KR20170126514A - 세포 배양 방법 - Google Patents

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KR20170126514A
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Abstract

CHO 또는 BHK 세포와 같은 이종 단백질-분비 포유동물 세포를 35.1-36.5 ℃에서 및/또는 pH 7.15-7.20에서 및/또는 10 % 이하의 용존 CO2 농도에서 배양한다. 바람직한 이종 단백질은 인자 VIII, ADAMTS-13, 푸린 또는 인자 VII이다.

Description

세포 배양 방법{CELL CULTURE PROCESSES}
본 출원은 여기서 그 전체가 참조로 도입된 2007년 12월 27일 출원된 미국 가특허 출원 제61/009,328호의 우선권을 주장한다.
<본 발명의 기술 분야>
본 발명은 포유동물 세포, 구체적으로 이종 및/또는 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포, 더 구체적으로 혈액 단백질, 예컨대 혈액 응고 인자 VIII(여기서 이하 '인자 VIII' 또는 단지 'FVIII'), ADAMTS-13, 푸린(furin) 또는 응고 인자 VII(여기서 이하 '인자 VII' 또는 단지 "FVII')를 분비하는 포유동물 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
혈액 응고 인자 VIII는 포유동물에서 발견되는 미량의 혈장 글리코단백질이며 인자 X의 활성화에서 IXa의 공인자로서 수반된다. 인자 VIII의 유전적인 결핍은 출혈 장애 혈우병 A를 야기하고, 이는 정제된 인자 VIII로 성공적으로 치료될 수 있다. 인자 VIII는 혈장으로부터 추출될 수 있거나 또는 재조합 DNA에 기초한 기술로 생산될 수 있다. 혈장에서, 그것은 폰 빌레브란트 인자(vWF)와의 복합물로 순환한다.
재조합 인자 VIII(rFVIII)는 인자 VIII 분자를 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 벡터로 형질감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로 생산될 수 있다. 일부 경우에, 재조합 인자 VIII는 인자 VIII를 안정화시키는 재조합 폰 빌레브란트 인자(rvWF)와 공-생산된다. 이와 같은 공-생산은 FVIII 및 vWF를 발현하는 각각의 세포주의 공-배양 또는 동일한 세포 내에서 두 단백질의 공-발현을 수반할 수 있다. US 5 250 421(제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)) 및 문헌 [Kaufman et al (1989) MoI. Cell. Biol. 9, 1233- 1242] 참조.
통상적인 재조합 인자 VIII 제조 방법에서, 세포는 배지 내에서 배양되고 인자 VIII를 배지 내로 분비한다. 그 후 인자 FVIII는 배지로부터, 임의로 vWF와의 복합물로 정제될 수 있다.
재조합 인자 VIII는 해당 분야에 공지된 방법에서 얻어지는 비교적 낮은 수득률 때문에 생산하기 비싸다. 세포당 수득률은 다른 재조합 단백질에 대해 얻을 수 있는 수득률에 비해 낮은 경향이 있다. 배양 배지가 혈청과 같은 동물 산물로 보충되지 않는 경우, 배지는 비교적 낮은 세포 밀도만을 지탱할 수 있다. 이것은 배지 부피당 수득률을 감소시킨다. 그러나, 바이러스 및 다른 전염되는 물질로의 오염의 위험성을 감소시키기 위해 배양 배지를 동물 산물로 보충하지 않는 것이 바람직하다. FVIII 생산용 동물 단백질 부재 배지는 예컨대 US 6 936 441(벡스터 에이지(Baxter AG))로부터 공지된다.
본 발명은 rFVIII를 포함한 혈액 단백질의 생산 방법을 제공하고, 여기서 해당 분야에 공지된 방법에 비해 수득률이 개선된다.
발명의 요약
본 발명의 제1 태양은 온도가 37 ℃ 미만으로 설정된다는 조건 하에서, X가 35.1 내지 36.5의 값을 갖는 X±0.9 ℃로 설정된 온도로 유지되는 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 태양은 pH가 7.10 초과로 설정된다는 조건 하에서, X가 7.15 내지 7.20의 값을 갖는 X±0.05로 설정된 pH로 유지되는 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 태양은 1 내지 10 %의 CO2 농도를 갖는 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 태양은 세포 배양 상청액 내 세포의 밀도가 인-라인 센서로 측정되는 세포 배양 상청액을 포함하고 세포의 밀도를 바람직한 범위 내로 유지하기 위해 새로운 배지의 용기 내로의 유입이 자동적으로 조절되는 용기 내의 FVIII-분비 포유동물 세포의 연속 배양 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 온도가 37 ℃ 미만으로 설정된다는 조건 하에서, 세포 배양 상청액이 X가 35.1 내지 36.5의 값을 갖는 X±0.9 ℃로 설정된 온도로 유지되는, 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법을 제공한다. 여기에서, 온도는 36±0.9 ℃, 36±0.5 ℃, 36±0.2 ℃, 36 ℃, 35.1±0.9 ℃, 35.1±0.5 ℃, 35.1±0.2 ℃, 35.1 ℃, 36.5±0.9 ℃, 36.5±0.5 ℃, 36.5±0.2 ℃, 또는 36.5 ℃로 설정될 수 있다.
일 실시형태에서, pH가 7.10 초과로 설정된다는 조건 하에서, 세포 배양 상청액이 X가 7.15 내지 7.20의 값을 갖는 X±0.05로 설정된 pH로 유지되는, 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법을 제공한다. 여기에서, pH는 7.20±0.05, 7.20±0.03, 7.20±0.01, 7.20, 7.15±0.05, 7.15±0.03, 7.15±0.01, 또는 7.15로 설정될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 배양 상청액이 1 내지 10 %의 용존 CO2 농도를 갖는, 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법을 제공한다. 여기에서, CO2 농도는 4.0 내지 9.0 %, 5.5 내지 8.5 %일 수 있다.
일 실시형태에서, 온도가 37 ℃ 미만으로 설정된다는 조건 하에서, 상기 세포 배양 상청액이 X가 35.1 내지 36.5의 값을 갖는 X±0.9 ℃로 설정된 온도로 유지되는 방법이 제공된다. 여기에서, 온도는 36±0.9 ℃, 35.1±0.9 ℃, 36.5±0.9 ℃로 설정될 수 있다.
일 실시형태에서, pH가 7.10 초과로 설정된다는 조건 하에서, 상기 세포 배양 상청액이 X가 7.15 내지 7.20의 값을 갖는 X±0.05로 설정된 pH로 유지되는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 상청액은 중탄산염으로 완충될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 배양 상청액은 공기로 분사될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 밀도는 1.0x106 내지 5.0x106 세포/ml, 1.0x106 내지 3.5x106 세포/ml, 1.4x106 내지 2.8x106 세포/ml, 1.6x106 내지 2.6x106 세포/ml, 1.8x106 내지 2.4x106 세포/ml일 수 있다.
일 실시형태에서, 이종 단백질은 혈액 단백질일 수 있다. 여기에서, 혈액 단백질은 인자 VIII일 수 있다. 여기에서, 인자 VIII는 폰 빌레브란트 인자와 공-발현될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 세포 배양 상청액 내의 Cu2 + 농도가 5 ppb 이상일 수 있거나, Cu2+ 농도가 7, 10, 15 또는 25 ppb 이상일 수 있다.
일 실시형태에서, 혈액 단백질은 ADAMTS-13, 푸린, 또는 인자 VII일 수 있다.
일 실시형태에서, 포유동물 세포는 설치류 세포, 예컨대 CHO 세포 또는 BHK 세포일 수 있다.
일 실시형태에서, 배양은 회분 배양, 유가 배양, 또는 연속 배양, 특히 반복식 회분, 케모스텟 또는 터비도스텟 배양일 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 배양 상청액 내 세포의 밀도가 인-라인 센서로 측정되는 세포 배양 상청액을 포함하고 세포의 밀도를 바람직한 범위 내로 유지하기 위해 새로운 배지의 용기 내로의 유입이 자동적으로 조절되는 용기 내의 인자 VIII-분비 포유동물 세포의 배양 방법이 제공된다. 여기에서, 세포 밀도는 1.2x106 세포/ml 이상일 수 있다.
본 발명의 제1 태양의 방법에서, 포유동물 세포가 배양되는 세포 배양 상청액은 온도가 37 ℃ 미만으로 설정된다는 조건 하에서, X가 35.1 내지 36.5의 값을 갖는 X±0.9 ℃로 설정된 온도로 유지된다. 바람직한 실시예에서, 온도는 36±0.9 ℃, 바람직하게는 36±0.5 ℃, 더 바람직하게는 36±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 36 ℃; 또는 35.1±0.9 ℃, 바람직하게는 35.1±0.5 ℃, 더 바람직하게는 35.1±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 35.1 ℃; 또는 36.5±0.9 ℃, 36.5±0.5 ℃, 더 바람직하게는 36.5±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 36.5 ℃로 설정된다.
"세포 배양 상청액"은 포유동물 세포가 배양되는 배지이다. 공급 배지 역시세포 배양 상청액이 설정된 온도에서 바람직하게 배양에 첨가될 수 있음에도 불구하고, 이 배지는 배양에 첨가될 수 있는 공급 배지와 혼동되지 않는다. "배양"은 세포 배양 상청액 및 그 안에서 배양되는 포유동물 세포를 의미한다. 통상적으로, 포유동물 세포는 37 ℃에서 배양된다. 놀랍게도, 출원인은 36 ℃와 같은 더 낮은 온도에서 포유동물 세포를 배양하는 것이 재조합 단백질의 수득률을 증가시킴을 밝혀냈다.
온도"에서 배양하다" 또는 "에서 유지하다"는 공정 조절 시스템이 설정된 온도, 즉 의도된, 목적 온도를 지칭한다. 명백하게, 시간이 지남에 따라 그리고 배양 용기에서의 위치에 따라 배양의 온도에는 작은 변동이 있을 것이다. X±Y ℃로 설정된 온도"에서 배양하다" 또는 "에서 유지하다"로 나타내진 경우, 이는 설정 지점이 X+Y ℃ 내지 X-Y ℃의 값임을 의미한다. 예컨대, X가 36.0±0.9 ℃인 경우, 설정 지점은 35.1 내지 36.9의 값에 설정된다. X의 각 바람직한 값에 대해, 설정 지점은 X±0.9 ℃, ±0.8 ℃, ±0.7 ℃, ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃ 또는 ±0.1 ℃ 범위 내의 값이다. 좁은 범위가 바람직하다. X의 설정 지점이 가장 바람직하다.
임의의 주어진 설정 지점에 대해, 온도의 약간의 변동이 일어날 수 있다. 통상적으로, 온도가 설정 지점으로부터 약간 변동된 후에만 가열 및 냉각 요소가 활성화되기 때문에 이와 같은 변동이 일어날 수 있다. 이 경우, 적절하게 설정 온도는 X(±Y)이고 가열 또는 냉각 요소는 온도가 ±Z ℃ 만큼 변할 시 활성화된다. 통상적으로, 가열 또는 냉각 요소가 활성화되기 전 설정 지점으로부터 온도의 허용가능한 정도의 변동이 공정 조절 시스템 내에 프로그램될 수 있다. 온도는 항온기로 조절되는 가열 및 냉각 요소에 의해 가장 가까운 ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃ 또는 심지어는 ±0.1 ℃로 조절될 수 있다. ±0.9 ℃, ±0.8 ℃, ±0.7 ℃ 또는 ±0.6 ℃와 같은 온도의 더 큰 차이도 프로그램될 수 있다. 온도는 배양 용기의 특정 온도의 가열 조 내로의 침액으로 조절될 수도 있다. 생각할 수 있는 바로는, 가열이 연속적으로 적용되기 때문에, 설정 지점으로부터 변동이 없다. 변동의 다른 원인은 세포 배양 상청액의 온도에서의 측정 오류에 기인한다. 세포 배양 장치에서 사용되는 통상적인 온도계는 ±0.3 ℃ 또는 ±0.2 ℃ 또는 심지어는 ±0.1 ℃의 변동성을 갖는다.
설정 지점이 X±Y ℃ 범위 내의 값에 설정되고 온도의 허용 범위가 ±Z ℃인 경우(즉, 적절하게는 온도가 ±Z ℃ 변했을 때 가열기 또는 냉각기가 활성화된다), 이는 (X-Y 내지 X+Y)±Z ℃의 설정 지점으로도 표현될 수 있다. 온도가 37 ℃ 미만으로 설정된다는 조건 하에, X의 각 가능한 값에 대해, 상기한 바와 같이 ±Y ℃ 및 ±Z ℃의 모든 조합이 예상된다.
