BR122019022434B1

BR122019022434B1 - método para cultivar células de mamífero que secretam proteína heteróloga em um sobrenadante de cultura celular

Info

Publication number: BR122019022434B1
Application number: BR122019022434-0A
Authority: BR
Inventors: Andre Giovagnoli; Sylvain Roy; Veronique Ducros; Virginie Charlot; Yves-Olivier Stauffer
Original assignee: Baxalta Incorporated; Baxalta GmbH
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2020-11-03
Also published as: HRP20171374T1; SI2574676T1; PT2574676T; WO2009086309A3; ES2644089T3; DK2574677T3; HUE036712T2; US9359629B2; ES2647294T3; CN106222220A; EP2574676B1; KR20100097752A; HK1246827A1; KR101818411B1; US20090176269A1; EP3255152A1; KR20170126514A; SG10201503304RA; KR101798813B1; PT2235197T

Abstract

Cultivar células de mamífero que secretam proteína heteróloga, tais como células CHO ou BHK, de 35,1 a 36,5 °C e/ou em pH 7,15 a 7,20 e/ou em uma concentração de CO2 dissolvido de 10 % ou menor. As proteínas heterólogas preferidas são Fator VIII, ADAMTS-13, furina ou Fator VII.

Description

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. N°. 61/009.328, depositado em 27 de Dezembro de 2007, que é incorporado neste por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção diz respeito aos processos para a cultura das células de mamíferos, particularmente as células de mamíferos que secretam as proteínas heterólogas e/ou recombinantes e, mais particularmente, as células de mamíferos que secretam as proteínas sanguíneas, tal como fator de coagulação VIII (em seguida “Fator VIII”, ou justo “FVIII”), ADAMTS-13, furina ou fator de coagulação VII (em seguida “Fator VII”, ou justo “FVII”).

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[003] O fator de clonagem sanguínea VIII é uma glicoproteína traço de plasma que é encontrada nos mamíferos e é envolvido como um co-fator de IXa na ativação do fator X. Uma deficiência herdada do fator VIII resulta na hemofilia A do distúrbio de sangramento, que pode ser tratado sucessivamente com fator VIII purificado. O fator VIII pode ser extraído a partir de plasma sanguíneo ou pode ser produzido pelas técnicas com base de DNA recombinantes. No plasma, este circula como um complexo com o fator von Willebrand (vWF).

[004] O fator recombinante VIII (rFVIII) pode ser produzido pelas células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectados com um vetor que realiza uma sequência de DNA que codifica a molécula de fator VIII. Em alguns casos, o fator VIII recombinante é co-produzido com fator von Willebrand recombinante (rvWF), que estabiliza o fator VIII. Tal co-produção pode envolver a co-cultura de linhas respectivas que expressam FVIII e vWF, ou a co-expressão de duas proteínas na mesma célula. Ver U.S. 5 250 421 (Genetics Institute) e Kaufman etal (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1233-1242.

[005] Em um típico processo para a preparação do fator VIII recombinante, as células são cultivadas em um meio e secreta o fator VIII no meio. O fator FVIII então pode ser purificado a partir do meio, opcionalmente como um complexo com vWF.

[006] O fator VIII recombinante é dispendioso para produzir devido aos rendimentos relativamente baixos obtidos nos processos conhecidos na técnica. O rendimento por células tende-se a ser comparado baixo ao rendimento que pode ser obtido para outras proteínas recombinantes. Se o meio de cultura não é suplementado com os produtos de animais, tal como soro, o meio pode suportar apenas as densidades celulares relativamente baixas. Este reduz a produção por volume do meio. Entretanto, não é desejável suplementar o meio de cultura com os produtos de animais a fim de reduzir o risco de contaminação com vírus e outros agentes transmissíveis. O meio livre de proteína animal para a produção de FVIII são conhecidos de U.S. 6 936 441 (Baxter AG), por exemplo.

[007] A presente invenção fornece os processos para a produção de proteínas sanguíneas, incluindo rFVIII, em que o rendimento é melhorado em comparação aos processos conhecidos na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Um primeiro aspecto da invenção fornece um método de cultivar as células de mamífero que secretam proteína heteróloga em um sobrenadante de cultura celular em que o sobrenadante de cultura celular é mantido em uma temperatura que ajustada em X±0,9° C em que X tem um valor de 35,1 a 36,5, com a condição que a temperatura seja ajustada em menos do que 37° C.

[009] Um segundo aspecto da invenção fornece um método de cultivar as células de mamífero que secretam proteína heteróloga em um sobrenadante de cultura celular em que o sobrenadante de cultura celular é mantido em um pH que é ajustado em X ± 0,05 em que X tem um valor de 7,15 a 7,20, com a condição de que o pH é ajustado em mais do que 7,10.

[0010] Um terceiro aspecto da invenção fornece um método de cultivar as células de mamífero que secretam proteína heteróloga em um sobrenadante de cultura celular em que o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração de CO2 de 1 a 10 %.

[0011] Um quarto aspecto da invenção fornece um método de cultura contínuo de células de mamíferos que secretam FVIII em um recipiente que compreende um sobrenadante de cultura celular em que a densidade das células no sobrenadante de cultura celular é medido por um sensor em linha e o influxo do meio fresco no reservatório é automaticamente controlado deste modo como para manter a densidade das células na faixa desejada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

[0012] No processo do primeiro aspecto da invenção, o sobrenadante de cultura celular em que as células de mamíferos são cultivados é mantido em um temperatura que é apresentado na X±0,9° C em que X tem um valor de 35,1 a 36,5, com a condição que a temperatura seja ajustada em menos do que 37° C. Nas formas de realização preferidas, a temperatura é ajustada em 36 ± 0,9° C, preferivelmente 36 ± 0,5° C, mais preferivelmente 36 ± 0,2° C e mais preferivelmente 36° C; ou 35,1 ± 0,9° C, preferivelmente 35,1 ± 0,5° C, mais preferivelmente 35,1 ± 0,2° C e mais preferivelmente 35,1° C; ou 36,5 ± 0,9° C, 36,5 ± 0,5° C, mais preferivelmente 36,5 ± 0,2° C e mais preferivelmente 36,5° C.

[0013] O "sobrenadante de cultura celular" é o meio em que as células de mamíferos são cultivadas. Este meio não será misturado com o meio de alimentação que pode ser adicionado à cultura, embora o meio de alimentação seja também preferivelmente adicionado à cultura na temperatura em que o sobrenadante de cultura celular é apresentado. Por "cultura"entende-se o sobrenadante de cultura celular e as células de mamíferos cultivadas neste. Convencionalmente, as células de mamíferos são cultivadas a 37° C. Surpreendentemente, o requerente observa que a cultura das células de mamíferos em uma temperatura inferior, tal como 36° C aumenta o rendimento da proteína recombinante.

[0014] Por "cultivar em" ou "manter em" uma temperatura, referimos a temperatura que os sistemas de controle de processo são apresentados, em outras palavras a temperatura alvo, pretendida. Claramente, existem pequenas variações de temperatura de uma cultura durante o período, e da localização a localização através dos reservatórios de cultura. Onde referimos a "cultivar em a" ou "manter em " uma temperatura que é ajustada em X ± Y° C, queremos dizer que o ponto apresentado é um valor de X+Y° C a X-Y° C. Deste modo, por exemplo onde X é 36,0 ± 0,9° C, o ponto apresentado ajustado em um valor de 35,1 a 36,9. Para cada um dos valores preferidos de X, o ponto de apresentação é um valor dentro da faixa de X ± 0,9° C, ± 0,8° C, ± 0,7° C, ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C, ou ± 0,1° C. as faixas mais estreitas são preferidas. Um ponto de apresentação de X é mais preferido.

[0015] Para qualquer ponto de apresentação dado, leves variações em temperatura podem ocorrer. Tipicamente, tal variação pode ocorrer por causa dos elementos de aquecimento e esfriamento são apenas inativados após a temperatura ser desviada relativamente do ponto apresentado. Naquele caso, o ponto apresentado é X (± Y) e o elemento de aquecimento ou esfriamento é ativado quando a temperatura varia por ± Z° C, como apropriado. Tipicamente, o grau permissível de desvio da temperatura a partir do ponto de apresentação antes do elemento de aquecimento ou esfriamento são ativados pode ser programado no sistema de controle de processo. A temperatura pode ser controlada mais próxima a ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C ou ainda ± 0,1° C pelos elementos de aquecimento e esfriamento controlado por termostatos. Os diferenciais mais amplos na temperatura também podem ser programados, tal como ± 0,9° C, ± 0,8° C, ± 0,7° C ou ± 0,6° C. A temperatura também pode ser controlada pela imersão do reservatório de cultura em um banho de aquecimento em uma temperatura particular. De modo conceptível, não existe variação a partir do ponto de apresentação por causa do aquecimento é aplicado continuamente. Uma outra fonte de variação origina-se devido ao erro de medição na temperatura do sobrenadante de cultura celular. Os termômetros típicos usados no equipamento de cultura celular podem ter uma variabilidade de ± 0,3° C ou ± 0,2° C, ou ainda ±0,1° C.

[0016] Onde o ponto de apresentação ajustado em um valor dentro da faixa X ± Y° C, e a tolerância da temperatura é ± Z° C (isto é um aquecedor e esfriador é ativado quando a temperatura desvia por ± Z° C, como apropriado) este também pode ser expressado como um ponto de apresentação de (X-Y a X+Y) ± Z° C. Para cada valor possível de X, todas as combinações de ± Y° C e ± Z° C, como indicado acima, são considerados, com a condição que a temperatura seja ajustada em menos do que 37° C.

[0017] Em uma forma de realização preferida, a temperatura é ajustada em 36 ± Y° C. Preferivelmente, a temperatura é ajustada em (35,4 a 36,6) ± 0,3° C, ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0; ou (35,5 a 36,5) ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou (35,6 a 36,4) ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou (35,7 a 36,3) ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0; ou (35,8 a 36,2) ± 0,7° C ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou (35,9 a 36,1) ± 0,8° C, ± 0,7° C ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou 36 ± 0,9° C ± 0,8° C, ± 0,7° C ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0o C.

[0018] Em uma forma de realização preferida, a temperatura é ajustada em 35,1 ± Y° C. Preferivelmente, a temperatura é ajustada em (34,5 a 35,7) ± 0,3° C, ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0; ou (34,6 a 35,6) ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou (34,7 a 35,5) ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou (34,8 a 35,4) ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0; ou (34,9 a 35,3) ± 0,7° C ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou (35,0 a 35,2) ± 0,8° C, ± 0,7° C ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0; ou 35,1 ± 0,9° C ± 0,8° C, ± 0,7° C ± 0,6° C, ± 0,5° C, ± 0,4° C, ± 0,3° C, ± 0,2° C , ± 0,1° C ou ± 0o C.

[0019] Em uma outra forma de realização preferida, a temperatura é ajustada em 36,5 ± Y° C. Preferivelmente, a temperatura é ajustada em (36,1 a 36,9) ± 0; ou (36,2 a 36,8) ± 0,1° C ou ± 0; ou (36,3 a 36,7) ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0; ou (36,4 a 36,6) ± 0,3° C, ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0; ou 36,5 ± 0,4° C. ± 0,3° C, ± 0,2° C, ± 0,1° C ou ± 0.

