 숙련된 전공의는 부작용 없는 적당한 투여량을 확정할 수 있을 것이다. 대체로, 전공의는 바람직한 효과(즉, 혈병의 용해)를 나타내는 투여량에 이를때까지 NAT 조성물을 투여할 것이다. 조성물은 투여기간을 반복하거나 연속적인 주성분으로 단일 투여되거나 또는 둘 또는 그 이상으로 투여될 것이다(동일한 양의 폴리펩티드를 포함하거나 포함하지 않음).

NAT 는 또한 표준 방법에 따라 항체를 생산하기 위해 사용된다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 단일 - 사슬 항체 및/또는 이중특이성 항체이다. 면역반응이 생길 가능성을 높이기 위하여, 증가된 면역원성에 관련된 분자의 부분을 증명하기 위해 NAT 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열은 Hope 및 Wood 의 방법[the National Academy of Science USA, Volume 78, page 3824 - 3828 (1981) 에 따른]에 따르는 것같이, 표면 에피토프를 증명하기 위해 컴퓨터로 분석할 수 있다.

NAT 의 에피토프를 인식하는 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 본 분야에 알려진 여러 방법을 이용할 수 있다. 항체를 제조하기 위해, 토끼나 마우스, 랫 등에 폴리펩티드를 주사함으로써 여러 숙주 동물을 면역화시킬 수 있다. 면역 반응을 촉진시키기 위해 숙주 종에 따라 여러 보조제를 이용할 수 있는데, 여기에는 프로인트 보조제, 수산화알루미늄(alum) 등의 무기질 겔, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 펩티드, 기름 에멀젼, 키홀 - 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등의 표면 활성제 및 바실레 칼메트 - 구에린 및 코리네박테리움 파르븀과 같은 매우 유용한 인체 보조제가 포함되나 이것으로 한정되지는 않는다.

NAT 에 대한 직접적인 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 배지 내에서 연속적인 세포주에 의해 항체 분자를 생산할 수 있는 모든 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, Nature, Volume 256, pages 495 - 497 (1975)에 기재되어 있는, Kohler 및 Milstein 에 의해 최초로 개발된 하이브리도마 기술과 Kozbor 등의 Immunology Today, Volume 4, page 72 (1983)에 기재되어 있는 트리오마 기술, 인체 B - 세포 하이브리도마 기술 및 Cole 등의 "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pages 77 - 96 (1985)에 기재되어 있는, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV - 하이브리도마 기술들 모두 본 발명의 모노클로날 항체 제조에 유용하다.

본 발명의 항체는 투여후 생체내에서 NAT 에 결합하여 과량의 NAT 를 중화시키거나 억제시키므로 치료학적으로 이용할 수 있다. 또한 상기 항체를 공지된 진단 방법에 따라 체액이나 조직 시료 또는 기타 추출물 내 NAT 의 존재를 검출하기 위해 표지 형태 등으로 사용함으로써 진단 목적으로 사용할 수 있다.

특정 실시형태의 기술

본 발명을 하기 실시예로 보다 상세히 기술하였다.

실시예 1

NAT 서열의 유도

피브롤라제를 효과적으로 생산하는 방법은 단백질 분해효소 kex-2 의 절단이 "프리프로" 영역과 "성숙한" 영역의 접합점에서 이루어지는 프리프로피브롤라제로 우선 발현시켜 생물학적으로 활성인 물질("성숙한" 피브롤라제)을 수득하는 것이다. 이로써, 프리프로피브롤라제가 합성되고 프로세싱됨으로써 배지 내로 성숙한 피브롤라제가 분비된다. 절단된 접합점의 실제 서열은 (...TKR↓QQRF...) 이다.