바람직한 실시예에서 온도는 36±Y ℃로 설정된다. 바람직하게는 온도는 (35.4-36.6)±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (35.5-36.5)±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (35.6-36.4)±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (35.7-36.3)±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (35.8-36.2)±0.7 ℃, ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (35.9-36.1)±0.8 ℃, ±0.7 ℃, ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 36 ±0.9 ℃, ±0.8 ℃, ±0.7 ℃ ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0°C로 설정된다.
다른 바람직한 실시예에서, 온도는 35.1±Y ℃로 설정된다. 바람직하게는 온도는 (34.5-35.7)±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (34.6-35.6)±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (34.7-35.5)±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (34.8-35.4)±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (34.9-35.3)±0.7 ℃ ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (35.0-35.2)±0.8 ℃, ±0.7 ℃ ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 35.1±0.9 ℃ ±0.8 ℃, ±0.7 ℃ ±0.6 ℃, ±0.5 ℃, ±0.4 ℃, ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0°C로 설정된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 온도는 36.5±Y ℃로 설정된다. 바람직하게는 온도는 (36.1-36.9)±0; 또는 (36.2-36.8)±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (36.3-36.7)±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 (36.4-36.6)±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0; 또는 36.5 ±0.4 ℃. ±0.3 ℃, ±0.2 ℃, ±0.1 ℃ 또는 ±0으로 설정된다.
본 발명의 제2 태양의 방법에서, 세포 배양 상청액은 pH가 7.10 초과로 설정된다는 조건 하에서, X가 7.15 내지 7.20의 값을 갖는 X±0.05로 설정된 pH로 유지된다. 바람직한 실시예에서, pH는 7.20±0.05, 바람직하게는 7.20±0.03, 더 바람직하게는 7.20±0.01 및 가장 바람직하게는 7.20; 또는 7.15±0.05, 바람직하게는 7.15±0.03, 더 바람직하게는 7.15±0.01 및 가장 바람직하게는 7.15로 설정된다. 재조합 단백질을 생산하기 위한 통상적인 방법에서, 세포 배양 상청액은 pH 7.1로 유지된다. 놀랍게도, 출원인은 pH 7.2와 같은 더 높은 pH에서 포유동물 세포를 배양하는 것이 재조합 단백질의 수득률을 증가시킴을 밝혀냈다.
pH"에서 배양하다" 또는 "에서 유지하다"는 공정 조절 시스템이 설정된 pH, 즉 의도된, 목적 pH를 지칭한다. X±Y로 설정된 pH"에서 배양하다" 또는 "에서 유지하다"로 나타내진 경우, 이는 설정 지점이 X+Y 내지 X-Y의 값임을 의미한다. X의 각 바람직한 값에 대해, 설정 지점은 X±O.05, ±0.04, ±0.03, ±0.02 또는 ±0.01 범위 내의 값이다. 좁은 범위가 바람직하다. X의 설정 지점이 가장 바람직하다.
임의의 주어진 설정 지점에 대해, pH의 약간의 변동이 일어날 수 있다. 통상적으로, pH가 설정 지점으로부터 약간 변동된 후에만 예컨대 산 또는 염기의 첨가에 의해 또는 분사율의 변화에 의해 pH를 조절하는 수단이 활성화되기 때문에 이와 같은 변동이 일어날 수 있다. 통상적으로, pH는 가장 가까운 ±0.05, ±0.04, ±0.03, ±0.02 또는 ±0.01 pH 단위로 조절된다.
pH 설정 지점이 X±Y 범위 내의 값에 설정되고 허용 범위가 ±Z ℃인 경우, 이는 (X-Y 내지 X+Y)±Z의 설정 지점으로도 표현될 수 있다. pH가 7.10 초과로 설정된다는 조건 하에, X의 각 가능한 값에 대해, 상기한 바와 같이 ±Y 및 ±Z의 모든 조합이 예상된다.
바람직한 실시예에서, pH는 7.20±Y로 설정된다. 바람직하게, pH는 (7.15-7.25)±0; 또는 (7.16-7.24)±0.1 또는 ±0; 또는 (7.17-7.23)±0.2, ±0.1 또는 ±0; 또는 (7.18-7.22)±0.3, ±0.2, ±0.1 또는 ±0; 또는 (7.19-7.21)±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 또는 ±0; 또는 7.20±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 또는 ±O으로 설정된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, pH는 7.15±Y로 설정된다. 바람직하게, pH는 (7.11-7.19)±0; 또는 (7.12-7.18)±0.1 또는 ±0; 또는 (7.13-7.17)±0.2, ±0.1 또는 ±0; 또는 (7.14-7.16)±0.3, ±0.2, ±0.1 또는 ±0; 또는 7.15±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 또는 ±0으로 설정된다.
본 발명의 제3 태양의 방법에서, 세포 배양 상청액은 1 내지 10 %, 예컨대 4.0-9.0 %, 5.5-8.5 % 또는 약 6-8 %의 CO2 농도를 갖는다. 세포에 의해 생산된 CO2가 세포 배양 상청액으로부터 제거되지 않기 때문에 통상적으로 CO2 농도는 이것보다 더 높다. 놀랍게도, 출원인은 CO2 농도를 10% 이하로 유지하는 것이 재조합 단백질의 수득률을 증가시킴을 밝혀냈다. 만약 공급 배지가 기체 제거되고(예컨대 그것을 통해 공기를 버블링함으로써) 생반응기 내의 세포 배양 상청액이 분사되는 경우 dCO2가 낮게 유지되는 것을 돕는다.
바람직하게는, 본 발명의 첫 번째 세 개의 태양의 방법 각각은 발명의 1 이상의 다른 태양의 방법에 관해 명시된 특정한 특징을 포함하도록 작동된다. 즉, 온도가 X±0.9 ℃로 유지되고, 상기 식에서 X는 35.1 내지 36.5 ℃의 값을 가지는 경우, pH 역시 X가 7.15 내지 7.20인 X±O.05로 및/또는 CO2 농도도 10 % 이하로 유지하는 것이 바람직하다. pH가 X±O.05로 유지되고, 상기 X가 7.15 내지 7.20의 값을 갖는 경우, 온도도 X가 35.1 내지 36.5 ℃의 값을 가지는 X±0.9 ℃로 및/또는 CO2 농도도 10 % 이하로 유지하는 것이 바람직하다. CO2 농도가 10 % 이하로 유지되는 경우, pH도 X가 7.15 내지 7.20인 X±O.05로 및/또는 온도도 X가 35.1 내지 36.5 ℃의 값을 가지는 X±0.9 ℃로 유지하는 것이 바람직하다.
세 개의 정의된 지표(온도, pH 및 CO2 농도)를 감시하는 방법은 본 분야에 주지되어 있고 일반적으로 생반응기 내에 삽입되거나 배양 배지가 이를 통해서 순환되는 루프에 포함되거나 또는 배양 배지의 추출된 샘플 내에 삽입되는 탐침에 의존한다. 적절한 인-라인 dCO2 센서 및 그것의 사용은 문헌 [Pattison et al (2000) Biotechnol. Prog. 16:769-774]에 개시된다. 적절한 인-라인 pH 센서는 메틀러 톨레도 인프로(Mettler Toledo InPro) 3100/125/Pt100(메틀러-톨레도 인골드 인크(Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA))이다. pH 및 pO2 외에, dCO2 측정에 적절한 오프라인 시스템은 바이오프로필(BioProfile) pHOx(노바 바이오메디칼 코포레이션(Nova Biomedical Corporation, Waltham MA))이다. 이 시스템에서, dCO2는 5 %의 부정확 해상도로 3-200 mmHg 범위 내에서 포텐시오미터 전극에 의해 측정된다. 이 시스템으로 37 ℃의 온도에서 pH를 측정할 수 있고, 이는 생반응기 내의 세포 배양 상청액의 온도와 가깝다. 특정한 지표를 미리 정해진 수준으로 유지하기 위해 변화시키는 방법도 또한 주지되어 있다. 예컨대, 온도를 일정하게 유지하는 것은 통상적으로 생반응기 또는 공급 배지(만약 그것이 유가 배양 또는 연속 공정인 경우)를 가열 또는 냉각시키는 것을 수반하며; pH를 일정하게 유지하는 것은 통상적으로 적절한 완충액(통상적으로 중탄산염)을 선택 및 충분히 공급하는 것 및 공급 배지에 필요한 만큼 염산과 같은 산 또는 수산화 나트륨, 중탄산 나트륨 또는 그들의 혼합물과 같은 알칼리를 첨가하는 것을 수반하고; CO2 농도를 일정하게 유지하는 것은 일반적으로 분사율을 조절하는 것(아래 상세히 설명함) 또는 상부 빈공간 내의 CO2 흐름을 규제하는 것을 수반한다. 인-라인 pH 탐침의 검량은 시간에 거쳐, 예컨대 세포가 배양되는 몇 일 또는 몇 주의 기간에 거쳐 서서히 이동하는 것이 가능하다. 그 경우에, 최근에 검량된 오프라인 탐침으로부터 얻은 측정을 사용해 인-라인 탐침을 재설정하는 것이 유익할 수 있다. 적절한 오프라인 탐침은 바이오프로필(BioProfile) pHOx(노바 바이오메디칼 코포레이션(Nova Biomedical Corporation, Waltham MA))이다.
발명자들은 (예컨대, NaOH의 첨가에 의해) pH를 증가시키는 것은 활성 단백질 생산에 있어서 최대의 이익을 달성하는데 그 자체로는 충분하지 않음을 밝혀냈다. 대신, CO2 농도를 낮추는 것이 바람직하다. 보통, 다른 공정 지표들은 일정하게 유지될 것이다. 그러나, 발명자들은 CO2 농도를 낮추면서 pH는 7.1에서 예컨대 7.15 또는 7.2로 바람직하게는 NaOH의 첨가 없이 증가하도록 하는 것이 바람직함을 밝혀냈다.
포유동물 세포 배양은 세포가 성장하기 위해 산소를 필요로 한다. 일반적으로, 이는 주입 포트를 통해 강제로 산소를 배양 내로 보냄으로써 제공된다. 세포의 호흡에 의해 축척되는 CO2를 제거하는 것이 필수적이다. 이는 '분사'에 의해, 즉 CO2를 끌고나가고 제거하기 위해 생반응기를 통해 가스를 통과시킴으로써 달성된다. 통상적으로, 이는 산소를 사용해 수행될 수도 있다. 그러나, 발명자들은 대신 공기를 사용하는 것이 바람직함을 밝혀냈다. 통상적으로 질소와 같은 종래의 불활성 기체가 공기를 사용하는 것보다 CO2 분사에 있어서 덜 효과적임이 밝혀졌다. 공기가 약 20 % 산소임을 고려할 때, 5 배만큼의 공기가 사용될 것이라고 생각될 것이다. 그러나 이는 큰 규모의 배양, 특히 2500 L 규모의 배양에서 적절하지 않음이 밝혀졌다. 2500 L 생반응기에서, 7 내지 10 배만큼의 공기, 바람직하게는 약 9 배만큼의 공기가 사용된다. 예컨대, 표준 조건 하에서, 2500 L 생반응기는 0.02 VVH(시간당 배양 부피당 O2 부피)의 속도로 10 μm 기포 크기의 O2로 분사된다. 본 발명의 방법에 따라 사용된 동일한 2500 L 생반응기는 0.18 VVH의 속도로 10 μm 기포 크기의 공기로 분사될 것이다.
따라서, 놀랍게 큰 부피의 공기의 사용이 적절한 산소 공급을 제공하고 바람직하지 않은 CO2를 제거한다고 밝혀졌다.
생산 단계 동안, 상기한 바와 같이 공기 분사로 CO2를 제거하는 것이 바람직하다. 이는 특히 큰 용량의 생반응기를 사용하는 경우이며, 여기서 세포 배양 상청액은 그렇지 않으면 CO2를 유독하게 높은 수준까지 축적시킬 것이다. 그러나, 배양 개시시, 또는 1 L 또는 2.5 L 규모에서와 같이 작은 규모의 배양에서, 상부 빈공간은 CO2로 덮일 수 있다. 이와 같은 조건 하에서 여전히 낮은 수준의 dCO2를 달성할 수 있다. 만약 pH가 너무 염기성인 경우, 상부 빈공간을 CO2로 덮는 것은 pH를 설정 지점으로 감소시키는데 사용될 수도 있다.
세포는 바람직하게 제조 공정(즉, 1 L 이상)에서 배양되어 FVIII와 같은 바람직한 단백질을 생산할 수 있는 임의의 포유동물 세포일 수 있다. 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아성 신장 주(현탁 배양 내의 293 또는 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]]); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10)); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR, 예컨대 DUKX-B11 서브클론(CHO, 문헌 [Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]]); 생쥐 세르톨리 세포(TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod , 23:243-251 [1980]]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51 ); TRI 세포(문헌 [Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 주(Hep G2)를 포함한다. 바람직하게, 세포 주는 설치류 세포 주, 특히 CHO 또는 BHK와 같은 햄스터 세포 주이다.
