NO175541B - Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivatorInfo
- Publication number
- NO175541B NO175541B NO891995A NO891995A NO175541B NO 175541 B NO175541 B NO 175541B NO 891995 A NO891995 A NO 891995A NO 891995 A NO891995 A NO 891995A NO 175541 B NO175541 B NO 175541B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tpa
- medium
- cells
- chain
- aminomethylbenzoic acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 35
- QCTBMLYLENLHLA-UHFFFAOYSA-N aminomethylbenzoic acid Chemical class NCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 QCTBMLYLENLHLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229960003375 aminomethylbenzoic acid Drugs 0.000 claims description 15
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 15
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 15
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 14
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 14
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 14
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 7
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 7
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 7
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001046633 Homo sapiens Junctional adhesion molecule A Proteins 0.000 description 3
- 102100022304 Junctional adhesion molecule A Human genes 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- OXWDLXLTUXWUIN-UHFFFAOYSA-N 4-(azaniumylmethyl)-3-methoxybenzoate Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC=C1CN OXWDLXLTUXWUIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- -1 ester compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- YIZOGSDIGJZZJF-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-(aminomethyl)benzoic acid Chemical compound NCC1=CC=C(C(O)=O)C(N)=C1 YIZOGSDIGJZZJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPWXETNWKBXANU-UHFFFAOYSA-N 4-(aminomethyl)-3-chlorobenzoic acid Chemical compound NCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1Cl WPWXETNWKBXANU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSDOQTSAGDHFHV-UHFFFAOYSA-N 4-(aminomethyl)-3-ethoxybenzoic acid Chemical compound CCOC1=CC(C(O)=O)=CC=C1CN PSDOQTSAGDHFHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNLOESNUVYZAPR-UHFFFAOYSA-N 4-(aminomethyl)-3-fluorobenzoic acid Chemical compound NCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1F DNLOESNUVYZAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PULJAVKYVDOTDQ-UHFFFAOYSA-N 4-(aminomethyl)-3-hydroxybenzoic acid Chemical compound NCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1O PULJAVKYVDOTDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGZUHCPDFVCBCB-UHFFFAOYSA-N 4-(aminomethyl)-3-methylbenzoic acid Chemical compound CC1=CC(C(O)=O)=CC=C1CN VGZUHCPDFVCBCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical class NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N bromo chloro 1h-indol-2-yl phosphate Chemical compound C1=CC=C2NC(OP(=O)(OBr)OCl)=CC2=C1 XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype-plasminogenaktivator (heretter angitt som htPA) produsert av humane, normale celler.
tPA som produseres og utskilles av vaskulære endotel-iale celler og forskjellige vevceller, lyserer fibrinklumper, nemlig tromber. tPA er således effektiv som et trombolytisk middel.
tPA har to molekylære former, enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA. Trombolytisk aktivitet av dobbeltkjedet tPA er høyere enn den for enkeltkjedet tPA. Såkalt tPA er konvensjonelt blitt utviklet som bare den dobbeltkjedede form eller en blandet form av dobbeltkjedet og enkeltkjedet form.
Dobbeltkjedet tPA har høy fibrinolytisk aktivitet, og det er meget mulig at dobbeltkjedet tPA aktiverer plasminogen ikke i tromber hvor fibrinolytisk effekt er forventet, men i blodstrømmen, hvilket ofte forårsaker klinisk blødning (japansk offentliggjørelsesskrift 118717/1984).
På den annen side har enkeltkjedet tPA som betraktes å være en forløper for dobbeltkjedet tPA, en høy affinitet overfor fibrin og omdannes raskt til dobbeltkjedet tPA så snart den er bundet til fibrin.
Følgelig utviser enkeltkjedet tPA maksimal plasmino-genaktivitet ved levringsstedene.
Den trombolytiske aktivitet av enkeltkjedet tPA er således relativt lav og utvises ikke i blodstrømmen. For klinisk bruk er det følgelig et større behov for enkeltkjedet tPA enn for dobbeltkjedet tPA, og en effektiv metode for fremstilling av enkeltkjedet tPA er meget etterstrebet.
Ved fremstilling av enkeltkjedet tPA under anvendelse av celler foreligger det imidlertid et problem ved at proteolytiske enzymer inneholdt i mediet eller produsert av cellene (for det meste betraktet som å være plasmin eller trypsin), omdanner enkeltkjedet tPA til dobbeltkj edet tPA under produksjonsprosessene, hvilket interfererer med effektiv produksjon av enkeltkjedet tPA.
Relevante metoder kjent for å løse et slikt problem, er beskrevet i det etterfølgende.