Kex-2 는 인접한 두 염기성 아미노산, 이 경우에는 리신(K) - 아르기닌(R) 다음을 절단하는 엔도프로테아제이다. 상기 언급한 서열을 갖는 DNA 로부터 발현된 성숙한 피브롤라제는 추정되는 N-말단 글루타민(Q) 잔기가 사실상 탈아미드화 및 고리화를 거쳐 피로글루타민산(E)을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 화학적 변이는, N-말단 고리화 글루타민(피로글루타민산) 잔기를 갖는 펩티드가 아미노산 서열결정을 위한 에드만 분해 과정에서 반응할 수 없기 때문에 바람직하지 않은 것으로 여겨진다. 따라서, 성숙한 피브롤라제의 서열내 N-말단에 존재하는 글루타민(Q) 잔기를 삭제하여 N-말단 아르기닌(R) 잔기를 생성하였다. 언급한 바와 같이 kex-2 가 인접한 두 염기성 아미노산 뒤를 절단하므로, 서열 (...KRRF...)가 kex-2 절단 부위인 것으로 여겨진다. 따라서, N-말단 아르기닌(R) 잔기(상기 밑줄친 부분)를 세린(S) 잔기로 치환하여 서열(...KRSF...)이 되도록 한다. 세린은 kex-2 절단이 가수분해 부위의 C-말단 측에서 일어날 경우 이것이 용이하도록 아미노산을 도입할 필요가 있을 때에 선택한다[Rholam 등의 European Journal of Biochemistry, Volume 227, pages 707 - 714 (1995) 를 참조].

결과적으로, 표준적인 PCR 프로토콜을 이용하여 "QQR" 에 대한 코돈을 "S" 에 대한 코돈으로 치환하는 부위 - 특이 돌연변이유발을 성숙한 피브롤라제의 N-말단 코딩 영역에 실시함으로써 프리프로피브롤라제의 DNA 서열을 변이시켜 SEQ ID NO : 3 의 아미노산 서열을 갖는 프리프로 NAT 를 제조하였다. PCR 반응을 촉진시키는 데 사용하는 올리고누클레오티드를 하기하였으며, 또한 표적 서열과의 상동성도 나타내었다. 초기에는 프라이머 쌍으로 올리고 1 및 4 를 사용하고 다른 프라이머 쌍으로 올리고 2 및 3 을 사용하여 두 PCR 반응을 실시하였고, 둘 다 주형으로 모유전자 DNA 를 갖는다. 이들 두 반응의 DNA 산물(길이가 601 및 815 누클레오티드임)을 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고 프라이머 쌍으로 올리고 1 및 2 를 이용한 2 회 PCR 에서 주형으로 사용하기 위해 결합시켰다. 이러한 최종 PCR 산물(길이가 1372 누클레오티드)을 제한 엔도누클레아제 XhoI 및 NotI 으로 절단하였다. 절단물을 페놀/클로로포름으로 단백질을 제거하고 DNA 를 침전시켰다. 회복 DNA 부분을 플라스미드 pPICZα (미국 캘리포니아 칼스배드 인비트로겐 카탈로그 No. VI95 - 20 ) 내로 결합시켰으며, 이와 마찬가지로 제한 엔도누클레아제 XhoI 및 NotI 으로 절단하고 효소적으로 탈인산화한 다음 페놀/클로로포름으로 단백질을 제거하였다. 후속 공정은 모두 인비트로겐 피히아 발현 키트 매뉴얼(인비트로겐 코포레이션, 카탈로그 No. K1710 - 01)에 따라 실시하였다. 결합 반응 산물을 전기천공법에 의해 E. coli 내로 형질전환시키고 제오신 - 함유 고체 배지에서 생존한 것을 선별하였다. 플라스미드를 분리하고 프로피브롤라제 영역을 DNA 서열결정으로 확인하였다. 제한 엔도누클라제 PmeI 으로 절단하여 플라스미드를 선형화한 다음 피히아 파스토리스 GS115his⁺ 내로 형질전환시켰다. GS115 균주(인비트로겐에서 입수)는 보통 his^- 이므로, his4 유전자의 야생형 버전을 수반하는 DNA 원으로 형질전환시킴으로써 his⁺ 유전자형을 회복시켰다. 선택적으로, his⁺ 균주는 인비트로겐 코포레이션에서 통상적으로 입수가능하 다(X - 33 세포주, 카탈로그 No. C180 - 00). 제오신 - 내성 콜로니로 성분을 선별하였다. 메탄올 - 함유 배지에서 후보 클론을 유도하였고, 쿠마시 염색을 이용하여 4 - 20 % PAGE 상에서 NAT 생산을 분석하였다.