재조합 단백질을 발현하는 안정한 CHO 세포 클론을 제조하는 바람직한 방법은 아래와 같다. 본질적으로 US 5,250,421(카프만 등(Kaufman et al), 제네틱스 인스티튜트, 인크.)에 기술된 바와 같이 DHFR 결핍 CHO 세포 주 DUKX-BII를 DHFR 발현 벡터로 형질감염시켜 관련된 재조합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 형질감염은 메토트렉세이트로 선별된다. 재조합 단백질 및 DHFR 유전자의 발현을 암호화하는 관련 영역의 증폭은 메토트렉세이트의 농도를 증가시키며 세포를 증식시킴을 통해 달성된다. 적절한 경우, CHO 세포 주는 본질적으로 US 6,100,061(레이터 등, 이뮤노 악티엔게젤샤프트(Reiter et al, Immuno Aktiengesellschaft))에 기술된 바와 같이 혈청 및/또는 단백질 부재 배지에서의 성장에 채택될 수 있다.
숙주 세포 주를 배양하기 위해 선택된 기본 배지는 본 발명에 중요하지 않고 포유동물 세포를 배양하는데 적절한 해당 분야에 공지된 것들 중 임의의 것 또는 조합일 수 있다. 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium), 햄 F-12 배지(Ham's F-12 Medium), 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium) 및 RPMI-1640 배지(RPMI-1640 Medium) 등과 같은 배지는 상업적으로 입수가능하다. 재조합 인슐린과 같은 성장 인자의 첨가는 임의적이다.
역사적으로, 동물 세포는 동물 혈청을 함유하는 배지에서 배양되었다. 그러나, 이와 같은 배지는 불완전하게 정의되었고 감염의 위험을 수반했다. 따라서 당업자는 임의의 단백질이 전혀 없거나 적어도 재조합적으로 생산되지 않은 임의의 단백질이 없는 "단백질-부재" 배지를 고안하였다. 인자 VIII의 불안정한 성질 때문에, 가공된 숙주 세포의 생산성은 단백질-부재 조건 하에서 심각하게 감소하였다. 재조합 단백질의 생산을 위한 혈청-부재 배양 보충제로 인간 혈청 알부민이 통상적으로 사용된다. 알부민 그 자체가 FVIII를 안정화시키며 혈청-유래 알부민 제제 내에 존재하는 불순물 역시 알부민의 효과를 안정화하는데 기여할 수 있다. 리포단백질과 같은 인자는 혈청-부재 조건 하에서 재조합 인자 VIII의 생산을 위한 인간 혈청 알부민의 대체물로 식별되었다.
바람직한 배지는 US 6 171 825(베이어, 인크(Bayer, Inc)) 및 US 6 936 441(백스터 에이지)에 개시된 것들을 포함한다.
US 6 171 825의 배지는 재조합 인슐린, 철, 폴리올, 구리 및 임의로 다른 미량 금속이 보충된 변형된 둘베코 최소 필수 배지 및 햄 F-12 배지(중량으로 50:50)으로 구성된다.
인슐린은 재조합이어야 하며 엘리 릴리(Eli Lilly)로부터의 '누셀린' 인슐린으로 얻을 수 있다. 그것은 0.1 내지 20μg/ml(바람직하게는 5-15 μg/ml 또는 약 10 μg/ml)로 첨가될 수 있다. 철은 바람직하게는 Fe2 + 이온, 예컨대 FeSO4·EDTA로 제공되는 형태이고, 5-100 μM(바람직하게는 약 50 μm)로 존재할 수 있다. 적절한 폴리올은 약 1000 내지 약 16,000 범위의 분자량을 갖는 폴리(옥시에틸렌) 및 폴리(옥시프로필렌)의 비이온성 블록 공중합체를 포함한다. 특히 적절한 폴리올은 플루로닉(Pluronic) F-68(BASF 위안도트(BASF Wyandotte))이고, 이는 8400의 평균 분자량을 가지며 폴리(옥시프로필렌)(20 중량%)의 중앙 블록 및 양 말단의 폴리(옥시에틸렌)의 블록으로 구성된다. 그것은 유니케마 케미 BV(Unichema Chemie BV)로부터의 신퍼로닉(Synperonic) F-68로도 입수가능하다. 다른 것들은 플루로닉 F-61, F-71 및 F-108을 포함한다. 구리(Cu2+)는 50-80O nM CuSO4, 바람직하게는 100-40O nM, 통상적으로는 약 250 nM과 동등한 양으로 첨가될 수 있다. 망간, 몰리브덴, 규소, 리튬 및 크로뮴과 같은 미량 금속 패널의 포함은 인자 VIII 생산의 추가적 증가를 불러올 수 있다. BHK 세포는 이 단백질-부재 기본 배지에서 잘 자란다.
US 6 936 441의 배지 역시 DMEM 및 햄 F12의 50/50 혼합물에 기초하나, 0.1 내지 100 g/l, 바람직하게는 1 내지 5 g/l의 대두 펩톤 또는 효모 추출물을 포함한다. 특히 바람직한 실시예로서, 대두 추출물, 예컨대 대두 펩톤이 사용될 수 있다. 대두 펩톤의 분자량은 50 kD 미만, 바람직하게는 10 kD 미만일 수 있다. 350 달튼의 평균 분자량을 갖는 한외여과된 대두 펩톤의 첨가는 재조합 세포 주의 생산성에 특히 바람직한 것으로 밝혀졌다. 그것은 약 9.5 %의 총 질소 함량 및 약 13 % 또는 약 7-10 %의 자유 아미노산 함량을 갖는 대두 단리물이다.
특히 적절한 배지는 아래의 조성을 갖는다: 합성 최소 배지(예컨대, 50/50 DMEM/햄 F12) 1 내지 25 g/l; 대두 펩톤 0.5 내지 50 g/l; L-글루타민 0.05 내지 1 g/l; NaHCO3 0.1 내지 10 g/l; 아스코르브산 0.0005 내지 0.05 g/l; 에탄올아민 0.0005 내지 0.05; 및 소듐 셀레나이트 1 내지 15 μg/l. 임의로, 폴리프로필렌 글리콜(예컨대, 플루로닉 F-61, 플루로닉 F-68, 플루로닉 F-71 또는 플루로닉 F-108)과 같은 비이온성 표면 활성 시약이 소포제로 배지에 첨가될 수 있다. 표면 활성 시약의 첨가 없이는 떠오르고 터지는 기포가 기포의 표면에 있는 세포들을 손상시킬 수 있기 때문에, 통기("분사")의 악영향으로부터 세포를 보호하기 위해 일반적으로 이 시약이 적용된다.
비이온성 표면 활성 시약의 양은 0.05 내지 10 g/l, 바람직하게는 0.1 내지 5 g/l 범위일 수 있다. 또한, 배지는 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 또한 함유할 수 있다. 바람직하게, 혈청- 및 단백질-부재 배지는 세린 프로테아제 억제자와 같은 프로테아제 억제자를 함유하고, 이는 조직 배양에 적절하며 합성 또는 식물 기원일 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 아래의 아미노산 혼합물이 상기한 배지에 추가로 첨가된다: L-아스파라긴(0.001 내지 1 g/l; 바람직하게 0.01 내지 0.05 g/l; 특히 바람직하게 0.015 내지 0.03 g/l), L-시스테인(0.001 내지 1 g/l; 바람직하게 0.005 내지 0.05 g/l; 특히 바람직하게 0.01 내지 0.03 g/l), L-시스틴(0.001 내지 1 g/l; 바람직하게 0.01 내지 0.05 g/l; 특히 바람직하게 0.015 내지 0.03 g/l), L-프롤린(0.001 내지 1.5 g/l; 바람직하게 0.01 내지 0.07 g/l; 특히 바람직하게 0.02 내지 0.05 g/l), L-트립토판(0.001 내지 1 g/l; 바람직하게 0.01 내지 0.05 g/l; 특히 바람직하게 0.015 내지 0.03 g/l) 및 L-글루타민 (0.05 내지 10 g/l; 바람직하게 0.1 내지 1 g/l). 이들 아미노산은 배지에 개별적으로 또는 조합으로 첨가될 수 있다. 상기한 아미노산 전부를 함유하는 아미노산 혼합물의 합쳐진 첨가가 특히 바람직하다.
특정 실시예에서 혈청- 및 단백질-부재 배지가 상기한 아미노산 혼합물 및 정제, 한외여과된 대두 펩톤의 조합물을 추가로 함유하도록 사용되었다.
US 6 936 441의 배지는 CHO 세포의 배양에 특히 적절하나 다른 세포와도 사용될 수 있다.
추가의 적절한 배지는 US 2007/0212770(글리버거 등; 백스터 인터네셔널 인크., 백스터 헬스케어 에스.에이.(Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.))에 개시된 올리고펩티드 부재 배지이다.
바람직하게, 배양 배지는 통상적으로 중탄산 나트륨으로 제공되는 중탄산염 이온의 사용을 통해 완충된다.
적절하게, 배양 배지는 210 내지 650 mOsm, 바람직하게는 270 내지 450 mOsm, 더 바람직하게는 310 내지 350 mOsm 및 가장 바람직하게는 320 mOsm의 오스몰 농도를 갖는다. 바람직하게, 상청액의 오스몰 농도는 본 발명의 방법 전체에서 이들 범위 중 1 이상 내로 유지된다.
배양은 회분식, 유가식 또는 연속식과 같은 임의의 종래 유형의 배양일 수 있으나, 바람직하게는 유가식 또는 연속식이다. 적절한 연속 배양은 반복식 회분, 케모스텟, 터비도스텟 또는 관류 배양을 포함한다.
회분식 배양은 필요한 모든 영양분 및 세포와 함께 개시되며 완료될 때까지, 즉 영양분이 소진되거나 배양이 어떤 이유로 정지될 때까지 진행된다.
유가식 배양은 세포 및 영양소로 개시되나 그 후 세포의 성장을 제한하기 위해 조절된 방식으로 추가의 영양분이 공급되는 의미에서 회분식 공정이다. 유가식 방식은 통상적으로 생반응기 내의 높은 세포 밀도에 도달하기 위해 생공업적 공정에 사용된다. 공급 용액은 생반응기의 희석을 파하기 위해 통상적으로 고농축된다. 영양분의 조절된 첨가는 배양의 성장률에 직접적으로 영향을 주고 과잉대사(대사 부산물의 형성) 및 산소 제한(혐기생활)을 피하게 한다. 대부분의 경우 성장-제한 영양분은 고농축 포도당 시럽(예컨대 600-850 g/l)으로 배양에 공급되는 포도당이다.
유가식 공정에서 성장을 조절하는데 상이한 방식을 사용할 수 있다. 예컨대, 용존 산소압(DOT, pO2), 산소 섭취율(OUR), 포도당 농도, 락테이트 농도, pH 및 암모니아 농도 중 임의의 것을, 그 지표를 일정하게 유지시킴으로써 배양 성장을 감시 및 조절하는데 사용할 수 있다. 연속 배양에서, 영양분이 첨가되며, 통상적으로 바람직하지 않은 부산물을 제거하고 정상 상태를 유지하기 위해 배지가 추출된다. 적절한 연속 배양법은 반복식 회분 배양, 케모스텟, 터비도스텟 및 관류 배양이다.
CHO 세포는 예컨대 40 % 내지 60 %, 바람직하게는 약 50 %의 산소 농도 및 일당 2 내지 10 부피 교환의 관류율로 적절한 배지로 관류되는 교반 탱크 또는 공수 탱크 내에서 배양될 수 있다. 또한, 세포는 상기한 바람직한 pH 값, 10 % 내지 60 %(바람직하게는 약 20 %)의 산소 농도 및 0.25 내지 1.0, 바람직하게는 약 0.5의 희석률 D를 사용해 케모스텟법의 방식으로 배양할 수 있다.
연속 계대 배양으로도 알려진 반복식 회분 배양에서, 세포는 배양 배지 내에 위치되고 바람직한 세포 밀도로 성장한다. 쇠멸 단계 및 세포 죽음의 개시를 피하기 위해, 배양은 세포가 그들의 최대 농도에 도달하기 전 완전 성장 배지로 희석된다. 희석의 양 및 빈도는 다양하게 변화하며 세포 주의 성장 특성 및 배양 공정의 편리성에 의존한다. 공정은 필요한 횟수만큼 반복될 수 있으며 세포 및 배지가 계대 배양에서 버려지지 않는 한 배양의 부피는 각 희석이 수행되면서 단계적으로 증가할 것이다. 증가하는 부피는 용기 내의 희석을 허용하기에 충분한 크기의 반응기를 사용함으로써 또는 희석된 배양을 몇몇 용기로 나눔으로써 처리할 수 있다. 이 유형의 배양의 이론적 근거는 세포를 지수함수적으로 성장하는 상태로 유지하는 것이다. 연속 계대 배양은 배양의 부피가 항상 단계적으로 증가하고, 다수의 포집이 있을 수 있고, 세포가 계속 성장하며 공정이 원하는 만큼 계속될 수 있다는 점에서 특징지어진다.