Disse er en metode hvori dyrkning og etterfølgende trinn utføres i nærvær av aprotinin (Europa-patentpublika-sjon nr. 41766), en metode hvori trypsininhibitor fremkalt av soyabønner eller aprotinin, tilsettes i dyrkningsmediet for tPA-produserende celler (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 118717/1984), en metode hvori dyrkning eller produksjon ut-føres i et medium supplert med aprotinin eller benzamidin (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 19486/1986) og en metode hvori bare enkeltkjedet tPA fremstilles ved tilsetning av aprotinin eller 6-aminocapronsyre i en renseprosess (Biochem. Biophys. Acta 719(2), 318-328, 1982).
I det tilfelle hvor adhesive celler anvendes, er det i særdeleshet et vanskelig problem at cellene er adskilt fra veggen av en beholder eller overflaten av perler under dyrkningen. For å løse dette problem er fjerning av plasmin fra serumet og tilsetning av aprotinin blitt foreslått (Kaufman Molecular and Cellular Biology, 5_, s. 1750).
Imidlertid foreligger det mange vanskeligheter ved utøvelse av disse konvensjonelle metoder i industriell måle-stokk. Eksempelvis er aprotinin som må anvendes, relativt kostbart. Fjerning av plasmin fra serumet krever enn videre kompliserte prosesser.
Under forløpet av en grundig studie for å løse pro-blemer ved de ovenfor angitte kjente metoder for fremstilling av tPA har foreliggende oppfinnere funnet at ved tPA-produksjon av celler, i særdeleshet av adhesive celler, er det effektivt å tilsette p-aminomethylbenzosyrederivater til mediet for å aktivere produktiviteten av enkeltkjedet tPA og for å forhindre avskalling av cellene fra veggen av beholderen eller overflaten av perler.
Enn videre har foreliggende oppfinnere funnet at produktiviteten av enkeltkjedet tPA kan sterkt forbedres ved å øke det osmotiske trykk av mediet supplert med p-aminomethylbenzosyrederivater opptil 350 milliosmol eller mer/liter ved anvendelse av bicarbonation, og dette har ført til foreliggende oppfinnelse.
tPA-produksjon i henhold til foreliggende oppfinn-
else kan utføres enten parallelt med celleveksten eller ved tPA-produksjonsprosesser uavhengig av celleveksten.
Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype-plasminogenaktivator (htPA) under anvendelse av celler transformert med et plasmid inneholdende htPA-genet og med evne til å uttrykke htPA, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at human vevtype-plasminogenaktivatoren produseres parallelt med veksten av cellene i et cellekulturmedium supplert med IO"<4> til IO"<1> M av et p-aminomethylbenzosyrederivat.
Fremgangsmåten er enn videre kjennetegnet ved at cellene dyrkes på forhånd i et cellekulturmedium og inkuberes deretter i et medium for produksjon av human vevtype-plasminogenaktivator, hvilket medium er supplert med en alminnelig kjent human vevtype-plasminogenaktivator-fremkaller og et p-aminomethylbenzosyrederivat.
Enn videre er fremgangsmåten karakterisert ved at det osmotiske trykk av det ovenfor angitte cellekulturmedium eller tPA-produserende medium, begge supplert med et p-aminobenzo-syrederivat, økes opptil 350 milliosmol eller mer/liter ved anvendelse av bicarbonation for således sterkt å forbedre produktiviteten av enkeltkjedet tPA.
Ved tilsetning av de billige p-aminomethylbenzosyrederivater istedenfor det kostbare aprotinin, som vanlig-vis anvendes, til cellekulturmediet eller det tPA-produserende medium, kan produktiviteten av enkeltkjedet tPA forbedres, og avskalling av cellene fra veggene av en beholder eller overflaten av perlene kan forhindres. Pa grunn av den synergistiske effekt av bicarbonation og et p-aminomethylbenzosyrederivat tilsatt til mediet kan enn videre produktiviteten av enkeltkjedet tPA sterkt forbedres.
Eksempler på p-aminomethylbenzosyrederivater som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, innbefatter p-aminomethylbenzosyre, 3-methoxy-4-aminomethylbenzosyre, 3-ethoxy-4-aminomethylbenzosyre, 3-hydroxy-4-aminomethylbenzosyre, 3-fluor-4-aminomethylbenzosyre, 3-klor-4-aminomethylbenzosyre, 3-methyl-4-aminomethylbenzosyre og 2-amino-4-aminomethylbenzosyre. Disse p-aminomethylbenzosyrederivater anvendes også i form av esterforbindelser, metallforbindelser, eksempelvis alkalimetallsalter, eller saltene derav, f.eks. klorider.