부위 - 특이적 PCR 돌연변이유발에 사용하는 올리고누클레오티드는 다음과 같다 :

이러한 올리고누클레오티드의 위치를 이중 - 가닥 DNA 서열(SEQ ID NO : 12, 코딩 가닥 또는 센스 가닥, SEQ ID NO : 13, 상보 가닥 또는 안티센스 가닥) 및 NAT 를 생산하기 위해 변이시킨 피브롤라제(프리프로 영역 포함)의 해당 아미노산 서열과 관련하여 하기하였다. 성숙한 피브롤라제의 N-말단 및 C-말단 영역은 말단 아미노산 서열(QQRF 및 LNKP)에 밑줄을 그어 표시하였다. N-말단 영역(QQRF)은 변이되는 부위이다(QQR 을 S 로 치환함). 하기에서 올리고 3 및 4 의 줄은 피브롤라제의 N-말단 영역내 잔기 QQ 를 코드하는 누락된 코돈의 위치를 나타내기 위해 삽입한 것이다.

실시예 2

피히아 파스토리스에서의 NAT 발현

E. coli 에서 NAT 의 DNA 를 발현시키고자 할 경우에, 재접힘이 매우 약하고 희석 조건이 요구되기 때문에 정제 효율이 감소되었다. 이러한 사항들로 인해 숙주 세포로 효모 종인 피히아 파스토리스를 사용하게 되었다. 프리프로 NAT cDNA(SEQ ID NO : 4)로 트랜스펙션시킨 피히아 파스토리스의 선택 클론 배양균을 500 ml 의 다음 접종 성장 배지내로 접종시켰다 :

회분 배지 리터 당

효모 추출물 30.0 g

이염기성 인산칼륨 17.2 g

글루코스 20.0 g

비오틴 0.004 g

물 1 리터

인산, 85 % pH 6.00 으로 조절

트랜스펙션된 피. 파스토리스 세포를 약 30 내지 32 시간 동안 30 ℃ 진탕기에서 배양시켰다. 결과적으로 생성된 약 1 %(w/v)의 배양균을 10 리터 발효조에 접종시켰다. 발효조는 멸균된 기초염 및 글루코스를 함유하였다(하기함). 화분 배지 리터 당 12 ml/l 의 PTM4 염(PTM4 는 황산구리(Ⅱ) 5수화물, 요오드화나트륨, 황산망간 1수화물, 몰리브덴산나트륨 2수화물, 붕산, 염화코발트(Ⅱ) 6수화물, 염화아연, 황산 제 I 철 7수화물, d-비오틴, 황산 및 정제수를 함유하는 미량 금속 용액이다)을 발효조 멸균 후에 첨가하였다. 발효 성장 온도는 30 ℃ 였다. 발효조의 pH 는 수산화암모늄 및 인산으로 pH 6.00 으로 조절하였다. 배지에 첨가된 아연염의 아연을 금속단백질 분해효소 구조의 일부로서 NAT 내로 삽입시켰다.

회분 배지 리터 당 기초염

인산, 85 % 26.7 ml

황산칼슘 0.93 g

황산칼륨 18.2 g

황산마그네슘 - 7H₂O 14.9 g

수산화칼륨 4.13 g

글루코스 30.0 g

물 1 리터

글루코스가 완전히 소비될 때까지(17 내지 20 시간) 회분 배지를 성장시켰다. 그런 다음, 유가 배양을 시작하였다. 유가 배양 배지는 글루코스 및 리터 당 12 ml 의 PTM4 염으로 이루어져 있다. 공급 사료는 글루코스, 25 % 메탄올 및 리터 당 12 ml 의 PTM4 염으로 이루어져 있다. 공급시, 반응기의 온도를 20 ℃ 까지 올렸다. 공급을 60 시간 내지 75 시간 동안 지속시켰다. 조정 배지를 수득하고 세포 찌꺼기를 제거하였다.

실시예 3

피히아 파스토리스로부터 NAT 정제

실시예 2 의 효모 육즙(세포 찌꺼기가 없는 조정 배지)을 정화시킨 다음, pH 와 전도율을 각각 6.5 및 10 - 20 mS/㎝ 로 맞추었다. 구리(Cu)로 하전시키고 인산완충식염수(PBS)로 평형화시킨 고정된 금속 친화성 수지에 육즙을 적하시켰다. 수지를 PBS 로 세척하고 PBS 내 이미다졸 기울기(0 - 100 mM) 로 용리시켰다. "성숙한" NAT(SEQ ID NO : 1)를 함유하는 분획을 풀링하여 전도율이 1.5 mS/㎝ 이하이고, pH 가 6.4 가 될 때까지 희석시켰다. 10 mM 2-(N-모르폴리노)메탄술폰산(MES)으로 평형화시킨 SP 세파로스 수지(미국 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 아머샴 파마시아 바이오테크, 인코포레이티드에서 입수)에 적하시켰다. 컬럼을 MES 로 세척한 후 MES 내 NaCl 기울기(0 - 500 mM)로 용리하였다. NAT 를 함유하는 분획을 풀링하여 저장하였다.