케모스텟 및 터비도스텟법에서, 추출된 배지는 세포를 함유한다. 따라서, 세포 배양 용기 내에 남아있는 세포는 정상 상태를 유지하도록 성장해야 한다. 케모스텟법에서, 성장률은 통상적으로 희석률, 즉 새로운 배지가 첨가되는 속도를 조절함으로써 조절된다. 세포는 최대 성장률 아래로 배양되며, 이는 희석률을 제한함으로써 달성된다. 성장률은 통상적으로 높다. 반면, 터비도스텟법에서, 희석률은 세포가 pH 및 온도와 같은 주어진 작동 조건에서 달성할 수 있는 최대 성장률을 허용하도록 설정된다.
관류 배양에서, 대부분의 세포가 예컨대 추출된 배지가 이를 통과해 흐르는 멤브레인 위에 보유됨으로써 배양 용기 내에 보유되기 때문에 추출된 배지는 세포가 고갈되어 있다. 그러나, 통상적으로 그와 같은 멤브레인은 세포의 100 %를 보유하지는 않고 따라서 배지가 추출될 때 일부분이 제거된다. 그것은, 세포의 대다수가 배양 용기 내에 보유되므로 매우 높은 성장률로 관류 배양을 작동시키는 것에 중요하지 않을 수 있다.
연속 배양, 구체적으로 반복식 회분, 케모스텟 및 터비도스텟 배양은 통상적으로 높은 성장률에서 작동된다. 통상적인 실시에 따르면, 최대 부피 생산성을 얻으려는 노력에서, 성장률을 최대로 또는 최대에 가깝게 하려고 하는 것이 일반적이다. 부피 생산성은 시간 간격당 배양 부피당 단백질 양 또는 활성의 단위로 측정된다. 더 높은 세포 성장은 일당 생산되는 더 많은 배양 부피와 동일하며 따라서 통상적으로 더 높은 부피 생산성을 반영한다고 여겨진다. 본 발명인들은 뜻밖에 특정 실시예에서, 최대 부피 생산율이 최대 세포 성장률에서 얻어지지 않는다는 것을 발견했다. 예에서 기술한 바와 같이, 케모스텟 배양 내의 푸린 발현 CHO 세포 클론의 최대 성장률은 36.5 ℃의 온도에서 관찰되었으나, 최대 부피 생산성은 35.1 ℃에서 관찰되었다. 더 낮은 온도의 더 낮은 성장률에서 기인한, 얻어진 더 낮은 포집 부피에도 불구하고, 생산된 재조합 단백질의 양은 훨씬 더 많아서 더 낮은 온도의 배양이 전체적으로 더 생산적이었다.
적절하게, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 태양 중 임의의 것에서, 세포 배양 상청액은 최대 성장률이 관찰되는 온도보다 0.5 ℃ 이상, 바람직하게 1.0 ℃ 이상 더 낮은 온도로 설정된 온도에서 유지된다. 이 실시예에서, 배양은 연속 배양, 특히 반복식 회분, 케모스텟 또는 터비도스텟 배양인 것이 바람직하다.
CHO 및 BHK 세포와 같은 포유동물 세포는 일반적으로 현탁 배양으로 배양된다. 즉, 세포가 고체 지지체에 부착되기보다는 배지 내에 현탁된다. 대안으로서 세포는 담체 위에, 구체적으로 미세담체 위에 고정화될 수 있다. 시톨린(Cytoline)®, 시토포어(Cytopore)® 또는 시토덱스(Cytodex)®와 같은 다공성 담체가 특히 적절할 수 있다.
세포 배양 내에서 세포 밀도가 통상적으로 감시된다. 원칙적으로, 세포당 생산성이 유지된다는 조건 하에 높은 세포 밀도가 바람직하다고 여겨질 수 있으며, 이는 생반응기 부피당 더 높은 생산성을 불러와야 한다. 그러나, 세포 밀도를 증가시키는 것은 실제로는 세포에게 유해할 수 있으며 세포당 생산성이 감소한다. 따라서 세포 밀도를 감시할 필요가 있다. 현재까지, 포유동물 세포 배양 공정에서 이것은 배양의 샘플을 추출하고 현미경 아래에서 또는 샤페 시스템 게엠베하(Scharfe System GmbH, Reutlingen, Germany)에 의해 판매되는 캐시(CASY) TT 장치와 같은 세포 계수 장치를 사용해 그들을 분석함으로써 수행되었다. 우리는 생반응기 자체 내로(또는 배지 및 현탁된 세포가 이를 통해서 통과하고 그 후 생반응기로 돌아오는 루프 내로) 주입되는 적절한 탐침의 방법으로 세포 밀도를 분석하는 것이 바람직함을 밝혔다. 이와 같은 탐침은 에이버 인스트루먼츠(Aber Instruments)로부터 상업적으로 입수가능하다(예컨대 바이오매스 모니터(Biomass Monitor) 220, 210 220 또는 230). 비전도성 세포 멤브레인이 전하의 축적을 허용하므로 배양 내의 세포는 전기장의 영향 아래의 작은 축전기와 같이 기능 한다. 결과로 얻은 전기용량은 측정될 수 있다; 그것은 세포 유형에 의존하며 생육가능한 세포의 농도에 직접 비례한다. 10 내지 25 mm 지름의 탐침은 바이오매스에 고주파장을 적용하기 위해 두 개의 전극을, 및 분극된 세포의 결과적인 전기용량을 측정하기 위해 두 번째 쌍의 전극을 사용한다. 결과로 얻은 신호의 전자적 처리는 생육가능한 세포 농도의 정확한 측정치인 결과물을 생성한다. 시스템은 누출성 멤브레인을 가진 세포, 배지, 기포 및 찌꺼기에는 무감하다.
통상적으로, 세포 밀도는 1.0x106 내지 5.0x106 세포/ml, 적절하게 1.0x106 내지 3.5x106 세포/ml, 적절하게 1.4x106 내지 2.8x106 세포/ml, 바람직하게 1.6x106 내지 2.6x106 세포/ml, 가장 바람직하게 1.8x106 내지 2.4x106 세포/ml이다. 세포의 농도를 바람직한 범위의 높은 말단으로 증가시키는 것은 부피 생산성을 개선시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기한 지점의 값 중 임의의 것을 범위의 낮은 또는 높은 말단으로 포함하는 세포 밀도의 범위가 고려된다.
배양은 통상적으로 생반응기 내에서 수행되며, 이는 주로 1(일) 내지 10000(만) 리터 용량, 예컨대 5, 10, 50, 100, 1000, 2500, 5000 또는 8000 리터의 스텐레스강, 유리 또는 플라스틱 용기이다. 용기는 통상적으로 강성이나 특히 더 작은 부피를 위해 연질 플라스틱 백을 사용할 수 있다. 이들은 일반적으로 '1회용' 유형이다.
본 발명의 첫 번째 세 개의 태양 중 임의의 방법으로 생산되는 이종 또는 재조합 단백질은 바람직하게는 혈액 단백질이다. "혈액 단백질"은 정맥내 사용을 위해 가공된 단백질을 포함한 인간 또는 동물의 혈액 내에 존재하는 또는 존재할 수 있는 임의의 단백질을 포함한다. 적절한 혈액 단백질은 혈청 알부민, 응고 인자 I, II, III, V, VII, VIII, IX, X, Xl, XII 및 XIII, 푸린, 폰 빌레브란트 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 인터루킨, 인터페론, 메탈로프로테아제, 예컨대 ADAMTS 프로테아제(예컨대, ADAMTS-13), 면역 글로불린, 예컨대 IgG, IgM, IgA 또는 IgE 및 면역 글로불린 단편을 포함한다. 적절한 항체 또는 면역 글로불린 단편은 Fab유사 분자(문헌 [Better et al (1988) Science 240, 1041]); Fv 분자(문헌 [Skerra et al (1988) Science 240, 1038]); VH 및 VL 협력자 영역이 유연한 올리고펩티드를 통해 연결된 단일 사슬 Fv(ScFv) 분자(문헌 [Bird et al (1988) Science 242, 423]; 문헌 [Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879]) 및 단리된 V 영역을 포함하는 단일 영역 항체(dAbs)(문헌 [Ward et al (1989) Nature 341, 544])을 포함한다. 면역 글로불린 및 그들의 단편은 "인간화"될 수 있다. 즉, 결과로 얻은 항체가 설치류 모 항체의 항원 특이성을 보유하도록 설치류 기원의 가변 영역들을 인간 기원의 불변 영역과 융합시킬 수 있다(문헌 [Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855]).
바람직한 실시예에서, 인자 VIII를 임의로 폰 빌레브란트 인자(vWF)와 함께 생산하는데 세포 배양이 사용된다. vWF는 배양 배지에 별도로 첨가될 수 있고 바람직하게 재조합성이다. 대안으로서, vWF는 FVIII 분비 세포와 vWF 분비 세포를 배양 내에 포함시킴으로써 공-생산될 수 있다. 그러나, 바람직하게 FVIII 및 vWF는 공-발현된다, 즉 각 세포가 FVIII 및 vWF 둘 다를 분비한다. 재조합 vWF는 문헌 [Schlokat, et al. (1995), "Large Scale Production of Recombinant von Willebrand Factor", Thrombosis and Haemostasis 78, 1160] 또는 US 6 114 146(백스터 에이지)에서와 같이 얻을 수 있다. 후자의 특허는 vWF를 FVIII 분비 세포와 공-생산하는데 사용할 수 있는 세포도 개시한다. 두 단백질 모두를 공-발현하는 세포는 US 5 250 421(제네틱스 인스티튜트) 및 문헌 [Kaufman et al (1989) MoI. Cell. Biol. 9, 1233-1242])에 개시된다.
용어 인자 VIII는 여기서 응고 인자 VIII 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합물을 지칭하도록 사용된다. 활성화된 인자 VIII는 인지질 및 칼슘 이온 존재 하에 활성화된 인자 IXa에 의한 인자 X의 인자 Xa로의 전환에서 공인자로 기능 한다. 통상적으로, 활성 인자 VIII의 양은 적절한 분석에서 그것이 인자 X의 인자 Xa로의 전환을 촉진하는 정도로부터 추정될 수 있다. 통상적인 분석에서, 인자 Xa는 특이한 색원성 기질을 가수분해하고 그로써 발색단을 방출시키며 그 양을 분광광도적으로 측정한다. 상업적으로 입수가능한 분석 키트는 인자 VIII 크로모제닉 에세이 키트(Chromogenic Assay kit)(데이드 베링(Dade Behring, Switzerland); US 6,100,050); 및 코테스트 인자 VIII 키트(크로모제닉스(Chromogenix, Sweden))를 포함한다. 인간 내의 인자 VIII 농도는 1 IU/mL 혈액으로 정의된다. 코테스트 인자 VIII 키트는 0.01 IU/ml 혈액 이상에 해당하는 FVIII 활성을 측정할 수 있다. 상기 정의한 바와 같은 인자 VIII로 고려되려면, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합물은 원 인자 VIII와 동일한 나노몰 농도로 혈액 내에 존재할 시, 그것의 활성이 코테스트 인자 VIII 분석으로 검출될 수 있도록 원 인자 VIII 활성의 1 % 이상을 가져야 한다.
본 발명의 방법으로 생산하기에 적절한 FVIII는 원, 전체 길이 FVIII이다. 본 발명에 따라 돼지 FVIII를 생산할 수 있으나 FVIII는 더 바람직하게 인간의 것이다. 원 FVIII에 대한 대체물로서 변이체 및 유사체를 생산할 수 있다. 본 분야에 많은 수의, 예컨대 미국 특허 제5 422 260호, 제4 749 780호, 제4 868 112호, 제4 877 614호 및 제5 171 844호에 개시된 변이체 및 결손 유도체가 공지되어 있다. 용어 "재조합 인자 VIII의 결손 유도체"는 1 이상의 아미노산을 결손시킴으로써 전체 길이 인자 FVIII로부터 유도한, 인자 VIII 활성을 갖는 1 이상의 폴리펩티드 사슬로 정의된다. 바람직하게, 상기 결손 유도체는 대부분의 B-영역을 결여하나 일차적인 번역 생산물의 두 개의 폴리펩티드 사슬로의 생체 내 단백 분해 공정에 필수적인 B-영역의 아미노 말단 및 카르복시 말단 사슬의 부분을 보유한다. "r-VIII SQ"로 식별되는 이와 같은 인자 VIII 결손 유도체의 생산은 WO 91/09122에 개시된다. 용어 "r-VIII SQ"는 전체 길이 인자 VIII로부터 유도된 폴리펩티드 사슬로 정의되며 743에서 1636까지의 아미노산이 결여된다. B 영역 전부 또는 일부를 결여하는 추가의 FVIII 변이체는 US 6 358 703에 개시된다.