Et eksempel på den tPA-produserende stamme som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er hT-382-cellelinje (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 126978/1987) som erholdes ved transformering av muse-C-127-celler med plasmidet konstru-
ert med innskudd av en del av det BPV-avledede plasmid omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for human vevtype-plasminogenaktivator avledet fra normale, humane celler, er bundet til en human-avledet metallothioneinpromoter, av en del av pBR322-plasmid og av en DNA-sekvens som er nødvendig for å stoppe transkripsjon.
Et annet eksempel på den tPA-produserende stamme er SV-21-M2,5 K7-cellelinje (japansk offentliggjørelsesskrift nr. 126978/1987) som erholdes ved transformering av CHO- (kinesisk hamsterovarie) celler med plasmidet omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for human vevtype-plasminogenaktivator avledet fra normale, humane celler, er bundet til SV-40 tidlig-promoter og en DNA—sekvens som koder for dihydrofolatreduktase, og ytterligere ved utvelgelse av celler som bærer forsterkede gener på et medium supplert med methotrexat.
Selvsagt kan en hvilken som helst type av tPA-produserende celler, f. eks. de som produseres i kombinasjon med andre midler slik som ved mutasjon eller adaptasjon, eller de som omdannes av virus, også anvendes.
Et eksempel på cellekulturmediet anvendt ifølge oppfinnelsen er et basalmedium supplert med kalvefosterserum i en egnet mengde (0 til 10 %), og ytterligere substanser som er nødvendige for cellevekst, slik som overflateaktive midler, aminosyrer, sukkere og salter, om ønsket.
Det tPA-produserende medium er eksempelvis et basalmedium supplert med kalvefosterserum i en egnet mengde (0 til 10 %) og med tPA-fremkallende substanser slik som sink, kadmium og salter derav, i en konsentrasjon på 1 til 10 uM.
Basalmediet er et medium omfattende f.eks. aminosyrer, vitaminer og uorganiske salter. Eksempler på basalmediet innbefatter Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), 199 medium og Eagles minimale essensielle medium.
Ifølge foreliggende oppfinnelse tilsettes p-aminomethylbenzosyrederivatene til konsentrasjoner varierende fra IO"<4> til IO-<1> M, fortrinnsvis fra IO"<3> til IO-<2> M, og enten til et tPA-produserende medium eller alternativt til et cellekulturmedium i det tilfelle hvor et tPA-produserende medium ikke anvendes.
Ved således å ganske enkelt tilsette p-aminomethylbenzosyrederivatene til mediet kan avskalling av cellene fra veggen av en beholder eller overflaten av perler under dyrkningen forhindres, og produktiviteten av enkeltkjedet tPA kan forbedres uten noen komplisert prosedyre.
Ved enn videre å øke det osmotiske trykk av det ovenfor angitte cellekulturmedim eller det tPA-produserende medium, begge supplert med p-aminomethylbenzosyrederivater, opptil 350 milliosmol eller mer/liter under anvendelse av bicarbonation, kan avskalling av cellene forhindres, og betydelig forbedring i produktivitet av enkeltkjedet tPA kan oppnås.
Bicarbonation anvendt ifølge oppfinnelsen for å øke osmotisk trykk kan tilveiebringes som salter, f.eks. natriumbicarbonat (NaHC^), eller som carbondioxydgass.
Bicarbonation anvendes generelt i en slik mengde
at summen av det osmotiske trykk som tilskrives de tilførte uorganiske salter, aminosyrer, vitaminer og lignende, og det som tilskrives bicarbonationet, er 350 milliosmol eller mer/liter.
Når f.eks. det osmotiske trykk som tilskrives uorganiske salter, aminosyrer eller vitaminer er 280 milliosmol/ Liter, tilsettes bicarbonation for å tilveiebringe ytterligere 70 milliosmol eller mer/liter i osmotisk trykk til totalt 350 Tiilliosmol eller mer/liter.
For å regulere det osmotiske trykk av mediet som ovenfor angitt, tilsettes eksempelvis natriumbicarbonat (NaHC03) til en konsentrasjon på mer enn 3 g/liter, fortrinnsvis 3 til 10 g/liter til mediet.
Tilsetningsmåter og former for bicarbonation velges avhengig av de anvendte dyrkningsmetoder. Når eksempelvis en T-kolbe, en rulleflaske eller lignende anvendes, tilsettes fortrinnsvis natriumbicarbonat til mediet for å bevirke et osmotisk trykk av mediet på 350 til 500 milliosmol/liter.
