NO175541B - Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator

Info

Publication number
NO175541B
NO175541B NO891995A NO891995A NO175541B NO 175541 B NO175541 B NO 175541B NO 891995 A NO891995 A NO 891995A NO 891995 A NO891995 A NO 891995A NO 175541 B NO175541 B NO 175541B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
tpa
medium
cells
chain
aminomethylbenzoic acid
Prior art date
Application number
NO891995A
Other languages
English (en)
Other versions
NO891995L (no
NO175541C (no
NO891995D0 (no
Inventor
Shoichiro Miyahara
Maki Suzuki
Atsunori Shindo
Nobumi Kusuhara
Nobuyoshi Makiguchi
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP12264488A external-priority patent/JP2648611B2/ja
Priority claimed from JP63316118A external-priority patent/JP2718726B2/ja
Application filed by Mitsui Toatsu Chemicals filed Critical Mitsui Toatsu Chemicals
Publication of NO891995D0 publication Critical patent/NO891995D0/no
Publication of NO891995L publication Critical patent/NO891995L/no
Publication of NO175541B publication Critical patent/NO175541B/no
Publication of NO175541C publication Critical patent/NO175541C/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456Plasminogen activators
    • C12N9/6459Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018Culture media for cell or tissue culture
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069Protein C activated (3.4.21.69)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype-plasminogenaktivator (heretter angitt som htPA) produsert av humane, normale celler.
tPA som produseres og utskilles av vaskulære endotel-iale celler og forskjellige vevceller, lyserer fibrinklumper, nemlig tromber. tPA er således effektiv som et trombolytisk middel.
tPA har to molekylære former, enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA. Trombolytisk aktivitet av dobbeltkjedet tPA er høyere enn den for enkeltkjedet tPA. Såkalt tPA er konvensjonelt blitt utviklet som bare den dobbeltkjedede form eller en blandet form av dobbeltkjedet og enkeltkjedet form.
Dobbeltkjedet tPA har høy fibrinolytisk aktivitet, og det er meget mulig at dobbeltkjedet tPA aktiverer plasminogen ikke i tromber hvor fibrinolytisk effekt er forventet, men i blodstrømmen, hvilket ofte forårsaker klinisk blødning (japansk offentliggjørelsesskrift 118717/1984).
På den annen side har enkeltkjedet tPA som betraktes å være en forløper for dobbeltkjedet tPA, en høy affinitet overfor fibrin og omdannes raskt til dobbeltkjedet tPA så snart den er bundet til fibrin.
Følgelig utviser enkeltkjedet tPA maksimal plasmino-genaktivitet ved levringsstedene.
Den trombolytiske aktivitet av enkeltkjedet tPA er således relativt lav og utvises ikke i blodstrømmen. For klinisk bruk er det følgelig et større behov for enkeltkjedet tPA enn for dobbeltkjedet tPA, og en effektiv metode for fremstilling av enkeltkjedet tPA er meget etterstrebet.
Ved fremstilling av enkeltkjedet tPA under anvendelse av celler foreligger det imidlertid et problem ved at proteolytiske enzymer inneholdt i mediet eller produsert av cellene (for det meste betraktet som å være plasmin eller trypsin), omdanner enkeltkjedet tPA til dobbeltkj edet tPA under produksjonsprosessene, hvilket interfererer med effektiv produksjon av enkeltkjedet tPA.
Relevante metoder kjent for å løse et slikt problem, er beskrevet i det etterfølgende.
Disse er en metode hvori dyrkning og etterfølgende trinn utføres i nærvær av aprotinin (Europa-patentpublika-sjon nr. 41766), en metode hvori trypsininhibitor fremkalt av soyabønner eller aprotinin, tilsettes i dyrkningsmediet for tPA-produserende celler (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 118717/1984), en metode hvori dyrkning eller produksjon ut-føres i et medium supplert med aprotinin eller benzamidin (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 19486/1986) og en metode hvori bare enkeltkjedet tPA fremstilles ved tilsetning av aprotinin eller 6-aminocapronsyre i en renseprosess (Biochem. Biophys. Acta 719(2), 318-328, 1982).
I det tilfelle hvor adhesive celler anvendes, er det i særdeleshet et vanskelig problem at cellene er adskilt fra veggen av en beholder eller overflaten av perler under dyrkningen. For å løse dette problem er fjerning av plasmin fra serumet og tilsetning av aprotinin blitt foreslått (Kaufman Molecular and Cellular Biology, 5_, s. 1750).