[0020] No processo do segundo aspecto da invenção, o sobrenadante de cultura celular é mantido em um pH que é ajustado em X ± 0,05 em que X tem um valor de 7,15 a 7,20, com a condição de que o pH é ajustado em mais do que 7,10. Nas formas de realização preferidas, o pH ajustado em 7,20 ± 0,05, preferivelmente 7,20 ± 0,03, mais preferivelmente 7,20 ± 0,01 e mais preferivelmente em 7,20; ou 7,15 ± 0,05, preferivelmente 7,15 ± 0,03, mais preferivelmente 7,15 ± 0,01 e mais preferivelmente a 7,15. Em um processo convencional para a produção de uma proteína recombinante, o sobrenadante de cultura celular é mantido a pH 7,1. Surpreendentemente, o requerente foi observado que a cultura das células de mamíferos em um pH mais alto, tal como pH 7,2 aumenta o rendimento de proteína recombinante.

[0021] Por "cultivar em" ou "manter em" um pH, refere-se ao pH em que os sistemas de controle do processo são apresentados, em outras palavras o pH alvo, pretendido. Onde referimos a "cultivar em" ou "manter em” um pH que é ajustado em X ± Y, significamos que o ponto apresentado está em um valor de X+Y a X-Y. Para cada um dos valores preferidos de X, o ponto de apresentação está em um valor dentro da faixa X ± 0,05, ± 0,04, ± 0,03, ± 0,02 ou ± 0,01. As faixas mais estreitas são preferidas. A ponto de apresentação de X é mais preferida.

[0022] Para um dado ponto de apresentação, leves variações do pH podem ocorrer. Tipicamente, cada variação pode ocorrer por causa dos meios que controlam o pH, por exemplo pela adição de ácido ou base, ou mudança da taxa de aspersão, são apenas ativadas após o pH ser desviado relacionado ao ponto de apresentação. Tipicamente, o pH é controlado as unidades mais próximas ± 0,05, ± 0,04, ± 0,03, ± 0,02 ou ± 0,01 de pH.

[0023] Onde o pH ponto de apresentação ajustado em um valor dentro da faixa X ± Y, e a tolerância é ± Z, este também pode ser expresso como um ponto de apresentação de (X-Y a X+Y) ± Z. Para cada valor possível de X, todas as combinações de +Y e ± Z, como indicado acima, são considerados, com a condição de que o pH é ajustado em mais do que 7,10.

[0024] Em uma forma de realização preferida, o pH ajustado em 7,20 ± Y. Preferivelmente, o pH ajustado em (7,15 a 7,25) ± 0; ou (7,16 a 7,24) ± 0,1 ou ± 0; ou (7,17 a 7,23) ± 0,2, ± 0,1 ou ± 0; ou (7,18 a 7,22) ± 0,3, ± 0,2, ± 0,1 ou ± 0; ou (7,19 a 7,21) ± 0,4, ± 0,3, ± 0,2, ± 0,1 ou ± 0; ou 7,20 ± 0,5, ± 0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 ou ± 0.

[0025] Em uma outra forma de realização preferida, o pH ajustado em 7,15 ± Y. Preferivelmente, o pH ajustado em (7,11 a 7,19) ± 0; ou (7,12 a 7,18) ± 0,1 ou ± 0; ou (7,13 a 7,17) ± 0,2, ± 0,1 ou ± 0; ou (7,14 a 7,16) ± 0,3, ± 0,2, ± 0,1 ou ± 0; ou 7,15 ± 0,4, ± 0,3, ± 0,2, ± 0,1 ou ± 0.

[0026] No processo do terceiro aspecto da invenção, o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração de CO2 de 1 a 10 %, por exemplo 4,0 a 9,0 %, 5,5 a 8,5 % ou cerca de 6 a 8 %. Convencionalmente, a concentração CO2 é maior do que este devido ao CO2 produzido pelas células não sendo removido a partir do sobrenadante de cultura celular. Surpreendentemente, o requerente foi observado que mantém a concentração CO2 a 10 % ou inferior o aumento da produção de proteína recombinante. Isto ajuda dCCh a ser mantida baixo se o meio de alimentação é desgaseificado (por exemplo borbulhando ar através deste) bem como o sobrenadante de cultura celular no biorreator sendo aspergido.

[0027] Preferivelmente, o processo de cada um dos primeiros três aspectos da invenção é operado para incluir a característica particular especificada em relação ao processo de um ou mais dos outros aspectos da invenção. Em outras palavras, onde a temperatura é mantida a X ± 0,9° C, em que X tem um valor de 35,1 a 36,5° C, é vantajoso também manter o pH a X ± 0,05 em que X tem um valor de 7,15 a 7,20, e/ou a concentração CO2 a 10 % ou menos. Onde o pH é mantido a X ± 0,05 em que X tem um valor de 7,15 a 7,20, é vantajoso também para manter a temperatura a X ± 0,9° C, em que X tem um valor de 35,1 a 36,5° C, e/ou a concentração CO2 a 10 % ou menos. Onde a concentração CO2 é mantida a 10 % ou menos, é vantajoso também para manter o pH a X ± 0,05 em que X tem um valor de 7,15 a 7,20, e/ou a temperatura a X ± 0,9° C, em que X tem um valor de 35,1 a 36,5° C.

[0028] As maneiras do monitoramento de três parâmetros definidos (temperatura, pH e concentração CO2) são bem conhecidos nesta técnica e geralmente contam as sondas que são inseridas no biorreator, ou incluídas nos arcos através do qual o meio de cultura é circulado, ou inserido nas amostras extraídas do meio de cultura. Um sensor dCCE em linha adequado e seu uso são descritos em Pattison et a/ (2000) Biotechnol. Prog. 16:769-774. Um sensor de pH em linha adequado é Mettler Toledo InPro 3100/125/Ptl00 (Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA). Um sistema fora de linha adequado para a medição de dCCh, em adição ao pH e pCE é o BioProfile pHOx (Nova Biomedical Corporation, Waltham MA). Neste sistema, dCCE é medido pelos eletrodos potenciométricos dentro da faixa 3 a 200 mmHg com uma resolução de imprecisão de 5 %. O pH pode ser medido neste sistema em uma temperatura de 37° C, que é próximo a temperatura do sobrenadante de cultura celular no biorreator. As maneiras de alteração do parâmetro especificado a fim de manter no nível pré-definido também são bem conhecidos. Por exemplo, a manutenção da natureza constante usualmente envolve o aquecimento ou esfriamento do biorreator ou o meio de alimentação (se é um banho de alimentação ou processo contínuo); a manutenção do pH constante usualmente envolve a escolha e o fornecimento suficiente de um tampão apropriado (tipicamente bicarbonato) e adição de ácido, tal como ácido clorídrico, ou alcalino, tal como hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio ou uma mistura destes, a um meio de alimentação como necessário; e mantendo o CO2 concentração constante usualmente envolve o ajuste da taxa de aspersão (ver ainda abaixo), ou regulação do fluxo de CO2 no espaço superior. É possível que a calibração de uma sonda de pH em linha pode desviar durante o tempo, tal como em período de dias ou semanas, durante o qual as células são cultivadas. Naquele evento, pode ser benéfico para restaurar a sonda em linha pelo uso de medições obtidas de sonda fora de linha recentemente calibrada. Uma sonda fora de linha adequada é o BioProfile pHOx (Nova Biomedical Corporation, Waltham MA).

[0029] Os inventores observaram que o aumento de pH (por exemplo pela adição de NaOH) não é suficiente em seu próprio para atingir o benefício máximo em termos da produção de proteína ativa. Em vez de, este ser desejável para reduzir a concentração CO2. Normalmente, um deve manter os outros parâmetros do processo constante. Entretanto, os inventores observaram que é vantajoso reduzir a concentração CO2 mas permitir o pH para elevar-se de 7,1, por exemplo a 7,15 ou 7,2, preferivelmente sem a adição de NaOH.

[0030] As culturas celulares de mamíferos necessitam de oxigênio para as células crescerem. Normalmente, este é fornecido para forçar o oxigênio na cultura através das portas de injeção. Também é necessário remover o CO2 que se acumula devido à respiração das células. Este é atingido pela “aspersão”, isto é, passando um gás através do biorreator a fim de arrastar e retirar o CO2. Convencionalmente, este também pode ser feito usando o oxigênio. Entretanto, os inventores observaram que, ao invés disso, é vantajoso usar o ar. Foi observado que, usualmente, um gás inerte convencional, tal como nitrogênio é menos efetivo nas aspersões de CO2 do que usando ar. Considerando que 0 ar é cerca de 20 % oxigênio, pode-se pensar que 5 vezes mais ar deve ser usado. Entretanto, foi observado ser inadequado em culturas de larga escala, particularmente em culturas na escala 2500L. Em um biorreator 2500L, tanto quanto 7 a 10 vezes de ar, preferivelmente cerca de tanto quanto 9 vezes de ar, é usado. Por exemplo, sob condições padrão, o biorreator 2500L é aspergido com O2 em um tamanho de bolha de 10 |im em uma taxa de 0,02 WH (volume O2 por volume de cultura por hora). O mesmo biorreator 2500L usado de acordo com o método da invenção será aspergido com ar em um tamanho de bolha de 10 pm em uma taxa de 0,18 WH.

[0031] Assim, o uso de volumes de ar supreendentemente altos foi observado para fornecer o fornecimento do oxigênio adequado e para remover o CCEindesejado.

[0032] Durante a fase de produção, é preferida para remover CO2 pela aspersão de ar, como descrito acima. Este é especialmente o caso quando se utiliza biorreatores de larga capacidade, em que o sobrenadante de cultura celular de outra maneira acumula CO2 em altos níveis deletérios. Entretanto, no início da cultura, ou em pequenas escalas de cultura, tal como na escala IL ou 2,5L, o espaço superior pode ser sobrecarregado com CO2. Sob tais condições, os baixos níveis de dCCE ainda podem ser atingidos. O sobrecarregamento do espaço superior com CO2 também pode ser usado para reduzir o pH ao ponto de apresentação, se o pH também é básico.

[0033] As células podem ser qualquer uma das células de mamíferos que podem ser cultivadas, preferivelmente em um processo de fabricação (isto é pelo menos 1 litro), para produzir uma proteína desejada tal como FVIII. Exemplos incluem a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriônico humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento na cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol.,36:59 [1977]); células de rim de hâmster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hâmster Chinês/-DHFR, tal como o subclone DUKX-B11 (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 [1980]); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243- 251 [1980]); células de rim de camundongo (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HeLa, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamífero de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Set, 383:44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; e a linha de hepatoma humana (Hep G2). Preferivelmente, a linha celular é uma linha celular de roedor, especialmente uma linha celular de hâmster tal como CHO ou BHK.

[0034] Um método preferido de preparação de um clone da célula CHO estável que expressa a proteína recombinante é como seguem. Uma linha de célula CHO deficiente DHFR DUKX-B11 é transfectado com um vetor de expressão DHFR permitindo a expressão da proteína recombinante relevante, essencialmente como descrito em U.S. 5.250.421 (Kaufman et al, Genetics Institute, Inc.). A transfecção é selecionada com metotrexato. A amplificação da região relevante codificada pela expressão da proteína recombinante e gene DHFR é atingida pela propagação das células nas concentrações aumentadas de metotrexato. Quando apropriado, as linhas celulares CHO podem ser adaptadas para crescimento no meio livre de soro e/ou proteína, essencialmente como descrito em U.S. 6.100.061 (Reiter et al, Immuno Aktiengesellschaft)

[0035] O meio basal escolhido para a cultura da linha das células hospedeira não é crítico a presente invenção e pode ser qualquer um de, ou combinação de, aqueles conhecidos na técnica que são adequados para a cultura das células de mamíferos. O meio tal como meio Eagle modificado por Dulbecco, meio de Ham F-12, meio essencial mínimo de Eagle e meio RPMI-1640 e outros são comercialmente disponíveis. A adição dos fatores de crescimento tal como a insulina recombinante é opcional.