Dyrkning av celler og produksjon av tPA utføres fortrinnsvis i en carbondioxydgassinkubator i enten lukket eller åpent system. Enn videre er carbondioxydgass oppløst i mediet under 5% carbondioxydgassatmosfære, maksimalt 0,001M som tilsvarer ca. 1 milliosmol/liter. Den totale innflytelse av atmosfærisk carbondioxydgass er således neglisjerbar i mediet i mediet ved pH 6,5 til 7,5, hvilket er det pH-område som anvendes i praksis for dyrkningen.
Når dyrkningen kan utføres i en roterende anord-ning eller en krukke, tilveiebringes bicarbonationet ved til-føring av natriumbicarbonat i mediet før dyrkning og samtidig med innblåsning av carbondioxyd i systemet for å opprettholde det totale osmotiske trykk i systemet ved 350 til 500 milliosmol/liter .
Enn videre kan p-aminomethylbenzosyrederivatene tilsettes til basalmediet under fremstillingen eller etter at mediet er blitt gjort hypertonisk med bicarbonation.
For celledyrkning er hvilke som helst kjente metoder anvendbare. Eksempelvis kan følgende metode anvendes.
En egnet mengde av celler inokuleres i et medium supplert med en tPA-fremkaller om ønsket, i en Roux-kolbe og inkuberes deretter ved en egnet temperatur i et egnet tidsrom i en carbondioxydgassinkubator for tPA-produksjon parallelt med cellevekst.
Alternativt inokuleres cellene i et medium i en Roux-kolbe og tillates å vokse ved en egnet temperatur i et egnet tidsrom i en carbondioxydgassinkubator. Når cellene har vokst til sammenløpning, erstattes mediet med et tPA-produserende medium, og inkuberingen fortsettes i carbondioxyd-gassinkubatoren ved en egnet temperatur i et egnet tidsrom for tPA-produksj on.
Når eksempelvis en 75 cm Roux-kolbe anvendes, inokuleres celler til en konsentrasjon på 0,5 til 2,0 x 10^/ml og inkuberes ved 37°C i 3 til 4 dager for vekst parallelt med tPA-produksjon.
Når alternativt en 75 cm<2> Roux-kolbe anvendes, inokuleres cellene til en konsentrasjon på 1 til 2 x 10^/ml og inkuberes ved 37°C i 3 til 4 dager for cellevekst. Mediet erstattes deretter med et tPA-produserende medium, og inkuberingen fortsettes ved 37°C i 1 til 3 dager for tPA-produksjon.
Eksempler
Foreliggende oppfinnelse illustreres nærmere i de etterfølgende eksempler:
Eksempel 1
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de fra den ovenfor angitte hT-382-stamme.
I 7 5 cm<2>Roux-kolber ble det anbrakt 20 ml hver av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% kalvefosterserum som var blitt varmeinaktivert, og 10 /uM sinkklorid. Til hvert medium ble det tilsatt aprotinin, p-aminomethylbenzosyre eller 3-methoxy-4-aminomethylbenzosyre i den spesifiserte mengde som er angitt i tabell 1. Hvert således fremstilte kulturmedium ble inokulert med de ovenfor angitte celler til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml.
Cellene ble inkubert ved 37°C i 4 dager. Når cellene var vokst til sammenløpning (ca. 10 x 10^ celler/ml),
ble konsentrasjonene av enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA i kulturen bestemt ved den analyse som er beskrevet i det etterfølgende. Resultatene er vist i tabell 1.
Analysemetoden for enkeltkjedet tPA og dobbeltkj edet tPA i kultur er som følger.
I ELlSA-metoden.