CHO 및 293S 세포를 형질전환하는데 적절한 벡터는 US 5 854 021에 개시된다. FVIII를 발현하는 BHK 세포는 문헌 [Wood et al(1984) Nature 312, 330-337]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있거나 배양 CRL-8544로서 ATCC로부터 얻을 수 있다. FVIII의 B-영역-결손된 변이체를 발현하는 CHO 세포는 문헌 [Lind et al (1995) Eur. J. Biochem. 232, 19-27] 및 US 5 661 008에 기술된다. 이와 같은 세 개의 세포 유형은 DSM 6415, DSM 6417 및 DSM 6416로 독일 생물 자원 은행(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 기탁 되었다.
FVIII 및 vWF가 공-생산되는 경우, 배지를 원심분리해 세포를 제거하고 그 후 결과로 얻은 액체를 복합물을 분리되게 하지 않을 조건 하에서, FVIII 또는 vWF에 특이적으로 결합할 펩티드 또는 FVIII 또는 vWF에 대한 항체를 함유하는 고정된 고체 지지체에 노출시킴으로써 그들 사이의 복합물을 정제할 수 있다. 적절한 방법은 US 6 307 032(백스터 에이지) 및 US 5 200 510(지모제네틱스(ZymoGenetics))에 교시된다.
그 후 (임의로 vWF와 복합된)FVIII를 제제화해 공지된 방법으로 사용할 수 있다. 예컨대, 동물 단백질 부재의 배양에서 생산된 FVIII는 예컨대 US 6 586 573(백스터 인터네셔널(Baxter International)), WO 94/07510 또는 US 6 599 724에 개시된 바와 같이 바람직하게 단백질 부재 조성물로 제제화되고 혈우병 A를 가진 환자를 치료하는데 사용된다.
본 발명의 방법이 FVIII를 생산하는데 사용되는 경우, 세포 배양 상청액이 36±0.9 ℃, 바람직하게는 36±0.5 ℃, 더 바람직하게는 36±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 36 ℃에 설정된 온도 및/또는 7.20±0.05, 바람직하게는 7.20±0.03, 더 바람직하게는 7.20±0.01 및 가장 바람직하게는 7.20에 설정된 pH로 유지되며/유지되거나; 세포 배양 상청액이 1 내지 10%, 바람직하게는 4.0 내지 9.0 %, 더 바람직하게는 5.5 내지 8.5 %의 용존 CO2 농도를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이들 지표 중 2 이상, 즉 온도 및 pH, 온도 및 dCO2 또는 pH 및 dCO2가 바람직한 한계 내이다. 가장 바람직하게, 세 지표 모두가 바람직한 한계 내에서 작동된다.
예에 도시된 바와 같이, 발명이 FVIII를 생산하기 위해 사용되는 경우, 세포 배양 상청액 내에 구리를 포함하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 세포는 4 ppb Cu2+를 포함하는 세포 배양 상청액 내에서 배양된다. 유리하게, 세포 배양 상청액 내의 Cu2+의 농도는 5 ppb 이상, 바람직하게는 7, 10, 15 또는 25 ppb 이상이다.
대체적인 바람직한 실시예에서, 세포 배양은 ADAMTS-13를 생산하기 위해 사용된다.
폰 빌레브란트 인자 절단 프로테아제(VWF-cp)로도 알려진 ADAMTS-13는 메탈로프로테아제 족의 일원이다. 그것은 VWF의 Tyr-842 및 Met-843 잔기 사이의 펩티드 결합을 절단함으로써 큰 VWF 다량체를 더 작은 형태로 대사하는 능력을 갖는다. 이 메탈로프로테아제는 Ca2_/Ba2으로 활성화되며 세린 또는 시스테인 프로테아제의 억제자로 억제되지 않는다. 부족한 폰 빌레브란트 인자(VWF) 분해는 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)과 관련되었다. 유전성 TTP에서, ADAMTS-13는 없거나 기능적으로 결함이 있는 반면 TTP의 가족성이 아닌, 후천적인 형에서는 대부분의 환자에서 ADAMTS-13 활성을 억제하는 자기 항체가 일시적으로 발견된다.
인간 ADAMTS-13 유전자의 클로닝 및 발현은 문헌 [Plaimauer et al, 2002, Blood. 15;100(10):3626-32]에 개시된다. cDNA의 완전한 서열과 함께, 인간 ADAMTS-13 유전자의 클로닝 및 발현 또한 US 2005/0266528 A 1 (램밀 등(Laemmle et al))에 기술된다. 본 발명의 방법에 의한 생산에 적절한 ADAMTS-13은 원, 전체 길이 ADAMTS-13, 바람직하게 인간 ADAMTS-13이다. 원 FVIII의 대안으로서, 변이체 및 유사체를 생산할 수 있다.
여기서 용어 ADAMTS-13은 ADAMTS-13 활성, 구체적으로 VWF의 Tyr-842 및 Met-843 잔기 사이의 펩티드 결합을 절단할 수 있는 능력을 가진 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합물을 지칭하기 위해 사용된다. 통상적으로, 활성 ADAMTS-13의 양은 변형된 폰 빌레브란트 인자 펩티드를 ADAMTS-13용 기질로 사용하는 기능적 분석과 같은 기능적 분석으로 측정할 수 있다(문헌 [Tripodi et al J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9): 1534-41]). r-hu ADAMTS13 활성을 측정하는 바람직한 방법은 문헌 [Gerritsen et al. Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389]에 개시된다. 이 분석에서, 1 U는 한데 모은 정상 인간 혈장 내의 ADAMTS-13 활성 수준에 해당한다. 상기한 바와 같은 ADAMTS-13으로 고려되려면, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합물은 원 ADAMTS-13 활성의 1 % 이상을 가져야 한다. ADAMTS-13의 양은 예컨대, 문헌 [Rieger et al, 2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212- 20]에 개시된 엘리사(ELISA)법을 사용해 ADAMTS-13 항원의 측정을 통해 결정될 수도 있다.
단백 분해적으로 활성인 재조합 ADAMTS-13는 상기 문헌 [Plaimauer et al, 2002] 및 US 2005/0266528 A1에 기술된 바와 같이 포유동물 세포 배양 내에서의 발현으로 제조할 수 있다. ADAMTS-13 발현 세포의 재조합 배양법은 문헌 [Plaimauer B, Scheiflinger F.Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):24-33]에 개시된다. ADAMTS-13 발현에 바람직한 세포 유형은 HEK-293 세포 및 CHO 세포를 포함한다.
US 2005/0266528 A1 및 문헌 [Zheng et al, 2001 , Blood, 98:1662-1666]은 ADAMTS-13를 정제하는 방법을 개시한다. 정제된 ADAMTS-13은 종래의 방법에 따라 제제화될 수 있고 예컨대 TTP를 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법이 ADAMTS-13를 생산하는데 사용되는 경우, 세포 배양 상청액이 36.0±0.9 ℃, 바람직하게는 36.0±0.5 ℃, 더 바람직하게는 36.0±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 36.0 ℃에 설정된 온도 및/또는 7.15±0.05, 바람직하게는 7.15±0.03, 더 바람직하게는 7.15±0.01 및 가장 바람직하게는 7.15에 설정된 pH로 유지되며/유지되거나; 세포 배양 상청액이 1 내지 10%, 바람직하게는 4.0 내지 9.0 %, 더 바람직하게는 5.5 내지 8.5 %의 용존 CO2 농도를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이들 지표 중 2 이상, 즉 온도 및 pH, 온도 및 dCO2 또는 pH 및 dCO2가 바람직한 한계 내이다. 가장 바람직하게, 세 지표 모두가 바람직한 한계 내에서 작동된다.
다른 바람직한 실시예예서, 푸린을 생산하기 위해 세포 배양을 사용한다.
PACE(짝지어진 염기성 아미노산 절단 효소)로도 지칭되는 푸린은 서브틸리신유사 세린 프로테아제의 군에 속하며, 프로단백질의 절단, 특히 분비성 합성에서 중요한 역할을 한다(문헌 [Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen., 4:115-136, 1993]). 그것은 몇몇 영역, 즉 신호 펩티드, 프로펩티드, 효소적 영역, 동종-B 또는 P-영역, C-말단에 위치한 시스테인-풍부 영역, 막통과 영역 및 세포질 꼬리로 구조적으로 배열되는 칼슘-의존성 세린 엔도프로테아제이다. 프로테아제 절단 부위는 아미노산 서열 Arg-X-Lys/Arg-Arg로 특징되는 인지 서열을 포함한다. 프로테아제 푸린은 이 공통 서열 뒤의 프로단백질을 특이적으로 절단한다(문헌 [Hosaka et al., 1991 , J. Biol. Chem. 266:12127-12130]).
무손상 푸린은 골지체 멤브레인 시스템 내로 혼입되고 거기서 그것은 기능적으로 활성이다(문헌 [Bresnahan et al, J Cell Biol. 1990;111 :2851-9]). 새롭게 합성된 푸린 전구체의 원형질 망상체로부터 골지 격실로의 전이에 의해, 프로펩티드는 두 단계 공정에 의해 자체촉매적으로 제거된다(문헌 [Anderson et al, EMBO J. 1997; 16: 1508-18]). 푸린은 또한 트랜스-골지 네트워크 및 세포 표면 사이를 엔도솜 소포를 통해 순환하며, 이로써 구조적인 분비 경로를 통한 그들의 이송 중 전구체 단백질과 흡수 경로에 들어가는 분자 둘 다를 가공한다. 가공 격실에 대한 푸린의 세포적 분산은 그것의 세포질 꼬리 내의 정의된 구조적 특징에 의해 지시받는다(문헌 [Teuchert et al, J Biol Chem. 1999;274:8199-07]).
원 푸린 프로테아제의 과발현은 연속적으로 성장하는 세포 배양의 성장에 악영향을 미치므로, 푸린의 세포에의 독성 영향을 줄이기 위한 해결책이 탐구되었다. C-말단 영역은 푸린의 기능적 활성을 위해 없어도 되는 것으로 밝혀졌으며 75-80 kD의 과-발현 원 푸린의 잘려진 형태는 분비된 단백질로서 세포 상청액 내에서 검출될 수 있다(문헌 [Wise et al, PNAS. 1990;87:9378-82]). 이 자연 분비된 잘려진 푸린은 "탈피 푸린(shed furin)"(문헌 [Vidricaire et al, Biochem Biophys Res Comm. 1993;195:1011-8; Plaimauer et al, Biochem J. 2001 ; 354:689-95])으로도 알려져 있으며 막통과 부분의 N-말단이 절단된다(문헌 [Vey et al, J Cell Biol. 1994; 127: 1829-42]).
막통과 및 세포질 영역의 암호화 부분이 삭제된 유전자 공학에 의해 잘려진 푸린 단백질은 예컨대 아미노산 Δ714-794(문헌 [Leduc et al, J Biol Chem. 1992;267: 14304-8; Molloy et al, J Biol Chem. 1992; 267: 16396-402]) 및 아미노산 Δ716-794("SoI-PACE", 문헌 [Wasley et al., J Biol Chem. 1993;268:8458-65]; 문헌 [Rehemtulla and Kaufman, Blood. 1992; 79:2349-55])에 대해 및 아미노산 Δ705-794(문헌 [Hatsuzawa et al, J Biol Chem. 1992 ;267: 16094-9])에 대해 기술되었다. 추가적으로 시스테인-풍부 영역의 결손을 포함하는 푸린 돌연변이도 기술되었다(문헌 [Hatsuzawa et al, J Biochem. 1992;101 :296-301]; 문헌 [Creemers et al, J Biol Chem. 1993;268:21826-34]).
WO 2008/141824(백스터 인터네셔널 인크,, 백스터 헬스케어 에스.에이)는 아미노산 578 내지 794, 즉 Δ578-794가 결여된 잘려진 인간 푸린을 개시한다.
여기서 용어 "푸린"은 푸린 단백분해 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합물을 지칭하도록 사용되었다.