[0036] Historicamente, as células animais foram cultivadas no meio contendo o soro animal. Entretanto, os tais meios são incompletamente definidos e apresentam o risco de infecção. Aquele na técnica tem, portanto, planejado o meio "livre de proteína" que são completamente livres de qualquer uma proteína ou pelo menos são livres de qualquer proteína que não é recombinantemente produzida. Devido à natureza instável do fator VIII, a produtividade das células hospedeiras projetadas é gravemente reduzida sob as condições livres de proteína. A albumina de soro humano é comumente usada como um suplemento de cultura livre de soro para a produção de proteínas recombinantes. A albumina por si só estabiliza o FVIII e as impurezas presentes nas preparações da albumina derivada de soro também pode ser contribuída para estabilizar o efeito de albumina. Fatores tais como lipoproteína foram identificados como uma substituição para a albumina de soro humana para a produção de fator VIII recombinante sob as condições livres de soro.

[0037] O meio preferido inclui aquele divulgado em U.S. 6.171.825 (Bayer, Inc) e U.S. 6.936.441 (Baxter AG).

[0038] O meio de U.S. 6.171.825 consiste do meio essencial mínimo de Dulbecco modificado e meio de Ham F-12 (50:50, em peso) suplementado com a insulina recombinante, ferro, um poliol, cobre e opcionalmente outros metais traço.

[0039] A insulina deve ser recombinante e pode ser obtida como insulina “Nucellin” de Eli Lilly). Este pode ser adicionado a 0,1 a 20 pg/ml (preferivelmente 5 a 15 pg/ml, ou cerca de 10 pg/ml). O ferro é preferivelmente na forma de íons Fe2+, por exemplo fornecido como FeSCU’EDTA, e pode estar presente a 5 a 100 pM (preferivelmente cerca de 50 pm). Os polióis adequados incluem os copolímeros de bloco não iônico de poli(oxietileno) e poli(oxipropileno) tendo pesos moleculares que varia de cerca de 1000 a cerca de 16.000. Um poliol particularmente preferido é F-68 plurônico (BASF Wyandotte), que tem um peso molecular médio de 8400 e que consiste de um bloco central de poli(oxipropileno) (20 % em peso) e blocos de poli(oxietileno) e ambas extremidades. É também disponível como F-68 Sinperônico de Unichema Chemie BV. Outros incluem F-61, F-71 e F- 108 plurônicos. A cobre (Cu2+) pode ser adicionado em uma quantidade equivalente a 50 em 800 nM de CuSÜ4, preferivelmente 100 a 400 nM, convenientemente cerca de 250 nM. A inclusão de um painel de metais traço tal como manganês, molibdênio, silício, lítio e crômio pode levar ao aumento adicional na produção do fator VIII. As células BHK cresceram bem neste meio basal livre de proteína.

[0040] O meio de U.S. 6.936.441 também é baseado em uma mistura 50/50 de DMEM e Ham F12 mas inclui o peptona de soja ou extrato de levedura entre 0,1 e 100 g/l, preferivelmente entre 1 e 5 g/l. como uma forma de realização particularmente preferido, extrato de soja, por exemplo peptona de soja, pode ser usado. O peso molecular de peptona de soja pode ser menos do que 50 kD, preferivelmente menos do que 10 kD. A adição de peptona de soja ultrafiltrado tendo um peso molecular médio de 350 Dalton tem demonstrado particularmente vantajoso para a produtividade das linhas celulares recombinantes. E uma soja isolada tendo um teor de nitrogênio total de cerca de 9,5 % e um teor de aminoácido livre de cerca de 13 %, ou cerca de 7 a 10 %.

[0041] Um meio particularmente preferido tem a seguinte composição: meio mínimo sintético (por exemplo 50/50 DMEM/Ham's F12) 1 a 25 g/l; peptona de soja 0,5 a 50 g/l; L-glutamina 0,05 a 1 g/l; NaHCCL 0,1 a 10 g/l; ácido ascórbico 0,0005 a 0,05 g/I; etanolamina 0,0005 a 0,05; e selenita sódica 1 a 15 pg/I. Opcionalmente, um agente ativo de superfície não iônica tal como um polipropileno glicol (por exemplo F-61 plurônico, F-68 plurônico, F-71 plurônico ou F-108 plurônico) pode ser adicionado ao meio como um agente desespumante. Este agente é geralmente aplicado para proteger as células a partir dos efeitos negativos de aeração ("aspersão"), visto que sem a adição de um agente ativo de superfície eleva e rompe as bolhas de ar e pode danificar aquelas células que estão na superfície das bolhas de ar.

[0042] A quantidade do agente ativo de superfície não iônica pode variar entre 0,05 e 10 g/l, preferivelmente entre 0,1 e 5 g/l. Além disso, o meio também pode conter a ciclodextrina ou um derivado deste. Preferivelmente, o meio livre de proteína e soro contém um inibidor de protease, tal como um inibidor de protease de serina, que é adequado para a cultura de tecido e que é de origem sintético ou vegetal.

[0043] Em uma outra forma de realização preferida a seguinte mistura de aminoácido é adicionalmente adicionada ao meio mencionado acima: L- asparagina (0,001 a 1 g/l; preferivelmente 0,01 a 0,05 g/I; particularmente preferivelmente 0,015 a 0,03 g/l), L-cisteína (0,001 a 1 g/l; preferivelmente 0,005 a 0,05 g/l; particularmente preferivelmente 0,01 a 0,03 g/l), L-cistina (0,001 a 1 g/l; preferivelmente 0,01 a 0,05 g/l; particularmente preferivelmente 0,015 a 0,03 g/l), L-prolina (0,001 a 1,5 g/l; preferivelmente 0,01 a 0,07 g/l; particularmente preferivelmente 0,02 a 0,05 g/l), L-triptofano (0,001 a 1 g/l; preferivelmente 0,01 a 0,05 g/l; particularmente preferivelmente 0,015 a 0,03 g/l) e L-glutamina (0,05 a 10 g/l; preferivelmente 0,1 to 1 g/l). Estes aminoácidos podem ser adicionados ao meio individualmente ou em combinação. A adição combinada da mistura de aminoácido contendo todos dos aminoácidos mencionados acima é particularmente preferido.

[0044] Em uma forma de realização particular um meio livre de proteína e soro é usado adicionalmente contendo uma combinação das misturas de aminoácidos mencionados acima e peptona de soja purificada, ultrafiltrada.

[0045] O meio de U.S. 6.936.441 é particularmente bem adequado a cultura de células CHO mas pode ser usado com outras células também.

[0046] Um meio adequado adicional é o meio livre de oligopeptídeo divulgado em U.S. 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

[0047] Preferivelmente, o meio de cultura é tamponado pelo uso de íons de bicarbonato, tipicamente fornecido como bicarbonato de sódio.

[0048] Adequadamente, o meio de cultura tem uma osmolaridade entre 210 e 650 mOsm, preferivelmente 270 a 450 mOsm, mais preferivelmente 310 a 350 mOsm e mais preferivelmente 320 mOsm. Preferivelmente, a osmolaridade do sobrenadante é mantido dentro de um ou mais destas faixas através do método da invenção.

[0049] A cultura pode ser qualquer tipo convencional de cultura, tal como batelada, batelada por alimentação ou contínuo, mas é preferivelmente batelada por alimentação ou contínuo. As culturas de condições adequadas incluídas pela batelada repetida, chemostat, turbidostat ou cultura de perfusão.

[0050] Uma cultura por batelada inicia com todos os nutrientes e células que são necessárias, e a cultura procede até a finalização, isto é, até os nutrientes serem consumidos ou a cultura ser interrompida por alguma razão.

[0051] A cultura de batelada por alimentação é um processo de batelada no sentido que este inicia com as células e é então alimentado com os nutrientes adicionais em uma maneira controlada a fim de limitar o crescimento das células. A estratégia de batelada por alimentação é tipicamente usada nos processos bioindustriais para atingir uma alta densidade celular no biorreator. A solução de alimentação é usualmente mais alto concentrado para evitar a diluição do biorreator. A adição controlada do nutriente diretamente afeta a taxa de crescimento da cultura e permite-se evitar a superabundância do metabolismo (formação de sub-produtos metabólicos) e limitação de oxigênio (anaerobiose). Em mais casos o nutriente limitante de crescimento é glicose que é alimentado pela cultura como um xarope de glicose altamente concentrado (por exemplo 600 a 850 g/l).

[0052] As estratégias diferentes podem ser usadas para controlar o crescimento em um processo de batelada por alimentação. Por exemplo, qualquer uma da tensão de oxigênio dissolvido (DOT, pÜ2), taxa de absorção de oxigênio (OUR), concentração de glicose, concentração de lactato, pH e concentração de amónia pode ser usado para monitorar e controlar o crescimento de cultura pela manutenção que o parâmetro constante. Em uma cultura contínua, os nutrientes são adicionados e, tipicamente, o meio é extraído a fim de remover os sub-produtos indesejáveis e mantém um estado constante. Os métodos de cultura contínua adequada são repetidos pela cultura por batelada, chemostat, turbidostat e cultura de perfusão.

[0053] As células CHO, por exemplo, podem ser cultivadas em um tanque agitado e um tanque de levantamento pneumático que é difundido com um meio adequado por uma taxa de perfusão adequada de trocas de 2 a 10 volume por dia e uma concentração de oxigênio de entre 40 % e 60 %, preferivelmente cerca de 50 %. Além disso, as células podem ser cultivadas por meio do método chemostat, usando o valor de pH preferido acima, uma concentração de oxigênio entre 10 % e 60 % (preferivelmente cerca de 20 %) e uma taxa de diluição D de 0,25 a 1,0, preferivelmente cerca de 0,5.

[0054] Em uma cultura de batelada repetida, também conhecida como uma subcultura em série, as células são colocadas em um meio de cultura e crescidas a uma densidade celular desejada. Para evitar o início de uma fase de declínio e morte celular, a cultura é diluída com o meio de crescimento completo antes das células atingirem sua concentração máxima. A quantidade e frequência da diluição varia amplamente e depende das características de crescimento da linha celular e conveniência de um processo de cultura. O processo pode ser repetido como muitas vezes como requerido e, a não ser as células e meio são descartados na subcultura, o volume de cultura aumentará gradualmente como cada diluição é feita. O aumento do volume pode ser manuseado por ter um reator do tamanho suficiente para permitir as diluições dentro do reservatório ou pela divisão da cultura diluída em diversos reservatórios. A análise racional deste tipo de cultura é para manter em um estado exponencialmente de crescimento. A subcultura em série é caracterizada naquele volume de cultura é sempre gradualmente aumentada, e pode ser coletas múltiplas, as células continuam o crescimento e o processo pode continuar contanto como desejado.