Imidlertid foreligger det mange vanskeligheter ved utøvelse av disse konvensjonelle metoder i industriell måle-stokk. Eksempelvis er aprotinin som må anvendes, relativt kostbart. Fjerning av plasmin fra serumet krever enn videre kompliserte prosesser.
Under forløpet av en grundig studie for å løse pro-blemer ved de ovenfor angitte kjente metoder for fremstilling av tPA har foreliggende oppfinnere funnet at ved tPA-produksjon av celler, i særdeleshet av adhesive celler, er det effektivt å tilsette p-aminomethylbenzosyrederivater til mediet for å aktivere produktiviteten av enkeltkjedet tPA og for å forhindre avskalling av cellene fra veggen av beholderen eller overflaten av perler.
Enn videre har foreliggende oppfinnere funnet at produktiviteten av enkeltkjedet tPA kan sterkt forbedres ved å øke det osmotiske trykk av mediet supplert med p-aminomethylbenzosyrederivater opptil 350 milliosmol eller mer/liter ved anvendelse av bicarbonation, og dette har ført til foreliggende oppfinnelse.
tPA-produksjon i henhold til foreliggende oppfinn-
else kan utføres enten parallelt med celleveksten eller ved tPA-produksjonsprosesser uavhengig av celleveksten.
Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype-plasminogenaktivator (htPA) under anvendelse av celler transformert med et plasmid inneholdende htPA-genet og med evne til å uttrykke htPA, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at human vevtype-plasminogenaktivatoren produseres parallelt med veksten av cellene i et cellekulturmedium supplert med IO"<4> til IO"<1> M av et p-aminomethylbenzosyrederivat.
Fremgangsmåten er enn videre kjennetegnet ved at cellene dyrkes på forhånd i et cellekulturmedium og inkuberes deretter i et medium for produksjon av human vevtype-plasminogenaktivator, hvilket medium er supplert med en alminnelig kjent human vevtype-plasminogenaktivator-fremkaller og et p-aminomethylbenzosyrederivat.
Enn videre er fremgangsmåten karakterisert ved at det osmotiske trykk av det ovenfor angitte cellekulturmedium eller tPA-produserende medium, begge supplert med et p-aminobenzo-syrederivat, økes opptil 350 milliosmol eller mer/liter ved anvendelse av bicarbonation for således sterkt å forbedre produktiviteten av enkeltkjedet tPA.
Ved tilsetning av de billige p-aminomethylbenzosyrederivater istedenfor det kostbare aprotinin, som vanlig-vis anvendes, til cellekulturmediet eller det tPA-produserende medium, kan produktiviteten av enkeltkjedet tPA forbedres, og avskalling av cellene fra veggene av en beholder eller overflaten av perlene kan forhindres. Pa grunn av den synergistiske effekt av bicarbonation og et p-aminomethylbenzosyrederivat tilsatt til mediet kan enn videre produktiviteten av enkeltkjedet tPA sterkt forbedres.
Eksempler på p-aminomethylbenzosyrederivater som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, innbefatter p-aminomethylbenzosyre, 3-methoxy-4-aminomethylbenzosyre, 3-ethoxy-4-aminomethylbenzosyre, 3-hydroxy-4-aminomethylbenzosyre, 3-fluor-4-aminomethylbenzosyre, 3-klor-4-aminomethylbenzosyre, 3-methyl-4-aminomethylbenzosyre og 2-amino-4-aminomethylbenzosyre. Disse p-aminomethylbenzosyrederivater anvendes også i form av esterforbindelser, metallforbindelser, eksempelvis alkalimetallsalter, eller saltene derav, f.eks. klorider.
Et eksempel på den tPA-produserende stamme som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er hT-382-cellelinje (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 126978/1987) som erholdes ved transformering av muse-C-127-celler med plasmidet konstru-
ert med innskudd av en del av det BPV-avledede plasmid omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for human vevtype-plasminogenaktivator avledet fra normale, humane celler, er bundet til en human-avledet metallothioneinpromoter, av en del av pBR322-plasmid og av en DNA-sekvens som er nødvendig for å stoppe transkripsjon.