(1) Monoklonale antistoffer overfor enkeltkjedet tPA (PAM-1) og monoklonale antistoffer overfor enkeltkjedet tPA pluss dobbeltkjedet tPA (PAM-2) ble fortynnet med en beleg-ningsløsning til 10 mikrogram/ml, og 50 mikroliter hver av de
fortynnede løsninger ble anbrakt i brønnene av en ELISA-plate (96 brønner). Platen fikk stå i 2 timer ved romtemperatur, hvorpå væsken i brønnene ble kastet. (2) Hver av brønnene ble vasket med en vaskeløs-ning og ble deretter fylt med en blokkeringsløsning. Platen fikk stå i 30 minutter ved romtemperatur. 50 mikroliter hver av 1000 - 2000 ganger fortynnede prøveløsninger og standard-løsninger (0, 1, 2, 4 og 8 ng/ml) ble tilsatt til hver av brønnene, og platen fikk stå i 2 timer. (3) Hver av brønnene ble igjen vasket med vaske-løsningen hvorpå anti-tPA kanin-antistoff ble tilsatt til hver brønn. (4) Hver av brønnene ble igjen vasket med vaske-løsningen hvorpå 50 mikroliter av en 500 gangers fortynnet løsning av geite-anti-kanin-IgG og alkalisk fosfatasekonju-gat ble tilsatt til hver brønn. Platen fikk stå i 1 time. (5) Hver av brønnene ble igjen vasket med vaske-løsningen hvorpå 50 mikroliter av en substratløsning (p-nitrofenylfosfat, 0,6 mg-ml) ble tilsatt til hver brønn. Platen fikk stå i 30 minutter. (6) 50 mikroliter av en 3N NaOH-løsning ble tilsatt til hver av brønnene for å stoppe den enzymatiske reak-s j on. (7) Absorpsjon ved 405 nm ble avlest med en kommersi-elt tilgjengelig ELISA-leser. (8) En målelinje ble nedtegnet under anvendelse av avlesningene av standardene, og tPA-konsentrasjonene i prøvene ble bestemt. (9) Beregninger ble foretatt som følger. Enkeltkjedet tPA-innhold (mg/liter) = Måling for PAM-1 Dobbeltkjedet tPA-innhold (mg/liter) = Måling for PAM-2 -
måling for PAM-1
II. Kvalitativ analyse ved immunoblotting
(1) Hver av kulturløsningene ble behandlet i en prøveløsning for elektroforese med eller uten betamercapto-ethanol som reduserer proteiner i prøven. Elektroforesen
utføres i henhold til metoden ifølge Laemmli (1970).
(2) Etter elektroforesen overføres proteinet elek-trisk på et nitrocellulosefilter ved metoden ifølge Towbin et al. (1979). (3) Ikke-spesifikke proteinabsorberende seter mettes med kvegserumalbumin. (4) Nitrocellulosefilteret behandles med primære antistoffer, dvs. anti-tPA-antistoffer (f.eks. geite-avledede eller kanin-avledede, polyklonale antistoffer eller muse-avledede, monoklonale antistoffer) og tillates å reagere med tPA på nitrocellulosefilteret. (5) Sekundære antistoffer tillates å reagere med anti-tPA-antistoffer og deretter å reagere med alkalifosfatase-bundne antistoffer overfor de sekundære antistoffer. (6) Fargereaksjon utføres under anvendelse av bromklorindolylfosfat som et substrat for alkalifosfatase som er oppløst i en løsning inneholdende nitrobluetetrazorium for å påvise tPA eller dekomponerte fraksjoner eller aggregater derav på nitrocellulosefilteret.
Ved blotting med enkeltkjedet tPA erholdes et hovedbånd ved ca. 70 kd i både reduserte og ikke-reduserte prøver. Ved blotting med dobbeltkjedet tPA erholdes hoved-båndet ved ca. 70 kd lik det med enkeltkjedet tPA i den ikke-reduserte prøve, men bånd ved ca. 30 kd og ca. 40 kd erholdes i reduserte prøver, og båndet ved ca. 70 kd erholdes ikke. Båndene funnet ved ca. 70 kd, ca. 30 kd og ca. 40 kd ved immunoblotting av disse reduserte og ikke-reduserte prøver, sammenlignes for å kvalitativt bestemme graden av enkeltkjedet tPA i forhold til dobbeltkjedet tPA i prøvene.
Selv om immunoblottinganalyse er en kvalitativ måling, ble den anvendt for å bekrefte de kvantitative data som konvensjonelt ble erholdt ved ELISA.
Som klart vist i tabell 1, var avskalling av cellene i kulturen supplert med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat, relativt usignifikant, og enkeltkjedet tPA-produksjon ble forbedret.
Med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat i en konsentrasjon på 10 <4> M eller mer var effekten i særdeleshet sammenlignbar eller større enn den med aprotinin.
Eksempel 2
Cellelinjen anvendt i eksempel 1, ble anvendt. Cellene ble inokulert ved en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml i 20 ml hver av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert kalvefosterserum i 75 cm^ Roux-kolber.
Cellene ble inkubert ved 37°C i 4 dager. Når cellene var vokst til sammenflytning (ca. 10 x 10^ celler/ml), ble mediet kastet og deretter erstattet med 20 ml av det tPA-produserende medium med samme sammensetning som ovenfor beskrevet, bortsett fra at sinkklorid i en konsentrasjon på 10 /uM og respektive additiver vist i tabell 2, ble tilsatt. Inkuberingen ble fortsatt i carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 2 dager. Konsentrasjonene av enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA i kulturen ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 2.