푸린, 잘려진 푸린 또는 푸린 유도체의 단백분해 활성의 평가는 임의의 적절한 시험, 예컨대 푸린이 이에 대해 특이적인 2 염기성 절단 부위로 구성된 형광 기질을 사용함으로써 수행할 수 있다(문헌 [Schlokat et al, Biotechnol Appl Biochem. 1996;24:257-67]). 상기 분석에서 1 단위는 30 ℃에서 1분 동안 형광 기질 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC로부터 1 pmol의 7-아미노-4-메틸코마린(AMC)을 방출시킬 푸린의 양으로 정의된다. 이 시험에 대한 정량화의 한계는 통상적으로 0.625 U/mL이다. 대안으로서 단백분해 활성은 푸린을 프로-단백질, 예컨대 프로-rvWF와 함께 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 측정할 수도 있다. 프로-rvWF 가공도는 예컨대 웨스턴 블롯을 통해 분석할 수 있다. 푸린 항원의 양은 엘리사 시험으로 측정할 수 있다. 적절한 엘리사 시험은 생쥐 안티-인간 푸린이 포획 항체로 사용되고 바이오틴화된 염소 안티-인간 푸린이 검출 항체로 사용되는 R&D 시스템, MN(카탈로그 번호 DY1503)로부터 입수가능한 인간 푸린 듀오셋(DuoSet)이다.
본 발명의 방법에 의한 생산에 적절한 푸린은 원, 전체 길이 푸린, 바람직하게는 인간 푸린이다. 원 푸린에 대한 대체물로서, 상기한 것들을 포함한 변이체 및 유사체가 생산될 수 있다.
포유동물 세포, 특히 CHO 세포를 푸린 또는 푸린의 변이체로 형질전환시키는데 적절한 벡터는 WO 2008/141824(백스터 인터네셔널 인크,, 백스터 헬스케어 에스.에이)에 그와 같이 생산된 푸린을 정제하는 방법과 함께 개시된다. WO 91/06314(홀랜드 바이오테크놀로지(Holland Biotechnology))는 푸린 발현 벡터, 포유동물 세포, 구체적으로 COS-1 세포 내에서 푸린을 발현하는 방법 및 재조합적으로 생산된 푸린의 정제를 기술한다. WO 92/09698(제네틱스 인스티튜트 앤드 키론 코프(Genetics Institute and Chiron Corp))는 단독으로 또는 vWF 또는 인자 IX와 조합으로의 CHO 세포 내의 푸린 발현을 기술한다.
프로-rVWF는 내생적으로 생산된 푸린에 의해 세포 배양 중 그것의 성숙한 형태로 가공되며, 상기 푸린은 많은 세포 유형에서 비교적 낮은 수준으로 발현된다(문헌 [Wise et al, 1990, PNAS 87:9378-9382]). 프로-rVWF 가공은 이종 푸린을 프로-rVWF와 공발현시킴으로써 더 효과적이게 될 수 있다. 대안으로서, WO 2008/141824는 정제된 푸린이 rVWF의 가공을 촉진하는 시약으로 사용하기에 적절할 수 있음을 제안한다.
본 발명의 방법이 푸린을 생산하는데 사용되는 경우, 세포 배양 상청액이 35.1±0.9 ℃, 바람직하게는 35.1±0.5 ℃, 더 바람직하게는 35.1±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 35.1 ℃에 설정된 온도 및/또는 7.15±0.05, 바람직하게는 7.15±0.03, 더 바람직하게는 7.15±0.01 및 가장 바람직하게는 7.15에 설정된 pH로 유지되며/유지되거나; 세포 배양 상청액이 1 내지 10%, 바람직하게는 4.0 내지 9.0 %, 더 바람직하게는 5.5 내지 8.5 %의 용존 CO2 농도를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이들 지표 중 2 이상, 즉 온도 및 pH, 온도 및 dCO2 또는 pH 및 dCO2가 바람직한 한계 내이다. 가장 바람직하게, 세 지표 모두가 바람직한 한계 내에서 작동된다.
대체적인 바람직한 실시예에서, 인자 VII를 생산하기 위해 세포 배양을 사용할 수 있다.
"인자 VII 폴리펩티드"는 야생형 인자 VII(즉, 미국 출원 제4,784,950호에 개시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)와 야생형 인자 VII에 비해 실질적으로 개선된 또는 동일한 생물학적 활성을 보이는 인자 VII의 변이체 및 야생형 인자 VII에 비해 실질적으로 감소된 또는 변형된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII를 포함한다. 용어 "인자 VII"는 비절단(치모겐) 형태의 인자 VII 폴리펩티드와 인자 VIIa로 지칭될 수 있는 그들 각각의 생활성 형태를 생산하도록 단백분해적으로 가공된 것들을 포함하도록 의도된다. 통상적으로, 인자 VII는 잔기 152 및 153 사이에서 절단되어 인자 VIIa를 생산한다. 용어 "인자 VII 폴리펩티드"는 또한 변이체를 포함한 폴리펩티드를 포함하고, 변이체에서 인자 VIIa 생물학적 활성이 야생형 인자 VIIa의 활성에 비해 어느 정도 감소되거나 실질적으로 변형된다. 이들 폴리펩티드는 제한 없이, 내부로 폴리펩티드의 생활성을 변형 또는 파괴하는 특정한 아미노산 서열 대체물이 주입된 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다.
혈전 내의 인자 VIIa의 생물학적 활성은 그것의 (i) 조직 인자(TF)에 결합 및 (ii) 인자 IX 또는 인자 X의 단백분해성 절단을 촉매화하여 활성화된 인자 IX 또는 X(각각 인자 IXa 또는 Xa)를 생산하는 능력으로부터 유래된다. 인자 VII 폴리펩티드의 생물학적 활성("인자 VII 생물학적 활성")은 예컨대 미국 특허 제5,997,864호 또는 WO 92/15686에 기술된 바와 같이 인자 VII-결핍 혈장 및 트롬보플라스틴을 사용해 혈액 응고를 촉진하는 제제의 능력을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이 분석에서, 생물학적 활성은 대조 샘플에 대한 응고 시간의 감소로 표현되며 1 단위/mL 인자 VII 활성을 갖는 한데 모아진 인간 혈청 표준과 비교함으로써 "인자 VII 단위"로 전환된다. 대안으로서, (i) 인자 X 및 지질 멤브레인 내에 매립된 TF를 포함하는 시스템 내에서 인자 VIIa(또는 인자 VII 폴리펩티드)의 활성화된 인자 X(인자 Xa)를 생산하는 능력을 측정하고(문헌 [Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997]); (ii) 수성 시스템 내에서 인자 X 가수분해를 측정하고; (iii) 표면 플라즈몬 공명에 기초한 기구를 사용해 인자 VIIa(또는 인자 VII 폴리펩티드)의 TF에의 물리적 결합을 측정하고(문헌 [Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997]); (iv) 인자 VIIa(또는 인자 VII 폴리펩티드)에 의한 합성 기질의 시험관 내 가수분해를 측정하거나; 또는 (v) TF-독립적 시험관 내 시스템에서 트롬빈의 생성을 측정함으로써 인자 VIIa 생물학적 활성을 정량화할 수 있다. 대안으로서, FVII 항원을 엘리사를 통해 측정할 수 있다. 적절한 엘리사는 에세이 프로(Assay Pro(St Charles, MO)) 카탈로그 번호 EF1007-1로부터 입수가능한 에세이멕스(AssayMax) 인간 인자 VII(FVII) 엘리사 키트이며, 이는 단일클론 안티-인간 FVII를 포획 항체로 사용하고, 바이오틴화된 다중클론 안티-인간 FVII를 검출 항원으로 사용한다.
원(야생형) 인자 VIIa 및/또는 인자 VIIa 변이체에 바람직한 시험관 내 단백분해 분석은 US 2007/0219135(노보 노르디스크 헬스케어 엔지(Novo Nordisk HealthCare NG))에 기술된 바와 같이 미량역가판(멕시소르프(MaxiSorp, Nunc, Denmark)) 내에서 수행된다. 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2 및 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 pH 7.4, 50 mM 100 μL 헤페스(Hepes)에서 인자 VIIa(10 nM) 및 인자 X(0.8 μM)를 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA 및 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 pH 7.4, 50 mM 50 μL 헤페스의 첨가로 인자 X 절단을 중단시켰다. 최종 농도 0.5 mM의 색원성 기재 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로아닐리드(S-2765, 크로모제닉스(Chromogenix, Sweden))의 첨가로 생성된 인자 Xa의 양을 측정했다. 405 nm에서의 흡수도를 스펙트라멕스(SpectraMax)™ 340 기판 내에서 연속적으로 측정하였다. FVIIa를 함유하지 않는 블랭크 내에서의 흡수도의 감산 후 10 분 동안 나타난 흡수도는 변이체 및 야생형 인자 VIIa의 단백분해 활성 사이의 비를 계산하는데 사용될 수 있다:
비=(A405 nm 인자 VIIa 변이체)/(A405 nm 인자 VIIa 야생형)
이 분석의 변경에서, FVII가 측정된다. 트롬보플라스틴이 포함된다. 샘플 내의 FVII는 Ca2 + 이온 및 적은 양의 FXa를 생산하는 조직 인자와 복합물을 형성한다. FXa는 FVII를 FVIIa로 활성화시킨다.
상업적으로 입수가능한 FVII 활성 분석은 칼슘 트롬보플라스틴에 의해 유발되는 응고가 측정되는 아니아라(Aniara (Mason, OH)) 카탈로그 번호 ACK081K로부터 입수가능한 헤모클롯(HEMOCLOT) FVII 시약 키트이다.
야생형 인자 VIIa에 비해 개선된 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체는 상기한 바와 같은 응고 분석, 단백분해 분석 또는 TF 결합 분석 중 하나 이상에서 시험시 동일한 세포 유형에서 생산된 인자 VIIa의 약 25 % 이상, 바람직하게 약 50 % 이상, 더 바람직하게 약 75 % 이상 및 가장 바람직하게 약 90 % 이상의 비활성을 보이는 것들을 포함한다. 야생형 인자 VIIa에 비해 실질적으로 감소된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체는 상기한 바와 같은 응고 분석, 단백분해 분석 또는 TF 결합 분석 중 하나 이상에서 시험시 동일한 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 VIIa의 약 25 % 미만, 바람직하게 약 10 % 미만, 더 바람직하게 약 5 % 미만 및 가장 바람직하게 약 1 % 미만의 비활성을 보이는 것들이다. 야생형 인자 VII에 비해 실질적으로 변형된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체는 제한 없이, TF-독립적 인자 X 단백분해 활성을 보이는 인자 VII 변이체 및 TF에 결합하나 인자 X를 절단하지 않는 것들을 포함한다. 인자 VII의 변이체는 야생형 인자 VII보다 실질적으로 우수한 또는 동일한 생활성을 보이든 또는 대안으로서, 야생형 인자 VII에 비해 실질적으로 감소된 또는 변형된 생활성을 보이든, 제한 없이, 1 이상의 아미노산의 삽입, 결손 또는 치환으로 인해 야생형 인자 VII의 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
야생형 인자 VII와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체의 비제한적인 예는 S52A-FVIIa, S60A-FVIIa(문헌 [Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998]); 미국 특허 제5,580,560호에 개시된 바와 같은 증가된 단백분해 안정성을 보이는 인자 VIIa 변이체; 잔기 290 및 291 사이 또는 잔기 315 및 316 사이에서 단백분해적으로 절단된 인자 VIIa(문헌 [Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501 -505, 1995]); 인자 VIIa의 산화된 형태(문헌 [Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999]); PCT/DK02/00189에 개시된 바와 같은 인자 VII 변이체; 및 WO 02/38162(스크립스 리서치 인스티튜트(Scripps Research Institute))에 개시된 바와 같은 증가된 단백분해 안정성을 보이는 인자 VII 변이체; WO 99/20767(미네소타대학(University of Minnesota))에 개시된 바와 같은 변형된 Gla-영역을 갖고 강화된 멤브레인 결합을 보이는 인자 VII 변이체; 및 WO 01/58935 (멕시젠 에이피에스(Maxygen ApS))에 개시된 바와 같은 인자 VII 변이체를 포함한다.
야생형 인자 VIIa에 비해 증가된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII의 비제한적인 예는 WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162(스크립스 리서치 인스티튜트)에 개시된 바와 같은 인자 VII 변이체; 및 JP 2001061479(케모-세로-테라퓨틱 레스 인스트.(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.))에 개시된 바와 같은 강화된 활성을 갖는 인자 VIIa 변이체를 포함한다. 야생형 인자 VII에 비해 실질적으로 감소 또는 변형된 생물학적 활성을 갖는 인자 VII 변이체의 비제한적인 예는 Rl 52E-FVIIa(문헌 [Wild-goose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990]), S344A-FVIIa(문헌 [Kazama et al, J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995]), FFR-FVIIa(문헌 [Hoist et al, Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998]) 및 Gla 영역이 결여된 인자 VIIa(문헌 [Nicolaisen et al, FEBS Letts. 317:245-249, 1993])를 포함한다.