실시예 4

랫 경동맥의 급성 혈전증에 대한 혈전용해

(NAT 와 우로키나제의 비교)

"성숙한" NAT(SEQ ID NO : 1)가 생물학적으로 활성이며 고유한 기능을 갖는다는 것을 입증하기 위해, 양극 전류를 가함으로써 경동맥 중 하나에 병소 손상을 발생시키는 급성 약물학 연구를 랫에서 실시하였다. 이러한 손상은 일반적으로 15 분 이내에 형성되는 폐쇄성 혈전을 야기한다. 혈전이 일단 발생하면, 확실히 경동맥이 폐색되는지 확인하기 위해서 30 분간 동맥을 관찰하였다. 그런 다음, 혈전이 더 이상 증식되는 것을 막기 위해 헤파린 및 아스피린을 정맥내 투여하였다. 그런 다음, 실험 물질을 동물에게 동맥내 주입시켰다. 실험 물질 수송 중에 경동맥을 통한 혈류량을 모니터하여 응괴 용해가 성공적으로 이루어졌는 지를 관찰하고 응괴 용해가 일어나는 시간을 관찰하였다. 응괴 용해가 일어난 경우의 실험 백분율을 나타내었으며, 응괴 용해가 성공적으로 이루어진 실험에 대해서만 그룹 평균율을 계산하였다. 실험 물질의 출혈 능력을 측정하기 위해 수술 부위에서 흘러나오는 혈액을 거즈 면봉으로 수집하였다. 적혈구를 용해시키고 헤모글로빈을 유리시키는 세정제 용액에 면봉을 둔 다음 분광광도계로 정량하였다. 실혈량을 측정하는 데 방출된 헤모글로빈을 사용하였다. 실험 데이터를 하기 표에 나타내었다.

이러한 연구로 NAT 가 생체내 응괴 용해의 동물 모델에서 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다. 또한 우로키나제에 비해 수술 부위의 실혈이 덜 할 뿐만 아니라 응괴 용해 시간도 현저히 감소하였다. 따라서, NAT 의 활성 프로필은 NAT 로 인한 응괴 용해가 보다 신속하고 출혈성 합병증에 대한 위험이 감소되었다는 점에서 혈전용해제의 플라스미노겐 활성인자 군(예를 들어, 우로키나제)과 구별된다.

NAT 의 섬유소용해 활성은 피브롤라제의 활성에 필적한다. 또한, 상기 언급한 바와 같이 NAT 의 N-말단의 안정성으로 인해 재조합 발현시 보다 균질한 최종 산물을 생산하며, 이것은 명확한 이점이다(즉, N-말단은 상이한 형태의 혼합물을 생산하는 규정 시간 이외에도 변하지 않으므로 보다 안정한 폴리펩티드가 제조된다).

본 발명의 SEQ ID NO : 5 에서 위치 1-3 에서의 Gln-Gln-Arg 가 세린으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제 및 이를 함유하는 조성물은 혈전증을 치료하는데 효과적이다.