Et annet eksempel på den tPA-produserende stamme er SV-21-M2,5 K7-cellelinje (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 126978/1987) som erholdes ved transformering av CHO- (kinesisk hamsterovarie) celler med plasmidet omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for human vevtype-plasminogenaktivator avledet fra normale, humane celler, er bundet til SV-40 tidlig-promoter og en DNA—sekvens som koder for dihydrofolatreduktase, og ytterligere ved utvelgelse av celler som bærer forsterkede gener på et medium supplert med methotrexat.
Selvsagt kan en hvilken som helst type av tPA-produserende celler, f. eks. de som produseres i kombinasjon med andre midler slik som ved mutasjon eller adaptasjon, eller de som omdannes av virus, også anvendes.
Et eksempel på cellekulturmediet anvendt ifølge oppfinnelsen er et basalmedium supplert med kalvefosterserum i en egnet mengde (0 til 10 %), og ytterligere substanser som er nødvendige for cellevekst, slik som overflateaktive midler, aminosyrer, sukkere og salter, om ønsket.
Det tPA-produserende medium er eksempelvis et basalmedium supplert med kalvefosterserum i en egnet mengde (0 til 10 %) og med tPA-fremkallende substanser slik som sink, kadmium og salter derav, i en konsentrasjon på 1 til 10 uM.
Basalmediet er et medium omfattende f.eks. aminosyrer, vitaminer og uorganiske salter. Eksempler på basalmediet innbefatter Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), 199 medium og Eagles minimale essensielle medium.
Ifølge foreliggende oppfinnelse tilsettes p-aminomethylbenzosyrederivatene til konsentrasjoner varierende fra IO"<4> til IO-<1> M, fortrinnsvis fra IO"<3> til IO-<2> M, og enten til et tPA-produserende medium eller alternativt til et cellekulturmedium i det tilfelle hvor et tPA-produserende medium ikke anvendes.
Ved således å ganske enkelt tilsette p-aminomethylbenzosyrederivatene til mediet kan avskalling av cellene fra veggen av en beholder eller overflaten av perler under dyrkningen forhindres, og produktiviteten av enkeltkjedet tPA kan forbedres uten noen komplisert prosedyre.
Ved enn videre å øke det osmotiske trykk av det ovenfor angitte cellekulturmedim eller det tPA-produserende medium, begge supplert med p-aminomethylbenzosyrederivater, opptil 350 milliosmol eller mer/liter under anvendelse av bicarbonation, kan avskalling av cellene forhindres, og betydelig forbedring i produktivitet av enkeltkjedet tPA kan oppnås.
Bicarbonation anvendt ifølge oppfinnelsen for å øke osmotisk trykk kan tilveiebringes som salter, f.eks. natriumbicarbonat (NaHC^), eller som carbondioxydgass.
Bicarbonation anvendes generelt i en slik mengde
at summen av det osmotiske trykk som tilskrives de tilførte uorganiske salter, aminosyrer, vitaminer og lignende, og det som tilskrives bicarbonationet, er 350 milliosmol eller mer/liter.
Når f.eks. det osmotiske trykk som tilskrives uorganiske salter, aminosyrer eller vitaminer er 280 milliosmol/ Liter, tilsettes bicarbonation for å tilveiebringe ytterligere 70 milliosmol eller mer/liter i osmotisk trykk til totalt 350 Tiilliosmol eller mer/liter.
For å regulere det osmotiske trykk av mediet som ovenfor angitt, tilsettes eksempelvis natriumbicarbonat (NaHC03) til en konsentrasjon på mer enn 3 g/liter, fortrinnsvis 3 til 10 g/liter til mediet.
Tilsetningsmåter og former for bicarbonation velges avhengig av de anvendte dyrkningsmetoder. Når eksempelvis en T-kolbe, en rulleflaske eller lignende anvendes, tilsettes fortrinnsvis natriumbicarbonat til mediet for å bevirke et osmotisk trykk av mediet på 350 til 500 milliosmol/liter.
Dyrkning av celler og produksjon av tPA utføres fortrinnsvis i en carbondioxydgassinkubator i enten lukket eller åpent system. Enn videre er carbondioxydgass oppløst i mediet under 5% carbondioxydgassatmosfære, maksimalt 0,001M som tilsvarer ca. 1 milliosmol/liter. Den totale innflytelse av atmosfærisk carbondioxydgass er således neglisjerbar i mediet i mediet ved pH 6,5 til 7,5, hvilket er det pH-område som anvendes i praksis for dyrkningen.