[0055] Nos métodos chemostat e turbidostat, o meio extraído contém as células. Deste modo, as células remanescentes no reservatório da cultura celular podem crescer para manter um estado constante. No método chemostat, a taxa de crescimento é tipicamente controlada pelo controle da taxa de diluição isto é a taxa em que o meio fresco é adicionado. As células são cultivadas em uma taxa de crescimento sub-máxima, que é atingido pela restrição da taxa de diluição. A taxa de crescimento é tipicamente alta. Em contraste, no método turbidostat, a taxa de diluição é apresentada para permitir a taxa máxima de crescimento que as células podem atingir nas condições de operação dadas, tal como pH e temperatura.

[0056] Em uma cultura de perfusão, o meio extraído é esgotado das células por causa mais das células são conservadas em um reservatório de cultura, por exemplo por ser retido em uma membrana através do qual o meio extraído flua. Entretanto, tipicamente uma tal membrana não retém 100 % das células, e deste modo uma proporção são removidas quando o meio é extraído. Este não pode ser crucial para operar as culturas de perfusão em uma taxa de crescimento muito alta, como a maioria das células são retidas em um reservatório de cultura.

[0057] As culturas contínuas, particularmente batelada repetida, chemostat e culturas turbidostat, são tipicamente operadas em uma alta taxa de crescimento. De acordo com a prática comum, é típico procurar manter a taxa de crescimento no máximo, ou próximo ao máximo, em um esforço para obter a produtividade volumétrica máxima. A produtividade volumétrica é medida nas unidades da quantidade de proteína ou atividade por volume de cultura pelo intervalo de tempo. Crescimento celular mais alto equivale a um volume mais alto de cultura sendo produzido por dia e deste modo isso é convencionalmente considerado como refletindo uma produtividade volumétrica mais alta. Os presentes inventores observaram de forma inesperada que, em certas formas de realização, a produtividade volumétrica máxima não é obtida na taxa de crescimento máxima da célula. Como descrito nos Exemplos, uma taxa máxima de crescimento de uma furina que expressa o clone da célula CHO na cultura chemostat foi observada em uma temperatura de 36,5° C, mas a produtividade volumétrica máxima foi observada a 35,1° C. Apesar dos volumes de coleta inferiores obtidos, originados a partir da taxa inferior de crescimento na temperatura inferior, a quantidade da proteína recombinante produzida foi deste modo muito maior que a cultura temperatura inferior foi, especialmente, a mais produtiva.

[0058] Adequadamente, em qualquer um do primeiro, segundo ou terceiro aspecto da invenção, o sobrenadante de cultura celular é mantido em uma temperatura que é ajustada em a temperatura que é inferior do que uma temperatura em que a taxa máxima de crescimento é observada por pelo menos 0,5° C, preferivelmente pelo menos 1,0° C. Nesta forma de realização, é preferido que a cultura é uma cultura contínua, particularmente uma batelada repetida, chemostat ou cultura turbidostat.

[0059] As células de mamíferos tais como células CHO e BHK são geralmente cultivadas como culturas de suspensão. Isto é para dizer, as células são recolocadas em suspensão no meio, antes do que aderir a um suporte sólido. As células podem ser alternativamente imobilizadas em um carregador, em particular em um microcarregador. Os carregadores porosos, tal como Cytoline®, Cytopore® ou Cytodex®, podem ser particularmente adequados.

[0060] Uma densidade celular é comumente monitorada nas culturas celulares. Em princípio, uma alta densidade celular deve ser considerada ser desejável visto que, fornecido que a produtividade por célula é mantida, este deve levar a mais alta produtividade pelo volume do biorreator. Entretanto, o aumento da densidade celular pode ser atualmente prejudicial às células e a produtividade por célula é reduzida. Existe, portanto, a necessidade para monitorar a densidade celular. Para datar, nos processos de cultura celular de mamífero, este foi feito pela extração de amostras de uma cultura e analisar sob um microscópio ou usando um dispositivo de contagem celular tal como o dispositivo CASY TT vendido por Scharfe System GmbH, Reutlingen, Germany. Observaram que é vantajoso analisar a densidade celular por meio de uma sonda adequada introduzida no próprio biorreator (ou em um arco através do qual o meio e as células recolocadas em suspensão são passadas e então retornadas no biorreator). Tais sondas são comercialmente disponível de Aber Instruments, por exemplo Biomass Monitor 220, 210 220 ou 230. As células em uma cultura atuam como os minúsculos capacitadores sob a influência de um campo elétrico, visto que a membrana celular não condutora permite como construção de carga. A capacidade resultante pode ser medida; é dependente do tipo celular e é diretamente proporcional à concentração das células viáveis. Uma sonda de 10 a 25 mm diâmetro usa dois eletrodos para aplicar o campo de frequência à radio a biomassa e um segundo par de eletrodos para medir a capacidade resultante das células polarizadas. O processamento eletrônico do sinal resultante produz uma produção que é uma medição exata da concentração das células viáveis. O sistema é insensível as células com as membranas mal vedadas, o meio, bolhas de gás e fragmentos.

[0061] Tipicamente, a densidade celular é de 1,0 x 106 a 5,0 x 106 células/ml, adequadamente 1,0 x 106 a 3,5 x 106 células/ml, adequadamente 1,4 x 106 a 2,8 x 106 células/ml, preferivelmente 1,6 x 106 a 2,6 x 106 células/ml, mais preferivelmente 1,8 x 106 a 2,4 x 106 células/ml. O aumento da concentração das células diz respeito da extremidade mais alta nas faixas preferidas pode melhorar a produtividade volumétrica. Entretanto, as faixas da densidade celular incluindo qualquer um dos valores de ponto acima tão inferior ou extremidades maiores de uma faixa são consideradas.

[0062] A cultura é tipicamente realizada em um biorreator, que é usualmente um aço inoxidável, vidro ou reservatório plástico de 1 (um) a 10000 (dez mil) litros de capacidade, por exemplo 5, 10, 50, 100, 1000, 2500, 5000 ou 8000 litros. O reservatório é usualmente firme, mas sacos plásticos flexíveis podem ser usados, particularmente para os menores volumes. Estes são geralmente do tipo de 'uso simples'.

[0063] O heterólogo ou proteína recombinante produzida pelo método de qualquer um do primeiro dos três aspectos da invenção é preferivelmente uma proteína sanguínea. Para a "proteína sanguínea" inclui qualquer proteína que é ou pode estar presente no sangue de um humano ou animal, incluindo as proteínas que são projetadas para o uso intravenoso. As proteínas sanguíneas adequadas incluem a albumina de soro, fator de coagulação I, II, III, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII e XIII, furina, fator von Willebrand, ativador de plasminogênio de tecido, interleucinas, interferons, metaloproteases tal como protease ADAMTS (por exemplo ADAMTS-13), imunoglobulinas tal como IgG, IgM, IgA ou IgE e fragmentos de imunoglobulina. Os anticorpo adequado ou fragmentos de imunoglobulina incluem as moléculas semelhantes a Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de cadeia simples (ScFv) onde os domínios associados VH e VL são ligados por intermédio de um oligopeptídeo flexível (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio simples (dAbs) que compreende os domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). As imunoglobulinas e seus fragmentos podem ser "humanizados". Em outras palavras, os domínios variáveis de origem de roedor podem ser fundidos aos domínios constantes de origem humana tal que um anticorpo resultante retém a especificidade antigênica do anticorpo parente de roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855).

[0064] Em uma forma de realização preferida, a cultura celular é usada para produzir o fator VIII, opcionalmente junto com o fator von Willebrand (vWF). O vWF pode ser adicionado separadamente ao meio de cultura e é preferivelmente recombinante. Alternativamente, o vWF pode ser co-produzido por incluir as células de secreção vWF em uma cultura, bem como as células que secretam FVIII. Preferivelmente, entretanto, o FVIII e vWF são co-expressados, isto é cada célula secreta tanto o FVIII quanto vWF. O vWF recombinante pode ser obtido como em Schlokat, et al. (1995), "Large Scale Production of Recombinant von Willebrand Factor", Thrombosis and Haemostasis 78, 1160 ou U.S. 6.114.146 (Baxter AG). A última Patente também divulga as células que podem ser usados para co- produzir as células que secretam vWF com FVIII. As células que co- expressam ambas as proteínas são divulgadas em U.S. 5.250.421 (Genetics Institute) e Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1233-1242.

[0065] O termo Fator VIII é usado neste para indicar qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que tem a atividade do fator VIII de coagulação. As funções do fator VIII ativado como um co-fator na conversão do fator X ao fator Xa pelo fator IXa ativado na presença de fosfolipídeos e íons de cálcio. Convenientemente, a quantidade do fator VIII ativo pode ser estimado do grau em que este promove a conversão do fator X ao fator Xa em um ensaio adequado. Em um típico ensaio, a hidrólise de fator Xa um substrato cromogênico específico, portanto liberando um cromóforo, a quantidade de que é determinado espectrofotometricamente. Os kits do ensaio comercialmente disponível incluem o kit de ensaio cromogênio de fator VIII (Dade Behring, Switzerland; US 6.100.050); e kit Coatest Factor VIII (Chromogenix, Sweden). A concentração de fator VIII em humanos é definida como 1 IU/mL sangue. O kit Coatest Factor VIII pode determinar a atividade FVIII equivalente a pelo menos 0,01 IU/ml sangue. A ser considerado como um fator VIII como definido acima, um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos pode ter pelo menos 1 % da atividade de fator VIII natural tal que, quando presente em sangue na mesma concentração nanomolar como fator VIII natural, sua atividade é detectável pelo ensaio Coatest Factor VIII.

[0066] Um FVIII adequado para a produção pelo método da invenção é natural, FVIII de comprimento total. O FVIII porcino pode ser produzido de acordo com a invenção, mas o FVIII é mais preferivelmente humano. Como uma alternativa ao FVIII natural, as variantes e análogos podem ser produzidos. Muitos são conhecidos nesta técnica, por exemplo as variantes e derivados de anulação descrito nas Patentes U.S. N°. 5.422.260, 4.749.780, 4.868.112, 4.877.614 e 5.171.844. O termo "derivado de anulação do fator VIII recombinante" é definido como uma ou mais cadeias de polipeptídeos tendo a atividade do fator VIII, derivado do polipeptídeo do fator VIII de comprimento total pela anulação de um ou mais aminoácido. Preferivelmente, a dita anulação derivada é isento de mais dos domínios B, mas retém as partes do terminal amino e sequências de terminal carbóxi do domínio B que são essenciais para o processamento proteolítico in vivo do produto de tradução primária em duas cadeias de polipeptídeos. A produção de um tal derivado de anulação do fator VIII, identificado como "r-VIII SO", é descrito em WO 91/09122. O termo "r-VIII SQ" é definido como uma cadeia de polipeptídeo derivado do fator VIII de comprimento total e perda de aminoácidos 743 diretamente a 1636. Ainda as variantes FVIII que perdem todas ou partes do domínio B são descritos em U.S. 6.358.703.

[0067] Os vetores adequados para a transformação das células CHO e 293S são divulgadas em U.S. 5.854.021. As células BHK que expressam FVIII podem ser preparados como divulgados em Wood et al (1984) Nature 312, 330-337 ou obtidos de ATCC como a cultura CRL-8544. As células CHO que expressam as variantes anuladas pelo domínio B de FVIII são descritos em Lind et al (1995) Eur. J. Biochem. 232, 19-27 e em U.S. 5.661.008. Três tais tipos celulares foram depositados com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen como DSM 6415, DSM 6417 e DSM 6416.