SEQUENCE LISTING <110> Boone, Thomas C. Li, Huimin Mann, Michael B. <120> FIBRINOLYTICALLY ACTIVE POLYPEPTIDE <130> A-596 <140> 09/411,329 <141> 1999-10-01 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: NAT (analog of fibrolase of Agkistrodon Contourtrix) <400> 1 Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His Arg 1 5 10 15 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val 20 25 30 His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile 35 40 45 Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile 50 55 60 Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp 65 70 75 80 Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu 85 90 95 Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val 100 105 110 Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp His 115 120 125 Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly 130 135 140 His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala 145 150 155 160 Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu 165 170 175 Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn 180 185 190 Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 2 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Encodes NAT (analog of fibrolase) <400> 2 tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60 tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120 gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180 caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240 cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300 gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360 tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420 cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480 aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540 tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600 ccg 603 <210> 3 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Native pro-NAT (analog of fibrolase) <400> 3 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser 85 90 95 Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro 100 105 110 Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr 115 120 125 Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn 130 135 140 Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp 145 150 155 160 Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr 165 170 175 His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala 180 185 190 Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu 195 200 205 Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys 210 215 220 Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val 225 230 235 240 Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu 245 250 255 Asn Leu Thr Lys Arg Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile 260 265 270 Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys 275 280 285 Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr 290 295 300 Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser 305 310 315 320 Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala 325 330 335 Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His 340 345 350 Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val 355 360 365 Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly 370 375 380 Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met 385 390 395 400 Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln 405 410 415 Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp 420 425 430 Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr 435 440 445 Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro 450 455 460 <210> 4 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Encodes pro-NAT (analog of fibrolase) <400> 4 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840 aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900 aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960 aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020 tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080 atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140 cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200 gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260 gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320 tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380 aaaccg 1386 <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Native fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 5 Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp 1 5 10 15 His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln 20 25 30 Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu 35 40 45 Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp 50 55 60 Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly 65 70 75 80 Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala 85 90 95 Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala 100 105 110 Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln 115 120 125 Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu 130 135 140 Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys 145 150 155 160 Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser 165 170 175 Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr 180 185 190 Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 6 <211> 609 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Encodes native fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 6 caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60 actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120 attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180 tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240 aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300 gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360 aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420 atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480 ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540 gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600 aacaaaccg 609 <210> 7 <211> 1392 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Coding sequence of native pro-fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 7 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840 aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900 accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080 accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380 ctgaacaaac cg 1392 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 8 tactattgcc agcattgctg c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 9 cctacagtct tacggtaaac g 21 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 10 tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtac 45 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 11 ggttaatttg aactgattct ctagaaaggg tgtttctatg catg 44 <210> 12 <211> 1620 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <221> misc_feature <222> Complement((1)..(1620)) <223> Complementary (sense) strand of antisense strand (See SEQ ID NO:13) <220> <223> Coding sequence of native pro-fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 12 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840 aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900 accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080 accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380 ctgaacaaac cgtaagcggc cgccagcttt ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat 1440 ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattgag tttgtagcct tagacatgac 1500 tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag 1560 aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt 1620 <210> 13 <211> 1620 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <221> misc_feature <222> Complement((1)..(1620)) <223> Complementary (antisense) strand of sense strand (See SEQ ID NO: 12) <220> <223> Anti-coding sequence of native pro-fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 13 aataaaaaag tatcaaaaat gaagcctgca tctctcaggc aaatggcatt ctgacatcct 60 cttgattaga atctagcaag accggtcttc tcgtaagtgc ccaacttgaa ctgaggaaca 120 gtcatgtcta aggctacaaa ctcaatgatg atgatgatga tggtcgacgg cgctattcag 180 atcctcttct gagatgagtt tttgttctag aaagctggcg gccgcttacg gtttgttcag 240 gatacactgc gggttgttaa cggtcaggaa ggtctggtag tctttcttag agcagtcgga 300 gaacagtttg gatggttgat cggacagcat agcagccata acacaggagt ttgcaccgca 360 gtgacactgg ttgccatcgt ggttcatacc caggttatga cccagttcgt gtgccatggt 420 cagagcaacc agcaggttaa tagcggagtg gtcctggata acaccagtag aatgtttcag 480 ttgacacatg ccaccaacgt aagccagacc aacagtatca ccgtcgaagt cgatagcggt 540 cagcagttga gcgttatcat gacgttggcg acgcagcagg tcggtttcac gccagttacc 600 gaaggatgcc agagtgtcgt gggatacaga agtaacggtg atcaaatctt ggttggacca 660 gatttccaaa ccaaccaaag tgaattggat gttcagtggt ctgtagattt cgttaatggt 720 gttgacgatt tggtgcaccc attgacggat tttgtcagag tcaccgttgt atttagtgtt 780 catacggtgg tcagcaacga taaccagctg tacgtatctt tgtgggaatc tttgttgtct 840 cttagtcaag tttaattgga aggccttctt gattggttca tatgattccc agttttgggt 900 aacaccacac atctttgggg cttcatcttc cttttcgacg ttttcgtact tgtagacagc 960 atgggcttca gagtcggaca attccaatgg ttcaatcaag tacatttcac cttgcaactt 1020 gaaatgaccc ttcaaaccgt tacaagcaga gatagaagca gtggagtcag catcgttttc 1080 gattctacca tggtagtaac agtgatcttc acccaatggg taagtagtaa tttctctacc 1140 atctggggag taatgagttt cagagtaatc ttcagagaac aaacctttgt ttttttccaa 1200 gtgcaagaca actggttcac tgttaacctt gaattcgtat tgcatggcat cttcgtactt 1260 tggttgaaca gcacccctag gaactggagt gacctttctt ggataaacaa cttcgtaatc 1320 gttaacgtta ccagattcca agataataga agaagcttca gcctctcttt tctcgagaga 1380 taccccttct tctttagcag caatgctggc aatagtagta tttataaaca ataacccgtt 1440 atttgtgctg ttggaaaatg gcaaaacagc aacatcgaaa tccccttcta aatctgagta 1500 accgatgaca gcttcagccg gaatttgtgc cgtttcatct tctgttgtag tgttgactgg 1560 agcagctaat gcggaggatg ctgcgaataa aacagcagta aaaattgaag gaaatctcat 1620 <210> 14 <211> 540 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Xaa in positions 465, 493, 516 and 536 correspond to stop codons. <220> <223> Native pro-fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 14 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser 85 90 95 Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro 100 105 110 Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr 115 120 125 Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn 130 135 140 Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp 145 150 155 160 Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr 165 170 175 His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala 180 185 190 Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu 195 200 205 Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys 210 215 220 Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val 225 230 235 240 Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu 245 250 255 Asn Leu Thr Lys Arg Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu 260 265 270 Val Ile Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser 275 280 285 Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu 290 295 300 Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile 305 310 315 320 Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr 325 330 335 Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln 340 345 350 Arg His Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp 355 360 365 Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser 370 375 380 Thr Gly Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu 385 390 395 400 Thr Met Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly 405 410 415 Asn Gln Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu 420 425 430 Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr 435 440 445 Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro 450 455 460 Xaa Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 465 470 475 480 Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser 485 490 495 Leu Arg His Asp Cys Ser Ser Val Gln Val Gly His Leu Arg Glu Asp 500 505 510 Arg Ser Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Glu Cys His Leu Pro 515 520 525 Glu Arg Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile 530 535 540 <210> 15 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Native fibrolase of Agkistrodon contortrix <220> <223> Xaa in position 1 represents the chemical compound, pyroglutamic acid. This chemical compound is referred to in the specification as the letter "E". <400> 15 Xaa Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp 1 5 10 15 His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln 20 25 30 Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu 35 40 45 Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp 50 55 60 Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly 65 70 75 80 Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala 85 90 95 Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala 100 105 110 Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln 115 120 125 Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu 130 135 140 Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys 145 150 155 160 Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser 165 170 175 Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr 180 185 190 Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 16 <211> 202 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Native fibrolase of Agkistrodon contortrix <220> <223> Xaa in position 1 represents the chemical compound, pyroglutamic acid. This chemical compound is referred to in the specification as the letter "E". <400> 16 Xaa Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His 1 5 10 15 Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp 20 25 30 Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn 35 40 45 Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu 50 55 60 Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn 65 70 75 80 Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln 85 90 95 Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr 100 105 110 Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp 115 120 125 His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu 130 135 140 Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly 145 150 155 160 Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys 165 170 175 Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val 180 185 190 Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 17 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Analog form of native pro-fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 17 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser 85 90 95 Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro 100 105 110 Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr 115 120 125 Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn 130 135 140 Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp 145 150 155 160 Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr 165 170 175 His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala 180 185 190 Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu 195 200 205 Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys 210 215 220 Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val 225 230 235 240 Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu 245 250 255 Asn Leu Thr Lys Arg Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile 260 265 270 Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys 275 280 285 Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr 290 295 300 Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser 305 310 315 320 Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala 325 330 335 Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His 340 345 350 Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val 355 360 365 Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly 370 375 380 Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met 385 390 395 400 Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln 405 410 415 Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp 420 425 430 Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr 435 440 445 Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro Xaa Ala 450 455 460 Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 465 470 475 480 Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser Leu Arg 485 490 495 His Asp Cys Ser Ser Val Gln Val Gly His Leu Arg Glu Asp Arg Ser 500 505 510 Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Glu Cys His Leu Pro Glu Arg 515 520 525 Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile 530 535 <210> 18 <211> 602 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Fragment of fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 18 tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60 agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120 aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180 cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240 ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300 attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360 ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420 gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480 cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540 accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600 ac 602 <210> 19 <211> 816 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Fragment of fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 19 tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg 60 ctgaccaccg tatgaacact aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc 120 accaaatcgt caacaccatt aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg 180 ttggtttgga aatctggtcc aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca 240 ctctggcatc cttcggtaac tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata 300 acgctcaact gctgaccgct atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg 360 gtggcatgtg tcaactgaaa cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc 420 tgctggttgc tctgaccatg gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg 480 gcaaccagtg tcactgcggt gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac 540 catccaaact gttctccgac tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca 600 acccgcagtg tatcctgaac aaaccgtaag cggccgccag ctttctagaa caaaaactca 660 tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 720 gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 780 agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgc 816 <210> 20 <211> 1373 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Fragment of fibrolase of Agkistrodon contortrix <400> 20 tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60 agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120 aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180 cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240 ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300 attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360 ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420 gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480 cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540 accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600 acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa tacaacggtg actctgacaa 660 aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac gaaatctaca gaccactgaa 720 catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac caagatttga tcaccgttac 780 ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg cgtgaaaccg acctgctgcg 840 tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc gacttcgacg gtgatactgt 900 tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat tctactggtg ttatccagga 960 ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca cacgaactgg gtcataacct 1020 gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca aactcctgtg ttatggctgc 1080 tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc tctaagaaag actaccagac 1140 cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa ccgtaagcgg ccgccagctt 1200 tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca 1260 tcatcattga gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg 1320 agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgc 1373