Når dyrkningen kan utføres i en roterende anord-ning eller en krukke, tilveiebringes bicarbonationet ved til-føring av natriumbicarbonat i mediet før dyrkning og samtidig med innblåsning av carbondioxyd i systemet for å opprettholde det totale osmotiske trykk i systemet ved 350 til 500 milliosmol/liter .
Enn videre kan p-aminomethylbenzosyrederivatene tilsettes til basalmediet under fremstillingen eller etter at mediet er blitt gjort hypertonisk med bicarbonation.
For celledyrkning er hvilke som helst kjente metoder anvendbare. Eksempelvis kan følgende metode anvendes.
En egnet mengde av celler inokuleres i et medium supplert med en tPA-fremkaller om ønsket, i en Roux-kolbe og inkuberes deretter ved en egnet temperatur i et egnet tidsrom i en carbondioxydgassinkubator for tPA-produksjon parallelt med cellevekst.
Alternativt inokuleres cellene i et medium i en Roux-kolbe og tillates å vokse ved en egnet temperatur i et egnet tidsrom i en carbondioxydgassinkubator. Når cellene har vokst til sammenløpning, erstattes mediet med et tPA-produserende medium, og inkuberingen fortsettes i carbondioxyd-gassinkubatoren ved en egnet temperatur i et egnet tidsrom for tPA-produksj on.
Når eksempelvis en 75 cm Roux-kolbe anvendes, inokuleres celler til en konsentrasjon på 0,5 til 2,0 x 10^/ml og inkuberes ved 37°C i 3 til 4 dager for vekst parallelt med tPA-produksjon.
Når alternativt en 75 cm<2> Roux-kolbe anvendes, inokuleres cellene til en konsentrasjon på 1 til 2 x 10^/ml og inkuberes ved 37°C i 3 til 4 dager for cellevekst. Mediet erstattes deretter med et tPA-produserende medium, og inkuberingen fortsettes ved 37°C i 1 til 3 dager for tPA-produksjon.
Eksempler
Foreliggende oppfinnelse illustreres nærmere i de etterfølgende eksempler:
Eksempel 1
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de fra den ovenfor angitte hT-382-stamme.
I 7 5 cm<2>Roux-kolber ble det anbrakt 20 ml hver av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% kalvefosterserum som var blitt varmeinaktivert, og 10 /uM sinkklorid. Til hvert medium ble det tilsatt aprotinin, p-aminomethylbenzosyre eller 3-methoxy-4-aminomethylbenzosyre i den spesifiserte mengde som er angitt i tabell 1. Hvert således fremstilte kulturmedium ble inokulert med de ovenfor angitte celler til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml.
Cellene ble inkubert ved 37°C i 4 dager. Når cellene var vokst til sammenløpning (ca. 10 x 10^ celler/ml),
ble konsentrasjonene av enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA i kulturen bestemt ved den analyse som er beskrevet i det etterfølgende. Resultatene er vist i tabell 1.
Analysemetoden for enkeltkjedet tPA og dobbeltkj edet tPA i kultur er som følger.
I ELlSA-metoden.