[0068] Quando FVIII e vWF são co-produzidos, o complexo entre estes podem ser purificados pela centrifugação do meio para remover as células e então a exposição do líquido resultante a um suporte sólido imobilizado contendo um anticorpo por FVIII ou vWF, ou um peptídeo que especificamente ligará FVIII ou vWF, sob as condições que não causará o complexo para dissociar. Os métodos adequados são ensinados em U.S. 6.307.032 (Baxter AG) e U.S. 5.200.510 (ZymoGenetics).

[0069] O FVIII (opcionalmente em complexo com vWF) pode então ser formulado e usado nas maneiras conhecidas. Por exemplo, FVIII, foi produzido em uma cultura livre de proteínas animais, é preferivelmente formulado em uma composição livre de proteína, como divulgado por exemplo em U.S. 6.586.573 (Baxter International), WO 94/07510 ou U.S. 6.599.724 e usado para tratar os pacientes com hemofilia A.

[0070] Onde o método da invenção é usado para produzir FVIII, é preferido que o sobrenadante de cultura celular é mantido em uma temperatura que ajustada em 36 ± 0,9° C, preferivelmente 36 ± 0,5° C, mais preferivelmente 36 ± 0,2° C e mais preferivelmente 36° C e/ou o pH ajustado em 7,20 ± 0,05, preferivelmente 7,20 ± 0,03, mais preferivelmente 7,20 ± 0,01, mais preferivelmente 7,20; e/ou o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração de CO2 dissolvido de 1 a 10 %, preferivelmente 4,0 a 9,0 %, mais preferivelmente 5,5 a 8,5 %. Preferivelmente, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, isto é, temperatura e pH, temperatura e dCCE ou pH e dCCE. Mais preferivelmente, todos dos três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

[0071] Como mostrado nos Exemplos, é vantajoso incluir o cobre no sobrenadante de cultura celular quando a invenção é usada para produzir FVIII. Tipicamente, as células são cultivadas em um sobrenadante de cultura celular que compreende 4 ppb Cu2+. Vantajosamente, a concentração da concentração de Cu2+ no sobrenadante de cultura celular é de pelo menos 5 ppb e preferivelmente pelo menos 7, 10, 15 ou 25 ppb.

[0072] Em uma forma de realização alternativa preferida, a cultura celular é usada para produzir ADAMTS-13.

[0073] ADAMTS-13, também conhecido como protease de clivagem do fator von Willebrand (VWF-cp) é um membro da família de metaloprotease. Este tem a capacidade de metabolizar os multímeros VWF amplos pelas formas menores, pela clivagem da ligação de peptídeo entre os resíduos Tyr-842 e Met-843 de VWF. Esta metaloprotease é ativada pela Ca2-/Ba2 e não é inibida pelos inibidores da protease de serina ou cisteína. A degradação do fator deficiente von Willebrand (VWF) foi associado com púrpura trombocitopênica trombótica (TIP). No TTP hereditário, ADAMTS- 13 está ausente ou funcionalmente defeituoso, considerando na forma adquirida não familial de TTP, um anticorpo que inibe a atividade ADAMTS- 13 é observada transitoriamente em mais pacientes.

[0074] A clonagem e expressão do gene ADAMTS-13 humano são descritos em Plaimauer et al, 2002, Blood. 15; 100(10):3626-32. A clonagem e expressão do gene ADAMTS-13 humano, junto com a sequência completa de cDNA também são divulgados em U.S. 2005/0266528 Al (Laemmle et al). Um ADAMTS-13 adequado para a produção pelo método da invenção é natural, o ADAMTS-13 de comprimento total, preferivelmente ADAMTS-13 humano. Como uma alternativa ao FVIII natural, variantes e análogos podem ser produzidos.

[0075] O termo ADAMTS-13 é usado neste para indicar qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que tem a atividade ADAMTS-13, particularmente a capacidade de clivar a ligação de peptídeo entre os resíduos Tyr-842 e Met-843 de VWF. Convenientemente, a quantidade de ADAMTS- 13 ativo pode ser determinada pelos ensaios funcionais, tal como ensaio funcionais que utilizam os peptídeos de fator von Willebrand modificado como substratos por ADAMTS-13 (Tripodi et al J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9): 1534-41). Um método preferido de determinação da atividade r-hu ADAMTS13 é divulgada em Gerritsen et al. O ensaio de protease de divagem do fator von Willebrand (vWF) com base na afinidade de ligação de colágeno diminuído de vWF degradado: uma ferramenta para a diagnose da púrpura trombocitopênica trombótica (TTP). Thromb Haemost 1999; 82:1386-1389. Neste ensaio, 1 U corresponde ao nível da atividade ADAMTS-13 em plasma humano normal unido. A ser considerado como um ADAMTS-13 como definido acima, um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos podem ter pelo menos 1 % da atividade de ADAMTS-13 natural. A quantidade de ADAMTS-13 também pode ser determinada pela medição do antígeno ADAMTS-13, por exemplo usando o método ELISA divulgado em Rieger et al, 2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20,

[0076] O ADAMTS-13 recombinante proteoliticamente ativo pode ser preparado pela expressão nas culturas das células de mamífero, como divulgado em Plaimauer et al, 2002, supra e U.S. 2005/0266528 Al. Os métodos para a cultura recombinante de ADAMTS-13 que expressa as células são divulgadas em Plaimauer B, Scheiflinger F.Semin Hematol. 2004 Jan;41(l):24-33. Os tipos de células preferidas para a expressão de ADAMTS-13 incluem as células HEK-293 e as células CHO.

[0077] U.S. 2005/0266528 Al and Zheng et al, 2001, Blood, 98:1662- 1666 divulga os métodos de purificação ADAMTS-13. O ADAMTS-13 purificado pode ser formulado de acordo com os métodos convencionais e usados terapeuticamente, por exemplo para tratar TIP.

[0078] Onde o método da invenção é usado para produzir ADAMTS- 13, é preferido que o sobrenadante de cultura celular é mantido em uma temperatura que ajustada em 36,0 ± 0,9° C, preferivelmente 36,0 ± 0,5° C, mais preferivelmente 36,0 ± 0,2° C e mais preferivelmente 36,0° C e/ou o pH ajustado em 7,15 ± 0,05, preferivelmente 7,15 ± 0,03, mais preferivelmente 7,15 ± 0,01, mais preferivelmente 7,15; e/ou o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração CO2 dissolvida de 1 a 10 %, preferivelmente 4,0 a 9,0 %, mais preferivelmente 5,5 a 8,5 %. Preferivelmente, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, isto é, temperatura e pH, temperatura e dCCh ou pH e dCCU Mais preferivelmente, todos os três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

[0079] Em uma forma de realização alternativa preferida, a cultura celular é usada para produzir furina.

[0080] Furina, também denominado PACE (enzima de clivagem de aminoácido básico em forma de par), pertence ao grupo da protease de serina semelhante a subtilisina, que desempenha um papel importante na clivagem das pró-proteínas, especialmente em síntese secretória (Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen., 4:115-136, 1993). Este é uma endoprotease de serina dependente por cálcio estruturalmente disposto nos diversos domínios, isto é peptídeo de sinal, propeptídeo, domínio catalítico, homo-B ou P-domínio, o domínio rico em cisteína localizada de terminal C, o domínio de transmembrana e cauda citoplásmica. O local de clivagem de protease compreende uma sequência de reconhecimento que é caracterizado pela sequência de aminoácido Arg-X-Lys/Arg-Arg. A furina de protease cliva as proproteínas especialmente após esta sequência de consenso (Hosaka et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:12127-12130).

[0081] A furina intacta é incorporada no sistema de membrana do mecanismo Golgi e este é funcionalmente ativo (Bresnahan et al,J Cell Biol. 1990;111:2851-9). No trânsito o precursor de furina recentemente sintetizada do retículo endoplásmico ao compartimento de Golgi, o propeptídeo é autocataliticamente removido em um evento de processamento de duas etapas (Anderson et al, EMBO J. 1997; 16: 1508-18). A furina também o ciclo entre a rede trans-Golgi e a superfície celular por intermédio de vesículas endossômicas, portanto o processamento de proteínas precursoras durante seu transporte através do caminho secretor constitutivo bem como as moléculas que entra no caminho endocítico. A distribuição celular de furina aos compartimentos de processamento é direcionado pelas características estruturais definidas dentro da cauda citoplásmica (Teuchert et al, J Biol Chem. 1999;274:8199-07).

[0082] Visto que uma superexpressão da protease de furina natural negativamente afeta o crescimento das culturas celulares continuamente o crescimento, as soluções foram procuradas para reduzir a influência tóxica de furina nas células. Os domínios de terminal C for a observados a ser dispensáveis para a atividade funcional de furina e uma forma truncada de furina natural super-expressada de 75-80 kD deve ser detectado no sobrenadante celular como a proteína secretada (Wise et al, PNAS. 1990;87:9378-82). Esta furina truncada naturalmente secretada também é conhecido como "furina derramada" (Vidricaire et al, Biochem Biophys Res Comm. 1993;195:1011-8; Plaimauer et al, Biochem J. 2001;354:689-95) e é clivado de terminal N da porção de transmembrana (Vey et al, J Cell Biol. 1994; 127: 1829-42).

[0083] As proteínas de furina truncados pela engenharia genética, em que a parte codificadora da transmembrana e domínios citoplásmicos foram anulados e foram descritos por exemplo pelos aminoácidos Δ714-794(Leduc et al, J Biol Chem. 1992;267: 14304-8; Molloy et al,J Biol Chem. 1992;267:16396-402) e pelos aminoácidos Δ716-794("Sol-PACE", Wasley et al., J Biol Chem. 1993;268:8458-65; Rehemtulla and Kaufman, Blood. 1992; 79:2349-55) e pelos aminoácidos Δ705-794(Hatsuzawa et al, J Biol Chem. 1992;267:16094-9). Os mutantes de furina adicionalmente que compreende uma anulação da região rica em cisteína e também foram descritos (Hatsuzawa et al, J Biochem. 1992;101 :296-301; Creemers et al, J Biol Chem. 1993;268:21826-34).

[0084] WO 2008/141824 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.) divulga uma furina humana truncada que perde aminoácidos 578 a 794, isto é Δ 578-794.

[0085] O termo "furina" é usada neste pedido para denotar qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que tem atividade proteolítica de furina.

[0086] A avaliação da atividade proteolítica de uma furina, furina truncada ou derivado de furina pode ser realizado por qualquer teste adequado, por exemplo pelo uso de substratos fluorogênicos que são compreendidos de um local de clivagem dibásica pelo qual a furina é específica (Schlokat et al, Biotechnol Appl Biochem. 1996;24:257-67). Com o dito ensaio 1 a unidade é definida como uma quantidade de furina que liberará 1 pmol de 7-Amino-4-metilcoumarina (AMC) do substrato fluorogênico Boc-Arg-Vai-Arg-Arg-AMC em 1 minuto a 30° C. O limite da quantificação para este teste é tipicamente 0,625 U/mL. Alternativamente a atividade proteolítica também pode ser medida pela incubação de furina com pró-proteínas, por exemplo pro-rvWF, para um período suficiente. O grau do processamento pro-rvWF pode ser analisado por exemplo pelo Western blotting. A quantidade de antígeno de furina pode ser medido por um teste de ELISA. Um teste ELISA adequado é o DuoSet de furina humano disponível dos sistemas R&D, MN (catálogo N°. DY1503) em que a furina anti-humana de camundongo é usada como um anticorpo de captura e furina anti-humana de cabra biotinilada é usado como um anticorpo de detecção.