Som klart vist i tabell 2, var avskalling av cellene i kulturen supplert med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat, relativt usignifikant, og enkeltkjedet tPA-produksjon var forbedret. Med p-aminomethylbenzosyre eller dens derivat i en konsentrasjon på 10-<4> M eller mer, overskred effekten den til aprotinin.
Eksempel 3
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av SV-21-M2,5 K7-cellelinjen som var erholdt ved transformering av CHO-(kinesiske hamsterovarie) celler med plasmidet omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for tPA, var bundet til SV-40 tidlig-promoter og en DNA-sekvens som koder for dihydrofolatreduktase, og ytterligere ved utvelgelse av de transformerte celler som bærer forsterkede gener på et medium supplert med methotrexat. tPA-produksjonen ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at sinkklorid ikke ble tilsatt til mediet. Resultatene er vist i tabell 3. Som det fremgår fra tabell 3, var avskalling av cellene relativt usignifikant, og enkeltkjedet tPA-produksjon var forbedret i alle tilfeller. Med p-aminomethylbenzosyre var effekten i særdeleshet bemerkelsesverdig.
Eksempel 4
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av hT-382-cellelinjen som var erholdt ved transformering av muse-C-127-celler med plasmidet konstruert med innskudd av en del av det BPV-avledede plasmid omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for tPA, var bundet til human-avledet metallothioneinpromoter, av en del av pBR322-plasmid og av en DNA-sekvens som var nødvendig for å stoppe transkripsjon.
I 75 cm<£> Roux-kolber ble 20 ml hver av DMEM-medium supplert med 10% varmeinaktivert kalvefosterserum og 10 /uM sinkklorid innført. Til hvert medium ble det tilsatt aprotinin (40 KIU/ml) eller p-aminomethylbenzosyre til en konsentrasjon på 10~<2>M og enn videre natriumbicarbonat i de spesifiserte mengder som vist i tabell 4. Hvert av de således fremstilte medier ble inokulert med de ovenfor angitte celler til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml.
Cellene ble inkubert i en 5% carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 4 dager. Når cellene hadde vokst til sammenflytning (ca. 10 x 10^ celler/ml), ble konsentrasjoner av enkeltkjedet tPA i de individuelle kulturer bestemt ved den ovenfor beskrevne metode. Resultatene er vist i tabell 4.
Målinger av osmotisk trykk ble foretatt under anvendelse av Simazu Osmometer etter prøvetagning for tPA-bestemmelse.
Som klart vist i tabell 4, ble når det osmotiske trykk av mediet overskred 300 milliosmol/liter, ikke bare enkeltkjedet tPA-produksjonsgrad øket, men også total tPA-produksjon forbedret. Enkeltkjedet tPA-produksjon ble kraftig-ere forbedret i mediet supplert med p-aminomethylbenzosyre enn i mediet supplert med aprotinin.
Eksempel 5
Cellene for tPA-produksjon var de av samme stamme som anvendt i eksempel 4. Cellene ble inokulert til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml i 20 ml hver av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert kalvefosterserum i 75 cm Roux-kolber.
Cellene ble inkubert i en 5% carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 4 dager. Når cellene var vokst til sammenflytning (10 x 10^ celler/ml), ble mediet kastet og deretter erstattet med 20 ml hver av mediet som hadde samme sammensetning som ovenfor beskrevet, bortsett fra at sinkklorid (10 /uM) og aprotinin (40 KIU/ml) og p-aminomethylbenzosyre (10 M) såvel som natriumbicarbonat ved de konsentrasjoner som er angitt i tabell 4, ble tilsatt. Cellene ble igjen inkubert i en carbondioxydgassinkubator ved 37°C i 2 dager for tPA-produksjon. Konsentrasjonene av tPA i den individuelle kultur ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 5.
Som i eksempel 4, ble en bemerkelsesverdig forbedring i produktivitet av enkeltkjedet tPA observert i kulturen hvori p-aminomethylbenzosyre var tilsatt, og det osmotiske trykk var øket.
Eksempel 6
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av SV-21-M2,5 K7-cellelinjen som var erholdt ved transformering av CHO- (kinesiske hamsterovarie) celler med plasmidet omfattende en DNA-sekvens hvori en DNA-sekvens som koder for tPA, var bundet til SV-40 tidlig-promoter og en DNA-sekvens som koder for dihydrofolatreduktase, og deretter ved utvelgelse av celler som bærer forsterkede gener på et medium supplert med methotrexat.
tPA-produksjonen ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 4, bortsett fra at mediet ikke inneholdt sinkklorid. Resultatene er vist i tabell 6.