(1) Monoklonale antistoffer overfor enkeltkjedet tPA (PAM-1) og monoklonale antistoffer overfor enkeltkjedet tPA pluss dobbeltkjedet tPA (PAM-2) ble fortynnet med en beleg-ningsløsning til 10 mikrogram/ml, og 50 mikroliter hver av de
fortynnede løsninger ble anbrakt i brønnene av en ELISA-plate (96 brønner). Platen fikk stå i 2 timer ved romtemperatur, hvorpå væsken i brønnene ble kastet. (2) Hver av brønnene ble vasket med en vaskeløs-ning og ble deretter fylt med en blokkeringsløsning. Platen fikk stå i 30 minutter ved romtemperatur. 50 mikroliter hver av 1000 - 2000 ganger fortynnede prøveløsninger og standard-løsninger (0, 1, 2, 4 og 8 ng/ml) ble tilsatt til hver av brønnene, og platen fikk stå i 2 timer. (3) Hver av brønnene ble igjen vasket med vaske-løsningen hvorpå anti-tPA kanin-antistoff ble tilsatt til hver brønn. (4) Hver av brønnene ble igjen vasket med vaske-løsningen hvorpå 50 mikroliter av en 500 gangers fortynnet løsning av geite-anti-kanin-IgG og alkalisk fosfatasekonju-gat ble tilsatt til hver brønn. Platen fikk stå i 1 time. (5) Hver av brønnene ble igjen vasket med vaske-løsningen hvorpå 50 mikroliter av en substratløsning (p-nitrofenylfosfat, 0,6 mg-ml) ble tilsatt til hver brønn. Platen fikk stå i 30 minutter. (6) 50 mikroliter av en 3N NaOH-løsning ble tilsatt til hver av brønnene for å stoppe den enzymatiske reak-s j on. (7) Absorpsjon ved 405 nm ble avlest med en kommersi-elt tilgjengelig ELISA-leser. (8) En målelinje ble nedtegnet under anvendelse av avlesningene av standardene, og tPA-konsentrasjonene i prøvene ble bestemt. (9) Beregninger ble foretatt som følger. Enkeltkjedet tPA-innhold (mg/liter) = Måling for PAM-1 Dobbeltkjedet tPA-innhold (mg/liter) = Måling for PAM-2 -
måling for PAM-1
II. Kvalitativ analyse ved immunoblotting
(1) Hver av kulturløsningene ble behandlet i en prøveløsning for elektroforese med eller uten betamercapto-ethanol som reduserer proteiner i prøven. Elektroforesen
utføres i henhold til metoden ifølge Laemmli (1970).
(2) Etter elektroforesen overføres proteinet elek-trisk på et nitrocellulosefilter ved metoden ifølge Towbin et al. (1979). (3) Ikke-spesifikke proteinabsorberende seter mettes med kvegserumalbumin. (4) Nitrocellulosefilteret behandles med primære antistoffer, dvs. anti-tPA-antistoffer (f.eks. geite-avledede eller kanin-avledede, polyklonale antistoffer eller muse-avledede, monoklonale antistoffer) og tillates å reagere med tPA på nitrocellulosefilteret. (5) Sekundære antistoffer tillates å reagere med anti-tPA-antistoffer og deretter å reagere med alkalifosfatase-bundne antistoffer overfor de sekundære antistoffer. (6) Fargereaksjon utføres under anvendelse av bromklorindolylfosfat som et substrat for alkalifosfatase som er oppløst i en løsning inneholdende nitrobluetetrazorium for å påvise tPA eller dekomponerte fraksjoner eller aggregater derav på nitrocellulosefilteret.
Ved blotting med enkeltkjedet tPA erholdes et hovedbånd ved ca. 70 kd i både reduserte og ikke-reduserte prøver. Ved blotting med dobbeltkjedet tPA erholdes hoved-båndet ved ca. 70 kd lik det med enkeltkjedet tPA i den ikke-reduserte prøve, men bånd ved ca. 30 kd og ca. 40 kd erholdes i reduserte prøver, og båndet ved ca. 70 kd erholdes ikke. Båndene funnet ved ca. 70 kd, ca. 30 kd og ca. 40 kd ved immunoblotting av disse reduserte og ikke-reduserte prøver, sammenlignes for å kvalitativt bestemme graden av enkeltkjedet tPA i forhold til dobbeltkjedet tPA i prøvene.
Selv om immunoblottinganalyse er en kvalitativ måling, ble den anvendt for å bekrefte de kvantitative data som konvensjonelt ble erholdt ved ELISA.
Som klart vist i tabell 1, var avskalling av cellene i kulturen supplert med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat, relativt usignifikant, og enkeltkjedet tPA-produksjon ble forbedret.
Med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat i en konsentrasjon på 10 <4> M eller mer var effekten i særdeleshet sammenlignbar eller større enn den med aprotinin.
Eksempel 2
Cellelinjen anvendt i eksempel 1, ble anvendt. Cellene ble inokulert ved en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml i 20 ml hver av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert kalvefosterserum i 75 cm^ Roux-kolber.
Cellene ble inkubert ved 37°C i 4 dager. Når cellene var vokst til sammenflytning (ca. 10 x 10^ celler/ml), ble mediet kastet og deretter erstattet med 20 ml av det tPA-produserende medium med samme sammensetning som ovenfor beskrevet, bortsett fra at sinkklorid i en konsentrasjon på 10 /uM og respektive additiver vist i tabell 2, ble tilsatt. Inkuberingen ble fortsatt i carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 2 dager. Konsentrasjonene av enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA i kulturen ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 2.