FVII 생산 후, 폴리펩티드는 배지로부터 정제될 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드의 정제는 예컨대, 안티-인자 VII 항체 칼럼 위의 친화 크로마토그래피(예컨대, 문헌 [Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261 :11097, 1986]; 및 문헌 [Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988] 참조) 및 인자 XIIa 또는 예컨대 인자 IXa, 칼리크레인, 인자 Xa 및 트롬빈과 같은 트립신유사 특이성을 갖는 다른 프로테아제를 사용한 단백분해성 절단에 의한 활성화를 수반할 수 있다. 예컨대 문헌 [Osteoid et al., Biochem. 11 :2853 (1972)]; 토마스(Thomas)의 미국 특허 제4,456,591호; 및 문헌 [Hedner et al., J. Clin. Invest. 71 :1836 ( 1983)] 참조. 대안으로서, 인자 VII를 모노 Q(Mono Q)®(파마시아(Pharmacia)) 등과 같은 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시킴으로써 인자 VII를 활성화시킬 수 있다.
인자 VII 또는 활성화된 인자 VII는 제제화될 수 있고 공지된 방법으로 사용될 수 있다. 예컨대, 그것은 혈우병의 출혈을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법이 인자 VII를 생산하는데 사용된 경우, 세포 배양 상청액이 36.5±0.9 ℃, 바람직하게는 36.5±0.5 ℃, 더 바람직하게는 36.5±0.2 ℃ 및 가장 바람직하게는 36.5 ℃에 설정된 온도 및/또는 7.20±0.05, 바람직하게는 7.20±0.03, 더 바람직하게는 7.29±0.01 및 가장 바람직하게는 7.29에 설정된 pH로 유지되며/유지되거나; 세포 배양 상청액이 1 내지 10%, 바람직하게는 4.0 내지 9.0 %, 더 바람직하게는 5.5 내지 8.5 %의 용존 CO2 농도를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이들 지표 중 2 이상, 즉 온도 및 pH, 온도 및 dCO2 또는 pH 및 dCO2가 바람직한 한계 내이다. 가장 바람직하게, 세 지표 모두가 바람직한 한계 내에서 작동된다.
본 발명은 아래 예에서, 거기에 제한됨이 없이 추가로 나타내질 것이다.
예 1: 기본 세포 배양
FVIII 생산
문헌 [Kaufman et al (1989) MoI. Cell. Biol. 9:1233-1242] 및 US 5 250 421에 기술된 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자를 공-발현하도록 형질전환된 10A1C6 CHO 세포 주의 서브클론을 사용해 생반응기 내에서 통상적인 배양을 형성한다. 동물-유래 생성물을 함유하지 않는 표준 배지에의 순응 및 미세기판 내에서의 서브클로닝에 의해 구체적인 서브클론을 얻었다.
표준 배양 배지는 다음과 같다:
Figure pat00001
기본 DMEM/햄 F12 50/50 배지는 완성된 배지가 4.3 ppb Cu2 +를 함유하기에 충분한 1.3 mg/kg Cu2 +를 함유한다.
ADAMTS -13 생산
인산칼슘 공침전법을 사용해 CHO DUKX-B11 세포를 형질감염시켜 ADAMTS-13 유전자를 도입시켰다. 네오마이신 선별 조건 하에서 세포를 배양했고 메토트렉세이트 및 G418 처리 후 선별했다. 혈청-부재 순응 이후, 세포를 서브클로닝시키고 서브클론 640-2를 생산 클론으로 선택했다.
표준 배양 배지는 US 2007/0212770(글리버거 등; 백스터 인터네셔널 인크., 백스터 헬스케어 에스.에이.)에 개시된 배지에 기초한 혈청-, 인슐린- 및 올리고펩티드-부재 배지였다.
푸린 생산
인산칼슘 공침전법을 사용해 CHO DUKX-B11 세포를 형질감염시켜 푸린 유전자를 도입시켰다. 히포크산틴, 티미딘 및 글리신이 없는 DHFR 배지로 세포를 선별했다. 100 nM 메토트렉세이트를 함유하는 배지 내에서 서브클로닝 및 선별하고 혈청-부재 순응시킴으로써 생산 클론 488-3을 확인했다.
표준 배양 배지는 US 2007/0212770(글리버거 등; 백스터 인터네셔널 인크., 백스터 헬스케어 에스.에이.)에 개시된 배지에 기초한 혈청-, 인슐린- 및 올리고펩티드-부재 배지였다.
FVII 생산
FVII 및 VKORC(비타민 K 에폭시드 환원효소 복합물)의 공발현을 허용하도록 바이시스트로닉 벡터로 CHO DUKX-B 11 세포를 형질감염시켰다. 유전자 발현은 CMV 촉진자로 구동되고 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 FVII 유전자 및 VKORC 유전자 사이에 위치한다. 인산 칼슘 공침전법을 사용해 세포를 형질감염시켰다. 선별 배지는 200μg/ml 하이글로마이신 B를 함유했다. 혈청-부재 조건 하에서 세포를 서브클로닝시켰고 고발현 서브 클론 1E9를 생산 클론으로 선택했다. 연속 배양 조건 하에서 성장, 생산성 및 안정성에 대해 바람직한 성질을 갖기 때문에 1E9가 선택되었다. 안정성은 케모스텟 방식으로 두 달의 기간 동안 평가되었다.
표준 배양 배지는 US 6,936,441(백스터 에이지)에 개시된 배양 배지에 기초하며 특히, 2.5 g/L 대두 펩톤 및 5 mg/L 인슐린(누셀린®;엘리 릴리 또는 노볼린(Novolin)®, 노보 노르디스크)을 함유한다.
FVIII 생산에 사용되는 표준 공정
5 L 연속 배양
37 ℃에서 CO2 인큐베이터(5-15 % CO2) 내에서 몇 시간 동안 배지를 사전-상태조절시킨다. 배지를 형성하기 위해 1 이상의 1 ml 바이알(107 CHO 세포/ml)을 서리제거시키고 세포를 루(Roux) 플라스크(200 ml) 내의 60 ml 사전-상태조절된 배지 내에 희석시키고 37 ℃에서 CO2 인큐베이터 내에서 배양한다. 약 3일 후, 60 ml 배양에 1 롤러 병(1.8 L) 내의 140 ml의 새로운 배지를 첨가한다. 롤러 병을 15 % CO2로 분사시키고 37 ℃에서 회전시키며 배양한다. 2일 후, 세포를 1/3로 나누고 새로운 배지(200 ml 배지 + 100 ml 배양 = 롤러 병당 300 ml) 내에서 2 롤러 병 내에서 배양한다. 추가로 2 또는 3일 후, 세포를 다시 1/3로 나누고 상기한 바와 같이 새로운 배지 내에서 총 6 롤러 병 내에서 배양한다. 대략 1x106 세포/ml의 바람직한 세포 밀도가 달성된 후, 상기한 바와 같이 사전상태조절된 3.2 L 배지 내에 1800 ml 종균을 접종시키고, 5 L 생반응기 내에서 배양한다. 표준 조건 하에서, 5 L 생반응기는 pH 7.2, 1.4x106 세포/ml의 세포 밀도 및 37 ℃의 온도에서 운전된다. 표준 조건 하에서, 배양을 0.25 VVH(시간당 배양 부피당 O2 부피)의 속도로 10 μm 기포 크기를 갖는 O2로 분사시킨다.
40 L 생반응기 내의 종균 축적
종균 풀은 본질적으로 5 L 연속 배양에 대해 상기한 바와 같이 얻어진다. 그러나, 풀은 대략 5 L이고 6 보다는 18 롤러 병으로부터 얻어진다. 작동 전 BR-40 생반응기를 세척하고 멸균시키며 접종전 대략 8 L의 배지를 BR-40로 이동시킨다. 대략 13 L의 총 배양 부피에 도달하도록 이동 선을 통해 대략 5 L의 접종 풀을 풀링 탱크로부터 생반응기로 이동시킨다. 세포 밀도가 ≥9x105 세포/mL에 도달한 후, 배양을 배지로 희석(1:3)시킨다. 추가의 1 내지 3일 후, 세포 농도는 다시 ≥9x105 세포/mL에 도달하고 320 L 생반응기로의 종균의 이동이 수행된다.
320 L 생반응기 내의 확장
작동 전 BR-320 생반응기를 세척하고 멸균시키며 접종전 대략 80 L의 배지를 BR-320로 이동시킨다. 대략 120 L의 초기 배양 부피에 도달하도록 이동 선을 통해 대략 40 L의 종균을 BR-40 생반응기로부터 BR-320 생반응기로 이동시킨다. 세포 밀도가 ≥9x105 세포/mL에 도달한 후, 배양을 배지로 희석(1:3)시킨다. 3 내지 6 일(총 시간) 후, 세포 농도는 다시 ≥9x105 세포/mL에 도달하고 2500 L 생반응기로의 종균의 이동이 수행된다.
2500 L 생반응기
축적
대략 950 L의 초기 배양 부피에 도달하도록 이미 대략 630 L의 배지를 함유하는 이동 선을 통해 대략 320 L의 종균을 BR-320으로부터 BR1 생반응기로 이동시킨다. 세포 밀도가 ≥9x105 세포/mL에 도달한 후, 대략 2500 L의 최종 부피로 배양을 배지로 희석(~1:3)시킨다. 4 내지 7일(총 시간) 후, 세포 농도는 다시 ≥9x105 세포/mL에 도달하고 BR1에서 대략 1350 L의 배지를 함유하는 BR2 생반응기로 대략 1150 L의 종균을 이동시킨다. 이동 후, 대략 1150 L의 배지를 생반응기 BR1에 첨가해 대략 2500 L의 최종 배양 부피에 도달했다.
케모스텟
각 6 개의 생반응기 내의 세포 농도가 ≥1.2x106 세포/mL에 도달하자마자 '케모스텟' 배양 방식을 개시한다. 각 생반응기 내로 1일당 대략 1250 L의 배지를 연속적으로 첨가한다. 세포 농도는 각 2500 L 생반응기 내에서 9x105 － 1.6x105 세포/ml 사이이다. 대략 1250 L/일/생반응기의 다수의 포획물은 2 － 8 ℃에서 멸균 백 내에 저장된다. 배양을 약 50-57일 동안 케모스텟 방식으로 유지한다. 표준 조건 하에서, pH는 7.2로 설정되고, 온도는 37 ℃로 설정되었으며 배양은 0.02 VVH(시간당 배양 부피당 O2 부피)의 속도로 10 μm 기포 크기를 갖는 O2로 분사된다.
유사한 배양 방법이 ADAMTS-13, 푸린 또는 FVII를 발현하는 CHO 세포의 배양에도 적용가능하다.
예 2: 다양한 지표의 변화의 FVIII 생산성에의 영향
예 1에 기술된 FVIII- 및 vWF-발현 CHO 세포 클론의 FVIII 생산성을 다양한 배양 조건 하에서 측정하였다.
별도의 실험에서, 5 L 규모 연속 배양 내에서 pH, 세포 밀도 및 온도를 변화시켰다. 각 경우에, 대조 실험은 pH 7.1, 1.4x106 세포/ml의 세포 밀도 및 37 ℃를 사용했다.
세포 밀도가 증가할 시, 1.2x106 세포/ml의 세포 밀도에 대한 값에 대한 부피 FVIII 생산성(일당 리터 당 IU)이 아래와 같이 증가하였다:
Figure pat00002
따라서, 세포 밀도를 증가시킴으로써 생산성의 상당한 증가를 달성할 수 있었다. 세포 밀도를 증가시키는 것이 세포당 생산성을 감소시킬 수 있기 때문에, 이는 예측될 수 없었다. 또한, 특정한 세포 밀도에서, 생산성의 증가가 세포 밀도의 증가보다 더 크다고 밝혀졌으며, 이는 더욱 놀랍다.
분사 지표를 변화시킴으로써 pH를 7.2로 증가시켰다. pH 7.1의 대조 용기에서, 0.25 VVH(시간당 배양 부피당 O2 부피)의 속도로 10 μm 기포 크기를 갖는 O2로 배양을 분사시켰다. pH 7.2의 실험 용기에서 1.25 VVH(시간당 배양 부피당 공기 부피)의 속도로 10 μm 기포 크기를 갖는 공기로 배양을 분사시켰다. pH를 7.1에서 7.2로 증가시킴으로써, 생산성을 약 16 % 증가시킬 수 있었다.
온도를 37 ℃에서 36 ℃로 감소시킴으로써, 생산성을 약 22 % 증가시켰다.