[0087] Uma furina adequada para a produção pelo método da invenção é natural, furina de comprimento total, preferivelmente furina humana. Como uma alternativa a furina natural, variantes e análogos podem ser produzidos, incluindo aqueles descritos acima.

[0088] Os vetores adequados para a transformação das células de mamíferos, particularmente as células CHO, com furina ou variantes de furina ou variantes são descritos em WO 2008/141824 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.), junto com os métodos para a purificação de furina deste modo produzido. WO 91/06314 (Holland Biotechnology) descreve os vetores de expressão de furina, um método de expressão de furina nas células de mamíferos, particularmente as células COS-1 e a purificação de furina recombinantemente produzido. WO 92/09698 (Genetics Institute and Chiron Corp) descreve a expressão de furina em células CHO, sozinho, ou em combinação com vWF ou fator IX.

[0089] O pro-rVWF é processado a sua forma madura durante a cultura celular pela furina endogenamente produzida, que é expressada em níveis relativamente baixos em muitos tipos celulares (Wise et al, 1990, PNAS 87:9378-9382). O processamento pro-rVWF pode ser feito mais eficiente pela co-expressão de furina heteróloga com o pro-rVWF. Alternativamente, WO 2008/141824 sugere que uma furina purificada pode ser adequada para o uso como um reagente para promover o processamento de rVWF.

[0090] Onde o método da invenção é usado para produzir furina, é preferido que o sobrenadante de cultura celular é mantido em uma temperatura que ajustada em 35,1 ± 0,9° C, preferivelmente 35,1 ± 0,5° C, mais preferivelmente 35,1 ± 0,2° C e mais preferivelmente 35,1° C e/ou o pH ajustado em 7,15 ± 0,05, preferivelmente 7,15 ± 0,03, mais preferivelmente 7,15 ± 0,01, mais preferivelmente 7,15; e/ou o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração CO2 dissolvida de 1 a 10 %, preferivelmente 4,0 a 9,0 %, mais preferivelmente 5,5 a 8,5 %. Preferivelmente, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, isto é, temperatura e pH, temperatura e dCCE ou pH e dCCE. Mais preferivelmente, todos os três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

[0091] Em uma forma de realização preferida alternativa, a cultura celular é usada para produzir o fator VII.

[0092] O "polipeptídeo de fator VII" abrange o fator VII de tipo selvagem (isto é um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido divulgada na Patente U.S. N°. 4.784.950), bem como as variantes do fator VII que exibe substancialmente o mesmo ou atividade biológica melhorada relativa ao fator VII de tipo selvagem e variantes do fator VII tendo atividade substancialmente modificada ou biológica reduzida relativa ao fator VII de tipo selvagem. O termo "fator VII" é pretendido abranger os polipeptídeos de fator VII em sua forma não clivada (zimogênio), bem como aquele que foi proteoliticamente processado para produzir suas formas bioativas respectivas, que podem ser projetadas pelo fator Vila. Tipicamente, o fator VII é clivado entre os resíduos 152 e 153 para produzir o fator Vila. O termo "polipeptídeo do fator VII" também abrange os polipeptídeos, incluindo as variantes, em que a atividade biológica do fator Vila foi substancialmente modificado ou algo reduzido relativo a atividade do fator Vila de tipo selvagem. Estes polipeptídeos incluem, sem limitação, o fator VII ou fator Vila em que as alterações da sequência de aminoácido específico foram introduzidas que modifica ou rompe a bioatividade do polipeptídeo.

[0093] A atividade biológica do fator Vila na coagulação sanguínea deriva de sua capacidade de (i) ligar ao fator de tecido (TF) e (ii) catalisar a clivagem proteolítica do fator IX ou fator X para produzir o fator IX ou X ativado (fator IXa ou Xa, respectivamente). A atividade biológica dos polipeptídeos do fator VII ("atividade biológica do fator VII") pode ser quantificado pela medição da capacidade de uma preparação para promover a coagulação sanguínea usando plasma deficiente do fator VII e tromboplastina, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N°. 5.997.864 ou WO 92/15686. Neste ensaio, a atividade biológica é expressa como a redução do período de clonagem relativo a uma amostra de controle e é convertido as "unidades do fator VII"em comparação com um padrão de soro humano unido contendo 1 unidade/mL da atividade de fator VII. Alternativamente, a atividade biológica do fator Vila pode ser quantificado pela (i) medir a capacidade do fator Vila (ou o polipeptídeo do fator VII) para produzir o fator X ativado (fator Xa) em um sistema que compreende TF incluído em uma membrana de lipídeo e fator X (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) medir a hidrólise de fator X em um sistema aquoso; (iii) medir a ligação física do fator Vila (ou o polipeptídeo do fator VII) ao TF usando um instrumento com base na ressonância de plasmon de superfície (Persson, FEBS Lefts. 413:359-363, 1997); (iv) medir a hidrólise in vitrode um substrato sintético pelo fator Vila (ou um polipeptídeo do fator VII); ou (v) medir a geração de trombina em um sistema in vitroindependente TF. Alternativamente, o antígeno FVII pode ser determinado por ELISA. Um ELISA adequado é o kit AssayMax Human Factor VII (FVII) ELISA disponível de Assay Pro (St Charles, MO) Cat. N°. EF1007-1, que usa um FVII anti-humano monoclonal como anticorpo de captura e um FVII anti-humano policlonal biotinilado como anticorpo de detecção.

[0094] Um ensaio de proteólise in vitropreferido pelo fator Vila natural (tipo selvagem) e/ou variante de fator Vila é realizado em uma placa microtituladora (MaxiSorp, Nunc, Denmark), como descrito em U.S. 2007/0219135 (Novo Nordisk Healthcare A/G). Fator Vila (10 nM) e fator X (0,8 microM) em 100 microL 50 mM de Hepes, pH 7,4, contendo 0,1 M de NaCl, 5 mM de CaCU e 1 mg/ml de albumina de soro bovino, são incubados por 15 minutos. A clivagem do fator X é então interrompido pela adição de 50 microL 50 mM de Hepes, pH 7,4, contendo 0,1 M de NaCl, 20 mM de EDTA e 1 mg/ml de albumina de soro bovino. A quantidade do fator Xa gerado é medido pela adição do substrato cromogênico Z-D-Arg-Gly-Arg-p- nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Sweden), concentração final 0,5 mM. A absorbância a 405 nm é medida continuamente em uma placa SpectraMax™ 340. A absorbância desenvolveu-se durante 10 minutos, após a subtração da absorbância em um reservatório vazio não contendo FVIIa, pode ser usado para calcular a razão entre as atividades proteolíticas de variante e fator Vila de tipo selvagem: Razão = (A405 nm fator Vila variante)/(A4os nm fator Vila tipo selvagem).

[0095] Em uma variação deste ensaio, o FVII é determinado. Uma tromboplastina é incluída. O FVII na amostra forma um complexo com os íons Ca2+ e fator de tecido que gera pequenas quantidades de FXa. O FXa ativa FVII a FVIIa.

[0096] Um ensaio da atividade FVII comercialmente disponível é o kit de reagente HEMOCLOT FVII, disponível de Aniara (Mason, OH) catálogo N°. ACK081 K em que a coagulação disparada por uma tromboplastina de cálcio é medida.

[0097] As variantes de fator VII tendo substancialmente o mesmo ou atividade biológica melhorada relativa ao fator Vila de tipo selvagem que abrange aquele que exibe pelo menos cerca de 25 %, preferivelmente pelo menos cerca de 50 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % da atividade específica do fator Vila que foi produzida no mesmo tipo celular, quando testado em um ou mais de um ensaio de coagulação, ensaio de proteólise, ou ensaio de ligação TF como descrito acima. As variantes do fator VII tendo atividade biológica substancialmente reduzida relativa ao fator Vila de tipo selvagem são aqueles que exibem menos do que cerca de 25 %, preferivelmente menos do que cerca de 10 %, mais preferivelmente menos do que cerca de 5 % e mais preferivelmente menos do que cerca de 1 % da atividade específica do fator Vila de tipo selvagem que foi produzida no mesmo tipo celular quando testado em um ou mais de um ensaio de coagulação, ensaio de proteólise, ou ensaio de ligação como descrito acima. As variantes do fator VII tendo uma atividade biológica substancialmente modificada relativa ao fator VII de tipo selvagem incluem, sem limitação, as variantes do fator VII que exibem o fator C independente do TF da atividade proteolítica e aquele que se liga a TF mas não cliva-se ao fator X. As variantes do fator VII, se exibe substancialmente o mesmo ou melhor bioatividade do que o fator VII de tipo selvagem, ou, alternativamente, que exibe a bioatividade substancialmente modificada ou reduzida relativa ao fator VII de tipo selvagem, incluem, em limitação, polipeptídeos tem uma sequência de aminoácido que difere-se da sequência do fator VII de tipo selvagem pela inserção, anulação ou substituição de um ou mais aminoácidos.

[0098] Exemplos não limitantes das variantes do fator VII tendo substancialmente a mesma atividade biológica como fator VII de tipo selvagem incluem S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes de fator Vila que exibe a estabilidade proteolítica aumentada como divulgado na Patente U.S. N°. 5.580.560; fator Vila que foi proteoliticamente clivado entre os resíduos 290 e 291 ou entre os resíduos 315 e 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); as formas oxidadas do fator Vila (Komfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); as variantes do fator VII como divulgados em PCT/DK02/00189; e variantes do fator VII que exibem a estabilidade proteolítica aumentada como divulgada em WO 02/38162 (Scripps Research Institute); variantes de fator VII tendo um domínio Gla e que exibe uma ligação da membrana intensificada como divulgada em WO 99/20767 (University of Minnesota); e variantes de fator VII como divulgada em WO 01/58935 (Maxygen ApS).

[0099] Exemplos não limitantes das variantes do fator VII tendo a atividade biológica aumentada comparada ao fator Vila de tipo selvagem incluem as variantes de fator VII como divulgada em WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); e variantes do fator Vila com atividade intensificada como divulgada em JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.). Exemplos não limitantes das variantes do fator VII tendo atividade biológica modificada ou substancialmente reduzida relativa ao fator VII de tipo selvagem incluem RI 52E-FVIIa (Wild-goose et al., Biochem 29:3413- 3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al, J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Hoist et al, Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) e fator Vila que perde o domínio Gla, (Nicolaisen et al, FEBS Lefts. 317:245- 249, 1993).

[00100] A seguinte produção de FVII, o polipeptídeo pode ser purificado da purificação média dos polipeptídeos do fator VII podem envolver, por exemplo, a cromatografia por afinidade em uma coluna de anticorpo anti-fator VII (ver, por exemplo, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; e Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988) e ativação pela clivagem proteolítica, usando fator Xlla ou outras proteases tendo as especificidades semelhantes à tripsina, tal como, por exemplo, Fator IXa, calicreína, fator Xa e trombina. Ver, por exemplo, Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Patente U.S. N°. 4.456.591; e Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Alternativamente, fator VII pode ser ativado pela passagem através de uma coluna trocadora de íon, tal como Mono Q® (Pharmacia) ou outros.

[00101] O fator VII ou fator VII ativado pode ser formulado e usado de maneiras conhecidas. Por exemplo, este podem ser usados no tratamento de sangria em hemofílicos.