Som klart vist i tabell 2, var avskalling av cellene i kulturen supplert med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat, relativt usignifikant, og enkeltkjedet tPA-produksjon var forbedret. Med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat i en konsentrasjon på 10-<4> M eller mer, overskred effekten den til aprotinin.
Eksempel 3
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av SV-21-M2,5 K7-cellelinjen som var erholdt ved transformering av CHO-(kinesiske hamsterovarie) celler med plasmidet omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for tPA, var bundet til SV-40 tidlig-promoter og en DNA-sekvens som koder for dihydrofolatreduktase, og ytterligere ved utvelgelse av de transformerte celler som bærer forsterkede gener på et medium supplert med methotrexat. tPA-produksjonen ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at sinkklorid ikke ble tilsatt til mediet. Resultatene er vist i tabell 3. Som det fremgår fra tabell 3, var avskalling av cellene relativt usignifikant, og enkeltkjedet tPA-produksjon var forbedret i alle tilfeller. Med p-aminomethylbenzosyre var effekten i særdeleshet bemerkelsesverdig.
Eksempel 4
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av hT-382-cellelinjen som var erholdt ved transformering av muse-C-127-celler med plasmidet konstruert med innskudd av en del av det BPV-avledede plasmid omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for tPA, var bundet til human-avledet metallothioneinpromoter, av en del av pBR322-plasmid og av en DNA-sekvens som var nødvendig for å stoppe transkripsjon.
I 75 cm<£> Roux-kolber ble 20 ml hver av DMEM-medium supplert med 10% varmeinaktivert kalvefosterserum og 10 /uM sinkklorid innført. Til hvert medium ble det tilsatt aprotinin (40 KIU/ml) eller p-aminomethylbenzosyre til en konsentrasjon på 10~<2>M og enn videre natriumbicarbonat i de spesifiserte mengder som vist i tabell 4. Hvert av de således fremstilte medier ble inokulert med de ovenfor angitte celler til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml.
Cellene ble inkubert i en 5% carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 4 dager. Når cellene hadde vokst til sammenflytning (ca. 10 x 10^ celler/ml), ble konsentrasjoner av enkeltkjedet tPA i de individuelle kulturer bestemt ved den ovenfor beskrevne metode. Resultatene er vist i tabell 4.
Målinger av osmotisk trykk ble foretatt under anvendelse av Simazu Osmometer etter prøvetagning for tPA-bestemmelse.
Som klart vist i tabell 4, ble når det osmotiske trykk av mediet overskred 300 milliosmol/liter, ikke bare enkeltkjedet tPA-produksjonsgrad øket, men også total tPA-produksjon forbedret. Enkeltkjedet tPA-produksjon ble kraftig-ere forbedret i mediet supplert med p-aminomethylbenzosyre enn i mediet supplert med aprotinin.
Eksempel 5
Cellene for tPA-produksjon var de av samme stamme som anvendt i eksempel 4. Cellene ble inokulert til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml i 20 ml hver av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert kalvefosterserum i 75 cm Roux-kolber.
Cellene ble inkubert i en 5% carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 4 dager. Når cellene var vokst til sammenflytning (10 x 10^ celler/ml), ble mediet kastet og deretter erstattet med 20 ml hver av mediet som hadde samme sammensetning som ovenfor beskrevet, bortsett fra at sinkklorid (10 /uM) og aprotinin (40 KIU/ml) og p-aminomethylbenzosyre (10 M) såvel som natriumbicarbonat ved de konsentrasjoner som er angitt i tabell 4, ble tilsatt. Cellene ble igjen inkubert i en carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 2 dager for tPA-produksjon. Konsentrasjonene av tPA i den individuelle kultur ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 5.
Som i eksempel 4, ble en bemerkelsesverdig forbedring i produktivitet av enkeltkjedet tPA observert i kulturen hvori p-aminomethylbenzosyre var tilsatt, og det osmotiske trykk var øket.