Claims

SEQ ID NO : 5 의 위치 1-3 에서의 Gln-Gln-Arg 가 세린으로 치환된 변이를 포함하는 섬유소용해 활성을 갖는 변형된 피브롤라제.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO : 5 의 N-말단 또는 C-말단에 이종의 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 변형된 피브롤라제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 중합체를 포함함을 특징으로 하는 변형된 피브롤라제.
제 3 항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜임을 특징으로 하는 변형된 피브롤라제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효모에서 재조합 발현시켜서 제조한 것임을 특징으로 하는 변형된 피브롤라제.
제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
제 6 항의 핵산 분자에 작동적으로 결합하는 발현 조절 요소를 포함 하는 발현 벡터.
제 6 항의 핵산 분자로 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨 숙주 세포.
제 8 항에 있어서, 원핵세포 또는 진핵세포임을 특징으로 하는 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨 숙주 세포.
제 9 항에 있어서, 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨 진핵세포가 효모 세포임을 특징으로 하는 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨 숙주 세포.
제 10 항에 있어서, 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨 효모 세포가 피히아 파스토리스임을 특징으로 하는 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨 숙주 세포.
다음 단계를 포함하는, 제 1 항 또는 제 2 항의 변형된 피브롤라제를 제조하는 방법

핵산 분자가 발현되는 조건 하에서, 핵산 분자의 발현을 촉진시키는 조절 요소에 작동적으로 결합하는 제 6 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양시키는 단계 ; 및

숙주 세포 배양물로부터 변형된 피브롤라제를 분리하는 단계.
제 12 항에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포임을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 효모 세포가 피히아 파스토리스임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항의 변형된 피브롤라제, 및 약학적으로 용인가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 에멀젼화제, 아쥬반트 또는 담체를 포함하는, 혈전증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
혈병을 용해시키는, 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항의 섬유소용해 활성을 갖는 피브롤라제를 함유하는 조성물을 혈병과 접촉시켜 인체를 제외한 포유동물의 혈병을 효과적으로 용해시키는 방법.
혈병을 용해시키는, 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항의 섬유소용해 활성을 갖는 피브롤라제를 함유하는 조성물을 투여하여 인체를 제외한 포유동물의 혈전증을 치료하는 방법.
제 17 항에 있어서, 조성물은 혈관 내의 혈병에 대하여 국소적으로 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 조성물은 카테터에 의해 투여함을 특징으로 하는 방법.