Bemerkelsesverdige effekter ble funnet ikke bare ved produktivitet av enkeltkjedet tPA, men også i graden av enkeltkjedet tPA.
Eksempel 7
Cellene anvendt for tPA-produksjon, var de av samme stamme som anvendt i eksempel 4. Cellene (10^ celler) ble inokulert til en konsentrasjon på 1,0 x 10^ celler/ml i 1 liter hver av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert kalvefosterserum i 1 liters rullekolber (total kapasitet på 1,5 liter), hver utstyrt med omrøringsblader, pH-elektroder, DO-elektroder og et rør for blåsing av gass. De anvendte såceller var blitt dyrket på forhånd i det ovenfor angitte medium i en rulleflaske. Inkuberingen ble utført ved 37°C i 4 dager. Når cellekonsentrasjonen nådde 10^ celler/ml, ble det ovenfor angitte medium kastet og erstattet med hensyn til tPA-produksjon med 1 liter hver av DMEM supplert med 5% varme-inaktivert kalvefosterserum, aprotinin (40 KIU/ml) eller p-aminomethylbenzosyre (IO-<2> M) og sinkklorid (10 /uM).
For å opprettholde det osmotiske trykk i mediet som vist i tabell 7, ble 5% carbondioxydgass leilighetsvis blåst inn i kolben. pH ble justert med NaOH. Enn videre ble DO opprettholdt ved 1 PPM og temperaturen ved 37°C. Medieforand-ringer ble utført én gang pr. dag i 5 dager slik at tPA-fraksjoner ble gjenvunnet totalt fem ganger.
Som vist i tabell 7, ble lignende effekter som vist i eksempel 4, observert når det osmotiske trykk ble regulert ved blåsing av carbondioxydgass inn i mediet.
Claims (5)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype-plasminogenaktivator (htPA) under anvendelse av celler transformert med et plasmid inneholdende htPA-genet og med evne til å uttrykke htPA,
karakterisert ved at human vevtype-plasmino-genaktivatoren produseres parallelt med veksten av cellene i et cellekulturmedium supplert med IO"<4> til IO"<1> M av et p-aminomethylbenzosyrederivat.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene dyrkes på forhånd i et cellekulturmedium og inkuberes deretter i et medium for produksjon av human vevtype-plasminogenaktivator, hvilket medium er supplert med en alminnelig kjent human vevtype-plasminogenaktivator- fremkal ler og et p-aminomethylbenzosyrederivat.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bicarbonation tilsettes til angitte cellekulturmedium for å øke det osmotiske trykk av mediet til 350 milliosmol eller mer/liter.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bicarbonation tilsettes til angitte cellekulturmedium for å øke det osmotiske trykk av mediet til 350 milliosmol eller mer/liter.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at det som p-aminomethylbenzosyrederivat anvendes p-aminomethylbenzosyre.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12264488A JP2648611B2 (ja) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
| JP63316118A JP2718726B2 (ja) | 1988-12-16 | 1988-12-16 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO891995D0 NO891995D0 (no) | 1989-05-18 |
| NO891995L NO891995L (no) | 1989-11-20 |
| NO175541B true NO175541B (no) | 1994-07-18 |
| NO175541C NO175541C (no) | 1994-10-26 |
Family
ID=26459739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO891995A NO175541C (no) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5151359A (no) |
| EP (1) | EP0342931B1 (no) |
| AT (1) | ATE108825T1 (no) |
| AU (1) | AU612837B2 (no) |
| CA (1) | CA1334288C (no) |
| DE (1) | DE68916857T2 (no) |
| DK (1) | DK243589A (no) |
| FI (1) | FI98123C (no) |
| NO (1) | NO175541C (no) |
| NZ (1) | NZ229187A (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5183754A (en) * | 1988-10-04 | 1993-02-02 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| WO1995022599A1 (fr) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Teijin Limited | Procede de mise en culture de cellules animales |
| US5856179A (en) * | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
| US6656466B1 (en) | 1995-06-06 | 2003-12-02 | Genetech, Inc. | Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition |
| US5721121A (en) * | 1995-06-06 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein |
| US5705364A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
| AU2002316230A1 (en) * | 2001-06-13 | 2002-12-23 | Genentech, Inc. | Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells |
| CA2829774C (en) | 2011-03-14 | 2019-09-24 | National Research Council Of Canada | Method of viral production in cells |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3732146A (en) * | 1970-12-22 | 1973-05-08 | Behringwerke Ag | Process for the isolation of native, highly purified plasminogen |
| JPS59196824A (ja) * | 1983-04-21 | 1984-11-08 | Kowa Co | 吸着防止剤 |