Eksempel 6
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av SV-21-M2,5 K7-cellelinjen som var erholdt ved transformering av CHO- (kinesiske hamsterovarie) celler med plasmidet omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for tPA, var bundet til SV-40 tidlig-promoter og en DNA-sekvens som koder for dihydrofolatreduktase, og deretter ved utvelgelse av celler som bærer forsterkede gener på et medium supplert med methotrexat.
tPA-produksjonen ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 4, bortsett fra at mediet ikke inneholdt sinkklorid. Resultatene er vist i tabell 6.
Bemerkelsesverdige effekter ble funnet ikke bare ved produktivitet av enkeltkjedet tPA, men også i graden av enkeltkjedet tPA.
Eksempel 7
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av samme stamme som anvendt i eksempel 4. Cellene (10^ celler) ble inokulert til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml i 1 liter hver av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert kalvefosterserum i 1 liters rullekolber (total kapasitet på 1,5 liter), hver utstyrt med omrøringsblader, pH-elektroder, DO-elektroder og et rør for blåsing av gass. De anvendte såceller var blitt dyrket på forhånd i det ovenfor angitte medium i en rulleflaske. Inkuberingen ble utført ved 37°C i 4 dager. Når cellekonsentrasjonen nådde 10^ celler/ml, ble det ovenfor angitte medium kastet og erstattet med hensyn til tPA-produksjon med 1 liter hver av DMEM supplert med 5% varme-inaktivert kalvefosterserum, aprotinin (40 KIU/ml) eller p-aminomethylbenzosyre (IO-<2> M) og sinkklorid (10 /uM).
For å opprettholde det osmotiske trykk i mediet som vist i tabell 7, ble 5% carbondioxydgass leilighetsvis blåst inn i kolben. pH ble justert med NaOH. Enn videre ble DO opprettholdt ved 1 PPM og temperaturen ved 37°C. Medieforand-ringer ble utført én gang pr. dag i 5 dager slik at tPA-fraksjoner ble gjenvunnet totalt fem ganger.
Som vist i tabell 7, ble lignende effekter som vist i eksempel 4, observert når det osmotiske trykk ble regulert ved blåsing av carbondioxydgass inn i mediet.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype-plasminogenaktivator (htPA) under anvendelse av celler transformert med et plasmid inneholdende htPA-genet og med evne til å uttrykke htPA, karakterisert ved at human vevtype-plasmino-genaktivatoren produseres parallelt med veksten av cellene i et cellekulturmedium supplert med IO"<4> til IO"<1> M av et p-aminomethylbenzosyrederivat.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene dyrkes på forhånd i et cellekulturmedium og inkuberes deretter i et medium for produksjon av human vevtype-plasminogenaktivator, hvilket medium er supplert med en alminnelig kjent human vevtype-plasminogenaktivator- fremkal ler og et p-aminomethylbenzosyrederivat.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bicarbonation tilsettes til angitte cellekulturmedium for å øke det osmotiske trykk av mediet til 350 milliosmol eller mer/liter.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bicarbonation tilsettes til angitte cellekulturmedium for å øke det osmotiske trykk av mediet til 350 milliosmol eller mer/liter.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at det som p-aminomethylbenzosyrederivat anvendes p-aminomethylbenzosyre.