예 3: 세포 밀도 및 구리 농도의 FVIII 생산성에의 영향
예 1에 기술된 FVIII- 및 vWF-발현 CHO 세포 클론의 FVIII 생산성을 다양한 배양 조건 하에서 측정하였다.
대조 배지는 pH 7.1, 37 ℃, 4 ppb Cu2 + 및 1.4x106 세포/ml의 세포 밀도에서 작동되었다.
비교 배양은 pH 7.2 및 36 ℃에서 운전되었다. 일 배양에서 세포 밀도는 1.6x106 세포/ml로 증가하였고 다른 것에서 그것은 2.0x106 세포/ml로 증가하였다. 세 번째 배양에서, 세포 밀도는 2.0x106 세포/ml였고 구리 농도는 4 ppb에서 6 ppb로 증가하였다.
결과: 온도를 낮추고, pH를 증가시키고 세포 밀도를 1.6x106 세포/ml로 증가(14 % 증가)시킴으로써, FVIII 생산성은 41-50 % 증가했다. 2.0x106 세포/ml(43 %)로의 세포 밀도의 추가적 증가는 (대조 배양에 비해) 39-77 %의 생산성 증가를 제공했다. 2.0x106 세포/ml 배양 내의 구리가 6 ppb로 증가될 시, 생산성은 (대조 배양에 비해) 48-98 % 증가했다.
따라서, pH를 약간 증가시키고, 온도를 약간 감소시키고 세포 밀도를 단지 43 % 증가시키고 구리 밀도를 50 % 증가시킴으로써 FVIII 생산성이 거의 두 배가 될 수 있다.
예 4: 세포 밀도 및 구리 농도의 vWF 생산성에의 영향
예 3을 반복했으나 부피 vWF 생산성을 측정했다. 1.6x106 세포/ml 및 4 ppb 구리(36 ℃, pH7.2)에서, 생산성은 대조군의 124 %였다. 2.0x106 세포/ml 및 6 ppb 구리에서, 생산성은 182 %였다
따라서, 공정 지표에 겉으로 보기에 작은 변화를 줌으로써 생산성의 상당한 증가를 다시 달성할 수 있었다.
예 5: 세포 밀도, pH 및 dCO 2 의 영향
예 1에 기술된 FVIII- 및 vWF-발현 CHO 세포 클론의 FVIII 생산성을 다양한 배양 조건 하에서 측정하였다.
이 실험에서, 세포 밀도를 1.41x106 세포/ml에서 2.03x106 세포/ml로 증가시켰고, pH를 7.1에서 7.2로 증가시켰으며 dCO2 농도를 9.5 %에서 6.2 %로 감소시켰다.
부피 FVIII 생산성(일당 리터 당 IU)은 98 % 증가했고 비 FVIII 생산성(1일당 100만 세포당 IU)는 36 % 증가했다.
예 6: pH 및 온도의 푸린 생산에의 영향
케모스텟 방식으로 2.5 L 생반응기 내에서 푸린 발현 CHO 세포를 길렀다. 5 배양일 동안 개별적인 배양에 대해 세포 밀도를 1.52x106 내지 1.78x106 세포/ml의 평균으로 유지했다. 모든 실험에서 20 % 공기 포화의 설정 지점으로 용존 산소를 조절했다. 생반응기의 상부 빈공간을 CO2로 덮음으로써 용존 CO2 농도를 5 %-6 % 사이로 유지했다.
"실험 방법 설계"의 방법으로, 푸린의 최대 부피 생산성을 낳는 조건을 확인하기 위해 상이한 온도들을 상이한 pH 값들과 결합시켰다. "도럴트 매트릭스(Doehlert Matrix)"에 따라 다섯 개의 온도를 세 개의 pH 값들과 결합시켜 아래와 같은 온도 및 pH의 일곱 개의 조합을 얻었다:
Figure pat00003
Figure pat00004
36.5 ℃ 및 pH 7.20의 조합이 중앙값으로 선택되었으며, 이를 두 개의 발효 롯트(상기 표의 4 및 5)에 적용했다.
부피 및 비생산성 및 성장률을 포함한 자료를 "미니탭(Minitab)" 소프트웨어를 사용해 반응 표면 분석법(RSM)으로 통계적으로 분석하였다.
온도는 성장률에 상당히 영향을 주었으나 pH는 그렇지 않았고, 성장률의 최대는 36.5 ℃에서 일어났다. 온도를 37 ℃에서 35.1 ℃로 감소시킴으로써, 부피 생산성을 대략 2.7 배 증가시킬 수 있었다. 비생산성에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다. 최대 부피 생산성이 성장률이 최대인 온도에서 관찰될 것으로 예상될 수 있기 때문에 이것은 놀라운 결과이다. pH의 비 및 부피 생산성에의 영향은 7.20 +/- 0.1의 조사된 범위 내에서 미미했다. 7.15 +/-0.05(또는 7.10 내지 7.20)의 더 낮은 pH 범위에서 약간 더 높은 생산성이 관찰되었고, 따라서 pH 7.15를 푸린 생산의 설정 지점으로 선택하였다.
예 7: dCO 2 의 푸린 생산에의 영향
2.5 L 생반응기 내에서 케모스텟 방식으로 두 개 발효 작동을 동시에 수행하였고, 하나는 대략 7.5 %의 CO2 농도로 및 다른 하나는 대략 12 %의 CO2 농도로 작동시켰다. 상부 빈공간 흐름 내의 CO2 분율을 변화시킴으로써 CO2 농도를 조절하였다. 37 ℃에서, 7.15의 pH에서 및 20 %의 pO2로 발효를 수행하였다. 고 CO2 배양에서 12일 후 세포 수는 대략 1.07x106 세포/ml였고 저 CO2 배양 내에서는 1.49x106 세포/ml였다.
CO2 농도를 12 %에서 7.5 %로 감소시키는 것은 부피 생산성을 대략 2.78 배 및 비생산성을 2 배 증가시키는 효과를 가졌다. 세포 성장률 역시 저 CO2 배양에서 더 높았다.
예 8: pH 및 온도의 FVII 생산에의 영향
케모스텟 방식으로 2.5 L 생반응기 내에서 FVII 발현 CHO 세포를 길렀으며, 4주 배양 동안 개별적인 배양에 대해 세포 밀도를 약 2.5x106 세포/ml(2x106 내지 3x106 세포/ml)의 평균으로 유지했다. 모든 실험에서 20 % 공기 포화의 설정 지점으로 용존 산소를 조절했다. 생반응기의 상부 빈공간을 CO2로 덮음으로써 용존 CO2 농도를 4 %-7 % 사이로 유지했다.
"실험 방법 설계"의 방법으로, FVII의 최대 부피 생산성을 낳는 조건을 확인하기 위해 상이한 온도들을 상이한 pH 값들과 결합시켰다. "도럴트 매트릭스"에 따라 세 개의 온도를 세 개의 pH 값들과 결합시켜 아래와 같은 온도 및 pH의 다섯 개의 조합을 얻었다:
Figure pat00005
평균 최대 부피 운동성 생산성이 36.5 ℃ 및 7.20의 pH 설정 지점에서 얻어졌다. 두 지표 모두를 최적화한 결과가 각 지표를 개별적으로 최적화한 것의 합쳐진 효과보다 더 크도록 지표들의 양의 상호작용이 있었다.
예 9: dCO 2 의 FVII 생산에의 영향
작은 규모의 연속 배양에서 네 개의 상이한 CO2(5.0, 6.3, 7.6 및 8.9 %) 농도의 FVII 생산성에의 영향을 시험하였다.
케모스텟 8 일차까지 세포를 길렀고 그 후 2.5 L 러쉬톤 생반응기(Rushton Bioreactor) 내로 이동시켰으며 거의 4 주 동안 pH 7.20 및 36.5 ℃의 연속 조건 하에서 길렀다. 첫 주 동안의 상이한 CO2 농도에 대한 필수적인 평형화 때문에 마지막 3 주로부터의 자료만 분석했다. 오프라인 측정 및 생반응기의 상부 빈공간 내로의 CO2의 첨가를 통해 CO2 수준을 조절했다.
기록된 세포 밀도는 8.9 %의 CO2 수준에서 2.36x106 세포/ml 내지 5.0 %에서 2.87x106 세포/ml로 변했다. 동일한 범위에서의 성장률은 0.42 d-1 내지 0.49 d- 1이었다. 낮은 CO2에서의 증가된 비성장률은 증가된 비생산성과 관련된다. CO2의 성장률 및 비생산성에의 복합된 효과는 부피 생산성에의 실질적인 영향을 불러왔다.
8.9 %에서 5 %로의 CO2 농도의 감소는 비성장률을 17 %, 비생산성을 10 % 및 부피 운동성 생산성을 35 % 증가시켰다.
예 10: 온도 및 pH의 ADAMTS -13 생산에의 영향
재조합 ADAMTS-13를 발현하는 형질감염된 CHO 세포를 1.5 L 생반응기 내에서 케모스텟 내에서 길렀다.
첫 번째 실험에서, pH 및 온도를 36 ℃ 내지 38 ℃ 및 pH 7.10 내지 7.30 범위 내의 상이한 설정 지점으로 설정했다. 정상 상태로부터의 샘플을 엘리사로 세포 수 및 ADAMTS-13 발현에 대해 분석했고, 케모스텟 배양으로부터의 희석률을 측정하여 성장률 및 부피 ADAMTS-13 발현을 계산했다. 최적치가 설계 공간 밖의 범위에 있다고 밝혀지면, 35 ℃ 내지 37 ℃의 온도 범위 및 pH 7.05 내지 7.15로 두 번째 실험을 설정했으며 정상 상태로부터 자료를 분석했다. 세포 밀도는 1.17-1.71x106 세포/ml 범위였다. 4-6 %의 용존 CO2 농도를 달성하기 위해 상부 빈공간을 CO2로 덮어 CO2를 조절했다.
두 실험으로부터의 자료를 정규화하고 통계학적 소프트웨어 미니탭을 사용해 분석했다.
pH 및 온도에 대한 2차의 모델을 사용해 비성장률이 pH 7.13 및 36.0 ℃에서 그것의 최적치를 갖는 것을 밝혔다. 온도의 성장률에의 영향은 약했다.
부피 생산성은 pH 7.15 및 36.0 ℃에서 그것의 최적치를 갖는 것으로 밝혀졌다. 온도의 성장률에의 약한 영향에도 불구하고, 부피 생산성에는 비교적 강한 온도의 영향이 있었다.
37 ℃의 일정한 온도를 가정하면, pH를 7.10에서 7.15로 증가시키는 것의 영향은 부피 생산성을 10 % 증가시키는 것이었다. 7.10의 일정한 pH를 가정하면, 온도를 37 ℃에서 36 ℃로 감소시키는 것의 영향은 부피 생산성을 14 % 증가시키는 것이었다. pH 7.10 및 37 ℃의 온도에서 pH 7.15 및 36 ℃의 온도로 조건을 변화시키는 것의 전체적인 영향은 부피 생산성을 24 % 증가시키는 것이었다.
여기서 인용된 모든 참고문헌의 내용은 참조로 도입된다.

Claims (19)

  1. 세포 배양 상청액이 1 내지 10 %의 용존 CO2 농도를 갖고, 세포 배양이 1.4x106 내지 2.8x106 세포/ml의 밀도로 유지되는 연속 배양이고, 포유동물 세포는 CHO 세포인, 세포 배양 상청액 내의 이종 단백질-분비 포유동물 세포의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CO2 농도가 4.0 내지 9.0 %인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CO2 농도가 5.5 내지 8.5 %인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 온도가 37 ℃ 미만으로 설정된다는 조건 하에서, 상기 세포 배양 상청액이 X가 35.1 내지 36.5의 값을 갖는 X±0.9 ℃로 설정된 온도로 유지되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 온도가 36.0±0.9 ℃로 설정되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 온도가 35.1±0.9 ℃로 설정되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 7.10 초과로 설정된다는 조건 하에서, 상기 세포 배양 상청액이 X가 7.15 내지 7.20의 값을 갖는 X±0.05로 설정된 pH로 유지되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액이 중탄산염으로 완충되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상청액이 공기로 분사되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질이 혈액 단백질인, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질이 인자 VIII인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인자 VIII가 폰 빌레브란트 인자와 공-발현되는 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액 내의 Cu2+ 농도가 5 ppb 이상인, 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액 내의 Cu2+ 농도가 7 ppb 이상인, 방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액 내의 Cu2+ 농도가 10 ppb 이상인, 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액 내의 Cu2+ 농도가 15 ppb 이상인, 방법.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 상청액 내의 Cu2+ 농도가 25 ppb 이상인, 방법.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질이 ADAMTS-13, 푸린 또는 인자 VII인, 방법.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속 배양이 케모스텟 또는 터비도스텟 배양인, 방법.



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