[00102] Onde o método da invenção é usado para produzir fator VII, é preferido que o sobrenadante de cultura celular é mantido em uma temperatura que ajustada em 36,5 ± 0,9° C, preferivelmente 36,5 ± 0,5° C, mais preferivelmente 36,5 ± 0,2° C e mais preferivelmente 36,5° C e/ou o pH ajustado em 7,20 ± 0,05, preferivelmente 7,20 ± 0,03, mais preferivelmente 7,29 ±0,01, mais preferivelmente 7,29; e/ou o sobrenadante de cultura celular tem uma concentração CO2 dissolvida de 1 a 10 %, preferivelmente 4,0 a 9,0 %, mais preferivelmente 5,5 a 8,5 %. Preferivelmente, pelo menos dois destes parâmetros estão dentro dos limites preferidos, isto é, temperatura e pH, temperatura e dCCF ou pH e dCCF. Mais preferivelmente, todos dos três parâmetros são operados dentro dos limites preferidos.

[00103] A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintes exemplos, sem qualquer limitação desta.

Exemplo 1: cultura celular básica Produção FVIII

[00104] As culturas típicas são estabelecidas em biorreatores, usando um subclone da linha celular 10A1 C6 CHO transformada para co-expressar o fator VIII e fator von Willebrand descrito em Kaufman et al (1989) Mot. Cell. Biol.9:1233-1242 e US 5 250 421. O subclone particular foi obtido pela adaptação a um meio padrão que não contém os produtos derivados de animais e subclonagem em uma microplaca.

[00105] O meio de cultura padrão é: DMEM/Ham's F12 50/ ao qual foi adicionado: 5011,76 g/kg L-glutamina 0,6 g/kg Etanolamina l,53mg/kg Synperonic F68 0,25 g/kg NaHCO3 2 g/kg Peptona de soja 4 g/kg CUSO4.5H2O 17,02 mg/kg

[00106] O meio DMEM/Ham's Fl2 50/50 basal contém 1,3 mg/kg Cu2+suficiente para o meio completo para conter 4,3 ppb Cu2+.

Produção ADAMTS-13

[00107] As células CHO DUKX-B11 foram transfectadas usando o método de co-precipitação de fosfato de cálcio, para introduzir o gene ADAMTS-13. As células foram cultivadas sob condições de seleção de neomicina e foram selecionadas após metotrexato e tratamento G418. Após a adaptação livre de soro, as células foram subclonadas e o subclone 640-2 foi escolhido como clone de produção.

[00108] O meio de cultura padrão é um meio livre de soro, insulina, e oligopeptideo com base no meio divulgado em U.S. 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

Produção de furina

[00109] As células CHO DUKX-B11 foram transfectadas usando o método de co-precipitação de fosfato de cálcio, para introduzir o gene de furina. As células foram selecionadas com o meio DHFR sem hipoxantina, timidina e glicina. O clone de produção 488-3 foi identificado pela subclonagem e seleção no meio contendo 100 nM de metotrexato, seguindo pela adaptação livre de soro.

[00110] O meio de cultura padrão é um meio livre de soro, insulina e oligopeptideo no meio divulgado em U.S. 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

Produção FVII

[00111] As células CHO DUKX-B11 foram transfectadas com um vetor bicistrônico para permitir a co-expressão de FVII e VKORC (complexo de redutase de epóxido de vitamina K). A expressão do gene é conduzida pelo promotor CMV e um local de entrada ribossômica interna (IRES) é localizado entre o gene FVII e as células do gene VKORC foram transfectadas usando o método de precipitação de fosfato de cálcio. O meio de seleção contém 200 p g/ml de higromicina B. As células foram subclonadas sob as condições livres de soro e uma alta expressão de subclone 1 E9 foi escolhido como o clone de produção. 1E9 foi selecionado como tendo as propriedades vantajosas com relação ao crescimento, produtividade e estabilidade sob as condições de cultura contínua. A estabilidade foi avaliada por um período de dois meses em modo chemostat.

[00112] O meio de cultura padrão é baseado no meio de cultura divulgado em U.S. 6.936.441 (Baxter AG) e contém, inter alia, 2,5 g/L de peptona de soja e 5 mg/L de insulina (Nucellin®; Eli Lilly ou Novolin®, Novo Nordisk).

Processos padrão usados para a produção FVIII Cultura contínua 5 L

[00113] O meio é pré-condicionado por diversas horas em um incubador CO2 (5 a 15 % de CO2) a 37° C. Para estabelecer a cultura, pelo menos um 1 ml de frasco (107 de células CHO/ml) é descongelada e as células diluídas em 60 ml de meio pré-condicionado em frascos Roux (200 ml) e cultivados na incubadora CO2 a 37° C. Após cerca de 3 dias, 60 ml de cultura é adicionada a 140 ml do meio fresco em um 1 garrafa rolante (1,8 L). A garrafa rolante é aspergida com 15 % de CO2 e cultivada a 37° C com rotação. Após dois dias, as células são divididas 1/3 e cultivadas em 2 garrafas rolantes no meio fresco (200 ml de meio + 100 ml de cultura = 300 ml por garrafa rolante). Após dois ou três dias adicionais, as células são novamente separadas 1/3 e cultivadas em um total de 6 garrafas rolantes no meio fresco como descrito acima. Uma vez a densidade celular requerida de aproximadamente 1 x 106 células/ml ser atingida, 1800 ml de inóculo é inoculado em meio 3,2L que foi pré-condicionado como descrito acima e cultivado no biorreator 5L. Sob as condições padrão, o biorreator 5L é realizado no pH 7,2, uma densidade celular de 1,4 x 106 células/ml e uma temperatura de 37° C. Sob as condições padrão, a cultura é aspergida com O2 tendo um tamanho de bolha de 10 pm em uma taxa de 0,25 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora).

Construção de inóculo no biorreator 40L

[00114] Um grupo de inóculo é essencialmente obtido como descrito acima em relação a cultura contínua 5L. Entretanto, o grupo é aproximadamente 5L e é obtido de 18 antes do que 6 garrafas rolantes. O biorreator BR-40 é clivado e esterilizado antes da operação e aproximadamente 8L do meio é transferido ao BR-40 antes da inoculação. O grupo inóculo de aproximadamente 5L é transferido do tanque de agrupamento ao biorreator por intermédio da linha de transferência para atingir o volume de cultura total de aproximadamente 13L. Uma vez que a densidade celular atinja 9 x 105 células/ml, a cultura é diluída (1:3) com meio. Após 1 a 3 dias a mais, a concentração celular novamente atinge 9 x 105 células/ml e a transferência do inóculo ao biorreator 320L é realizado.

Expansão no biorreator 320L

[00115] O biorreator BR-320 é clivado e esterilizado pela operação e aproximadamente 80L do meio é transferido ao BR-320 antes da inoculação. O inóculo de aproximadamente 40L é transferido do biorreator BR-40 ao biorreator BR-320 por intermédio de uma linha de transferência para atingir um volume de cultura inicial de aproximadamente 120L. Uma vez que a densidade celular atinja > 9 x 105 células/ml, a cultura é diluída (1:3) com meio. Após 3 a 6 dias (período total), a concentração celular novamente atinge 9 x 105 células/ml e a transferência do inóculo ao biorreator 2500L é realizado.

Biorreator 2500L Construção

[00116] O inoculo de aproximadamente 320L é transferido de BR-320 ao biorreator BR1 por intermédio de uma linha de transferência que já contém aproximadamente 630L de meio para atingir um volume de cultura inicial de aproximadamente 950L. Uma vez que a densidade celular atinja 9 x 105 células/ml, a cultura é diluída (—1:3) com meio a um volume final de aproximadamente 2500L. Após 4 a 7 dias (período total), a concentração celular novamente atinge > 9 x 105 células/ml e aproximadamente 1150L de inoculo é transferido de BR1 ao biorreator BR2 que contém aproximadamente 1350L do meio. Após a transferência, aproximadamente 1150L de meio é adicionado ao biorreator BR1, para atingir um volume de cultura final de aproximadamente 2500L.

Chemostat

[00117] O modo de cultura de 'chemostat' é iniciado como assim que a concentração celular em cada biorreator atinge 1,2 x 106 células/ml. Aproximadamente 1250L de meio por dia é adicionado em um modo contínuo a cada biorreator. A concentração celular está entre 9 x 105 - 1,6 x 106 células/ml em cada biorreator 2500L. As coletas múltiplas de aproximadamente 1250L/dia/biorreator são armazenados nos sacos estéreis a 2 a 8o C. A cultura é mantida por cerca de 50 a 57 dias no modo chemostat. Sob as condições padrão, o pH é apresentado a 7,2, a temperatura é apresentada a 37° Cea cultura é aspergida com O2 tendo um tamanho de bolha a 10 pm em uma taxa de 0,02 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora).

[00118] Os métodos de cultivo similares também são aplicáveis a uma a cultura de células CHO que expressam ADAMTS-13, furina ou FVII.

Exemplo 2: Efeitos da mudança em vários parâmetros na produtividade FVIII

[00119] A produtividade FVIII do clone de célula CHO que expressa FVIII e vWF descrito no Exemplo 1 foi determinado sob várias condições de cultura.

[00120] Nos experimentos separados, o pH, a densidade celular e temperatura foram variadas em uma escala 5L de cultura contínua. Em cada caso, o experimento de controle usando o pH 7,1, uma densidade celular de 1,4 x 106 células/ml e 37° C.

[00121] Quando a densidade celular foi aumentada, a produtividade FVIII volumétrica (IU por litro por dia), relativo ao valor para a densidade celular de 1,2 x 106 células/ml, aumentado como seguem: Porcentagem de produtividade

[00122] Visto que, um aumento substancial na produtividade deve ser atingido pelo aumento da densidade celular. Este não deve ter predito, visto que o aumento da densidade celular pode reduzir a produtividade por célula. Além disso, em certas densidades celulares, o aumento na produtividade foi observado ser maior do que o aumento da densidade celular, que é ainda mais surpreendente.

[00123] O pH foi aumentado ao 7,2 pela alteração dos parâmetros de aspersão. Nos reservatórios de controle a pH 7,1, uma cultura foi aspergida com O2 tendo um tamanho de bolha 10 pm em uma taxa de 0,25 WH (volume de O2 por volume de cultura por hora). No reservatório testado a pH 7,2 uma cultura foi aspergida com ar tendo um tamanho de bolha 10 pm em uma razão de 1,25 WH (volume de ar por volume de cultura por hora). Pelo aumento o pH de 7,1 a 7,2, a produtividade deve ser aumentada por cerca de 16%.

[00124] Pela diminuição da temperatura de 37° C a 36° C, uma produtividade aumentada por cerca de 22 %.

Exemplo 3:Influência da densidade celular e concentração de cobre na produtividade FVIII

[00125] A produtividade FVIII de clone da célula CHO que expressa FVIII e vWF descrito no Exemplo 1 foi determinado sob várias condições de cultura.

[00126] Uma cultura de controle foi operada a pH 7,1, 37° C, 4ppb Cu2+ e uma densidade celular de 1,4 x 106 células/ml.

[00127] As culturas comparativas foram realizadas a pH 7,2 e 36° C. Em uma cultura a densidade celular foi aumentada a 1,6 x 106 células/ml e em outro foi aumentado a 2,0 x 106 células/ml. Em uma terceira cultura, a densidade celular foi de 2,0 x 106 células/ml e a concentração de cobre foi aumentado de 4ppb a 6ppb.