NO891995A 1988-05-19 1989-05-18 Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator NO175541C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12264488A JP2648611B2 (ja) 1988-05-19 1988-05-19 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法
JP63316118A JP2718726B2 (ja) 1988-12-16 1988-12-16 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO891995D0 NO891995D0 (no) 1989-05-18
NO891995L NO891995L (no) 1989-11-20
NO175541B true NO175541B (no) 1994-07-18
NO175541C NO175541C (no) 1994-10-26

Family

ID=26459739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO891995A NO175541C (no) 1988-05-19 1989-05-18 Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5151359A (no)
EP (1) EP0342931B1 (no)
AT (1) ATE108825T1 (no)
AU (1) AU612837B2 (no)
CA (1) CA1334288C (no)
DE (1) DE68916857T2 (no)
DK (1) DK243589A (no)
FI (1) FI98123C (no)
NO (1) NO175541C (no)
NZ (1) NZ229187A (no)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5183754A (en) * 1988-10-04 1993-02-02 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Method for production of human tissue type plasminogen activator
EP0756003B1 (en) * 1994-02-18 1999-03-24 Teijin Limited Method of culturing animal cells
US5856179A (en) 1994-03-10 1999-01-05 Genentech, Inc. Polypeptide production in animal cell culture
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US5721121A (en) * 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US6656466B1 (en) 1995-06-06 2003-12-02 Genetech, Inc. Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
AU2002316230A1 (en) * 2001-06-13 2002-12-23 Genentech, Inc. Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells
US9879229B2 (en) 2011-03-14 2018-01-30 National Research Council Of Canada Method of viral production in cells

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3732146A (en) * 1970-12-22 1973-05-08 Behringwerke Ag Process for the isolation of native, highly purified plasminogen
JPS59196824A (ja) * 1983-04-21 1984-11-08 Kowa Co 吸着防止剤
FR2548211B1 (fr) * 1983-06-29 1985-10-18 Choay Sa Procede de production d'un activateur tissulaire du plasminogene et activateur obtenu par ce procede
US4554251A (en) * 1983-11-07 1985-11-19 The Ohio State University Research Foundation Process and medium for culturing ant venom gland cells
GB8334499D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Derivatives
US4724206A (en) * 1984-02-13 1988-02-09 Damon Biotech, Inc. Protein production using hypertonic media
DE3479814D1 (en) * 1984-06-05 1989-10-26 Asahi Chemical Ind Process for the preparation of a plasminogen activator
US4661453A (en) * 1984-06-19 1987-04-28 American Biogenetic Sciences, Inc. Production of tissue plasminogen activator factor
US4661469A (en) * 1984-08-08 1987-04-28 Survival Technology, Inc. t-PA composition capable of being absorbed into the blood stream and method of administration
JPS624233A (ja) * 1985-07-01 1987-01-10 Toyobo Co Ltd 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法
US4960702A (en) * 1985-09-06 1990-10-02 Codon Methods for recovery of tissue plasminogen activator
US5183754A (en) * 1988-10-04 1993-02-02 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Method for production of human tissue type plasminogen activator

Also Published As

Publication number Publication date
NO891995L (no) 1989-11-20
EP0342931A1 (en) 1989-11-23
ATE108825T1 (de) 1994-08-15
NO175541C (no) 1994-10-26
EP0342931B1 (en) 1994-07-20
DE68916857D1 (de) 1994-08-25
AU3489289A (en) 1989-11-23
NZ229187A (en) 1991-12-23
DE68916857T2 (de) 1994-11-10
NO891995D0 (no) 1989-05-18
AU612837B2 (en) 1991-07-18
FI892358A (fi) 1989-11-20
DK243589D0 (da) 1989-05-19
FI892358A0 (fi) 1989-05-17
FI98123B (fi) 1997-01-15
DK243589A (da) 1989-11-20
FI98123C (fi) 1997-04-25
US5151359A (en) 1992-09-29
CA1334288C (en) 1995-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6413746B1 (en) Production of proteins by cell culture
AU778046B2 (en) Cell culture process for glycoproteins
US3904480A (en) Enhanced production of plasminogen activator
NO169497B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en serumavhengig human cellelinje
US4190708A (en) Production of urokinase
WO1998024889A1 (en) Enzyme composition for tissue dissociation
EP0239292B1 (en) Production of proteins by cell culture
NO175541B (no) Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator
Shuman et al. Tissue plasminogen activator in cultured human trabecular meshwork cells. Predominance of enzyme over plasminogen activator inhibitor.
US4661453A (en) Production of tissue plasminogen activator factor
RU2096455C1 (ru) Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности
DK175411B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner
CA1335188C (en) Method for production of human tissue type plasminogen activator
EP0139447A2 (en) A process for preparing urokinase zymogen
EP0247674B1 (en) Plasminogen activator and thrombolytic composition
JP4004585B2 (ja) 新規コンドロイチン硫酸分解酵素
JP2648624B2 (ja) ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法
KR980009454A (ko) 바실러스속 균주 유래의 혈전용해효소
JP2825541B2 (ja) ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法
JPH01256385A (ja) 組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法
Spížek et al. The synthesis of β-galactosidase in Escherichia coli in the presence of Methionine analogues
JPH01291796A (ja) ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法
JPH01256384A (ja) 組織型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造法
JPH02273180A (ja) 2本鎖組織型プラスミノゲンアクチベータの製造法
JPH05252951A (ja) プロコラゲナーゼの製造方法