| FR2548211B1 (fr) * | 1983-06-29 | 1985-10-18 | Choay Sa | Procede de production d'un activateur tissulaire du plasminogene et activateur obtenu par ce procede |
| US4554251A (en) * | 1983-11-07 | 1985-11-19 | The Ohio State University Research Foundation | Process and medium for culturing ant venom gland cells |
| GB8334499D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Derivatives |
| US4724206A (en) * | 1984-02-13 | 1988-02-09 | Damon Biotech, Inc. | Protein production using hypertonic media |
| DE3479814D1 (en) * | 1984-06-05 | 1989-10-26 | Asahi Chemical Ind | Process for the preparation of a plasminogen activator |
| US4661453A (en) * | 1984-06-19 | 1987-04-28 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Production of tissue plasminogen activator factor |
| US4661469A (en) * | 1984-08-08 | 1987-04-28 | Survival Technology, Inc. | t-PA composition capable of being absorbed into the blood stream and method of administration |
| JPS624233A (ja) * | 1985-07-01 | 1987-01-10 | Toyobo Co Ltd | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
| US4960702A (en) * | 1985-09-06 | 1990-10-02 | Codon | Methods for recovery of tissue plasminogen activator |
| US5183754A (en) * | 1988-10-04 | 1993-02-02 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
-
1989
- 1989-05-05 US US07/347,649 patent/US5151359A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-09 CA CA000599119A patent/CA1334288C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-16 AT AT89304944T patent/ATE108825T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-16 DE DE68916857T patent/DE68916857T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-16 EP EP89304944A patent/EP0342931B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-17 AU AU34892/89A patent/AU612837B2/en not_active Ceased
- 1989-05-17 FI FI892358A patent/FI98123C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-05-18 NO NO891995A patent/NO175541C/no unknown
- 1989-05-18 NZ NZ229187A patent/NZ229187A/en unknown
- 1989-05-19 DK DK243589A patent/DK243589A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI892358A0 (fi) | 1989-05-17 |
| DK243589D0 (da) | 1989-05-19 |
| CA1334288C (en) | 1995-02-07 |
| FI98123C (fi) | 1997-04-25 |
| EP0342931B1 (en) | 1994-07-20 |
| DE68916857D1 (de) | 1994-08-25 |
| ATE108825T1 (de) | 1994-08-15 |
| AU3489289A (en) | 1989-11-23 |
| FI98123B (fi) | 1997-01-15 |
| EP0342931A1 (en) | 1989-11-23 |
| NO891995D0 (no) | 1989-05-18 |
| NZ229187A (en) | 1991-12-23 |
| DK243589A (da) | 1989-11-20 |
| DE68916857T2 (de) | 1994-11-10 |
| NO175541C (no) | 1994-10-26 |
| US5151359A (en) | 1992-09-29 |
| AU612837B2 (en) | 1991-07-18 |
| FI892358A (fi) | 1989-11-20 |
| NO891995L (no) | 1989-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6413746B1 (en) | Production of proteins by cell culture | |
| AU778046B2 (en) | Cell culture process for glycoproteins | |
| US3904480A (en) | Enhanced production of plasminogen activator | |
| NO169497B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av en serumavhengig human cellelinje | |
| US4190708A (en) | Production of urokinase | |
| EP0907723A1 (en) | Enzyme composition for tissue dissociation | |
| NO311299B1 (no) | Protein C derivater, rekombinant DNA molekyl, kodende dette samt fremgangsmåte for fremstilling av proteinene | |
| EP0239292B1 (en) | Production of proteins by cell culture | |
| NO175541B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator | |
| Shuman et al. | Tissue plasminogen activator in cultured human trabecular meshwork cells. Predominance of enzyme over plasminogen activator inhibitor. | |
| US4661453A (en) | Production of tissue plasminogen activator factor | |
| RU2096455C1 (ru) | Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности | |
| DK175411B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner | |
| CA1335188C (en) | Method for production of human tissue type plasminogen activator | |
| EP0247674B1 (en) | Plasminogen activator and thrombolytic composition | |
| JP4004585B2 (ja) | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素 | |
| JP2648624B2 (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 | |
| KR980009454A (ko) | 바실러스속 균주 유래의 혈전용해효소 | |
| JP2825541B2 (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 | |
| JPH01256385A (ja) | 組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法 | |
| JPH01291796A (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 | |
| JPH01256384A (ja) | 組織型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造法 | |
| JPH02273180A (ja) | ２本鎖組織型プラスミノゲンアクチベータの製造法 | |
| JPH05252951A (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 |