[00128] Resultados: para a redução da temperatura, o aumento do pH e aumento da densidade celular a 1,6 x 106 células/ml (um aumento de 14 %), a produtividade FVIII aumentada por 41 a 50 %. Um aumento adicional na densidade celular a 2,0 x 106 células/ml (43 %) dão um aumento na produtividade (comparado a cultura de controle) de 39 a 77 %. Quando o cobre em uma cultura 2,0 x 106 células/ml foi aumentada a 6ppb, a produtividade (comparado a cultura de controle) foi aumentada por 48 a 98 %.

[00129] Visto que, pelo aumento leve do pH, a diminuição da temperatura levemente, o aumento da densidade celular por apenas 43 % e aumento da concentração de cobre por 50 % a produtividade FVIII pode ser quase duplo.

Exemplo 4: Influência da densidade celular e concentração de cobre na produtividade vWF

[00130] O Exemplo 3 foi repetido mas a produtividade vWF volumétrica foi medido. Em 1,6 x 106 células/ml e 4ppb de cobre (36° C, pH7,2) a produtividade foi 124 % de controle. Em 2,0 x 106 células/ml e 6ppb de cobre a produtividade foi de 182 %.

[00131] Visto que, novamente o aumento substancial na produtividade pode ser atingido pela fabricação de pequenas mudanças aparentemente nos parâmetros do processo.

Exemplo 5: Influência da densidade celular, pH e dCQ?

[00132] A produtividade FVIII do clone da célula CHO que expressa FVIII e vWF descrito no Exemplo 1 foi determinado sob várias condições de cultura.

[00133] Neste experimento, a densidade celular foi aumentada de 1,41 x 106 células/ml a 2,03 x 106 células/ml, o pH foi aumentado de 7,1 a 7,2 e a concentração dCÜ2 foi reduzido de 9,5 % a 6,2 %.

[00134] A produtividade volumétrica FVIII (IU por litro por dia) aumentado por 98 % e a produtividade FVIII específica (IU por milhão de células por dia) aumentado por 36 %.

Exemplo 6: Influência da pH e temperatura na produção de furina

[00135] As células CHO que expressam furina foram cultivadas nos biorreatores 2.5L no modo quimioestático. A densidade celular foi mantida em uma média entre 1,52 x 106 e 1,78 x 106 células/ml pelas culturas individuais nos 5 dias de cultivo. O oxigênio dissolvido foi controlado em todos os experimentos em um ponto de apresentação de 20 % saturação de ar. A concentração CO2 dissolvida foi mantida entre 5 % a 6 % pela sobreposição do espaço superior dos biorreatores com CO2.

[00136] Por meio do "projeto do método de experimentos", temperaturas diferentes foram combinadas com valores de pH diferentes para determinar as condições em que resulta na produtividade volumétrica máxima de furina. Cinco temperaturas foram combinadas com três valores de pH de acordo com o "Doehlert Matrix”, resultando em sete combinações de temperatura e pH como seguem:

[00137] A combinação de 36,5° C e pH 7,20 foi escolhido como o ponto central, que foi aplicado a dois lotes de fermentação (4 e 5 na tabela acima).

[00138] Os dados, incluindo a produtividade volumétrica e produtividade específica e taxa de crescimento, foram analisados estatisticamente com a metodologia de superfície de resposta (RSM), usando o software "Minitab".

[00139] A temperatura, mas não pH, significantemente influenciado na taxa de crescimento, com um máximo para a taxa de crescimento que ocorre a 36,5° C. Pela diminuição da temperatura de 37° C a 35,1° C, a produtividade volumétrica deve ser aumentada por aproximadamente 2,7 vezes. Uma direção similar foi vista para a produtividade específica. Este é um resultado surpreendente, como deve ser esperado que a produtividade volumétrica máxima deve ser observada na temperatura no qual a taxa de crescimento foi máxima. A influência do pH para a produtividade volumétrica e específica seja menor na faixa investigada de 7,20 +/- 0,1. Uma produtividade levemente maior foi observada na faixa de pH inferior de 7,15 +/- 0,05 (ou entre 7,10 e 7,20), portanto pH 7,15 foi selecionado como ponto de apresentação para a produção de furina.

Exemplo 7: Influência de dCO? na produção de furina

[00140] Duas fermentações foram realizadas em paralelo no modo chemostat nos biorreatores 2.5L, um realiza com uma concentração CO2 de aproximadamente 7,5 % e outro com uma concentração CO2 de aproximadamente 12 %. A concentração CO2 foi ajustada pela variação da fração CO2 no fluxo do espaço superior. As fermentações foram realizadas a 37° C, em um pH de 7,15 e com um pCF de 20 %. A contagem celular foi de aproximadamente 1,07 x 106 células/ml em 12 dias de luz de cultura de CO2 e 1,49 x 106 células/ml na cultura CO2 baixa.

[00141] Redução da concentração CO2 de 12 % a 7,5 % tem o efeito de aumentar a produtividade volumétrica por aproximadamente 2,78 vezes e a produtividade específica por 2 vezes. A taxa celular de crescimento também foi mais alta na cultura CO2 inferior.

Exemplo 8: Influência de pH e temperatura na produção FVII

[00142] As células CHO que expressa FVII foram cultivadas em 2.5L biorreatores no modo quimioestático, onde a densidade celular foi mantida em uma média de cerca de 2,5 x 106 células/ml (entre 2 x 106 e 3 x 106 células/ml) para as culturas individuais em 4 semanas de cultivo. O oxigênio dissolvido foi controlado em todos os experimentos em um ponto de apresentação de 20 % de saturação em ar. A concentração CO2 dissolvida foi mantida entre 4 % a 7 % pela sobreposição do espaço superior dos biorreatores com CO2.

[00143] Por meios de "projeto do método de experimentos", as temperaturas diferentes foram combinadas com valores de pH diferentes para determinar as condições que resultam na produtividade volumétrica máxima de FVII. Três temperaturas foram combinadas com três valores de pH de acordo com o "Doehlert Matrix", resultando em cinco combinações de temperatura e pH como seguem:

[00144] A produtividade cinética volumétrica máxima foi atingida a 36,5° C e um pH do ponto de apresentação de 7,20. Existe uma interação positiva dos parâmetros, tal que o resultado de otimização de ambos os parâmetros foi maior do que os efeitos combinados de otimização de cada parâmetro individual.

Exemplo 9: Influência de dCCE na produção FVII

[00145] O efeito de quatro concentrações diferentes CO2 (5,0, 6,3, 7,6 e 8,9 %) na produtividade FVII foi testada em pequena escala de cultura contínua.

[00146] As células foram cultivadas até chemostat do dia oito e então transformada em 2.5 L de biorreatores Rushton e cultivados sob as condições contínuas a pH 7,20 e 36,5° C por quase quatro semanas. Os dados de apenas das últimas três semanas foram analisados devido ao equilíbrio necessário as concentrações CO2 diferentes durante a primeira semana. Os níveis CO2 foram controlados pela medição fora de linha e adição de CO2 no espaço superior dos biorreatores.

[00147] As densidades das células registradas variadas de 2,36 x 106 células/ml em um nível CO2 de 8,9 % a 2,87 x 106 células/ml a 5,0 %. A taxa de crescimento para a mesma área da faixa são 0,42 d-1 e 0,49 d1. A taxa de crescimento específica aumentada no nível de CO2 baixo correlaciona com as produtividades específicas aumentadas. Os efeitos dos compostos de CO2 na taxa de crescimento e produtividade específica resultou em um efeito substancial na produtividade volumétrica.

[00148] Um aumento na concentração de CO2 de 8,9 % a 5 % de aumento na taxa de crescimento específica por 17 %, a produtividade específica por 10 % e a produtividade cinética volumétrica por 35 %.

Exemplo 10: Influência da temperatura e pH na produção ADAMTS-13

[00149] As células CHO transfectadas que expressam o ADAMTS-13 recombinante foram cultivadas nas culturas chemostat em biorreatores 1.5L.

[00150] Em um primeiro experimento, pH e temperatura foram apresentados em pontos de apresentação diferentes na faixa de 36° C a 38° C e pH 7,10 a 7,30. As amostras do estado constante foram analisadas pela contagem da célula e expressão ADAMTS-13 por ELISA e taxa de diluição da cultura chemostat foram medidos para calcular a taxa de crescimento e expressão ADAMTS-13 volumétrica. Uma vez que a condição mais favorável foi observada ser na faixa exterior do espaço projeto, um segundo experimento foi apresentado com uma faixa de temperatura de 35° a 37° C e pH 7,05 a 7,15 e os dados foram analisados pelo estado constante. As densidades celulares variadas de 1,17 a 1,71 x 106 células/ml. O CO2 foi controlado pela sobreposição do espaço superior com CO2 para atingir uma concentração CO2 dissolvida de 4 a 6 %.

[00151] Os dados de ambos experimentos foram normalizados e analisados usando software estatístico Minitab.

[00152] A taxa de crescimento específica foi observada ter sua condição favorável ao pH 7,13 e 36,0° C usando um modelo quadrático por pH e temperatura. O efeito de temperatura na taxa de crescimento foi enfraquecido.

[00153] A produtividade volumétrica foi observada sua condição favorável ao pH 7,15 e 36,0° C. Apesar do efeito fraco de temperatura na taxa de crescimento, existe um efeito relativamente alto de temperatura na produtividade volumétrica.

[00154] Admitindo uma temperatura constante de 37° C, o efeito de aumento do pH de 7,10 a 7,15 foi para aumentar a produtividade volumétrica em 10 %. Admitindo um pH constante de 7,10, o efeito de diminuição da temperatura de 37° C a 36° C foi para aumentar a produtividade volumétrica em 14 %. O efeito total das mudanças das condições de pH 7,10 e temperatura de 37° C a pH 7,15 e temperatura de 36° C foi para aumentar a produtividade volumétrica em 24 %.

[00155] Os conteúdos de todas as referências citadas neste são incluídas por referência.

Claims

1. Método para cultivar células de mamífero que secretam proteína heteróloga em um sobrenadante de cultura celular, caracterizadopelo fato de que o sobrenadante de cultura celular é mantido em um pH que é ajustado em uma faixa de 7,10 a 7,25, com a condição que o pH seja ajustado em mais do que 7,10, em que a cultura celular é uma cultura contínua mantida a uma densidade de 1,6 x 106 a 2,6 x 106 células/ml, em que a cultura contínua é uma cultura chemostat ou turbidostat, em que a proteína heteróloga é Fator VIII, e em que o sobrenadante da cultura celular tem concentração de CO2 dissolvido de 5,5 a 8,5%.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o pH é ajustado em 7,15 a 7,25; 7,17 a 7,23; 7,19 a 7,21; 7,20; 7,12 a 7,18; 7,14 a 7,16 e 7,15.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadopelo fato de que o sobrenadante de cultura celular é tamponado com bicarbonato.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadopelo fato de que o sobrenadante é aspergido com ar.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o Fator VIII é co-expressado com o fator de von Willebrand.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadopelo fato de que a concentração de Cu2+ no sobrenadante de cultura celular é de pelo menos 5, 7, 10, 15 ou 25 ppb.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadopelo fato de que a célula de mamífero é uma célula de roedor, tal como uma célula CHO ou uma célula BHK.